Krooninen sairaus

tiivistelmä

Johdanto

Dendriittisoluille avainasemassa aloitteentekijöinä T-soluvasteiden, ja vaikka kasvaimen antigeeni-ladattu dendriittisolujen voi aiheuttaa anti-tuumorivasteita, niiden tehokkuus on kyseenalaistettu, mikä osoittaa tarvetta parantaa immunisaatiostrategioista.

Matherials Menetelmät

keskittyneet luonnehdinta luuytimestä peräisin dendriittisoluja, joille koko kasvaimen lysaatin (TAA-DC), lähteenä tunnettuja ja tuntemattomia antigeenejä, hiirimallissa rintasyövän (MMTV-

Ras

). Dendriittisoluja arvioitiin antigeenin oton ja MHC-luokan I /II ja kostimulatorista molekyyliä, ja merkkiaineita, jotka liittyvät kypsymistä.

Tulokset

Tulokset osoittivat, että antigeenin ladattu dendriittisolujen on ominaista fenotyyppisesti puolikypsä /kypsä profiilin ja vahvistava säätely geenien antigeenin esittelyä ja T-solujen esikäsittely. Aktivoidut dendriittisolut stimuloitujen T-solujen lisääntymistä ja indusoi tuotannon suuria pitoisuuksia IL-12p70 ja IFN-γ mutta vain pieniä määriä IL-10, mikä osoittaa niiden kyky saada aikaan T

H1-immuunivasteen. Lisäksi anto Antigen ladattu-dendriittisoluilla MMTV-

Ras

hiiret herätti voimakasta kasvaimen vastaisen vasteen

in vivo

osoituksena yleinen aktivoituminen immunokompetenttien solujen ja vapauttamaan T

H1 sytokiineja.

Johtopäätös

Data tässä voisi olla hyödyllistä suunnittelussa kasvaimen kasvua estävän DC-pohjainen hoitoja, joka näyttää tietyn aktivointi immuunijärjestelmän rintasyöpää vastaan.

lainaus: Rainone V, Martelli C, Ottobrini L, Biasin M, Borelli M, Lucignani G, et ai. (2016) immunologisia Whole Kasvaimen lysaatti-Loaded dendriittisoluja Cancer immunoterapia. PLoS ONE 11 (1): e0146622. doi: 10,1371 /journal.pone.0146622

Editor: Natalia Lapteva, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 24 syyskuu 2015; Hyväksytty: 18 joulukuu 2015; Julkaistu: 21. 2016

Copyright: © 2016 Rainone et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat PRIN 2008 (Progetti di Rilevante Interesse Nazionale, terveysministeriön, projekti ei. 20082NHWH9_001) saamat MC ja AIRC (Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro; rahoittama hanke nro IG-9311) saamat MC. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Lyhenteet : DC, dendriittisolut; IDC epäkypsä dendriittisoluja; TAA, kasvaimeen liittyvä antigeeni; MMTV, hiiren nisäkasvainviruksen; Ras, ihmisen-Rat sarkooma; GM-CSF, granulosyytti makrofagi-pesäkkeitä stimuloiva tekijä; HSP, lämpösokkiproteiinit; MRI, magneettikuvaus; SPECT, yhden fotonin emission tietokonetomografiaa; BFA, brefeldin A; PMA, forbolimyristaattiasetaatti; Rahalaitos, keskimääräinen fluoresenssin intensiteetti; ICAM-1, solujen välinen adheesiomolekyyli 1; Rac1, Ras liittyvät C3 botuliinitoksiinin substraatti 1; ERAP1, Endoplasmakalvosto aminopeptidaasi 1; TAP2, antigeeni peptiditransportteri 2; TAPBP, TAP liittyvä glykoproteiini tai tapasin; LRP1, low-density-reseptoriin liittyvä proteiini 1; CFS1R, pesäkkeitä stimuloiva tekijä 1-reseptori; CFS2R, pesäkkeitä stimuloiva tekijä 2-reseptori; Tr1, tyypin 1 säätelijä-T-solut; PD1, ohjelmoidun solukuoleman proteiini 1-reseptori; PDL1, ohjelmoitu kuolema-ligandi 1; T

reg, säätelijä-T-solujen

Johdanto

Syöpä immunoterapian pyritään optimaaliseen koostamisen kasvaimen immuunivasteita ja lopullisena tavoitteena on tuhota tuumorisoluja ja houkutella pitkäkestoisen immuniteetin että tulee ehkäistä taudin pahenemiseen [1]. Induktio tehokas kasvainimmuniteetin on monimutkainen prosessi, joka sisältää esitystapa kasvaimeen liittyvien antigeenien (TAA), valinta ja aktivointi TAA-spesifisten T-solujen ja lopuksi ohjautumisen TAA-spesifisten T-solujen kasvaimen ja poistaminen pahanlaatuisia soluja, jotka ilmentävät TAA [2,3,4]. Escape from immuunipuolustus kuitenkin olennainen biologinen ominaisuus maligniteettien joka edistää hallitsematonta kasvaimen kasvua, joka lopulta johtaa kuolemaan isäntä.

Kasvainantigeenit, toisin kuin antigeenit, jotka liittyvät bakteerit ja muut taudinaiheuttajat, ovat itsestään antigeenejä, ja immuunijärjestelmän on usein sietää niitä. Näistä syistä, paljon huomiota on kiinnitetty kehittämiseen immunisaatiostrategioista maksimoida immunostimulatoristen kapasiteetti dendriittisolujen (DC). DC: t ovat perhe ammatillisen antigeenia esittelevien solujen Niillä on keskeinen asema moduloinnissa T-soluvasteiden; nämä solut ovat erittäin tärkeitä suojaa taudinaiheuttajia ja kasvaimen immunologian. Tämän ymmärtäminen on lisännyt perustavaa laatua Translaatiotutkimuksen ymmärtää ja hyödyntää ainutlaatuisia immunomodulaarisia kyky syöpää vastaan ​​[2].

DC rokotteita on osoitettu olevan turvallinen, toteuttamiskelpoisia ja tehokkaita joillakin potilailla, erityisesti, jos DC: itä asianmukaisesti kypsynyt ja aktivoitu [5,6]. Siitä huolimatta, että immunologisia vasteita havaitaan useimmissa tapauksissa, kliiniset vasteet havaitaan vain pienellä osalla potilaista [7]. Useat alussa julkaistut tutkimukset olivat riittämättömiä niiden suunnittelussa ja tulkinta, koska epäkypsä sijaan kypsillä DC käytettiin [8]. Mahdollisuuksia parantaa tehoa DC että immunoterapiassa kasvaimia on harkittava useita eri muuttujia. Täten viimeaikaiset raportit ovat osoittaneet, että verrattuna epäkypsiä DC, kypsillä DC on suurempi kyky synnyttää immuunivasteita ja siirtyä molemmat

in vitro

ja

in vivo

[9]. Muut ominaisuudet näiden solujen, jotka on otettava huomioon, ovat niiden eri osa, modaliteetista antigeenin lastaus, antoreitistä, ja annostusta ja DC: iden viranomaisille. Lopuksi immunisoiva kyky DC

in vivo

kriittisesti vaikuttanut näiden kypsyminen valtion ja kykyä siirtyä kohti imukudosmääriä.

DC: iden suurten voidaan tuottaa

in vitro

kulttuuri monosyyttien tai CD34

+ esisolujen kanssa granulosyyttimakrofagin pesäkkeitä stimuloiva tekijä (GM-CSF) ja interleukiini-4 (IL-4) [10], tai IL-13. DC Tällä tavoin saatu voidaan pohjustetaan kasvaimen antigeenejä optimoimiseksi niiden kyky tuottaa kasvaimen spesifisten T-soluvasteiden. Näin ollen, solut voidaan ladata joko koko kasvainsolujen tai kasvainsolujen lysaattia, kasvaimen antigeeni-fraktiolla, tai vaihtoehtoisesti, jossa kasvaimen antigeenejä. Lähestymistapoja käyttäen koko kasvainsolujen lähteenä antigeenin DC: iden voivat olla erityisen käyttökelpoisia: tällä tavalla koko ohjelmistoon liittyvät antigeenit tiettyyn kasvaimeen voidaan käsitellä. Tämä voisi estää kasvaimen immuunijärjestelmän vuotaa antigeeni-puutteellisten muunnosten tai mutaatioita kriittisessä T-soluepitooppeja [11,12]. Kasvaimen solulysaattia edustaa koko proteiinipitoisuus lysoitiin syöpäsoluja. Etu käyttää kasvaimen lysaatin on se, että useita antigeenejä, jotka voivat herkistää T-solut voidaan heterogeenisesti ilmaistaan ​​kasvava kasvaimia (erityisesti ne, jotka eivät ole molekyylirakennetta määritelty TAA). Lisäksi solustressiä aiheuttama lyyttisten prosessit voivat saada mukautuva mekanismeja, kuten ilmaus lämpösokkiproteiinien (HSP), jotka vapautuvat kuolleet solut jälkeen ensisijaisen tai toissijaisen kuolion [13,14]. HSP: t voivat parantaa tunnustamista ja käyttöönottoa kuolla solujen DC; lisäksi kasvainperäinen antigeeniset peptidit voivat sitoutua HSP: t, ja voidaan kierrättää antigeeniesittelyä erityisen tehokkaalla tavalla [14]. Antigeeni lastaus on todellakin herkkä prosessi, koska se ei saa häiritä MHC luokka I- ja luokka II ja kostimuloivien molekyylien, niin jotta DC tehokkaasti esitellä antigeenejä ja virittävät T-lymfosyytit. Optimaalisesti manipuloitu DC on myös ilmaista vakaa sekä aktivoitu fenotyyppi, ja olisi rikastettu adheesiomolekyylien ja kemokiinireseptoreita, jotta ne homing toissijaiseen imukudoselimiin.

hiiren nisäkasvainviruksen (MMTV) aiheuttaman ihmisen –

Ras

ilmentävät rintasyöpäkohteisiin eläinmalli on erittäin informatiivinen malli ihmisen rintasyöpä. [15]. Niinpä aktivoivat mutaatiot Ras onkogeenin löytyy noin 30% ihmisen maligniteettien ja MMTV-

Ras

hiirillä on luotu sijoittamalla aktivoitu v-Ha-

Ras

valvonnassa MMTV-promoottori [16]. Pahanlaatuinen maitorauhasen ja sylkirauhasen kasvaimet syntyvät joukossa siirtogeenisiä hiiriä välillä 9 ja 20 viikon huipun 12-15 viikon iässä. Olemme aiemmin määritellyt optimaaliset olosuhteet merkitsemiseksi koko kasvain lysaattia ladattu DC MRI ja SPECT kuvausta [17]. Näiden tutkimusten tulokset osoittivat, että nämä menettelyt eivät muuta DC toimintoa ja voidaan seurata

in vivo

kulkeutumista merkitty DC: iden valuu LNS osaksi syöpäkasvaimia sisältävistä MMTV-

Ras

siirtogeenisiä hiiriä.

näiden havaintojen olemme edelleen tunnettu immunologista piirteet koko kasvain lysaatin-pulssi DC suhteen solun fenotyypin, toiminnallisuus ja kyky saada aikaan erityinen anti-kasvain T-soluvasteita

vuonna vitro

käyttäen MMTV-

Ras

siirtogeenisiä hiiriä malli. Lisäksi, joka on

in vivo

tutkimus suoritettiin ruiskuttamalla antigeeni ladattu DC samaan hiirimallissa, ja immuunijärjestelmän profiilin ja kasvaimen puhkeamista arvioitiin.

Data tässä raportoitu pystyvät tukemaan DC -välitteisen aktivaation immuunijärjestelmän kasvain, joka esittää osittain kypsän profiili dendriittisolujen ja T

H1 fenotyypin T-soluja, jotka kykenevät merkittävästi viivyttää kasvaimen kasvua.

Materiaalit ja menetelmät

Eläimet

tutkimus hyväksyttiin Italian terveysministeriön (tutkimusprotokollan 07/010 eläimelle laitos sijaitsee Lääketieteellisen ja Clinical Sciences ”L. Sacco”, Milano). Eläimet hoidettiin periaatteiden mukaisesti, että ”Guide for Care ja käyttö Laboratory Animals” ja noudattaen Italian kansallisen lainsäädännön (asetus. 116/1992) ja suositukset Euroopan yhteisön (86/609 /ETY) hoidosta ja koe-eläinten käytön. Aikuinen nainen FVB hiiriä, ikä 6-8 viikkoa, ja FVB naisten MMTV-

Ras

hiirillä [17], 27 ± 8 viikkoa vanhoja, oli pidettiin 12 tunnin valo-pimeä-sykli häkeissä 5 eläintä veden ja ruoan kanssa edellyttäen

halun

. Uros ja naaras MMTV-

Ras

hiirillä kasvaimen vauriot olivat heterotsygoottinen ihmisen-Ras siirtogeenin ja pidettiin puhtaassa FVB tausta. MMTV-

Ras

hiiri uroksia FVB hiiren taustan kasvatettiin villityypin FVB naisilla (Jackson Laboratories) säilyttää FVB tausta. PCR-pohjainen hiiren seulontamääritys tunnistamiseksi siirtogeeniset hiiret tehtiin.

dendritic soluviljelmässä

Yhteensä luuytimen solut uutetaan sääriluu ja reisiluu villityypin FVB hiirissä, kuten aiemmin on kuvattu [17 ]. Lyhyesti, poistamisen jälkeen lihaskudoksen luu kasvulevyjen leikattiin ja luuydin huuhdeltiin pois käyttäen 26G1 /2 neula ruiskuun. Solususpensiota viljeltiin täydellisessä Iscoven (Euroclone, Italia) väliaineessa. Erityinen sytokiiniseoksessa, joka sisälsi 3000 U /ml GM-CSF: n ja 900 U /ml IL-4 (R 90% CD3

+ FACS-analyysi.

induktio proliferatiivisten T-soluvasteiden

in vitro

3×10

7 CD3

+ naiiveja T lymfosyytit lietettiin uudelleen 0,1%: PBS /BSA: ta (PBI International) huoneen lämpötilassa ja värjättiin 2,5 ng /ml solun läpäisevä fluoreseiini-pohjainen karboksi-fluoreseiini-diasetaatti-succimidyl-esterin (CFSE-DA tai CFSE, Sigma Aldrich), joka kovalenttisesti kiinnittyy sytoplasman komponentteja solujen, jolloin yhtenäinen kirkas fluoresenssin. Kun solunjakautumisen, väriaine jakautuu tasan tytärsolut, jolloin resoluutio solunjakautumisen virtaussytometrialla. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 10 minuutin ajan, suspendoitiin uudelleen 5 ml: aan täydellistä kylmää Iscoven täydennetty 10% BSA: ta (I10 medium) ja inkuboitiin jäillä 5 minuutin ajan. Tämän jälkeen solut pestiin I10 väliaineen 1200 rpm 7 minuutin ajan, ne suspensoitiin uudelleen loppukonsentraatioon 3×10

6 solua täydellisessä Iscove keskipitkällä ja ympättiin 24-kuoppalevylle (Corning Coster) läsnä ollessa /poissa ollessa 3×10

5 kasvain-lysaattia pulssi DC 7 päivää. Sitten solut otettiin talteen, pestiin PBS: ssä ja värjättiin anti-hiiri-CD3-PECy7 (eBioscences) ja analysoitiin virtaussytometrialla. Prosenttiosuus lisääntyvien solujen laskettiin seuraavasti:.

Leviämisen-indeksi laskettiin seuraavasti:.

sytokiinianalyysi

10

5 kasvain-lysaatin pulssi DC maljattiin 24-kuoppalevylle, jossa 10

6 syngeneeisissä CD3

+ T-soluja ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 5% CO

2 1, 3, 5 tai 7 päivää [5 ug /ml PMA -Phorbol Myristate asetaatti- ja 1M Ionomycin (Sigma Aldrich) stimuloidut T-solut tai T-solut yksinään käytettiin positiiviset ja negatiiviset kontrollit, vastaavasti]. Levyjä sentrifugoitiin 1000 rpm 10 minuuttia ja supernatantit otettiin talteen ja säilytettiin -20 ° C: ssa määritykseen sytokiinien tasot. IFN-γ, IL-12p70: n ja IL-10-pitoisuus supernatanteissa mitattiin spesifisellä sandwich entsyymi-immunologiset määritykset (ELISA) (R PERM Cell läpäiseväksi kit, Caltag Laboratories, Burlingame, CA, USA) 10 minuutin ajan huoneen lämpötilassa pimeässä. Sitten solut pestiin PBS: ssä ja suspendoitiin uudelleen reagenssia B (FIX PERM Cell läpäiseväksi kit, Caltag Laboratories, Burlingame, CA, USA), jossa mAb: t, jotka ovat spesifisiä eri sytokiinien (IL-12p70, IL-10, IFN-γ, eBioscience) . Sen jälkeen 45 minuutin inkubaation 4 ° C: ssa pimeässä, solut pestiin ja kiinnitettiin 1% paraformaldehydillä PBS: ssä.

In vivo

Immunisointiaikataulun

MMTV-

Ras

hiiriä 6 viikon ikäisiä satunnaistettiin kahteen ryhmään: yksi ryhmä sai immunisaatio kasvain lysaatin ladattu dendriittisoluja, ja yksi ryhmä sai fysiologista suolaliuosta kontrollina. Molemmille ryhmille, pistoskohdan tasolla esiin pad vasemman takajalan oli esikäsitelty 30 ng TNFa 24 tuntia ennen solujen antoa. Sitten, 2×10

6 antigeeni ladataan-DC-solut injektoitiin käsitellyssä ryhmässä MMTV-

Ras

hiiret, läsnä ollessa vielä 30 ng TNF-α [17]. Ohjaus hiiret saivat TNF-α injektio yhdessä 20 ui fysiologista suolaliuosta; käsittelemättömien hiiret eivät saaneet mitään hoitoja. Hiiriä hoidettiin kahden peräkkäisen viikon ajan saman protokollan injektion. Eläimiä seurattiin viikoittain varhaiseen tunnistamiseen kasvaimeen puhkeamista käsin tunnustelu ja tapettiin kahden viikon kuluttua kasvain perustamisen niskavenytyksellä jälkeen anesthetization kanssa 4% kloraalihydraatti v /v (Sigma-Aldrich). Jotkut hiirtä kustakin ryhmästä lopetettiin seitsemän päivää sen jälkeen vastaanotetaan ensimmäinen immunisaatio ja pernat aseptisesti talteen analyysiä varten T-solu- fenotyyppi, ja mittaus sytokiinituotannon; päinvastoin, kaikki jäljellä olevat hiiret seurasi loppuun asti immunisaation hoidon ja kasvaimen puhkeamista kirjattiin. Hiiret sitten tapettiin kaksi viikkoa sen jälkeen kasvaimen perustamisen ja tuumorimassoja kerättiin.

puhkeaminen viivästyminen laskettiin: viikon puhkeamista käsiteltyjen-hiirten viikon alkamisesta kontrollihiirten.

Mitä tulee analyysiin T-solujen fenotyyppi, CD3

+ T-solut eristettiin pernasoluja immunisoiduista tai ohjata MMTV-

Ras

hiiret magneettisella erotuksella käyttämällä Pan T Cell Isolation Kit (Myltenyi Biotech, Italia) ja värjättiin fluoresoivasti leimattuja monoklonaalisia vasta-aineita on suunnattu paneelin solunpintamarkkereiden [fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC), fykoerytriini (PE), fykoerytriini-syaniini-5 (PCy5) tai 7 (PCy7)] (eBioscience, San Diego, CA , USA): CD4, CD8, CD25, CD69. Koska parametri T-solun efektoritoiminnan yhdistetty arviointi sytokiinierityksen suoritettiin virtaussytometrialla. 3×10

6 CD3

+ T-solut värjättiin 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa leimaamaton vasta-aine, anti-FcyR vähentämään erityisiä signaaleja. Sitten solut värjättiin anti-CD4-PECy5 ja anti-CD8-PECy7 (eBioscience) 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa pimeässä, pestiin ja kiinnitettiin Reagent liuosta (FIX PERM Cell läpäiseväksi kit, Caltag Laboratories, Burlingame, CA, USA) 10 minuutin ajan huoneen lämpötilassa pimeässä. Sitten solut pestiin PBS: ssä ja suspendoitiin uudelleen reagenssia B (FIX PERM Cell läpäiseväksi kit, Caltag Laboratories, Burlingame, CA, USA), jossa monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä IL-10, IL-12p70: n, IFN-γ: n, TNF-α, Granzyme B ja perforiinin (eBioscience). Toinen solunsisäinen värjäys suoritettiin hiiren vasta anti-Foxp3 (eBioscience, San Diego, CA) tunnistaa T

regs kuin CD4

+ /CD25

+ /Foxp3

+ soluja. Sen jälkeen 45 minuutin inkubaation 4 ° C: ssa pimeässä, solut pestiin ja kiinnitettiin 1% paraformaldehydillä PBS: ssä.

Tilastollinen

Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS 11 ohjelmisto (SPSS Inc., Chicagossa, IL, USA). Vertailut näytteiden perustaa tilastollisen merkitsevyyden eron määritettiin kaksisuuntaisella Mann-Whitney Rank Sum testi riippumaton näytteitä. Arvot P 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

DC immunofenotyypin

Hiiren DC valmistettiin luuytimestä esiasteista ja korjataan jälkeen 6 päivän kulttuuri läsnäollessa GM-CSF: n ja IL -4 kuten edellä on kuvattu. Laadun ja puhtauden DC: iden arvioitiin FACS-analyysillä perusteella ilmentymisen pintamerkkiaine CD 11 c; 88% soluista oli CD11 c

+. Solujen elinkelpoisuus oli suurempi kuin 90% kaikissa kokeissa. Ennen lastausta kasvaimen lysaattia, DC karakterisoitiin virtaussytometrialla analysoida MHC-luokan I ja II molekyylejä, kostimulatorisia molekyylejä (CD86, CD80, CD40), ja merkkiaineita, jotka liittyvät kypsymisen (CD83, CCR7, PD-L1). DC osoitti alhainen MHC-luokan I ja II molekyylit, CD86, CD80 ja CD40, ja CCR7, mikä osoittaa epäkypsä fenotyyppi. Kaikissa tapauksissa DC ilmaisivat merkittäviä määriä PD-L1, luultavasti indusoi GM-CSF: n ja /tai IL-4 käsittely (kuvio 1).

Unpulsed epäkypsiä DC (IDCS), kasvain lysaattia-ladattu DC (TAA -DCs) ja LPS stimuloi-DC, perustettiin rinnakkain ja korjattu samalla fenotyypin analysointia. DC tunnistettiin MHC-DR, CD11 c (A) (ylempi täpläblottauksessa ja alemman dot blot, joka osoittaa gating strategiaa ja MHC II ilme CD11 c

+ solut ennen ja jälkeen kasvaimen lysaatin lastaus ja LPS stimulaatio, vastaavasti) ja markkereita kuvassa (B). Numerot osoittavat rahalaitos (fluoresenssin voimakkuuden keskiarvo) varten isotyyppikontrolleja (avoimet histogrammit) ja DC pintamarkkerien (tummennetut histogrammit). Edustavia tuloksia yksi kolmesta kokeesta esitetään täällä. Fold-kasvu ekspressiotasot kypsymisen merkkiaineiden kasvainten lysaatin pulssi DC yli IDCS määritettiin ilmaisemalla rahalaitosten suhteutettuna TAA-DC: iden unpulsed IDCS (C).

DC kypsymisen vastauksena antigeeni loading

kasvainten solulysaatin edustaa koko proteiinipitoisuus lysoitiin syöpäsoluja. Indusoivan DC aktivointia ja kypsymisen, soluja pulssitettiin koko kasvaimen lysaatin nisäkasvaimia kudosviljellyn päässä MMTV-

Ras

hiirillä 24 tunnin ajan. Kuten on esitetty kuviossa 1, tämä menettely johti merkittävään kasvuun pinnan spesifisten proteiinien, kuten PD-L1, verrattuna ekspressiotasot puretaan DC. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin, kun LPS stimulaation (positiivinen kontrolli) (kuvio 1).

DC elinkelpoisuutta ei vaikuttanut antigeeni-lastaus menettely (purettu-DC: 100%

vs

ladattu-DC ja LPS-stimuloitujen-DC: 98% ja 98,5%, tässä järjestyksessä), että huomattava lisääminen rinnakkain toiminnallinen kypsä DC väestöstä voitiin havaita (purettava-DC: 11%

vs

ladattu-DC ja LPS-stimuloiduissa -DCs: 51% ja 50%, tässä järjestyksessä).

konfokaalimikroskopia arviointi DC lastaus kasvaimen lysaatin

kapasiteetti DC ryhtyä kasvain lysaatti varmistettiin konfokaalimikroskopialla. Sekä hiiren soluja ja kasvaimen solulysaatti oli fluoresenssi-leimattuja ja kuvat on hankittu. Konfokaalimikroskopia kuvia 24 tunnin co-viljelmistä DC ja kasvaimen solulysaatti osoittavat, että fluoresoiva materiaali hajotetuista kasvainsolujen sisäistää DC. Analyysit konfokaalimikroskopia lentokoneita osoitti, että DC-vihreä fluoresenssi ympäröivä kasvain lysaattia-punainen fluoresenssi, mutta päinvastoin ei havaittu. Todisteita internalisaation konfokaali lentokoneita on esitetty erilaisille suurennoksilla ja tiivistänyt jälleenrakentamiseen useita konfokaali lentokoneita Z-akselin. Tulokset osoittavat täten sytoplasman lokalisaation kasvaimen antigeenejä DC: issä, joka vahvistaa, että päivä-6 epäkypsiä DC oli aktiivinen fagosyyttisiä kykyä ja pystyivät ottamaan koko kasvain solulysaattina (kuvio 2).

Konfokaalimikroskopia käytettiin tarkistaa sytosolinen lokalisaatio kasvainperäinen antigeenejä seuraavat 24 tuntia co-viljelmistä päivän 6 DC ja kasvainsolun lysaattia. Kasvaimen massat leimattiin PKH26 Red Fluorescent Cell Linker (punainen) ja DC-soluja värjättiin monoklonaalisella vasta-aineella anti-CD11 c FITC (vihreä). Antigeeni kuormitus todennetaan visualisointi kasvaimen antigeeni (punainen) sisällä dendriittisolut (vihreä). Yksi edustaja kolmesta itsenäisestä kokeesta; kaikki kuvat ovat 20x taas zoom on 40X.

geeniekspressioprofiili kasvaimen lysaatin pulssitettu DC

Voit testata, onko kasvain lysaatin sykkivä moduloi yleisen geenin ilmentymistä DC, analysoimme ilmaus 84 osallistuvien geenien DC aktivointi ja kypsymisen käyttämällä rtPCR paneelit. Vertasimme ilmaus profiilia DC jälkeen 6, 16 tai 24 tuntia inkubaation kasvaimen antigeenejä; tulokset vahvistettiin vuonna vähintään kolme riippumatonta määrityksissä.

Tulokset osoittivat, että 43 geenit voimistunut (kertainen muutos ≥ 2 ladattu DC vs. puretaan DC), ja 7 geenejä vaimentua. Niistä voimistunut geenit löydettiin geenejä, jotka olennaisesti liittyvät solun liikkuvuuden ja klusterointi ja DC-T-solu-vuorovaikutuksia, kuten CD44, ICAM-1, Cdc42, Rac1 ja ERAP1 (kuvio 3A), ja antigeenin esittelyn mukaan lukien TAP2, TAPBP, CD1d1 ja B2M (kuvio 3B). Voimistunut geenit olivat myös jäseniä B7 perheen, kuten B7.1 (CD80) ja B7.2 (CD86), jotka sitoutuvat spesifisesti niiden samankaltaisiin ligandin T-soluihin ja antaa toisen signaalin T-soluaktivaation ja tehostamalla DC-toiminto, ja CD40, joka on kostimulatorinen proteiini, joka tarvitaan DC-aktivaatiota sitoutumalla CD40L T

H-soluissa (kuvio 3B).