Krooninen sairaus

tiivistelmä

Eturauhassyöpä (PCA) on yleisimmin diagnosoitu syöpä miehillä teollisuusmaissa. Androgeenireseptorin signalointireitin on tärkeä rooli eturauhassyövän etenemiseen. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että microRNA miR-124 kykenee tuumoria tukahduttavan funktion eturauhassyövässä. Kuitenkin suhde AR ja miR-124 on epäselvä. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, negatiivinen takaisinkytkentäsilmukka välillä AR ja miR-124 ilmentymistä. Toisaalta miR-124 oli säätää positiivisesti kohdegeenin AR, toisaalta, yliekspressio miR-124 inhiboi ilmentymisen AR. Lisäksi olemme havainneet, että miR-124-2 ja miR-124-3 promoottorit hypermetyloitunut AR-negatiivinen PCa soluissa. Lisäksi yli-ilmentyminen miR-124 esti leviämisen hinnat ja invasiivisuus kapasiteetti Eturauhassyövän soluja

in vitro

, ja tukahdutti ksenografti- kasvaimen kasvua

in vivo

. Yhdessä tuloksemme tukevat negatiivinen kierre välillä AR ja miR-124 ilme. Metylaatio miR-124-2 ja miR-124-3 voidaan käyttää biomarkkerina AR-negatiivisten PCa soluja, ja yli-ilmentyminen miR-124 voi olla potentiaalia terapeuttista arvoa hoidettaessa PCa.

Johdanto-osan : Chu M, Chang Y, Guo Y, Wang N, Cui J, Gao WQ (2015) asetus ja metylointi kasvain vaimennin MiR-124 androgeenireseptorin eturauhassyöpäsoluissa. PLoS ONE 10 (4): e0116197. doi: 10,1371 /journal.pone.0116197

Academic Editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Itävalta

vastaanotettu: 01 lokakuu 2014; Hyväksytty: 7. joulukuuta 2014; Julkaistu: 10 huhtikuu 2015

Copyright: © 2015 Chu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Tietopaketti.

Rahoitus: tutkimus tukee varoja W.-Q. Gao Kiinan Ministry of Science and Technology (2012CB966800, 2013CB945600 ja 2012CB967900), National Natural Science Foundation of China (81130038 ja 81372189), Science and Technology komission Shanghai kunta (Pujiang ohjelma), Shanghai Koulutuskomitea Key Kuri ja Specialty Foundation (J50208), Key Kuri ja Specialty Foundation Shanghai Health Bureau ja KC Wong perusta, ja M. Chu Shanghaista Postdoctoral Scientific Program of China (12R21415100).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

MikroRNA (mIR) ovat endogeenisiä, yksijuosteisia pienet ei-koodaavat RNA: t (noin 20-22 nukleotidia), jotka tavallisesti aiheuttavat geenien vähentämällä mRNA: n stabiilisuuteen ja /tai käännös [1]. Heidän poikkeava ilmaisu on todettu liittyvän useita erilaisia ​​syöpiä [2-4]. MiR-124 on erittäin konservoitunut microRNA, että sillä on kasvaimia estävä rooli erilaisten syöpien [5-9]. Kypsän sekvenssin miR-124 on käsitelty kolme esiaste varianttien sekvenssit, jotka sijaitsevat kromosomeja 8p23.1 (miR-124-1), 8q12.3 (miR-124-2) ja 20q13.33 (miR-124- 3), jotka kaikki sisältävät CpG saaria niiden promoottori alueella [9].

CpG saaret ovat genomialuetta jotka sisältävät tiheä CpG sivustoja ja tyypillisesti lähellä transkription aloituspaikkoja [10]. Metylaatio CpG: t näillä alueilla uskotaan johtavan transkription vaiennettu niiden alavirran geenien [10]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että metylaatio on syy alhaiseen ilmentymisen miR-124 kohdunkaulan syövän [9], akuutti lymfaattinen leukemia [5], maksasyövän [6], ja haimasyövän [7]. Kuitenkin Raynalin et ai. [11] on raportoitu, että DNA: n metylaatio ei stabiilisti estää geenin ilmentymistä alkaen histonideasetylaasi-inhibiittorit voivat aktivoida geenin ilmentymistä vaikuttamatta metylaatiostatuksen [11]. Mutta malleja metylaation voivat toimia epigeneettisiin markkereita pitkäaikaiseen ylläpitoon geenien [11]. Koska sen erityispiirteet ja vakautta ihmisnäytteillä, DNA: n metylaatio profiilit voivat olla hyödyllisenä biomarkkereiden syövän seulonnan [12, 13]. Tämän mukaisesti käsite, viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että poikkeava DNA metylointi miR-124 variantteja arvokas biomarkkeri kohdunkaulan syövän [9], virtsarakon syöpä [14] ja selkeä cell munuaissolusyövässä [15].

eturauhassyöpä (PCA) on yleisin maligniteetti iäkkäillä miehillä kehittyneissä maissa yhä hinnat kehitysmaissa [16]. Androgeenireseptorin (AR) signalointireitin on erittäin tärkeä eturauhasen syöpä [17], joka säätelee monia muita geenejä mukana kasvaimen etenemiseen tai tuumorisuppressiogeeneksi [18]. Lisäksi on osoitettu, että AR korreloi metylaatiostatuksen erityisten MikroRNA PCA-soluissa [19]. Kuitenkin mekanismit sääntelyn ja metylaation miR-124 ovat vielä epäselviä.

Tässä tutkimuksessa on tarkoitus tutkia sääntelyn mekanismi miR-124, metylaatiostatuksen miR-124 ja anti-kasvain toiminto Mir-124 PCA-soluissa. Tulokset meidän kokeen osoitti, että AR signalointi edistetään ilmentymistä miR124, kun taas miR124 tukahdutti AR ilme. Oli negatiivinen kierre välillä miR124 ja AR ilme. Lisäksi DNA: n metylaatio analyysi osoitti, että suuri metyloinnin miR124-2 ja miR-124-3 tapahtui AR-negatiivinen PCa soluissa, mikä viittaa siihen, että tämä fenotyyppi voidaan käyttää biomarkkerina AR-negatiivisten PCa soluja. Lisäksi yli-ilmentyminen miR-124 osoitti antituumorivaikutuksen

in vitro

ja

in vivo

, mikä viittaa mahdollista terapeuttista arvoa miR-124 hoitoon PCa.

Materiaalit ja menetelmät

Eturauhassyöpä soluviljelmissä ja dihydrotestosteroni hoidon

LNCaP, 22Rv1, DU145 ja PC-3-solulinjat saatiin the American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA ). C4-2-soluja, alalinja LNCaP-soluja, saatiin UroCore (Oklahoma City, OK, Yhdysvallat). PC3 /AR-solut ovat PC3-soluja, jotka stabiilisti yli-ilmentävät villityypin AR-geenin [20]; PC3 /neo-solut ovat ohjaus solulinjaa. Soluja ylläpidettiin valmistajan mukaan ja tarjoajien protokollia. Sillä Dihydrotestosteroni (DHT, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) käsittelyn jälkeen, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (Hyclone, Logan, UT, USA) korvattiin 10% hiilellä erotettua naudan vasikan seerumia (Bioind , Israel), kun LNCaP-solut olivat 60% -70% konfluentteja, ja sitten 0, 5 ja 10 nM DHT lisättiin vastaavasti, ja soluja viljeltiin vielä 12 tunnin ajan.

Plasmidit, lentivirus- tuotannon ja infektio

21mer-sekvenssi (5-GGTGTCACTATGGAGCTCTCA-3) on suunniteltu tuottamaan lentivirusvektorin AR lyhyen hiusneula-RNA (shRNA) [21], ja vektorirakenne, lentivirus- tuotannon ja infektio tehtiin mukaisesti edellinen kuvaus [19] . Lentiviruksen Plenti-CMV-miR-124 vektori rakennettiin vakaasti yli-ilmentävät kypsän sekvenssin miR-124. Vektori Plenti CMV /Puro tyhjä (Addgene plasmidi # 17482 [22]) hankittiin Addgene. Genominen segmentti miR-124 -2-sekvenssit monistettiin käyttäen alukkeita miR-124-2-F: CCTGGATCCGCTGTAAATGGCATGGAGATAT ja miR-124-2-R: GCGTCTAGAGCGGCTGTAATGGAAAAGTAG; ja subkloonattiin BamH1 ja Xbal-kohtiin Plenti CMV /Puro tyhjän vektorin [23]. Lentivirus tuotanto ja transduktio tehtiin artikkelin aiempaan menetelmään [23].

Real-Time PCR

Yhteensä-RNA: t eristettiin käyttäen RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) eri PCa soluista. Käänteistranskriptio suoritettiin käyttäen PrimeScript RT reagenssipakkaus (TaKaRa, Dalian, Kiina) ja TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Suhteelliset määrät miR-124 (käyttäen TaqMan microRNA määritykset, Applied Biosystems) ja AR (käyttäen SYBR Green Realtime PCR Master Mix, TOYOBO, Osaka, Japani) tehtiin 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems). Geenien ilmentyminen normalisoitiin endogeeninen kontrolli RNU44 (miR-124) tai β-aktiini (AR). Ct-arvot laskettiin käyttäen ΔΔCt menetelmää. Seuraavia alukkeita käytettiin: AR eteenpäin CCAGGGACCATGTTTTGCC, käänteinen CGAAGACGACAAGATGGACAA; β-aktiini eteenpäin CATGTACGTTGCTATCCAGGC, taaksepäin CTCCTTAATGTCACGCACGAT.

Natrium bisulfiittimodifikaatio ja sekvensointi

metylaatiostatuksen kunkin miR-124 variantteja määritettiin bisulfiittimodifiointi-sekvensointi PCR (BSP) jälkeen bisulfiittikonversion solujen käyttämällä EZ DNA metylaatio-suora kit (Zymo Research Corporation, Irvine, CA, USA) seuraavan standardin protokollia. BSP Alukkeet suunniteltiin käyttäen metyyli Primer Express v1.0 ohjelmisto (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) (taulukko 1). PCR-tuotteet ligatoitiin pMD19-T Simple Vector (TaKaRa Biotechnology Co., Ltd., Dalian, Kiina). Pesäkkeet (n = 10) valittiin kohti PCa solulinjaa ja sekvensoitiin Shanghai Shenggong Biotech (Shanghai, Kiina).

soluproliferaatiomäärityksissä

Solulisääntyminen mitattiin käyttämällä solulaskennan kit (CCK-8; Dojindo, Kumamoto, Japani) määritys. Solut maljattiin 96-kuoppaisille levyille 5000 solua kuoppaa kohti ja tutkittiin 48, 72, 96 tuntia sen jälkeen, kun pinnoitus (n = 12). CCK-8 (10 ui) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja soluja inkuboitiin vielä 2 tuntia. Absorbanssi mitattiin mikrolevylukijalla (BioTek, USA) aallonpituuksilla 450 nm.

Migration määrityksissä

Costar TranswellTM Migration Levyjä 8 um huokoskoko (# 3422, Corning, USA) olivat käyttää. Ylempi kammio ympättiin 1 x 10

5 soluja seerumittomassa alustassa ja 20% FBS käytettiin houkutin alemmassa kammiossa. 24 tunnin kuluttua viljelyn, viljelmän insertit poistettiin ja pestiin fosfaattipuskurilla (PBS) useita kertoja päästä eroon irrallinen soluja. Kaikki jäljellä olevat solut yläpuolen raaputettiin pumpulipuikolla. Siirtynyt solujen alapuolelle insertin kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 15 minuutin ajan, pestiin kahdesti PBS: llä, ja värjättiin 0,1% kristallivioletilla 10 minuutin ajan. Kunkin insertti, 5 satunnaisesti valittujen alueiden suodattimen laskettiin valomikroskoopilla. Kukin koe toistettiin kolme kertaa.

In vivo

ksenografti määrityksiä

Kuusi viikkoa vanhoja BALB /C nude-hiirissä (SLAC, Shanghai, Kiina) olivat satunnaisesti ryhmitelty ja injektoidaan subkutaanisesti 4x 10

6 LNCaP-ohjaus tai LNCaP-miR-124 soluja sekoitettiin yhtä tilavuus matrigeelin (BD Biosciences, Bedford, MA, USA). Jokainen ryhmä oli ainakin viisi hiirtä. Kasvaimet mitattiin mittaharpilla välein 10 päivää alkaen 2 viikkoa ymppäyksen jälkeen, ja tilavuus laskettiin π /6 x pituus x leveys

2. Ksenograftikasvaimissa leikattiin irti ja punnittiin uhrauksia 34 päivää post-kasvainsolujen injektion jälkeen. Kaikki hiiri kokeet hyväksynyt Renji sairaala eläinten hoitoon ja käyttöön komitea.

Tilastollinen

Tiedot analysoitiin SPSS 13.0 ohjelmistot (SPSS Inc., Chicago, Ill., USA) ja Prism GraphPad 5 (GraphPad Software, La Jolla, Kalifornia., USA). Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen Studentin t-testiä. Data esitetään keskiarvoina ± SEM vähintään kolmesta itsenäisestä kokeesta. Todennäköisyys arvot alle 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

Negatiivinen palaute silmukka välillä miR-124 ja AR ilmaisun

Voit selvittää AR säätelee ilmentymistä miR-124 PCa solulinjat, AR yli-ilmentyminen ja AR pudotus kokeet suoritettiin PC3-soluissa (vs. PC3 /AR) ja LNCaP-soluja (vs. LNCaP-sh-AR), vastaavasti. Kuten on esitetty kuviossa. 1, kun taas yli-ilmentyminen AR PC3-soluissa lisääntynyt ilmentyminen tasolla miR-124 (Fig. 1A), pudotus AR LNCaP vähensi ekspressiotaso miR-124 (Fig. 1 B). Lisäksi tutkimme jos miR-124 on androgeeniresponsiivinen microRNA. LNCaP-solujen androgeenin-reagoiva PCa soluja, maljattiin androgeeni-väliaineessa ja käsiteltiin DHT 0 nM, 1 nM ja 10 nM, vastaavasti. Sen jälkeen 12 tunnin kuluttua RNA: t uutetaan ja reaaliaikainen PCR analysoitiin. Nämä kokeet paljastivat lisäystä ilmentymisen määrä tasoja miR-124-geenin LNCaP käsiteltiin DHT (10 nM) käsittely (Fig. 1 C). Edellä esitetyt tulokset viittaa siihen, että AR läheisesti korreloi positiivisesti ilmentymisen miR-124. Ei kuitenkaan ole selvää, onko olemassa palautetta vaikutus välillä miR-124 ja AR. Tutkia tätä mahdollisuutta LNCaP-solut infektoitiin ohjaus lentivirus (LNCaP-kontrollisolut) tai Plenti-CMV-mir-124 lentivirus (LNCaP-miR-124-solut), joka ilmentää suuria määriä miR-124 (Fig. 1 D). Ilmentymistaso AR analysoitiin sitten qRT-PCR: llä. Kuten on esitetty kuviossa. 1E, yli-ilmentyminen miR-124 esti merkittävästi AR mRNA-tasolla, joka on sopusoinnussa aiemman tutkimuksen perusteella, että hoito miR-124 vähensi AR proteiinin LNCaP [8]. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, negatiivinen takaisinkytkentäsilmukka välillä miR-124 ja AR ilmentymistä (Fig. 1 F).

(A) PC3 /AR-solut ovat stabiili solulinja, joka yli-ilmentää ihmisen AR-cDNA; PC3 /neo soluja käytetään kontrollina. (B) LNCaP-sh-AR-solut ovat AR-pudotus-solut, joissa LNCaP-solut infektoitiin lentivious AR shRNA; LNCaP-sh-ohjaus soluja käytetään kontrollina. (C) 0 nM, 1 nM ja 10 nM DHT lisättiin LNCaP-soluja ja niitä viljeltiin 12 tunnin ajan. (D) LNCaP-solut infektoitiin ohjaus lentivirus (LNCaP-kontrollisolut) tai Plenti-CMV-mir-124 lentivirus (LNCaP-miR-124-solut). Suhteellinen ilmentyminen miR-124 LNCaP-soluissa määritettiin qRT-PCR ja korjattuna RUN44 tasolle. Arvot tarkoittavat fold-muutokset normalisoida (A) PC3 /neo-soluissa; (B) LNCaP-sh-AR solu; (C) LNCaP-soluja (0 nM DHT) ja (D) LNCaP-kontrollisoluja. (E) Suhteellinen ilmentyminen AR määritettiin qRT-PCR ja normalisoidaan p-aktiini tasot. Arvot tarkoittavat taitettava muutoksista normalisoida LNCaP-ohjaus soluissa. (F) Kaaviokuva kuvattua reittiä tutkimuksessa. Data näytetään keskiarvoina ± SEM 3 riippumattomasta kokeesta, joista kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena

metylointi analyysi miR-124 PCa soluissa

kypsä miR-124 sisältää 3 ennenaikainen variantit: miR-124-1, miR-124-2 ja miR-124-3 (20q13.33). Bisulfiitti sekvensointi PCR (BSP) ja geenin sekvensointi suoritettiin analysoida DNA metylaatiotasoilla kunkin miR-124 variantteja. Nämä analyysit osoittivat, että metylaatio toiminta miR-124-2 ja miR-124-3 olivat korkeampia AR-negatiivisten PCa soluja (85% -96%, 80% -88%, tässä järjestyksessä) kuin AR-positiivisten PCa soluja (0 % -50%, 1% -3%, vastaavasti) (Fig. 2). Kuitenkin sekä AR-negatiivisia ja AR-positiivisia PCa soluja, promoottorialue miR-124-1 metyloitiin vain rajoitetussa määrin (2% -38%, Fig. 2). Lisäksi, miR-124-1 metylaatio ei ollut merkittävästi korkeampi kuin AR-positiivinen solu AR-negatiivinen PCa-soluja (DU145, PC3) lukuun ottamatta DU145-solut, joissa metylaation oli huomattavasti suurempi kuin AR-positiivisia soluja (22RV1, C4 -2 ja LNCaP; p 0,05).

Kaavamainen yhteenveto CpG sivustoja miR-124-1, miR-124-2 ja miR-124-3 promoottorialueille. (A) metylointianalyysi tehtiin 10 kloonia kustakin solulinjasta. Jokainen rivi piireissä edustaa yksittäistä kloonia, ja kunkin ympyrän edustaa yksinkertaista DNA metyloitu tai demetyloitunut päällä. (B) metylaatio prosenttiosuudet 10 kloonia kustakin solulinjoja yhteenveto pylväskaaviona. Data näytetään keskiarvoina ± SEM. Tähdet osoittavat P 0,05, kaksinkertainen Tähdet osoittavat P 0,001.

MiR-124 yliekspressio estää LNCaP jakaantumiseen, kulkeutumiseen ja ksenograftikasvaimissa kasvu

Aiemmat tutkimukset osoittavat, että miR-124 näytelmiä rooli tuumorisuppressorina [5-9], niin halusimme tutkija onko yli-ilmentymisen miR-124 voi estää PCa solujen lisääntymistä. Voit vastata tähän kysymykseen, LNCaP-ohjaus solujen ja LNCaP-miR-124 solua maljattiin 96-kuoppalevyille ja tutkittiin 48, 72, 96 tunnin kuluttua alkumaljauksesta (n = 12). Solujen proliferaatio mitattiin absorbanssi (optinen tiheys, OD) 450 nm aallonpituuksilla. Tuloksemme osoittivat, että yli-ilmentyminen miR-124 inhiboi merkittävästi LNCaP soluproliferaatiota 48, 72 ja 96 tuntia, vastaavasti (kuvio. 3A).

(A) LNCaP-ohjaus solujen ja LNCaP-miR-124-soluja siirretään 96 kuoppiin ja tutkittiin 48, 72, 96 tuntia käyttäen CCK8 määritystä. Solujen lisäkasvua tutkittiin arvon OD. Data näytetään keskiarvoina ± SEM (n = 12). Ryhmä data (B) ja edustavat kuvat (C, D) on esitetty. (B) määrä vaeltavien solujen määrä kenttää kohden LNCaP-ohjaus solujen ja LNCaP-miR-124 soluja. Edustavia mikrovalokuvia havainnollistaa migraation LNCaP-ohjaus soluja (C) ja LNCaP-miR-124-solut (D). Viisi nude hiirtä per ryhmä injektoitiin ihonalaisesti 4×10

6 LNCaP-ohjaus soluja tai LNCaP-miR-124 soluja. (E) määrä ksenograftikasvaimissa mitattiin 10 päivän välein 2 viikon kuluttua inokulaation. (F) Kasvaimen painot mitattiin aikaan uhrin 34 päivää sen jälkeen, kun kasvainsolujen injektion jälkeen. (G) Kasvaimet irrotettiin aikaan uhrin 34 päivää post tuumorisoluinjektion. Data esitetään keskiarvoina ± SEM. Tähdet osoittavat P 0,05, kaksinkertainen Tähdet osoittavat P 0,001.

Lisäksi olemme onko yli-ilmentymisen miR-124 estää PCa solujen vaeltamiseen, Transvvell- kammiot käytettiin arvioimaan muuttavia vaikutuksia LNCaP- kontrollisoluja ja LNCaP-miR-124-soluja. Transvvell- määritykset osoittivat, että yli-ilmentyminen miR-124 suppressoi merkitsevästi migraation LNCaP-soluja (Fig. 3B, C, D). Havainto, että miR-124 estää LNCaP proliferaatio ja migraatio sai meidät onko miR-124 yliekspressio voi estää ksenograftin kasvaimen kasvua LNCaP

in vivo

. Voit vastata tähän kysymykseen, nude-hiiriin istutettiin ihonalaisesti LNCaP-ohjaus soluja tai LNCaP-miR-124 soluja. Huomasimme, että molemmat ryhmät hiiriä osoitti kouraantuntuva ksenograftikasvaimissa 14. päivänä istuttamisen jälkeen. Kuitenkin kasvainten koon olivat merkittävästi pienempiä LNCaP-miR-124 ksenografteissa verrattuna LNCaP-ohjaus ksenografteissa jälkeen 24 päivää (kuvio. 3E, G). Lisäksi olemme havainneet, että paino kasvainten olivat huomattavasti kevyempiä LNCaP-miR-124 ksenografteissa verrattuna LNCaP-ohjaus ksenografteissa aikaan uhrata 34 päivää (Fig. 3F, G). Yhdessä yli-ilmentyminen miR-124 paitsi esti LNCaP-solujen lisääntymisen ja muuttoliike

in vitro

mutta myös merkittävästi tukahdutti kasvua ksenograftikasvaimissa

in vivo

.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme esittäneet todisteita siitä, että miR-124 on androgeeni /AR reagoiva geenin ja yli-ilmentyminen miR-124 inhiboi AR ilmaisun ja tukahduttaa PCa solujen jakaantumiseen, kulkeutumiseen ja ksenografti- kasvaimen kasvua. Nämä tulokset viittaavat negatiivinen kierre välillä AR ja miR-124 ilmaisua, ja miR-124 voi olla lupaava terapeuttinen kohde PCA.

Androgeenien /AR signalointi on erittäin tärkeää puhkeamisessa ja etenemisessä eturauhasen syövän synnyn [ ,,,0],24, 25]. Ei vain steroidihormonien vaan myös steroidiset yhdisteet voivat aktivoida AR signalointi [26]. Sitä paitsi ”hormoni-tulenkestävien eturauhassyöpä”, AR signalointi voidaan aktivoida kaikki samat [27]. Lyhyesti, androgeenien /AR signalointi, AR on entistä merkittävämmässä roolissa kuin androgen. Siksi ensinnäkin suoritimme AR yli-ilmentymisen ja knockdown kokeita tarkistaakseen, AR signalointi voi vaikuttaa ilmaus miR-124. Olemme havainneet, että ilmentyminen miR-124 korreloivat positiivisesti AR. Toiseksi hoito LNCaP-solujen DHT indusoi lisääntyneen ekspression miR-124. Siksi AR säätelee positiivisesti ilmentymisen miR-124. On huomattava, että meidän tulokset eivät ole yhdenmukaisia ​​aiemman raportin, jossa androgeeni analoginen R1881 käytettiin eikä säännellä miR-124 [8]. Yksi selitys tälle ero saattaa johtua eri tutkimusmenetelmiä. Lisätutkimuksia tarvitaan selvittämään ristiriitaisia ​​tuloksia.

Negatiivinen palaute silmukka että me havaittu miR-124 ja AR ilme voi olla rooli kehitettäessä kastraation vastustuskykyisten PCa (CRPC). Kuten tiedämme, androgeenien puute hoitoa, joka poistaa kiertävän androgeenien tai estää AR on tavanomaista hoitoa hoito eturauhasen syövän hoitoon. Huolimatta alustava tehokas hoitovaste, lähes kaikki potilaat väistämättä kehittyä CRPC. Vaikka on ollut paljon tutkimusta tehnyt, mekanismi on vielä epäselvä. Tulokset osoittavat androgeenireseptorin /AR-signalointi voi vaikuttaa myönteisesti ilmentymisen miR-124, mutta jälkimmäinen estää ilmentymisen entisen. Me spekuloida, että normaalissa eturauhasessa solussa, AR ja miR-124 ilmaisuja ovat tasapaino ehdotettua jotka esiintyvät välillä proto-onkogeenien ja tuumorisuppressoreita [28]. Jos AR signalointi on aktivoitu, ilmaus alas-stream miR-124 olisi korkea, ja kääntäen estää AR signalointi. Kuitenkin tasapaino häiriintyy PCA, joka on, AR signalointi voidaan edelleen tehostaa, jos ilmaus miR-124 on alhainen [8].

Koska metylaatio on rooli säätelyssä geeni lauseke, tässä tutkimuksessa on tutkinut ilmentymistä miR-124 liittyi sen metylaatiostatuksen. Kypsän sekvenssin miR-124 on kolme esiaste variantteja, miR-124-1, miR-124-2 ja miR-124-3, jotka kaikki analysoitiin metylaatiostatuksen meidän tutkimuksissa. Lisäksi miR-124-1, promoottorialueet miR-124-2 ja miR-124-3 ovat erittäin metyloitu AR-negatiivinen PCa soluja kuin AR-positiivisia PCa solut (Fig. 2). Kun ekspressio miR-124 tutkitaan PCa-soluissa, se ei ole esitetty yhdenmukaisuus metylaatiostatuksen Eturauhassyövän soluja (S1 kuvio.). Tämä discordancy voidaan selittää hiljattain uusi teoria viittaa siihen, että DNA: n metylaatio ei vakaasti sammuta geeniekspressiota vaan toimii molekulaarinen merkkiaine pitkän aikavälin huolto geenin hiljentäminen [11]. Johtuen DNA: n metylaatio merkitsee enemmän kemiallisesti ja biologisesti stabiili lähde molekyylidiagnoositekniikoiden tietoa kuin RNA: ta tai useimmat proteiinit [29], sillä on suuret mahdollisuudet olla hyödyllinen informatiivinen biomarkkereiden syövän seulonnan [12, 13]. Tältä osin tulokset viittaavat siihen, että poikkeava hypermetylaatiota miR-124-2 ja miR-124-3 voidaan antaa hyödyllinen biomarkkeri AR-negatiivisten PCa soluissa.

On syytä huomauttaa kuitenkin yliekspressio asennuspalveli- 124 voi estää PCa karsinogeenisia prosessi

in vitro

ja

in vivo

The knockdovvn miR-124 LNCaP-soluissa ei muuta karsinogeeninen tila (tuloksia ei ole esitetty). Yksi selitys voisi olla, että kypsät sekvenssit miR-124 on kolme esiaste variantit sekvenssit, ja on vaikea syvästi downregulate ilmaisua. Kuitenkin tarvitaan lisätutkimuksia selventämään tätä kysymystä.

Yhteenvetona tuloksemme tarjota uusia oivalluksia säätelevä mekanismi tuumorisuppressorin miR-124 ja eri metylaatiostatuksen miR-124 variantteja voitaisiin käyttää mahdollisesti hyödyllinen biomarkkereiden PCA soluja.

tukeminen Information

S1 Kuva. Expression of MiR-124 PCA soluissa.

Suhteellinen ilmentyminen miR-124 PCA solulinjoissa määritettiin qRT-PCR ja korjattuna RUN44 tasolle. Arvot tarkoittavat taitettava muutoksista normalisoitu LNCaP. Data näytetään välineet ± 3 eri kokeesta, joista kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0116197.s001

(DOC) B

Tiedoksi

tutkimus tukee varoja WQ Gao Kiinan Ministry of Science and Technology (2012CB966800, 2013CB945600 ja 2012CB967900), National Natural Science Foundation of China (81130038 ja 81372189), Science and Technology komission Shanghai kunta (Pujiang ohjelma), Shanghai Koulutuskomitea Key Kuri ja Specialty Foundation (J50208), Key Kuri ja Specialty Foundation Shanghai Health Bureau ja KC Wong perusta, ja M Chu Shanghaista Postdoctoral Scientific Program of China (12R21415100).