Krooninen sairaus

tiivistelmä

Nuclear tekijä (NF) -κB signalointi tarvitaan keuhkojen adenokarsinooma kehityksen hiirissä, ja sen molempien alayksiköt

Rel

A ja

Rel

B oli itsenäisesti raportoitu olevan erittäin ilmaistaan ​​ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Kokonaisvaltaisesti tutkia NF-KB ilmaisun NSCLC, analysoimme leikesarjojen Primaarikasvaimen näytteitä 77 hyvin dokumentoitu potilailla (36 adenokarsinoomat, 40 levyepiteelikarsinoomien ja 3 suurta solukarsinoomat) varten immunoreaktiivisuus

Rel

A,

Rel

B, P50, ja P52 /P100. Kasvain ja kasvaimensisäistä strooman alueet syrjitty perustuvat proliferoivan solun tuma-antigeeni immunoreaktiivisuus ja tulehdussairauksien tunkeutuminen arvioitiin kasvaimensisäisenä strooman alueilla. NF-KB immunoreaktiivisuus kvantifioitiin intensiteetti, laajuus, ja ydinvoiman lokalisointi ja oli rajat tutkittiin kasvainsoluproliferaation, tulehduksellinen tunkeutuminen, ja kliinisen patologisen data. Huomasimme, että ilmaisun eri NF-KB-alayksiköiden ollut yhdenmukaisia, jotka oikeuttavat meidän olennainen lähestymistapa. Kaiken

Rel

A,

Rel

B, ja P50 ilmaistiin korkeammalla tasolla verrattuna P52 /P100. Kuitenkin

Rel

A ja P50 olivat pääasiassa ilmaistu kasvaimensisäisiä strooman, mutta

Rel

B kasvainsoluissa. Tärkeää on, kasvaimen alueella

Rel

ilmentyminen korreloi intensiteetti tulehduksellisten tunkeutumisen, kun taas

Rel

B ilmentyminen todettiin lisääntyvissä kasvainsoluissa. Useiden logistinen regressio, tunnistimme, että kasvaimen

Rel

B ilme oli itsenäinen ennustaja imusolmuke etäpesäke, ja kasvaimen P50 oli itsenäinen ennustaja TNM6 vaiheen IIB tai suurempi, kun taas kasvain

Rel

A oli itsenäinen ennustaja tulehduksellisten tunkeutumisen. Olemme päätellä, että patologinen tutkimukset NF-KB ilmentyminen syövässä tulisi sisältää useita reitin osia. Hyödyntämällä tällainen lähestymistapa tunnistimme kiehtova assosiaatioita erillisten NF-KB alayksiköt ja kliinisen ja patologisen piirteitä NSCLC.

Citation: Giopanou I, Lilis I Papaleonidopoulos V, Marazioti A, Spella M, Vreka M, et al. (2015) Kattava arviointi Nuclear Factor-κΒ Expression Patterns in ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 10 (7): e0132527. doi: 10,1371 /journal.pone.0132527

Editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 03 maaliskuu 2015; Hyväksytty: 15 Kesäkuu 2015; Julkaistu: 06 heinäkuu 2015

Copyright: © 2015 Giopanou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Tietopaketti.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Euroopan tutkimusneuvoston 2010 Starting Independent tutkija Grant (lupanumeroon # 260524 GTS; https://erc.europa.eu/KRAS-mutaatio-vuorovaikutukset-isäntä-immuniteetti pahanlaatuisia-keuhkopussin-effuusio). Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yksi yleisimmistä ihmisen syöpien ja johtava syövän tappaja maailmanlaajuisesti [1]. Keuhkosyöpä koostuu kahdesta histologisen tyyppiä, pienisoluinen keuhkosyöpä ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), joista jälkimmäinen toi yli 80% uusista tapauksista [2]. NSCLC edustaa histologisesti monipuolinen joukko kasvaimia, jotka eritellään osaksi adenokarsinoomat, okasolukarsinoomia, ja suuri solukarsinoomat osuus 40, 30, ja 10% uusista NSCLC tapauksissa vastaavasti [2]. Adenokarsinooma on hallitseva NSCLC alatyypin nousevalla esiintyvyys [3].

nisäkkään ydin- tekijä (NF) -κB reitin koostuu pääosin

Rel

A, C-

Rel

,

Rel

B, NF-κB1 (P105 /P50), ja NF-κB2 (P100 /P52) [4]. Nämä kaikkialla läsnä proteiinit muodostavat homo- tai heterodimeerejä, jotka sijaitsevat sytoplasmassa inaktiivisessa muodossa, sitoutuu estävä proteiinien, joiden tiedetään inhibiittoreina NF-KB: n (ΙκΒ). Stimuloituessaan, IKB läpi fosforylaatio useiden IKB-kinaasit (IKK, α, β, γ, ε, ja muut), sekä ubikinaation ja proteolyyttisen hajoamista proteasomista ja muiden proteaasien, vapauttamaan aktiivinen NF-KB-alayksiköiden varten tumaansiirtymiseen ja aktivoitumista kohdegeenin transkription [5, 6]. On olemassa kaksi pääasiallista NF-KB aktivaatioteillä, kanoninen (tai klassinen) ja ei-kanoninen (tai vaihtoehtoisia), jotka välittävät

Rel

A /P50 tai C-

Rel Twitter /P50 ja

Rel

B /P52 dimeerejä, vastaavasti [4-7]. Viime aikoina muita mekanismeja NF-KB: n aktivaation paljastettiin, mukaan lukien, mutta ei rajoittuen indusoitavissa käsittely P100 ja P52 säädellään IKKα homodimeerejä, mikä lisää entisestään monimutkaisuutta järjestelmää [8]. Kanoninen ja /tai vaihtoehtoisten NF-KB: n aktivoituminen tapahtuu sen jälkeen, kun solujen stimulaation sytokiinien, bakteereita tai viruksia, endotoksiinien, oksidatiivisen stressin, säteilytys, jne, ja ne voivat johtaa solujen erilaistumisen, proliferaation, apoptoosin inhibitio, ja /tai tulehduksellisten signaloinnin [9] .

NF-KB: n aktivaation on havaittu useissa ihmisen syövissä, mukaan lukien, mutta ei rajoittuen lymfooma, peräsuolen kasvaimia, ruokatorven ja pään ja kaulan alueen syöpä, rintasyöpä kasvaimia, maksasyövän ja eturauhassyövän [10-16] . Kuitenkin tutkimukset ovat keskittyneet lähes yksinomaan kanoninen NF-KB-reitin, kun taas rooli vaihtoehtoisten NF-KB signalointi kasvaimen edistämisen ja etenemisen epäselviä [17-19]. Ihmisen NSCLC, kasvava ydinvoiman

Rel

immunoreaktiivisuus on kuvattu etenevä sairaus [20]. Canonical NF-KB signalointi on myös todettu olevan ensiarvoisen keuhko- kasvainten muodostumista hiirimalleissa NSCLC aiheuttamien onkogeeninen

KRAS

G12D

ja /tai menetys tuumorisuppressoreilla

Trp53

ja

Gprc5a

, tupakansavun altistumisen, ja tupakka karsinogeeni uretaani [21-25]. Kuitenkin muut tutkimukset osoittavat, että konstitutiivinen tai kasvaimen mikroympäristössä aiheuttama NF-KB-aktivaation in NSCLC on monimutkaisempi ja lepää yli yhden jakson [26-28].

Täällä esitetyt testata tämän käyttämällä laajat analyysit useiden NF-KB alayksikköä ilmentymistä 77 hyvin dokumentoitu potilailla, joilla on NSCLC. Tätä varten olemme kehittäneet semikvantitatiivinen NF-KB-alayksikön pisteytysjärjestelmää, jossa otetaan huomioon sekä ekspressiotasoja sekä ydinvoiman lokalisointi. Olemme johdonmukaisesti havaittu selvä NF-KB alayksikköä ekspressiokuvioita kasvainsoluissa verrattuna kasvaimensisäisenä strooman ja löytänyt mielenkiintoisia suhteita näiden kuvioiden ja kliinisen patologisen piirteitä ihmisen NSCLC. Lopuksi kertasi jotkin näistä havainnoista kahdessa eri hiirimalleissa NSCLC, mikä osoittaa, että erilaiset NF-KB kuviot ovat todellakin leikkiä NSCLC ja voi olla eri toimintoja.

Materiaalit ja menetelmät

potilaat

Seitsemänkymmentä seitsemän arkistointia formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut diagnostisia kudosnäytteistä sairastavien potilaiden NSCLC että tehtiin kirurginen resektio kanssa parantava tarkoitus vuosina 2001 ja 2008 yliopistollisen sairaalan Patraksen oli jälkikäteen kirjoilla tutkimuksessa. Jotkut näistä potilaista oli myös tutkittu aikaisemmassa raportin meidän Institution [28]. Potilaat, kaikki valkoihoinen, 69 miestä ja 8 naista vuotiaiden 46-84 vuotta, oli huolellisesti valittu perustuvat saatavuuteen täydellisen kliinisen ja patologisen poimittuja ensisijaisen patologiaraporteista ja potilaiden tiedostoja, kuten ikä, sukupuoli, histologinen tyyppi, luokka , ja yksityiskohtainen patologinen vaiheessa. Potilaat valitut 34 potilasta, joilla keuhkojen adenokarsinooman, 40 kanssa okasolukarsinoomia, ja kolme suurta solukarsinoomat. Kaikki potilaat olivat lavastettuja mukaan kuudes painos TNM luokituksen NSCLC, nykyinen aikaan niiden diagnosointi [29]. Tutkimuksen havaintojen protokolla suoritettiin mukaan Helsingin julistuksen, hyväksyttiin eettisen komitean yliopistollisen sairaalan Patras, Kreikka, ja kaikki potilaat antoivat kirjallisen tietoisen suostumuksensa.

Hiiret

Kokeet hyväksyttiin a priori eläinlääkintäviranomaiset hallinto Länsi-Kreikka (Protocol Number: 276134/14873/2) ja tehtiin mukaan direktiivin 2010/63 /EU (https://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do ? uri = OJ: L: 2010: 276: 0033: 0079: EN: PDF). Sillä KRAS-odotuksiin keuhko- kasvainten synnyssä,

C57BL Twitter /6 hiirillä heterotsygoottinen loxP-STOP-loxP.

KRAS

G12D siirtogeenin käytettiin, jotka ilmaisevat KRAS millään somaattisten solujen upon CRE-välitteisen rekombinaatio (jäljempänä

LSK

hiirillä; Jackson Laboratories, Bar Harbor, MN) [22]. Keuhkojen kasvain induktio,

LSK

hiiret saivat adenovirusyhdistelmävektoreita koodaavat CRE rekombinaasia (Ad-

Cre

, Baylor College of Medicine, Cell ja Gene Therapy Center, Vector Development Lab, Houston, TX) henkitorveen (5×10

8 plakkia muodostavaa yksikköä 50 ul: ssa fosfaatilla puskuroitua fysiologista suolaliuosta) ja tapettiin neljän kuukauden jälkeen [30]. Kemiallisten aiheuttaman keuhkotulehduksen tuumorigeneesiä,

FVB

hiiriä (Jackson Laboratories, Bar Harbor, MN) sai tupakan karsinogeeni uretaani intraperitoneaalisesti (1 g /kg 100 ul: ssa fosfaattipuskuroitua suolaliuosta) ja tapettiin 6 kuukautta [21 , 31]. Hiiren keuhkot poistettiin veri 20 ml sydämensisäistä suolaliuosta infuusiona, olivat liian suuret 10% neutraaliksi puskuroidulla formaliinilla käyttäen 20 cmH

2O paine, fiksoitiin% neutraaliksi puskuroituun formaliiniin, ja upotettiin parafiiniin.

immunohistokemia

Ihmisen ja hiiren kudospaloista leikattiin 4 um: n paksuisia leikkeitä, jotka myöhemmin deparaffinised etanolilla kaltevuus, vedettömät, ja keitettiin lämmön epitooppisup- antigeenin haku-liuosta (0,1 M natriumsitraattia, pH = 6,0 ). Endogeeninen peroksidaasi aktiivisuus estyi käyttämällä 3% H

2O

2 ja ei-spesifinen vasta-aine-proteiini-sitoutumisen esti käyttäen 3% naudan seerumin albumiinia sisältävään Tris-puskuroitua suolaliuosta. Seuraavat ensisijainen vasta-aineet ja laimennoksia käytettiin yön yli 4 ° C: anti-P50 (sc-114 kanin polyklonaalista IgG, 1/150; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti P100 /P52 (ab31409 kanin polyklonaalinen IgG; 1 /150; Abcam, Cambridge, UK), anti-

Rel

A (sc-8008 hiiren monoklonaalinen IgG, 1/200, Santa Cruz), anti-

Rel

B (sc-226 kanin polyklonaalinen IgG, 1/400, Santa Cruz), ja anti-jakautuviin solun tuma-antigeenin (PCNA; ab2426 kanin polyklonaalinen IgG; 1/2000, Abcam). Havaitseminen primaaristen vasta-aineiden suoritettiin käyttämällä piparjuuriperoksidaasiin konjugoidun polymeerin mukaan valmistajan ohjeiden (EnVision, Dako, Glostrup, Tanska) ja diaminobentsidiiniä kromogeeninen substraatti. Osiot vastavärjättiin Harrisin hematoksyliinillä, kuivattu, ja sitten asennetaan. Isotyypin valvontaa, primaarisen vasta-aineen jätettiin pois. Normaali nielurisojen kudosta käytettiin positiivisena kontrollina. Kaikki vasta-aineet validoitu immunohistokemiallisesti ilman sarjalaimennoksia alkaen 1/100 (lukuun ottamatta PCNA jossa laimennoksia alkoi 1/1000) ja eri naudan seerumialbumiinia pitoisuudet Tris-puskuroitu suolaliuos seuraavat tai muuttamiseksi valmistajan ohjeita, jotta maksimoidaan signaalin tausta-suhde. Immunoreaktiivisuus tekee kolme sokko tapauksessa tutkijat (I. G., H. P., ja G.T.S.) joista yksi Hellenic board-sertifioitu patologi (H. P.) ja konsensuksen haettiin epäselvä tapauksissa co-havainto. PCNA immunoreaktiivisuus määritettiin positiivisten solujen prosenttiosuuden kasvaimen alueilla käytettiin erottamaan nämä (suuri prosenttiosuus immunoreaktiivisten solujen) sisäisistä kasvaimen stroman alueilla (pieni osa immunoreaktiivisia soluja). Osiot laskettiin suurella teholla (X400), ja 5-8 kentät arvioitiin satunnaisesti kasvainsolujen ja kasvaimensisäistä strooman alueilla, vastaavasti. Tuhat solujen tumat laskettiin vastaavasti, ja solujen lukumäärä positiivisia tuman värjäytymisen kirjattiin. NF-κΒ alayksikköä immunoreaktiivisuus pisteytettiin seuraavasti: intensiteetti (0: negatiivinen, 1: heikko, 2: kohtalainen, ja 3: voimakas), laajuus (0: 10% soluista positiivisia; 1: 10-35% of solut positiivisia; 2: 35-70% soluista positiivisia, ja 3: 70% soluista positiivisia), ja jakelu (0: negatiivinen; 1: sytoplasminen vain; 2: soluliman ja ydin- sekä 3: ydin- pelkästään) immunoreaktiivisuus pisteytettiin erikseen kullekin NF-κΒ alayksikön näytteen yleistä, sekä erikseen kasvainsoluja ja kasvaimeen strooman kunkin kasvaimen, ja yhdistettiin alayksikön erityisiä yleistä, kasvain, ja strooman tulokset käyttäen kaavaa: NF-κΒ alayksikköä pisteet = (intensiteetti + määrin) * jakeluun. NF-κΒ alayksikköä pistemäärät edelleen luokiteltu alhainen (0-4), keskitason (5-6), ja korkea (7-18). Tulehduksellisten infiltraattien määritettiin semi-kvantitatiivisesti käyttäen PCNA-värjätään ja isotyyppikontrolli näytteitä ja määritettiin pieni (alle 5%), kohtalainen (5-20%), ja korkea ( 20%) riippuen prosenttiosuus leukosyyttien kasvaimensisäistä strooman alueilla. Jälkimmäinen tunnistettiin morfologia ja puute immunoreaktiivisuus PCNA. Kuvat otettiin käyttäen pystyssä Axio Lab.A1 mikroskooppi kytketty AxioCam ERC 5s kamera (Zeiss, Jena, Saksa). Immunofluoresenssi-, kudoksen leikkeitä inkuboitiin samanaikaisesti anti-PCNA (joko ab2426 kanin polyklonaalinen IgG; 1/100 laimennos, Abcam varten collocalization kanssa

Rel

A tai sc-56 hiiren monoklonaalista IgG, 1/100 laimennus; Santa Cruz collocalization kanssa

Rel

B) ja joko anti

Rel

A (sc-8008 hiiren monoklonaalinen IgG, 1/100 laimennos, Santa Cruz) tai anti

Rel

B (sc-226 kanin polyklonaalista IgG, 1/100 laimennos, Santa Cruz) vasta-aineita, mitä seuraa ydinvoiman counterstaining Hoechst 33258 (Molecular Probes, Eugene, OR). Havaitseminen primaaristen vasta-aineiden suoritettiin käyttäen aasin anti-kani-Alexa568-konjugoitu (A10042, 1/500 laimennus; Invitrogen, Carlsbad, CA) ja aasin anti-hiiri-Alexa488-konjugoitu (A21202, 1/500 laimennus; Invitrogen, Carlsbad, CA) sekundäärisiä vasta-aineita. Sillä isotyyppikontrolleja, jompikumpi tai molemmat ensisijainen aineet jätettiin pois. Immunoreaktiivisuus taltioinut Zeiss Axio Observer.D1 käänteismikroskooppi kytketty AxioCam MRc 5 kamera (Zeiss, Jena, Saksa) ja annettiin samanaikaisesti rekisteröity käyttäen Fiji akateemisen kuvantamisen freeware (https://fiji.sc/Fiji).

tilastot

todennäköisyys arvot (

P

) alle 0,05 pidettiin merkittävinä. Ihmisen NF-κΒ alayksikköä tulokset eivät normaalisti jakautunut, kuten testattu Kolmogorov-Smirnov testi (

P

0,05), ja ne esitetään pylväsnäyttönä mediaani laatikoita osoittaa kvartiiliväli ja viikset osoittaa 95% prosenttipisteet. Hyväksytty numeerinen NF-κΒ alayksikköä tulokset saman kasvaimia verrattiin käyttämällä Friedmanin testejä seurasi Dunnin post-testeissä. Kategorisia NF-κΒ alayksikköä tulokset verrattiin käyttämällä χ

2 testiä, jota seuraa Fisherin tarkka testejä. Korrelaatioita numeerinen NF-κΒ alayksikön tulokset ja kliinisen patologisen data tehtiin käyttäen Spearmanin testejä, jolloin yleinen kynnys tilastollisen merkitsevyyden (

P

0,05), säädettiin kokonaismäärä korrelaatioita tutkittiin (n = 153), jonka Bonferronin menetelmällä

P

0,05 /153 = 0,000327. Vertailut numeeristen NF-κΒ alayksikköä partituureja tulehduksellinen tunkeutumisen aste ja kliinisen patologisen luokkia tehtiin käyttäen Wilcoxonin testejä tai Kruskal-Wallisin kokeista seuraa Dunnin post-testit, kaksi tai useampia vertailu ryhmiä, vastaavasti. Sen määrittämiseksi, onko numeerinen NF-κΒ alayksikköä tulokset itsenäisesti ennustaa kliinisen patologisen muuttujia, jälkimmäinen oli kaksijakoinen niiden mediaani ja binary logistinen regressio analyysit tehtiin käyttäen taaksepäin Waldman menetelmällä. Tätä NF-κΒ alayksikön tulokset käytettiin tulo (riippumattomat muuttujat) ja kliinisen patologisen muuttujat ja tulehduksellinen tunkeutumisen tulokset kuin lähtö (riippuvat muuttujat). Hiiren NF-κΒ alayksikön tulokset on asteittain syövän esitetään keskiarvona ± SD ja verrattiin käyttäen kaksisuuntaista ANOVA seurasi Bonferronin post-testejä. Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen Prism v5.0.0 (GraphPad, San Diego, CA) ja tilasto-paketti Social Sciences v20 (IBM SPSS Statistics, Chicago, IL, USA).

Tulokset

NF-κΒ alayksikköä ekspressiokuvioita NSCLC

kliiniset ja patologisen piirteitä tutkimuksen potilaita on koottu taulukkoon 1. raaka tutkimustulokset ovat liitteenä tämän artikkelin S1 Taulukko. Ensin tutkittiin NF-κΒ alayksikköä ilmentymistä normaalissa keuhkojen alueilla lähellä meidän kirurgisesti resekoituun kasvainnäytteestä. Keuhkoputkien ja keuhkorakkuloiden epiteelin,

Rel

A, P50 ja P100 /P52 osoittautunut alhaiseksi tai kohtalainen soluliman immunoreaktiivisuus, kun taas

Rel

B näkyy korkeampia ekspressiotasoja. In Juxta kasvaimen keuhkoputken ja keuhkorakkuloiden hyperplasia, immunoreaktiivisuus kaikille NF-KB alayksiköiden osoitti vahvempi ilme kuvio, jossa

Rel

B osoittaa sekä sytoplasman ja ydinvoiman lokalisointi. Kasvaimissa, kaikki NF-KB alayksiköt olivat erittäin ilmaistu suhteessa normaaliin ja hyperplastic alueilla, joissa

Rel

B pisteytys korkein ja osoittaa mahdollisimman suurta tumaanohjaussignaali. Kuitenkin

Rel

A,

Rel

B, ja P50 immunoreaktiivisuus vahvempi verrattuna P100 /P52 (kuvio 1A ja 1B). Kun NF-KB-alayksikön pisteet jaettiin edelleen alhainen (0-4), keskitason (5-6), tai korkea (7-18), ei suhdetta näkyi eri alayksiköiden (kuvio 1 C). Tilastollisesti merkitseviä eroja ei havaittu eri NSCLC histologiset alatyyppejä. Kuitenkin tilastollisesti merkitseviä eroja havaittiin NF-KB alayksikköä ekspressiotasot kunkin kasvain: kasvain alueet näkyvät eri ilmaisua malleja verrattuna kasvaimensisäisenä stroman alueilla (kuvio 1A, edustaja paneelit punainen kehys). Nämä tulokset viittaavat siihen useita NF-κΒ alayksikköä asteittain yliekspressoituvat NSCLC osoitti, etteivät kaikki NF-κΒ alayksiköt ilmentyvät yhtäläisesti, ja havaitsi ristiriita ilmaus useiden NF-κΒ alayksiköiden välillä kasvain ja kasvaimeen strooman alueilla, jotka oikeuttavat lisätutkimuksia .

(A) kuvat ovat. Kuvaa punaisena kehyksissä edustavasti näyttää ero NF-KB alayksikköä ilmentyminen kasvaimen ja kasvaimensisäisenä strooman alueilla. (B) Yleinen pisteytystä NF-KB: n alayksikköä ekspressiotasot. Tiedot esitetään mediaani laatikoita osoittaa kvartiiliväli ja viikset osoittaa 95% persentiilit. ns, * ja ***: P 0,05, P 0,05, ja P 0,001 merkitty vertailuja Friedmanin testi seuraa Dunnin post-testeissä. (C) Co-ilmentyminen matriisien kategorisen NF-KB alayksikköä ekspressiotasot. Tätä varten NF-KB pisteiden (B) on luokiteltu alhainen (0-4), keskitason (5-6), ja korkea (7-18). ns: P 0,05 χ

2 testiä, jota seuraa Fisherin tarkka testejä.

Differential NF-κΒ ilmentyminen kasvaimen ja strooman osastoissa NSCLC

Tämän tutkimiseksi tarkemmin kaikki näytteet värjättiin PCNA, joka selvästi kasvaimen alueita (korkea runsaasti PCNA + solut) päässä kasvaimensisäisenä stroman osaston (hyvin vähäisessä määrin PCNA + soluja), ja NF-KB-alayksikön pisteytys toistettiin erikseen näiden kahden alan leikesarjojen kaikkien potilaiden (kuvio 2A). Nämä analyysit paljastivat, että

Rel

B oli alayksikkö ilmaistuna vahvin alueilla kasvainsolujen näyttämään sekä ydin- ja sytoplasman ilme kuvio. Toisaalta, jäljellä oleva alayksiköt tutkittu osoitti vain kohtalaista sytoplasmista ekspressiota kasvaimen alueilla (kuvio 2A ja 2B). Kun kasvain lokero NF-KB-alayksikön pisteet jaettiin edelleen alhainen (0-4), keskitason (5-6), tai korkea (7-18) ja verrataan kunkin kasvain,

Rel

B ja P50 osoittivat merkittäviä eripuraisuus, kasvaimia vahvojen

Rel

B immunoreaktiivisuus näytteille alhainen P50 tulokset (kuvio 2C). Yllättäen arviointi yksinomaan kasvaimeen strooman tuotti erilaisia ​​tuloksia: tässä,

Rel

A ja P50 alayksiköt eniten ekspressoituu pääasiassa ytimet stroomasoluissa. Täydellisenä vastakohtana

Rel

B ja P100 /P52 osoitti vain heikkoa sytoplasman immunoreaktiivisuus (kuvio 2A ja 2D). Kun strooman NF-KB-alayksikön pisteet jaettiin edelleen alhainen (0-4), keskitason (5-6), tai korkea (7-18) ja verrataan kunkin kasvain,

Rel

B ja P100 /P52 osoitti merkittävää vastaavuutta, jossa 49/77 kasvaimia näyttämällä samanaikaisesti pienellä tasoituksella molempien alayksiköiden, todennäköisesti heijastaa alhainen ekspressiotasot molemmat proteiinit (kuvio 2E). Olemme vihdoin tutkitaan suhteita numeerisen ja kategorinen kasvain ja strooman pistemäärät kullekin NF-KB-alayksikön, todetaan, että vain P100 /P52 ilmentymistä kasvain ja siihen liittyvä strooman olivat yhtäpitäviä ja korreloivat (kuvio 2F ja 2G).

(A) kuvat ovat. (B, D), pisteytys NF-KB-alayksikön ekspressiotasot kasvaimen (B) ja strooman (D) alueilla. Tiedot esitetään mediaani laatikoita osoittaa kvartiiliväli ja viikset osoittaa 95% persentiilit. ns ja ***: P 0,05 ja P 0,001 merkitty vertailuja Friedmanin testi seuraa Dunnin post-testeissä. (C, E) Co-ilmentyminen matriisien kategorisen NF-KB alayksikköä ekspressiotasot kasvaimen (C) ja strooman (E) alueilla. Tätä varten NF-KB pisteiden (B) ja (D) on luokiteltu alhainen (0-4), keskitason (5-6), ja korkea (7-18). ns: P 0,05 ja P: todennäköisyys arvot χ

2 testiä, jota seuraa Fisherin tarkka testejä. (F) Co-ilmentyminen matriiseja kasvaimen versus strooman NF-KB alayksikköä ilme. ns: P 0,05 ja P: todennäköisyys arvot χ

2 testiä, jota seuraa Fisherin tarkka testejä. (G) Korrelaatio kasvaimen ja strooman P100 /P52 ilmaisun tulokset. Näkyy ovat datapisteitä, lineaarinen regressio mukaisesti 95%: n luottamusväli, neliö Spearmanin korrelaatiokertoimen, ja todennäköisyys arvo.

Korrelaatio Rel alayksikköä ilmaisutapoja solujen lisääntymistä ja tulehduksellinen tunkeutuminen

Koska NF-KB on mekaanisesti osallinen leviämisen ja tulehduksellinen signalointi keuhkojen kasvainsolujen hiirimalleissa [21-24], pyrimme asteen määrittämiseksi solujen lisääntymisen ja tulehduksellisten tunkeutuminen meidän 77 potilasta NSCLC. Tätä varten sarja leikkeitä altistettiin PCNA Immunovärjäyksen kuten edellä, samanaikaisesti hematoksyliinillä värjäys isotyyppikontrollia kohdissa, ja prosenttiosuus PCNA-positiivisten solujen kasvaimen alueilla arvioitiin mittana solujen lisääntymisen korko. Lisäksi osuus kasvaimen tunkeutumisatmosfäärin PCNA-negatiivinen tulehduksellisten solujen strooman alueilla määritettiin kullekin potilaalle (kuvio 3A). Nämä analyysit tunnistettu, että vaikka ekspressiotasot

Rel

A kasvaimen alueet olivat melko alhaiset, niitä korotettiin kasvainten korkea tulehduksellisten tunkeutumisen (kuvio 3B). Lisäksi, vaikka osuus PCNA-positiivisten solujen ei ollut erilainen eri histologisia alatyyppejä (kuvio 3C), ja siihen ei liittynyt ilmaus tahansa NF-KB-alayksikön (tuloksia ei ole esitetty), kaksi immunofluoresenssi ja

Rel

A tai

Rel

b yhdistettynä PCNA paljasti, että PCNA + jakautuvat solut pääasiallisesti ilmaistaan ​​

Rel

b niiden tumassa (kuvio 3D). Nämä tulokset osoittivat, että kasvain

Rel

ilmentyminen liittyi tulehduksellinen soluttautuminen ja että kasvaimen

Rel

B-ilmentyminen liittyy solujen lisääntymisen kussakin kasvain. Koska

Rel

B ilmentyminen on havaittu olevan säätelevät sekä kanoninen sekä vaihtoehtoisten NF-KB-polkuja, meidän vieressä pyrki tutkimaan mahdollisia korrelaatio

Rel

ilmentyminen kasvaimen tai strooman osastoja, ja

Rel

B ilmentymistä kasvainsoluissa. Kuitenkaan mitään tilastollisesti merkittävää korrelaatiota ei havaittu, kun tiedot arvioitiin joko parametrinen tai ei-parametrinen tavalla, mikä viittaa siihen, että kasvaimen

Rel

A ja

Rel

B ilmaisu tapahtunut riippumattomasti NSCLC.

(A) edustaja kuvia hematoksyliini- värjättyä näytteet osoittavat eriasteisia tulehdussolujen infiltraation stroomamääriin alueilla. (B) NF-KB alayksikköä ilmentymisen tulokset kasvainten vaihtelevalla tulehduksellisten tunkeutumisen. Tiedot esitetään mediaani laatikoita osoittaa kvartiiliväli ja viikset osoittaa 95% persentiilit. ns, ** ja ***: P 0,05, P 0,01, ja P 0,001 merkitty vertailuja Kruskal-Wallisin kokeista seuraa Dunnin post-testeissä. (C) edustavat kuvat PCNA-värjättyä NSCLC alatyyppiä näytteitä. (D) Nuclear kolokalisaation PCNA immunoreaktiivisuus

Rel

B (nuolet), mutta ei

Rel

A, tunnistettiin käyttäen dual immunovärjäyksen näytteitä 10 potilaista (edustaja kuvissa) .

Association of NF-κΒ alayksikköä ilmaisutapoja kliinisen ja patologisen piirteet NSCLC

seuraava tutki NF-KB alayksikköä ilmentyminen kasvaimen ja strooman osastojen korreloi kliinisen ja patologisen ominaisuudet kuin potilailla, joilla on NSCLC. Tämän korrelaatio analyysit tehtiin, joka ei paljastanut mitään merkitseviä (tuloksia ei ole esitetty). NF-KB pisteet jaettiin edelleen kliinisen ja patologisen ominaisuuksia ja alaryhmiä verrattiin (kuvio 4A). Stroomaan pisteet P100 /P52 oli merkitsevästi pienempi hyvin eriytetty kasvaimet, verrattuna alhainen tai kohtalaisen eriytetty niistä. Lisäksi strooman P100 /P52 ilmentyminen väheni potilailla, joilla N2 sairaus, verrattuna potilaisiin ilman imusuonten osallistumista. Muita merkittäviä eroja ei havaittu koskien kasvaimensisäisenä strooman ilmaus muun alayksikön. Kun kasvain alue NF-KB tulokset tutkittiin tällä tavalla,

Rel

A havaittiin ilmentyvän korkeammilla tasoilla miehillä verrattuna naisiin, potilailla Yli 65-vuotiaiden ja nuorempien, ja potilailla, joilla on levyepiteelikarsinooma karsinooma verrattuna adenokarsinooma. Tärkeää on, kasvain P50 tulokset olivat koholla potilailla N2 ja pTNM6 vaiheen III tauti verrattuna potilaisiin ilman imusuonten osallistumista ja vaiheen II tauti, vastaavasti. Lopuksi kasvain P100 /P52 ilmentyminen tilastollisesti merkitsevästi suurempi potilailla, joilla pTNM6 vaiheen II tauti verrattuna potilaisiin, joilla on vaiheen I tauti. Kolmannessa tason tutkimusten kliinisten ja patologisten NSCLC ominaisuuksia on kaksijakoinen niiden mediaani ja kirjattiin huollettavia binary logistinen regressio analyysit, käyttäen kasvaimen ja strooman NF-KB: n tulokset kuin tulo (riippumaton) muuttujat (kuvio 4B). Nämä analyysit paljastivat, että kasvain

Rel

Pistemäärä oli itsenäinen ennustaja iästä 65 vuotta, squamous histologia, ja tulehduksellisten tunkeutumisen. Mielenkiintoista, kasvain ja strooman

Rel

B ilmaisu tunnistettiin positiiviset ja negatiiviset ennustajia solmukohtien osallistuminen, vastaavasti. Lopuksi kasvain P50 pisteet todettiin olevan riippumaton ennustaja huono erilaistumisen ja pTNM6 vaihe II B tai korkeampi. Niinpä erillisiä NF-KB-alayksikön (

Rel

B ja P50, mutta ei

Rel

A) ilmentyminen liittyi edenneen taudin, ja erillisiä NF-KB alayksiköt olivat yhteydessä määriteltyjen ominaisuuksien NSCLC, validointi meidän integroitu lähestymistapa.

(A) NF-KB ekspressiotasot jaettu kliiniset ja patologiset parametrit. Tiedot esitetään mediaani laatikoita osoittaa kvartiiliväli ja viikset osoittaa 95% persentiilit. ns, * ja **: P 0,05, P 0,05, ja P 0,0501 varten osoitetaan vertailuja Wilcoxonin testejä tai Kruskal-Wallisin kokeista seuraa Dunnin post-testit, kaksi tai useampia vertailu ryhmiä, vastaavasti. (B) Tulokset binary logistisen regressioanalyyseissä käyttäen NF-KB alayksikköä ilmentymisen tulokset kuin tulo (riippumattomat muuttujat) ja kahtia kliinisten ja patologisten parametrit tuotoksella (riippuvat muuttujat). RR, riskisuhteita; CI, luottamusvälit; P, todennäköisyys arvot.

NF-κΒ alayksikköä ilmentymistä hiirimalleissa NSCLC

vihdoin pyrki tarkistamaan, onko havaintomme voitaisiin toisteta kahta erilaista hiiren mallia ihmisen NSCLC eli malli uretaani aiheuttama keuhkojen adenooma ja mutanttien

KRAS

indusoiman keuhkojen adenokarsinooma. Analyysit, tehdään kuten ihmisen näytteitä, havaittiin, että

Rel

B yliekspressoitiin uretaani aiheuttama hyperplastic vaurioita, mutta ei adenoomia. Lisäksi

Rel

B yliekspressoitui molemmissa mutantti

KRAS

indusoimaan hyperplastic vaurioita ja adenokarsinoomat (kuvio 5). Nämä löydökset olivat yhdenmukaisia ​​ihmisen tietoja, joiden polttoväli yliekspressio

Rel

B kasvaimen alueilla ihmisen NSCLC (kuvio 2).

NF-KB alayksikköä ilmentyminen arvioitiin immunohistokemia uretaanilla aiheuttaman hiiri keuhko adenoomien (A ja C) ja mutanttien

KRAS

indusoimaan keuhko- adenokarsinoomat (B ja D). (A, B) Kuvat ovat. (C, D) Kaiken pisteytystä NF-KB: n alayksikköä ekspressiotasot neljästä hiirtä ryhmää kohti. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD. ** Ja ***: P 0,01, ja P 0,001 osoitetun värikoodatut alayksikköä verrattuna normaaliin keuhkoputkien ja keuhkorakkuloiden epiteelin kaksisuuntaisella ANOVA seurasi Bonferroni post-testit. Ei-merkitsevä vertailuja ei mainita.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme tunnettu ilmaisun ja solunosasijaintia useita NF-KB alayksiköiden ihmisen NSCLC ja kokeellisissa malleissa tauti. Löysimme eri mallien immunoreaktiivisuus kunkin alayksikön tutkittu, perustellaan meidän integroitu lähestymistapa. Tietyissä,

Rel

B oli hyvin ilmaistu kasvainsoluissa, kun taas

Rel

A ja P50 on stroomasoluissa. Mielenkiintoista, kasvain

Rel

ilmentyminen korreloi tulehduksellinen tunkeutuminen ja kasvaimen

Rel

B-ilmentyminen collocalized proliferoivalla kasvainsolun ytimiä. Nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​binary logistisen regression analyysit paljastivat, että kasvain

Rel

ilme oli itsenäinen ennustaja tulehduksellisten infiltraattien, kun kasvain

Rel

B immunoreaktiivisuus ennustettu kehittyneempää tautien kanssa solmukohtien osallistumista. Lopuksi, tämä malli hallitseva

Rel

B ilmentyminen ihmisen NSCLC oli toisteta hiirimalleissa taudin. Yhdessä tuloksemme osoittavat multimodaalinen NF-KB: NSCLC ja mahdollisesti ehdottaa poikkeavia toimintoja

Rel

A ja

Rel

B ajo parakriinisella induktioon tulehduksen ja solu-autonomiset tai autokriinisen edistäminen soluproliferaation, vastaavasti (kuvio 6).

NF-KB alayksikköä ekspressiotasot kasvain- ja stroomasoluilla 77 potilasta NSCLC on merkitty suhteellinen kirjasinkoko.