Krooninen sairaus

tiivistelmä

pysyviä HPV-infektio on merkittävä rooli kohdunkaulan syöpä. Tämä tutkimus tehtiin tunnistamiseksi HPV-tyyppien kohortin Indian women joilla on paikallisesti edennyt kohdunkaulan syövän sekä määrittää olomuoto ja /tai sivuston viruksen integraation isännän genomiin. Esikäsittely koepaloja (n = 270) potilaista seulottiin HPV-infektion suurikapasiteettisten HPV genotyypitysmääritys perustuvat Luminex xMAP teknologian sekä MY09 /11 PCR ja spf1 /2 PCR. Kaiken HPV positiivisuus havaittiin olevan 95%, ja HPV16 ovat yleisimpiä (63%) ja sen jälkeen infektion HPV18. Integrointi tila tunnistettiin käyttämällä monistaminen papilloomavirustyypeissä Oncogene Transcripts (APOT) määrityksessä osajoukko näytteistä positiivisia HPV16 ja /tai HPV18 (n = 86) ja jossa on asianmukainen seuranta. Data korreloi kliinisten tutkimusten tulosten kanssa potilaista. Integrointi virusgenomin havaittiin 79% tapauksista ja mieluummin integroituminen kromosomaaliseen loci 1p, 3Q, 6Q, 11q, 13q ja 20q nähtiin. Kliiniset tiedot paljastivat, että olomuoto viruksen (integroitu tai episomaalinen) voisi olla tärkeä prognostinen kohdunkaulan syövälle.

Citation: Das P, Thomas A, Mahantshetty U, Shrivastava SK, Deodhar K, Mulherkar R (2012) HPV genotyypin ja Site Viral Integration in kohdunkaulasyövän Indian Women. PLoS ONE 7 (7): e41012. doi: 10,1371 /journal.pone.0041012

Editor: Torbjörn Ramqvist, Karolinska Institutet, Ruotsi

vastaanotettu: 17 helmikuu 2012; Hyväksytty: 15 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 16 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Das et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat haluavat ilmaista kiitollisuutensa rahoitustuki Naisten Cancer Initiative IRG # 634. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kohdunkaulan syöpä on kolmanneksi yleisin syöpä naisilla maailmanlaajuisesti ja yleisin syöpä löytyy Indian naisilla. HPV-infektio on osoitettu olevan kriittinen, mutta ei riittävä, etiologinen kohdunkaulan syövistä. Till mennessä yli 200 HPV-tyyppien on raportoitu, joista HPV16 on yleisin, jota seuraa yleensä HPV18, HPV45, HPV31 ja HPV33 [1], [2]. Suurin osa korkean riskin HPV (HR-HPV) infektioiden (90%) häviävät spontaanisti ja vain noin 10% tapauksista infektio jatkuu ja etenee korkealaatuista CIN-muutos. Tämä tapahtuu yleensä integroimalla HPV-genomin isännän kromosomiin liittyvine menetys tai keskeytyminen E2 [3]. Käytettävissä olevien raporttien viruksen E2-geeni on kyky tukahduttaa viruksen E6 ja E7-onkogeenin Solut, integroitu HPV-DNA [4]. Näin ollen integrointi viruksen menetys transkriptionaalisen säätelyn E2 tulokset yliekspressioon E6 ja E7 johtaa kuolemattomaksi ja solujen transformointi [5]. Useimmissa tapauksissa integrointi HR-HPV-genomin aiheuttaa fuusion selostukset, joka käsittää virus- onkogeenien E6, E7 ja viereisten solujen sekvenssit [6], [7], [8], [9]. In vitro tutkimukset ovat osoittaneet, että viruksen-solufuusio transkriptit ovat vakaampia ja levittää solut valikoivan kasvun etu verrattuna Episomaalisen kollegansa [10], [11].

Tutkimukset kertovat, että integrointitapahtumassa on satunnainen mukana lähes kaikki kromosomit, ja näin ollen monien virusten isäntä integraatio sivustoja on kartoitettu asti mennessä [12]. On kuitenkin olemassa tiettyjä kuormittajat esim hauras sivustoja, translokaatio taitepisteissä ja kopiointia ajatellen aktiivisen alueen [3], [13], [14], [15], joka on edullinen virus sen integroitumista ihmisen genomin. On integrointia tai lähellä geeniä, virus voi saada aikaan muutosta sen ilmaisu, joka voi lopulta johtaa muutoksiin solujen kasvun ja lisääntymisen. Myös viruksen yhdentyminen voi saattaa sekä viruksen koodaus geenit sekä solujen geenien alttiita epigeneettiset muutoksia, jotka voivat säädellä ilme. Siksi integrointi HPV osaksi ihmisen perimän pidetään tärkeä tapahtuma kohdunkaulan syövän syntymistä.

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli HPV genotyypitys ja tunnistaminen Integraatiopaikka kahden HR-HPV-tyypit (16 ja 18) sekä arvio ennusteen arvioinnissa integraation sivuston, paikallisesti edenneessä kohdunkaulasyövän Intian naisilla.

Materiaalit ja menetelmät

Kliininen näytteitä

esikäsittely kohdunkaulan kasvainbiopsioissa, pääasiassa alkaen FIGO vaiheen III B, saatiin potilailta (mediaani-ikä 50 vuotta, ikäryhmä, 33-80 vuotta) sädehoitoa yksin tai samanaikainen kemoterapia on Radiation Oncology Department, Tata Memorial Hospital, Mumbai, saatuaan IRB hyväksynnän. Geneerinen suostumuksen perustutkimuksen saatiin ennen saada koepaloja. Kuitenkin nykyinen tutkimus suostumuksen luopuminen saatiin sairaalan eettisen komitean. Koepaloja saatiin histologisesti todistettu, ensisijainen kohdunkaulan kasvain, ennen radikaalin sädehoidon ja koodattiin Tiesuolauksen tunnistamiseen lääkäri ennen testausta. Näytteet kerättiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa myöhempään käyttöön saakka. Kaikki näytteet osoitettu laboratoriokoodi luottamuksellisuuden.

Jalostus kasvainnäytteestä

Jäädytetyt kudoksista cryocut varten DNA: n eristäminen ja RNA. DNA: n eristämiseksi, viisi 30 um: n leikkeitä kerättiin STE-puskurissa (0,1 M NaCl, 0,05 M Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA, 1% SDS), joka sisälsi 10 mg /ml proteinaasi K (USB, Cleveland, OH, USA). DNA eristettiin tavanomaisilla fenoli-kloroformilla menetelmällä. Eristämiseksi kokonais-RNA, RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Saksa) käytettiin. Kymmenen 30 um: n leikkeet kerättiin RLT, joka sisälsi guanidiinitiosyanaatin annetaan kit ja käsitellä valmistajan ohjeita noudattaen. DNaasikäsittelyä ja RNA-näytteet tehtiin käyttäen DNA-free-sarja (Ambion, Austin, TX, USA).

HPV genotyypitys korkea suoritusteho Luminex array

genotyypin 24 HPV-tyyppien, joka sisälsi 15 korkean riskin tyyppejä (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51,52, 56, 58, 59, 68, 73, ja 82), 3 otaksuttu korkean riskin tyyppejä (26, 53, ja 66 ), ja 6 matalan riskin tyyppejä (6, 11, 42, 43, 44, ja 70) [1], [2] suoritettiin käyttäen multiplex HPV genotyypityksen array (Multimetrix GmbH, Heidelberg, Saksa), joka perustuu Luminex xMAP teknologiaan . Kuten kohti valmistajan ohjeiden, PCR suoritettiin käyttämällä sarjaa biotinyloitua laajan alukkeita kokonaistilavuudessa 50 ui, joka sisälsi 3,5 mM MgCl

2, 200 uM dNTP: itä, 0,75 yksikköä Taq-DNA-polymeraasia ja 1 ul nalliseoksesta. Vahvistusta vaiheet sisältyvät ensimmäisen DNA-denaturointi 94 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 40 sykliä denaturointi 20 s 94 ° C: ssa, alukkeiden 30 s 38 ° C: ssa, ja laajennus 1 min 20 s 71 ° C: ssa ennen lopullisen laajennus 4 min 71 ° C: ssa. PCR positiivista näytettä altistettiin sitten Luminexin aikavälillä. Kymmenen mikrolitraa PCR-tuote sekoitettiin Luminex helmi yhdistelmä, joka sisältää erillisiä helmi populaatioiden kytketty 24 HPV-tyyppejä. Jälkeen lämpödenaturaatio, kohdesekvenssien hybridisoitiin helmi-sidottu koettimia. Hybridisoituihin PCR-tuotteet leimattiin sitoutumalla R-fykoerytriinikonjugoitua streptavidiinin. Luetun saatiin Luminex bioanalysaattorin (Luminex Corporation, Austin, TX, USA). HPV-tyypit olivat havaittavissa mukaan ainutlaatuinen helmi allekirjoituksen, kun taas läsnäolo PCR-tuotteiden määritettiin fykoerytriinifluoresenssi. Analyyttinen herkkyys katkaisun laskettiin negatiivinen kontrolli, joka vähennettiin kustakin lukema.

HPV genotyypitys PCR: llä käyttäen MY09 /11 ja spf1 /2 alukkeita

Koska määrän DNA käytettävissä tutkimus on rajoittava, β-aktiini-PCR tehtiin vain niissä näytteissä, jotka ole osoittanut monistamisen GP5

+ /6

+ alukkeita (n = 92). Nämä seulottiin edelleen HPV PCR: llä käyttäen MY09 /11 L1-alukkeita (taulukko S1) ja spf1 /2-alukkeita [16]. PCR suoritettiin reaktio 25 ui, joka sisälsi 1,5 mM MgCl

2, 10 uM kutakin aluketta, 200 uM dNTP: itä ja 0,75 yksikköä Taq-DNA-polymeraasia. Näytteet joka positiivisiksi HPV joko MY09 /11 tai spf1 /2 tai molemmat edelleen genotyyppi varten kaksi yleisintä HR-HPV tyypit-HPV16 ja 18 käyttäen HPV16 /18-spesifisiä alukkeita (taulukko S1). Koska määrä DNA rajoittava, SPF 1/2 PCR ei suoritettava 4 92 näytteistä.

Association of HPV16, HPV18 ja HPV16 /18-infektion kliinisten tutkimusten tulosten kanssa

genotyypin tiedot kahden HR-HPV-tyypeille, HPV16, HPV18 ja HPV16 /18 yhdessä, jossa asianmukaisen seurannan data oli saatavissa verrattiin kliinisen tuloksen potilaista. Kaplan-Meier-analyysi (SPSS 15.0) tehtiin määrittää yhdistyksen välillä infektio näiden HR-HPV-tyypit ja taudin uusiutumisesta. Taudista vapaa eloonjääminen pidettiin alusta sädehoitoa, kun uusiutumisen tapahtunut tai kunnes viimeinen seurannan. Tilastollinen merkitsevyys arvioitiin käyttämällä log-rank-testiä (SPSS 15.0).

tunnistaminen Integraatiokohdan tekijänä APOT määrityksen

Näytteet (n = 86) positiivisia HPV16, HPV18 tai molemmat ja jossa on riittävästi kliinistä seurantaa (minimi 1YR tai kunnes esiintyminen ensimmäinen tapahtuma, kumpi oli aikaisempi) vietiin tutkia viruksen integraation avulla monistaminen papilloomavirustyypeissä Oncogene Transcripts (APOT) määritys, kuten on kuvannut Klaes

et al

[6 ]. Lyhyesti, kokonais-RNA: ta (0,5-1 ug) käänteiskopioitiin käyttäen oligo (dT) 17-aluketta, joka on kytketty kytkijäsekvenssin [(dT) 17-p3] [17] ja 50 yksikköä Superscript II käänteiskopioijaentsyymiä (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 1 tunnin ajan 42 ° C: ssa. PCR β-aktiini-alukkeet toteutettiin eheyden tarkistamiseksi cDNA. Ensimmäisen juosteen cDNA: ta monistettiin käyttäen HPV E7-spesifisen alukkeen (p1-16 spesifinen HPV16 ja p1-18 spesifisiä HPV18) eteenpäin-alukkeita ja linkkeri p3 kuin käänteinen aluke (taulukko S1). PCR-monistus suoritettiin reaktion tilavuus oli 50 ui, joka sisälsi 2,5 mM MgCl

2, 200 uM dNTP: itä, 25 uM kutakin aluketta ja 1 yksikkö Taq DNA-polymeraasia. Reaktio, joka käsittää ensimmäisen denaturaatiovaiheen 94 ° C: ssa 2 min, jota seurasi 35 sykliä denaturointi 94 ° C: ssa 30 s, pariutuminen 58 ° C: ssa 30 s, ja pidennys 72 ° C: ssa 4 minuutin ajan. Tätä seurasi lopullinen pidentäminen 72 ° C: ssa 20 min. Seuraavaksi 7 ui PCR-tuotetta käytettiin templaattina nested-PCR: llä käyttäen eteenpäin-alukkeita p2-16 spesifisiä HPV16 tai p2-18 spesifinen HPV18 ja (dT) 17-p3 reverse-aluketta (taulukko S1). PCR-olosuhteet olivat samat kuin ensimmäisessä PCR: ssä, paitsi että hehkutus lämpötila oli 66 ° C.

kloonaus fuusio transkriptien

Amplikonit kuin suuret episomaaliseen transkriptit (~1050 bp HPV16 ja ~1000 bp HPV18) epäiltiin olevan peräisin integroidun HPV genomeja. Nämä leikattiin geelistä ja DNA eristettiin käyttäen GFX PCR-DNA-ja Gel Band Purification Kit (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). Eristetty DNA joko sekvensoitiin suoraan tai seuraavan kloonauksen pTZ57R /T vektoriin käyttäen Insta PCR Cloning Kit (Fermentas, Liettua, EU), DNA-sekvensseri (3100 Avant Genetic analysaattori, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Kromosomaalista integraatiota loci määritettiin käyttämällä National Center for Biotechnology Information (BLAST) ja University of California, Santa Cruz (UCSC) hg19 (helmikuu 2009) (BLAT) ihmisen genomin kokoonpanot. Lisäksi integraatio sivustot tarkastettiin läsnäolo hauras sivustoja ja kaikki geenit tunnetaan henkilöllisyytensä käyttämällä NCBI hauras sivukartta katsojan ja UCSC Blat työkalua vastaavasti.

Association of viruksen integraation kliinisten tutkimusten tulosten kanssa

saadut verrattiin kliinisen tuloksen potilaista. Kaplan-Meier-analyysi (SPSS 15.0) tehtiin määrittämään yhdistyksen viruksen tila (episomaalinen /integroitu) kanssa taudin uusiutumista. Taudista vapaa eloonjääminen pidettiin alusta sädehoitoa, kun uusiutumisen tapahtunut tai kunnes viimeinen seurannan (seuranta-ajan mediaani oli 86 tapausta oli 44 kuukautta). Tilastollinen merkitsevyys arvioitiin käyttämällä log-rank-testiä (SPSS 15.0).

Tulokset

HPV genotyypitys suurikapasiteettisten Luminex array

Vaikka on olemassa muutamia raportteja eri high riskin HPV Intian naiset, me raportoimme tässä 15 korkean riskin HPV, 3 väli- riski ja 6 matalan riskin HPV-tyypit käyttävät korkea suoritusteho Luminex array. Alukkeet annetaan Luminex array kit HPV genotyypityksen biotinoitiin, laaja GP5

+ /GP6

+ alukkeita. Käyttämällä tätä alukesarjaa PCR, saimme 178 ulos 270 näytteiden positiivisia HPV (kuvio 1). HPV-positiiviset näytteet alistettiin edelleen hybridisaatio helmi-sidottu koettimet Luminex array kuten aiemmin on kuvattu. Sata kuusikymmentäyhdeksän näytteen havaittiin hybridisoituvan eri HPV-koettimet taas 9 näytteet olivat negatiivisia. Nämä 9 näytteet voivat olla HPV-infektio ei ole sisällytetty 24 tyyppejä havaitseman kit. Out of 169 HPV positiivista näytettä, 168 näytteet olivat positiivisia yhden tai useamman HR-HPV-tyypeille osoittaa korkea yhdistys kohdunkaulan syövän HR-HPV-infektio. Näistä HPV16 ja /tai HPV18-infektiota olivat yleisimpiä – 114 näytettä ovat positiivisia HPV16 yksin, 6 näytteitä HPV18 yksin ja 16 näytettä sekä HPV16 ja HPV18 (kuva 2).

Genotyping toteutettiin 270 pitkälle kohdunkaulan syöpä näytteitä suurikapasiteettisten, GP5

+ /6

+ alukkeita, jotka perustuvat Luminex matriisi; konsensus MY09 /11 ja spf1 /2-alukkeita. HPV positiivisuus oli 95% (257/270). APOT määritys tehtiin 86 HPV16

+ ja /tai HPV18

+ näytteitä, hyvän kliinisen seurannan ja laadukas RNA. 18 näytettä, vain episomaalisia muoto HPV tunnistettiin, loput 68 vihjasi kohti mahdollista integroitumista. Site integraation voitaisiin ennustaa korkeat pisteet BLAST ja /tai BLAT 48 näytettä.

Kuvaaja esittää taajuus 24 HPV-tyyppien 178 kohdunkaulan syövän biopsianäytteissä joiden havaittiin olevan positiivisia GP5

+ /6

+ alukkeita. HPV16 tartunnan vallitsevia näytteissä. Jokainen pylväs edustaa eri HPV-tyypit.

HPV genotyypitys PCR: llä käyttäen MY09 /11 ja spf1 /2 alukkeita

Jotta voidaan arvioida todellinen HPV-positiivisuuden 270 tapauksissa 92 kohdunkaulan syövän koepaloja negatiivisiksi HPV Luminex array, ensin PCR: ään käyttäen β-aktiini-alukkeet tarkistaa laadun DNA. Kaikki todettiin olevan positiivisia β-aktiini. Seuraava ne tehtiin PCR: llä käyttäen MY09 /11 ja spf1 /2-alukkeita. Kaksikymmentä viisi pois 92 näytteen havaittiin olevan positiivinen HPV by MY09 /11 PCR. Koska määrä DNA rajoittava, SPF 1/2 PCR ei suoritettava 4 92 näytteitä. Seulonta spf1 /2 alukkeita paljasti 79 näytteiden olevan HPV positiivisia. Nämä 79 näytettä sisälsi myös 25 näytettä, jotka testattiin HPV positiiviseksi MY09 /11 PCR. HPV positiivisuus oli siis lasketaan ottamalla huomioon tulokset Luminex array ja spf1 /2 PCR. Yleinen HPV-positiivisuuden kohortin havaittiin olevan 95% (257/270). Edelleen genotyypitys on 79 näytettä, käyttäen HPV 16/18 spesifisiä alukkeita, osoitti 49 näytettä positiiviseksi HPV16. Mikään näistä 79 näytteet olivat positiivisia HPV18. Siksi esiintyvyys HPV16 ja /tai HPV18 tässä kohortissa oli 69% (185/270) (kuva 1).

Association of HPV16, 18 ja dual-infektion kliinisten tutkimusten tulosten kanssa

Kaplan -Meier selviytyminen analyysitulokset 125 potilasta, joilla HPV type16, 18 ja kaksi infektion ja riittävän kliinisen seurannan (mediaani seuranta-ajan 125 tapausta oli 54 kuukautta), paljasti, että ei ollut merkitsevää eroa infektion näiden kahden HR HPV-tyypit kannalta taudin tulos (kuva S1).

olomuoto viruksen ja kliinisen tuloksen

Out of 125 HPV16, HPV18 tai kaksi HPV positiiviset näytteet, osa-sarja 86 näytettä laadukasta RNA, otettiin tutkia olomuoto ja /tai sivuston viruksen integraation APOT määrityksessä. Useimmissa tapauksissa, virusgenomin havaittiin voidaan integroida (n = 68), kun taas 21% (n = 18) vain episomaaliset transkriptit voitiin tunnistaa. 12 tapauksessa, jossa on integroitu virusgenomin, episomaalisia muodossa HPV havaittiin myös (kuvio 1). Fyysinen tila virus (episomaalinen /integroitu) liittyi taudin lopputulokseen. Survival data paljasti, että 16 pois 18 potilailla, joilla on vain episomaalisia muoto HPV (16 ja /tai 18), oli taudista vapaa eloonjääminen verrattuna niihin, joissa on integroitu muodossa virus, joka osoittaa hyvä kliininen tulos (p = 0,067, mikä rajatapaus merkitys) (kuva 3). Kliininen tulos kaikki potilaat, joissa virus- integraatio tutkittiin on esitetty taulukossa S2.

Kaplan-Meierin selviytymisen käyrä potilailla, joilla episomaaliseen muodossa viruksen (n = 18) vs. integroitu muodossa (n = 68 ) on kuvattu. Suurin osa potilaista, joilla episomaalisesta muotoon (16 18: sta) oli taudista vapaan eloonjäämisen verrattuna potilaisiin, joissa on integroitu muodossa, mikä osoittaa hyvän kliinisen tuloksen, joskin rajatapaus merkitys (p = 0,067).

tunnistaminen viruksen integraatiokohdan

jotta ymmärtää, onko integraatio tapahtuma on satunnainen tai jonkin verran parempana tiettyjen sivustojen sisällä kromosomien, sekvensointi tietoja 68 tapauksessa peräisin APOT määrityksessä tutkittiin Blast ja /tai Blat. Integraatiopaikka voitaisiin ennustaa ennätyksen 48 tapausta (taulukko S3a), loput 20 tapauksessa tilanne oli alhainen (taulukko S3b). Vain niissä tapauksissa, joissa Integraatiokohdan ennustettiin suurella pisteet (n = 48) analysoitiin edelleen eri piirteitä liittyy sama. Sivustoja integraation todettiin jaettava koko genomin. Kuitenkin integraatio oli yleisempää kromosomitasolla loci 1p (n = 7), 3q (n = 8), 13q (n = 4), 6Q (n = 4), 11q (n = 4) ja 20q (n = 4 ) (kuvio 4). Vain yksi näyte osoitti HPV integraatio kahden kromosomi loci samanaikaisesti. Jotkut toistuvia integraation sivustot myös tarkastettiin genomitasolla suorittamalla genomista DNA PCR HPV E7 alukkeita eteenpäin pohja- ja spesifisiä alukkeita tietylle kromosomaalisen alueen käänteinen yksi (kuva S2).

site integraation määritettynä APOT määritys 48 tapauksissa positiivinen HPV16, HPV18 tai molempia ja korkea ennustaminen pisteytä BLAST /BLAT. Integraatio tapahtuma todettiin olevan yleisempää 1p ja 3q kromosomi loci. Jokainen pylväs edustaa eri kromosomilokuksen.

Ominaisuudet HPV integraatio

Käyttäen NCBI Fragile sivuston Kartankatselumoduuli havaittiin, että 60% integrointeja (29/48) on sijoitettu tai lähelle yhteisen tai harvinaisia ​​hauras sivusto. Loput integraation sivustot eivät liity mihinkään hauras sivustoja (taulukko 1). Käyttäen UCSC Blat työkalu 58% sekvenssien (28/48) havaittiin olevan joko tai lähellä proteiinin koodaavan geenejä. Nämä geenit kuuluivat eri ryhmiin vaihtelevat onkogeenien, transkriptiotekijät, ja tuumorisuppressorigeeneille (taulukko 1).

Keskustelu

On kiistatta todistettu, että infektiota HPV on tärkeä rooli kohdunkaulansyövän etiologian. Raportit eri puolilla niemimaalla osoittavat esiintyvyys HPV vaihtelee 73-99% [18] – [30]. Tässä tutkimuksessa raportoimme 95% HPV-positiivisuuden käyttäen kolmea eri alukesarjoja. Ilmenee tässä tutkimuksessa, että yksiä alukkeiden ei riitä arvioimaan todellista HPV tarttuvuutta. Eri HPV-genotyyppien HPV16 oli yleisintä (60%), jota seurasi infektio HPV18 yksinään (2%). Dual infektio HPV16 /18 (6%) ja HPV16 /45 (3%) havaittiin myös. Nämä tulokset ovat yhdenmukaiset muissa tutkimuksissa Intian niemimaalta joka raportoi 57-65% HPV16 positiivisuutta, jota seuraa HPV18, 45, ja 33 kohdun neoplasiaa [19], [20], [29].

Integrointi virus on yleinen myöhäisessä vaiheessa kohdunkaulan syöpiä ja pidetään tärkeänä tapahtuma taudin etenemistä. Integraatio tapahtuu yleensä alavirtaan varhaisten geenien E6 ja E7, usein E1 tai E2-aluetta. E2-geeni on transkriptionaalisesti inaktivoitu, kun virus saa integroitu hajoamisen johdosta sen avoimen lukukehyksen. Viruksen E2-geeni on tutkittu laajasti, ja on tunnettu rooli viruksen replikaation sekä negatiivisen säätelyn E6- ja E7-geenit [31].

Eri tekniikoita on käytetty tutkimaan integraation viruksen, kuten koska ligaatio-välitteisen PCR [32], restriktiopaikka–PCR [15] ja APOT määritys [6]. Jotta rajoitamme tutkimuksen integrointi sivustoja kopiointia ajatellen aktiivisen viruksen genomia, APOT määritys valittiin. Lisäksi, APOT määrityksen avulla voidaan todeta integroidun virusgenomin kliinisissä vaurioita jopa, kun läsnä on suuri ylimäärä integroitumattomana episomaalisen muodossa virusgenomien [6], [33]. Taajuus viruksen integraation isännän genomiin kohdunkaulan karsinoomat on raportoitu olevan niinkin korkea kuin 100% vuonna HPV18

+ kasvaimissa [34] ja jopa 80% vuonna HPV16

+ kasvaimissa [35]. Tutkimuksessamme löysimme neljä HPV18

+ näytteet jossa virus integroitiin ja yksi HPV18

+ näyte, jossa virus oli episomaalisesta. Ilmaantuvuus integroituminen HPV16

+ näytteitä oli korkeampi. Mekanismi HR-HPV integrointi ei ole täysin ymmärretty. On arveltu, että yhdentyminen saattaa merkitä sattumaa, todennäköisyys joka kasvaa taajuuden kaksinkertaisen säikeen katkoksia (DSB: t) vastaanottavissa ja virus-DNA. Kromosominen hauras sivustot voisivat edustaa kuormittajat HR-HPV integraatio.

olomuoto ja /tai Integraatiopaikka tutkittiin 86 kohdunkaulan Tuumorinäytteissä tartunnan jompikumpi tai molemmat kahdesta HR-HPV: t, HPV16 ja HPV18, ja joissa on riittävästi kliinistä seurantaa. Episomaalisia muotoa HPV havaittiin 18 tapauksessa. Läsnäolo vain episomaalista muodossa näillä potilailla, joilla on edennyt sairaus vaiheessa (pääasiassa FIGO vaihe IIIB), voisi osoittaa, että joko HPV integraatio ei ole yksin vastuussa sairauden etenemistä; tai se voi olla rajoitus tekniikka johtaa epäonnistumiseen amplifikaation integrantti peräisin transkriptin. Viimeaikaiset tutkimukset ovat vahvistaneet läsnäolo vain episomaalisen muoto viruksen kehittyneen kohdunkaulan okasolusyöpää [33], [36]. Lisäksi, koska APOT toimii perusteella hehkutus Frohman alukkeen polyA-häntä, joissa polyA-häntä on sijoitettu suuren etäisyyden päässä eteenpäin-aluketta, ei ehkä ole vastaanottavaisia ​​monistaminen PCR: llä.

Tässä tutkimuksessa havaitsimme, 12 näytettä, joissa sekä integroitu sekä episomaalisia muotoja viruksen olivat läsnä. Tällaisissa tapauksissa E2 voivat olla käytettävissä

trans

ilmentymisen moduloimiseksi tasot onkogeenisten E6 ja E7 [37]. Myös mukaan raportin Pett

et al

. Menetys episomeista on niin paljon tärkeää kuin integrointi virus isännän genomiin varten vaurioiden kehittyminen kohdunkaulan neoplasian [38]. Olisi mielenkiintoista nähdä ilmaus E2 ja E6 /E7 silloin HR-HPV on läsnä episomaalisessa sekä integroitu muodossa tai näytteitä, jos HPV on vain episomaalisia.

On raportoitu, että HR HPV proteiineihin kuin E6 /E7 kromosomeja epävakautta ja transformaatio [39]. On todettu, että E2 stabiloi Skp2, onkogeenillä ja tämä voi johtaa aktivoitumiseen S-vaiheen entry [39]. Hamid et. al., [40] ovat myös ehdottaneet rooli E2 soluproliferaatioon. Koska solujen S-vaiheen vastaavat paremmin säteilyä, syöpiä episomaalisia E2 voisivat vastata paremmin sädehoitoa. Vertailu olomuoto viruksen (episomaalinen /integroitu) kanssa kliinisen tuloksen jälkeen radikaalin sädehoidon paljasti, että potilaalla on episomaaliseen muodossa virus oli lisääntynyt taudista vapaa eloonjääminen verrattuna niihin, joissa on integroitu muodossa. Tämä havainto tukee erilaisia ​​raportteja, joiden mukaan integrointitapahtumassa liittyy alentunut taudista vapaa eloonjääminen [41], [42]. Kuitenkin, on olemassa ristiriitaisia ​​raportteja sekä, jonka mukaan fyysinen tila virus ei korreloi taudista vapaa eloonjääminen [43], [44]. Tämä on tutkittava tarkemmin.

Vaikka integrointi sivustoja jaettiin koko genomin eri näytteissä, oli mieltymys tiettyjä kromosomi loci kuten 1p, 3Q, 6Q, 11q, 13q, 6Q ja 20q. Tietyillä alueilla joissakin näistä lokuksista, kuten 1p36.23, 1p36.33, 3q26, 3q28 ja 20q11.21 osoitti toistettiin integraatiot, mikä osoittaa, että integraatio ei ehkä ole satunnainen tapahtuma. Raportit tutkimuksia Länsi populaatiot osoittavat, että integraatio virus esiintyy yleisimmin 8q kromosomilokuksen [3], [45], [46]. Integraatio on 8q lokuksessa tutkimuksessamme havaittiin vain 1 ulos 48 tapauksessa. Tämä saattaa johtua siitä, että ero etnisen kahden populaatioiden.

3Q, 13q ja 20q loci lisäksi se etuoikeutettu kohde HPV integraatio on raportoitu olevan sivustoja perimän epävakaisuuden liittyvät kohdunkaulan syöpään. Vahvistus 3q ja 20q, kun taas menetys 13q on raportoitu eri vaiheissa taudin [47] – [49]. Myös lisää Viimeaikaiset raportit osoittavat, että merkittävä yhdistyksen välillä genomista uudelleenjärjestelyn ja HPV integraatio [46]. Siksi olisi mielenkiintoista tutkia, onko etuuskohteluun integraatio viruksen näihin loci on rooli asiakkuutta perimän epävakaisuuden.

Useimmat integraatiot (28/48) havaittiin sijaita tai lähellä tiettyjen geenien. Tämä voi osoittaa, että virus mieluummin kopioinnin suhteen aktiivisia alueita varten integrointitapahtumassa. Tällaiset geenit sisältyvät onkogeenien kuten myc, transkriptiotekijät kuten TP63, MECOM jne Havaintoa tukee edellinen raportti Wentzensen

et al

jossa he ovat osoittaneet osallistumisen kasvainten liittyvien geenien (myc ja TP63) HPV integraatioprosessin [50]. Tutkimukset laboratoriossamme ovat osoittaneet, että jotkut geeneistä, jossa integraatio havaittiin, kuten ABCB10, SLC25A36, IL8, COX4I2, HNF1B, myc, havaittu olevan ilmaisun (julkaisematon data), mikä osoittaa, että kun integraatio sisällä tai lähellä tietyn geenin virus voi aiheuttaa muutoksia geenien ilmentyminen.

integrointi viruksen lähellä tai sisällä hauras sivustoja on usein raportoitu [15], [45], [50] – [52]. Fragile sivustot ovat erityisiä alueita kromosomeissa että nonrandomly läpikäy tauko vastauksena tiettyihin stressiä. Tämä tekee geenejä tai lähellä näitä sivustoja alttiita vieraan DNA yhdentymistä. Tutkimuksessamme 29/48 integraatiot sijaitsivat tai lähellä yhteisen tai harvinaisia ​​hauras sivusto, joka on yhdenmukaiset aikaisempien raporttien kanssa. Toinen havainto meidän oli, että potilailla, joilla viruksen integraatio kromosomi loci 3Q, 13q ja 20q osoitti pahin ennuste kaikkien kesken. Olipa tämä voi olla mitään kliinistä implisiittisesti ennustetta kohdunkaulan syövän olisi mielenkiintoista ja haastavaa tutkimuksessa.

tukeminen Information

Kuva S1.

Kaplan-Meier-analyysi kahden HR-HPV-tyypit – HPV16 ja /tai HPV18 ja sairauksien lopputulos. Kaplan-Meier selviytymisen analyysi HPV16 ja /tai HPV18 125 potilasta, joilla oli hyvä kliininen seuranta toteutettiin. Potilaat, joilla HPV16 tartunnan yksinään osoitti suuntaus kohti parempaa taudista vapaa eloonjääminen verrattuna HPV18 tartunnan yksin ja dual infektio HPV16 /18.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0041012.s001

(TIF) B Kuva S2.

genomista DNA: ta PCR määräaikaiskoulutuksessa integraation sivustoja. Edustavia geeli kuvia (a, b) osoittaa HPV yhdentymistä genomitasolla. Toistuva integraatiot at kromosomi loci 1p36.23, 3q28, 6q23.3, 8p11.21 ja 11q13.1 on kuvattu.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0041012.s002

(TIF) B Taulukko S1 .

Alukesekvenssit.

doi: 10,1371 /journal.pone.0041012.s003

(DOCX) B Taulukko S2.

kliinis tiedot kaikista tapauksista, joissa viruksen integraation tutkittiin.

doi: 10,1371 /journal.pone.0041012.s004

(DOCX) B Taulukko S3.

järjestys HPV integraation sivustoja genomin 68 tapauksessa. a) Integration sivustoja 48 tapauksessa, joilla on korkea ennustus pisteet. b) integrointi sivustoja 20 tapauksia, joissa on pieni ennustus pisteet.

doi: 10,1371 /journal.pone.0041012.s005

(DOCX) B

Kiitokset

Kirjoittajat haluavat tunnustaa myöhään Dr. KA Dinshaw ja kaikki yksilöt Gynekologiassa Disease Management Group, Tata Memorial Hospital, jotka olivat mukana harkiten kokoamisessa kliinisen historian ja keräämällä ja tallentamalla koepalat kohdunkaulan syöpäpotilailla. Apua Ms Sadhana Kannan (ACTREC) in tilastollinen analyysi ja Ms Tabish Hussain (ACTREC) hänen arvokasta valmistelussa käsikirjoituksen ovat kiitettävällä.