Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

mikrosatelliittien epävakaus (MSI) käytetään seulomaan kolorektaalisyövissä (CRC) ja Lynch oireyhtymä , ja ennustaa tuloksen ja hoitovasteen mukaan. Nykyinen mittausmenetelmä MSI edellyttää DNA normaaleista ja neoplastisia kudoksia, ja ei tunnista kasvaimiin erityisiä DNA mismatch korjaus (MMR) vikoja. Testasimme paneelin viiden lähes monomorphic mononukleotidi toista markkereita monistetaan yhdessä multiplex PCR-reaktion (pentaplex PCR) havaitsemiseksi MSI.

Experimental Suunnittelu

tutkittu kohortin 213 CRC potilaita, koostuu 114 MMR-puutteellinen ja 99 MMR-taitavia kasvaimia. Immunohistokemiallinen (IHC) analyysi arvioi ilmaus MLH1, MSH2, PMS2 ja MSH6. MSI tila määriteltiin erot lähes monomorphic vaihteluväli (QMVR) poolista normaalia DNA-näytteitä, ja mittaamalla erot alleelin pituudet kasvaimen DNA.

Tulokset

monistaminen 426 normaali alleelit sallittu optimointi QMVR kussakin merkki, ja poistetaan vaatimus Hyväksytty viittaus DNA määritellä MSI kussakin näytteessä. Käyttämällä ≥2 /5 epävakaa markkereita kuin kriteerit MSI johti herkkyys 95,6% (95% CI = 90,1-98,1%) ja positiivinen ennustearvo 100% (95% CI = 96,6% -100%). Detection of MSH6-puutos rajattiin käyttäen kaikkia tekniikoita. Tietojen analyysi kolmen markkeripaneelin (BAT26, NR21 ja nR 27) oli verrattavissa herkkyys (97,4%) ja positiivinen ennustearvo (96,5%) viidelle markkeripaneeli. Molemmat lähestymistavat olivat parempia kuin standardi tapa mitata MSI.

Johtopäätökset

optimoitu pentaplex (tai tripleksi) PCR tarjoaa helpon, vankka, erittäin edullinen, erittäin herkkä, ja erityisiä määritys varten tunnistaminen MSI CRC.

Citation: Goel A, Nagasaka T, Hamelin R, Boland CR (2010) optimoidun Pentaplex PCR havaitsemiseen DNA täsmää korjaus-puutteellinen kolorektaalisyövissä. PLoS ONE 5 (2): e9393. doi: 10,1371 /journal.pone.0009393

Editor: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 marraskuu 2009; Hyväksytty: 03 helmikuu 2010; Julkaistu: 24 helmikuu 2010

Copyright: © 2010 Goel et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tuettiin avustuksilla RO1 CA 72851 (ja CRB) ja RO1 CA 129286 (AG ja CRB) National Cancer Institute, National Institutes of Health, ja varoja Baylor Research Institute. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

mikrosatelliittien epävakaus (MSI), joka on määritelty kertymistä insertion-deleetiomutaatioiden lyhyellä toistuvia DNA-sekvenssejä (tai ”mikrosatelliitit) on ominaista syöpäsolujen DNA mismatch korjaus (MMR) puutos [ ,,,0],1]. Inaktivointi tahansa useista MMR geenien, kuten

MLH1

,

MSH2

,

MSH6

ja

PMS2

, voi johtaa MSI. Alunperin MSI osoitettiin korreloivan ituradan puutteita MMR geenien sairastavilla potilailla Lynch oireyhtymä (LS), jossa 90% paksusuolen syövän (CRC) potilasta näytteille MSI [2], [3]. Myöhemmin tunnustettiin, että MSI esiintyy myös -12% satunnaisia ​​CRC esiintyy potilailla, joilla ei ole ituradan MMR mutaatioita, ja MSI näillä potilailla johtuu promoottori metylaatio aiheuttama hiljentäminen

MLH1

geeniekspression [4 ]. Määrittäminen MSI tilaansa CRC on kliinisessä käytössä tunnistamiseksi potilaalla on ituradan vikoja altistavien MMR-puutos. Lisäksi MSI tila on ennustetekijöitä ja terapeuttisia vaikutuksia, koska MSI CRC on tyypillisesti parempi ennuste, ja nämä syövät ovat vähemmän herkkiä 5FU kemoterapiaa liitännäishoitona [5].

Koska alkuperäisessä löytö yli kymmenen vuotta sitten menetelmät ja kriteerit määrittämiseksi MSI CRC ovat jatkuvasti kehittyneet. On kuitenkin vielä ole päästy yksimielisyyteen siitä, että käytetään eri MSI määrityksiä, jotka ovat vakaampia, halpa ja johtaisi MSI analyysien, joka parhaiten edustaa MMR-puutos laboratorioissa ympäri maailman [6]. Kun pyritään yhdistämään MSI analyysi CRC, vuonna 1997 National Cancer Institute (NCI) workshop suositellaan käyttäen viite paneelia viiden MSI markkereita, joka koostui 2 mononukleotidi toista markkereita (BAT26 ja BAT25) ja 3-dinukleotidi toista markkereita (D2S123, D5S346 ja D17S250) [7]. Vuonna seurannan NCI workshop, paneeli totesi joitakin rajoituksia alkuperäisen markkereita, johtuen ensisijaisesti sisällyttäminen 3 dinukleotidi markkereita [8]. Ensin todettiin, että dinukleotidi toista merkkiaineet olivat sopivampia tunnistamiseen MSI-L kasvaimia, kun taas mononukleotidi toista merkkiaineet olivat tarkempia ja herkkä määrittämistä varten MSI (tai MSI-H) CRC [9]. Toiseksi, koska polymorfinen luonteen dinukleotidin markkereita, nämä vaaditaan saatavuus ei vain kasvaimen, mutta sopivat yhteen normaalia DNA: ta kustakin yksilöstä tulkita MSI tuloksia. On osoitettu, että paneelin viiden lähes monomorphic mononukleotidi toista merkkiaineiden pentaplex PCR vältyttäisiin normaalia DNA: ta kustakin CRC potilaan, ja voi tarjota parempia spesifisyys ja herkkyys kuin NCI-paneeli merkkiaineet [10].

Valitettavasti huolimatta sen ilmeinen vahvuuksina, pentaplex MSI lähestymistapa on saavuttanut vain rajoitettua MSI-pohjainen seulonta CRC. Voi olla useita syitä, mukaan lukien puute selkeä käsitys teknisten näkökohtien ja riippumaton validointi Tämän määrityksen. Tämän tutkimuksen tähän huoleen validoinnissa tarkkuutta pentaplex-paneeli markkereita suuressa sarjassa MMR-taitavia ja puutteellinen CRC analysoimalla PCR-monistettu profiilit kunkin merkin sekä kasvaimen ja vastaavat normaali DNA. Tässä osoitamme erittäin herkkä ja erityiset pentaplex PCR, joka vaatii yhden kerran optimointi lähes monomorphic vaihteluväli (QMVR) kunkin markkerin normaalissa DNA. Tulosten mukaan optimoidun pentaplex PCR-määrityksen tulisi olla edullinen menetelmä MSI arviointia kliinisissä ja tutkimuslaboratorioissa, koska se on nopea, edullinen, erittäin herkkä ja spesifinen havaitsemiseksi MMR-puutosta CRC ja poistaa tarpeen viittaus normaalia DNA.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki potilaat kirjallisia tietoon perustuva suostumus ja tutkimuksen hyväksyi laitoksen tarkastus- hallituksissa Baylor University Medical Center, Dallas, USA; University of Heidelberg, Heidelberg, Saksa; ja Okayama University Hospital, Okayama, Japani.

kudosnäytteiden

Kasvain ja vastaavat ituradan DNA kerättiin 213 potilasta diagnosoitu CRC kolmella eri toimielimissä: 1) Baylor University Medical Center, Dallas , TX, USA 2) University of Heidelberg, Heidelberg, Saksa ja 3) Okayama University Hospital, Okayama, Japani. Joukossa tämä kohortti, 114 kasvaimet olivat MMR-puutteellisia, ja mukana 50 CRC menetys MLH1, 48 menetys MSH2 ja 8 tapausta jokaisella on yksinomainen menetys PMS2 tai MSH6 proteiineja. Loput 99 tapauksista oli MMR-taitavia.

MMR Protein immunohistokemia

tutkittiin proteiinin ilmaisun MLH1, MSH2, PMS2, ja MSH6 vuonna 213 tuumorikudoksissa immunohistokemiallisella (IHC) värjäys käyttäen DAKO EnVision System-HRP polymeerijärjestelmällä kit (Dako Cytomation Inc., Carpinteria, CA). Kudosleikkeet koetettiin sopivia laimennoksia hiiren monoklonaalisia vasta-aineita MLH1 (klooni 13271A, BD Pharmingen, San Diego, CA), MSH2 (klooni FE11, Oncogene Research Products, Boston, MA), PMS2 (klooni A37, BD Pharmingen, San Diego, CA), ja MSH6 proteiini (klooni 44, BD Transduction Laboratories, Lexington, KY). Kasvainsoluja teki negatiivisia MMR-proteiinin ilmentymisen vain, jos epiteelisolujen sisällä kasvainkudoksen puuttui tumavärjäystä, kun taas ympäröivä stroomasoluissa oli vielä positiivista värjäytymistä.

Mikrodissektiomenetelmiä ja DNA Amplification

Serial kohdat (5 um) päässä formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettu vastaaviin normaaleihin ja kasvaimen kudokset rutiininomaisesti värjättiin, ja edustavia normaalin ja kasvaimen alueet tunnistettiin mikroskoopilla tarkasteltuna. Genominen DNA eristettiin parafinoidut kudoksissa käyttäen QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) erotuksen jälkeen kasvaimen ja normaalin kudoksen käsin mikrodissektion.

Pentaplex PCR ja Quasi-monomorfinen vaihteluväli (QMVR ) Määritelmä

MSI analyysi suoritettiin käyttämällä viittä mononukleotidi toista microsatellite tavoitteita (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 ja NR-27) in pentaplex PCR järjestelmä [10]. Alukesekvenssit on kuvattu aikaisemmin, ja kukin sense-aluke leimattiin päästään yhden fluoresoivan markkerit: FAM, HEX tai NED [11]. Pentaplex PCR suoritettiin MJ Research DNA 200 multicycler (Biorad, Hercules, CA). PCR-olosuhteet koostuivat aluksi 15 min alkudenaturaatio lämpötilassa 95 ° C: ssa, mitä seurasi 35 sykliä 95 ° C: ssa 30 s, 55 ° C: ssa 30 s ja 72 ° C: ssa 30 s, ja lopullinen pidennys 72 ° C: ssa 10 min. Monistettujen PCR-tuotteiden laimennettiin formamidia, ja ajettiin Applied Biosystems 3100 Avant automatisoitu kapillaarielektroforeesi DNA sekvensserin. Alleelisia koot kunkin markkereita arvioitiin käyttämällä GeneMapper 3.1 ohjelmistoa (Applied Biosystems, Foster City, CA).

määrittämiseksi ja validointi lähes monomorphic vaihteluväli (QMVR) kullekin viidestä MSI markkereita, PCR-monistus profiilit pisteytettiin erikseen, ja koko molempien alleelien määritettiin kunkin merkin ja kunkin kasvaimen erikseen kuten aiemmin on kuvattu [11]. Laskuissa johtuen monomorphic luonne markkereita, laskimme kunkin alleelin koko kahdesti homotsygoottisia näytteissä.

määritys alleelivaihtelujen vuonna Kasvain DNA verrattuna Normaali DNA

Seuraavaksi tutkimme onko saatavissa olevista sopivista normaalin DNA CRC potilas lisäisi seulonta suorituskykyä pentaplex PCR MMR puutteellinen CRC. Laskimme erot alleelinen pituudet välillä kasvain ja normaali DNA jokaisen potilaan ja jokainen MSI merkki. Kussakin tapauksessa meillä pitää lyhin alleelin läsnä kasvain tai normaalissa DNA laskelmissa seuraavalla kaavalla:

(ero alleeli pituus) = | (Normaali DNA alleeli) – (kasvain DNA alleeli) | (Ep)

Jos PCR-fragmentti kasvain DNA paljasti kaksi huippua, me pidetään lyhyempiä huippu edustaja kasvaimen DNA.

MSI Analyysi NCI-paneeli Markers

Jos haluat vertailla herkkyys ja spesifisyys pentaplex PCR alkuperäisen NCI-paneeli markkereita (BAT25, BAT26, D2S123, D5S346 ja D17S250), suoritimme MSI analyysit osajoukon 86 MMR-puutosta CRC ja 37 MMR taitavia CRC käyttämällä molemmat lähestymistavat [7]. Alukkeet kullekin 5 markkereita aiemmin kuvattu [12], [13].

TILASTOANALYYSI

Käytimme logistista regressioanalyysiä tutkia diagnostinen suorituskyky MMR puutteellinen CRC hyödyntäen erilaisia ​​strategioita määrittelee MSI. Voit tarkastella niiden suhdetta yksittäisten MSI markkereita, Monimuuttuja korrelaatio ja hierarkkinen klusterointi analyysi tehtiin käyttämällä standardoituja absoluuttinen ero pituusero kasvain alleeli ja ituradan /normaali alleeli. Analyysit suoritettiin käyttäen JMP (versio 6.0, SAS Institute). Kaikki raportoidut P-arvot ovat kaksipuolisia ja P 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

MMR-puutteellinen ja MMR-Taitavan CRC

määrittämiseksi tarkkuutta pentaplex PCR järjestelmä havaitsemiseksi MMR puutteellinen CRC, tutkimme kohortin 213 CRC joka koostui 114 MMR-puutteellinen ja 99 MMR-taitavia kasvaimia. Taulukossa 1 luetellaan kliiniset piirteet MMR-taitavia ja vajausta CRC.

määritys ja optimointi QMVR varten Jokainen Marker mukaan Normaali DNA

Vaikka viiden mono-repeat merkkiaineiden pentaplex PCR on ehdotettu olevan erittäin monomorphic sisään ituradan DNA monenlaisia ​​väestön maailmanlaajuisesti menestys tämän MSI määrityksen vahvasti perustuva tarkka määrittäminen QMVR kunkin markkerin normaalissa DNA [11]. Teoreettisesti QMVR kunkin markkerin on vakio jokaisessa kokeellinen ympäristössä, mutta tiedot osoittavat, että tietyn instrumentoinnin tai reagenssit voivat osittain vaikuttaa alleeli koon mittaukset kunkin markkerin [11]. Tämä toimeksiannot kertaluonteinen huolellinen määrittäminen QMVR vuonna ituradan DNA ennen kasvaimen MSI analyysiin. Me PCR-monistettiin 426 alleelien 213 normaalia DNA yksilöitä määrittää QMVR jokaisen MSI merkki. Kuten kuviossa 1, polymorfinen alue jokaiselle MSI markkeri normaalissa DNA on seuraava: NR 27 (82-87 bp), NR21 (102-106 emäsparia), NR24 (120-125 emäsparia), BAT25 (142-148 bp), ja BAT26 (174-179 bp). Yleisin alleelin kunkin markkereita oli seuraava: nR 27 (85 bp), NR21 (105 bp), NR24 (123 bp), BAT25 (145 bp) ja BAT26 (178 bp). Toisin kuin aiemmissa tutkimuksissa, jotka käytetään terveillä koehenkilöillä tuottamaan QMVR kunkin markkerin [11], QMVR arvot tutkimuksessamme perustuivat suuren joukon vastaavia normaalin DNA-näytteitä saatu CRC potilaista. Olemme huomanneet, että yleisin alleelit olivat lyhyempiä kunkin merkin (BAT26 1 kp, NR21 nR 27 2 emäsparin ja BAT25 NR24 3 emäsparia) ja siksi optimoitu QMVR siirtyivät hieman vasemmalle kuten osoitetaan harmaalla tummennetut alueet kuvassa 1A. Sen jälkeen me pidetään kasvain positiiviseksi alleelivariaatiota (tai epästabiili) tietyllä merkki kun kasvain alleelin koot eivät kuulu optimoitu QMVR. Tukeminen spesifisyys vastikään optimoitu QMVR, olemme huomanneet, että lähes kaikki vahvistusta profiileja kaikista MMR-taitavia kasvaimia kuului tähän ryhmään, kun taas lähes kaikki MMR-puutosta kasvaimia osoitti suuria alleelivaihtelujen useilla markkereita ja olivat tämän alueen ulkopuolella (kuvio 1 B ).

) alleelityypitys kokojakauma (in emäsparia) 213 normaalin DNA yksilöitä. Kunkin merkki, sininen varjostus osoittaa oikaistun QMVR, kun taas harmaa varjostus osoittaa koko joukko alleeliset koko saatu 426 ituradan alleeleja. B) jakauma alleelin koot MMR-puutosta (oranssi) ja MMR-asiantunteva (vihreä) CRC.

määritys alleelivaihtelujen tuumorikudok- DNA Jokainen Marker ja sen suhteesta MMR Status CRC

totesi, että koska merkittävää vastaavuutta välillä MMR IHC ja MSI tuloksia kunkin merkin, käytämme IHC tietoa laskemisessa cut-off kynnyksiä, jotka vastasivat menetys DNA MMR-proteiinin ilmentymisen ja MMR-puutos. Me määritelty cut-off kunkin viiden merkkiaineiden määrittämällä tietyn alleelin pituuden muutokset, joissa vähintään 95% kasvaimista oli sisällä QMVR (ei osoittanut epävakautta) ja olivat samanaikaisesti MMR-taitava mukaan IHC tuloksia. Tällä tavalla olemme onnistuneesti määrittänyt, että alleelinen ero 3 bp välillä kasvain ja vastaavassa normaalissa DNA: ta sekä BAT25 ja BAT26 oli diagnostisia MSI-positiivisen kasvaimen. Samoin ero 2 emäsparin kasvain verrattuna ituradan DNA NR21, NR24, ja nR 27 pidettiin positiivisena määrittelyyn MSI-positiivisuus (harmaa varjostettu neliö laatikko kuvassa S1).

Suorituskyky Ominaisuudet

yksittäiset

Pentaplex Merkit varten tunnistaminen MMR-puutteellinen CRC

vieressä tutki suoritusarvot yksittäisten pentaplex markkereita, erityisesti suhteellisen tutkittu ilmiö NR-markkereita tunnistamiseksi MMR-puutosta CRC (taulukko 2). Analyysimme käyttää ”QMVR arvot yksin” selvästi esiin luotettavuutta eri mono-markkereita havaitsemiseksi MMR puutteesta CRC kanssa

herkkyys

joka vaihteli 86,8%: sta 94,7%, ja

spesifisyys

96,0%: sta 100%, tunnistamiseksi MMR taitavia CRC. Kiinnostaa, kun tuloksia analysoitiin uudelleen käyttäen ”tietoja vastaavat normaalia DNA, tulokset olivat hämmästyttävän samanlainen, jossa kukin merkki näkyy

herkkyys

alueella 85,1%: sta 95,6% tunnistamiseksi MMR-puutosta CRC ja

spesifisyys

on 95,0%: sta 100% havaitsemiseksi MMR-taitavia CRC.

optimoidun Pentaplex PCR ei vaadi Yhteensopiva Normaali DNA havaita MMR-puutteellinen CRC

vieressä analysoineet kaikki mono-merkkiaineiden pentaplex PCR sekä MMR puutteellinen ja -proficient CRC käyttäen kaksi lähestymistapaa: ensin käyttäen ’QMVR tuloksia yksin’ (kuvio 2A vasen paneelit ja taulukko 3), ja toinen, kun tietoja oli saatavilla ”matching normaali DNA CRC potilaiden (kuvio 2A, oikea paneelit ja taulukko 4). Kun alleelivaihtelujen at ≥3 5 markkereita määriteltiin diagnoosi MSI, sekä strategiat näkyy 93,9% (CI, 87,9% -97,0%) herkkyys tunnistamiseen MMR puutteesta CRC ja 100% (CI, 96,3% -100%) spesifisyys MMR-taitavia CRC. Osalta korrelaatiota MSI tietojen MMR-proteiinin ilmentymisen tila, sekä strategiat oli samanlainen herkkyys kasvainten MLH1 (96,0%), MSH2 (100%), ja PMS2 (100%) puutos. Kumpikaan ei kuitenkaan lähestymistapa oli riittävän vahva havaita MSH6-puutos ja tunnistaa vain 37,5% (3/8) ja MSH6-puutosta CRC (kuvio 2B). Kääntäen kun MSI-H määriteltiin epävakauden ≥2 5 markkereita, sekä strategiat osoitti hieman parantunut herkkyys MMR-puutosta CRC (95,6%, Cl, 90,1% -98,1%) ja sama spesifisyys MMR-taitavia CRC (100 %, Cl, 96,3% -100%). Mutta tämä parannus johtui ainoastaan ​​lisääntynyt herkkyys havaita MSH6-puutosta kasvaimet (62,5%; 5 8 CRC), ilman mitään siihen liittyvää muutosta herkkyyden tunnistamiseksi MLH1 (96,0%), MSH2 (100%), ja PMS2 (100 %) puutteellinen (kuvio 2B). Näin ollen optimoitu pentaplex määritys on erittäin spesifinen ja herkkä havaitsemaan MMR-puutosta kulutustarviketta, ja että tavanomaiset DNA CRC potilas ei välttämättä parantaa sen suorituskykyä. Lisäksi käyttäen cut-off epävakauden ≥2 /5 markkereita määritellä MSI tuloksia maksimaalinen herkkyys ja tätä analyysiä, erityisesti näytteitä mutantti MSH6.

) Kuviossa on suorituskykyä pentaplex mononukleotidi-repeat maker paneeli määriteltäessä MSI aseman kasvain DNA ”QMVR only” (kun vastaaviin normaaleihin DNA ei ollut saatavilla) ja ”Normal DNA” vähentämällä ituradan alleeli pituudet kasvain kunkin kasvaimen. Tiedot kahdessa paneelien vasemmalla on peräisin MMR-puutosta kasvaimia, kun taas kaksi muuta paneelien oikealla edustaa MMR-taitavia CRC. (* Tarkoittaa yhdessä tapauksessa menetys molempien MLH1 ja MSH2). Musta neliöt osoittavat kasvaimen positiivinen alleelivariaatiota (eli epästabiili) ja valkoiset neliöt osoittavat kasvaimen negatiivinen tahansa alleelin variaatioita (ts vakaa). B) Näyttää taajuus MMR-puutosta kasvaimista useita markkereita näyttämään alleelivaihtelujen kun analysoitiin kaikista

viisi

pentaplex markkereita. C) Näyttää taajuus MMR-puutosta kasvaimista useita markkereita näyttämään alleelivaihtelujen kun analysoitiin vain

kolmea

pentaplex markkereita (BAT26, NR21 ja nR 27).

Association between Pentaplex mononukleotidi Toista merkkiaineet

sitten kysyttiin yhdistyksen välillä vallitsee yksittäisten mononukleotidi toista markkereita, vai onko epävakauden jokaisen markkeri oli riippumaton tapahtuma. Tätä varten suoritimme monimuuttuja korrelaatio sekä hierarkkinen klusterointi analyysi vertaamalla erot alleelinen koossa saatu kasvain ja normaali-DNA (kuviot 3A B). Kaikki korrelaatiokertoimet (r) osoittivat arvoja 0,75, mikä viittaa vahvasti keskinäinen yhdistys keskuudessa markkereita. Kuitenkin, kun analysoidaan erityisiä pareittain yhdistysten, havaitsimme, että BAT26, NR21 ja nR 27 osoittivat korkeampia korrelaatiokertoimet välillä toisiaan (kuvio 3A). Nämä havainnot vahvistivat upon hierarkkinen klusterointi analyysi, jossa huomasimme NR24 oli kauimpana yläosasta hierarkkinen puu, jonka jälkeen BAT25 verrattuna BAT26, NR21 ja nR 27 mikrosatelliittimerkkien toistoja joita tiukemmin korreloivat (kuva 3B).

A) Sirontakuvio matriisi osoittaa pareittain korrelaatiokerrointa (r) viidestä mikrosatelliittimarkkerin kohortin MMR-taitavia ja puutteellinen CRC. Y ja X-akseli merkitsevät absoluuttinen eroja alleelin kokoihin kasvaimen DNA ja normaalin DNA. B) Kuvassa näkyy hierarkkinen klusterointi analyysi on johdettu 104 MMR-puutteellinen ja 99 MMR-taitavia CRC. Tiedot esitetään matriisimuodossa, jossa rivit edustavat kukin CRC ja sarakkeet osoittavat yksittäisten mononukleotidi markkereita. Väriskaala edustaa kaltevuus (vihreästä punaiseen) absoluuttisen alleelin pituuden erot kasvain ja ituradan DNA QMVR standardoituja tietoja; vihreä (ei eroja alleelin kooltaan kasvain ja normaali DNA) punaiseen (merkittäviä eroja alleeliset pituudet välillä kasvain ja normaali DNA).

Alennettu Marker Yhdistelmä on yhtä tehokas kuin kaikki viisi Merkit on Pentaplex Pitoisuus

epäilivät alennettua paneeli merkkiaineiden voisi olla yhtä tehokas kuin kaikki viisi merkkiaineet pentaplex paneelissa. Tätä varten me uudelleen analysoineet seulonta suorituskykyä pentaplex PCR havaitsemiseksi MMR puutteesta CRC perustuttava kaikkiin

viisi

tai valittua paneeli

kolme

(BAT26, NR21 ja nR 27) markkereita MSI luokittelu analyysi (taulukot 3 4).

Kun MSI määriteltiin epävakauden ≥1 tai ≥2 3 markkereita, jälleen kerran, vertailukelpoinen herkkyysasteiden (93,9% -97,4%) ja spesifisyys (92,9% -100%) saatiin. Suhteen MMR-proteiinin ekspression tila, sekä strategiat näkyy samanlainen herkkyys kasvainten MLH1 (96,0%), MSH2 (100%), ja PMS2 (100%) puutos. Kuitenkin, kuten edellä on todettu, jossa on

viisi

markkeripaneelin, cut-off raja epävakauden ≥2 3 merkkiaineiden johti lisääntynyt herkkyys havaitsemiseksi MSH6 puutteellinen CRC (62,5%; 5 8 kasvaimia; kuvio 2C). Vaikka herkkyys MSI määrityksen käyttävät näitä on hieman pienempi 93,9% (CI 87,9% -97,0%) verrattuna käyttäen kaikkia viittä markkereita 95,6% (CI 90,1% -98,1%), spesifisyys Tämän määrityksen pysyi ennallaan (100% , jossa molemmat markkeripaneelit).

Screening suorittaminen Pentaplex Pitoisuus on parempi kuin NCI-paneeli markers

NCI-paneeli MSI markkereita (2 mono markkerit; BAT25 BAT26 ja 3-dinukleotidi markkereita, D3S1023, D5S346 D17S250) on nykyisin standardi MSI-määrityksen CRC [7]. Dinukleotidi merkkiaineita tässä paneelissa edellyttävät samanaikaisesti monistaminen vastaaviin normaaleihin DNA samalle potilaalle CRC, ja sopivat paremmin havaitsemaan MSI-L kuin MSI kasvaimia. Koska pentaplex markkereita ovat lähes monomorphic vertasimme seulonnan suorituskykyä näiden kahden MSI määrityksissä tunnistamiseksi kahden yleisimmin viallinen MMR proteiineja, MLH1 ja MSH2 meidän kokoelma CRC. Kuten on esitetty kuvioissa 4A B pentaplex markkereita osoitti parempia tai verrattavissa herkkyys ja NCI-paneeli merkkiaineita tunnistamiseksi MMR-puutteellisia CRC. Kun otetaan huomioon tämän skenaarion pentaplex PCR tarjoaa valtavia yleinen etu NCI-markkereita, koska se on nopea, käyttää yhdessä PCR-reaktiossa, vältetään tarve normaalin DNA: n, on vähemmän kallista ja on erittäin tarkka.

) kuvassa suorituskyvyn vertailu NCI-paneeli markkereita ja QMVR optimoitu pentaplex PCR. Musta neliöt osoittavat kasvaimen positiivinen alleelivariaatiota (vakaa) ja valkoiset neliöt osoittavat kasvaimen negatiivinen tahansa alleelin vaihtelut (tai vakaa). Dinukleotidi toista markkereita (D2S123, D5S346 ja D17S250) ovat vähemmän kestäviä kuin mononukleotidi toistuu havaitsemiseksi MSI. B) Kuvassa on taajuuden kasvainten määrä markkereita näyttämällä alleelivaihtelujen MMR puutteellista ja taitavia CRC. Kuten, pentaplex PCR osoittaa suurempi herkkyys ja spesifisyys verrattuna NCI paneelin markkereita, ja jakelu muuttuneen markkereita on yksiselitteisesti bimodaalinen.

Keskustelu

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli kehittää nopea ja erittäin tarkka MSI määritys, joka voidaan sovittaa mihin tahansa laboratoriossa varustettu automaattisella DNA sekvensserin. Tässä me optimoitu ja validoitu hyödyllisyys viiden mononukleotidi mikrosatelliittimarkkerin joka voidaan monistaa yhden pentaplex PCR-reaktio MSI määrittämiseen suuressa sarjassa MMR-taitavia ja puutteellinen CRC.

MSI analyysin kanssa NCI- paneeli viisi mikrosatelliittimarkkerin (2 mono- ja 3 di-nukleotidin toistoja) edelleen näyttää olevan edullinen menetelmä useimmissa kliinisissä ja tutkimuslaboratorioissa. Valitettavasti vaikka useita tutkimukset ovat toistuvasti osoittaneet, että mononukleotidi MSI markkereita tarjota parempaa tarkkuutta havaitsemiseksi MSI-H tai MMR-puutosta kasvaimia [10], tämä lähestymistapa ei ole saanut riittävästi tunnustusta tai hyväksymistä. Yksi tärkeimmistä teknisistä haasteista assayis huolellisen kertaluonteinen optimointi QMVR kutakin mono-merkki. Tämä johtuu siitä, alleelinen koko arvio näiden lähes monomorphic markkereita voidaan vaikuttaa erityisten reagenssien tai -sekvensointikonetta [14]. Tätä tukevat käsite, QMVR kaikkien merkkiaineiden meidän potilasryhmässä erosivat muutama emäsparin kuin mitä oli aikaisemmin raportoitu [11], [14]. Uskomme, että QMVRs tutkimuksessamme ovat vakaampia, koska nämä saatiin vastaavat normaali /ituradan DNA suuren joukon CRC potilaita, vaan terveistä yksilöistä kuin raportoitu aiemmin [11], [14]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet käyttökelpoisuutta BAT25 ja BAT26 markkereita tunnistamaan MSI-positiivisten CRC [9], on kuitenkin rajallinen ymmärrystä herkkyydet ja positiivinen ennustearvo arvojen NR-markkereita. Tuoreessa raportissa todettiin, että näyttö perustuu arvioon vain BAT26 ja NR24 voi olla tehokas havaitsemiseksi MMR-puutosta CRC [15]. Itse asiassa BAT26 oli suurin herkkyys ja positiivinen ennustearvo meidän kohortissa MMR-puutteellisia CRC. Päinvastoin, pareittain korrelaatio ja hierarkkinen klusterointi analyysi tutkimuksessamme osoitti selvästi heikoin ennustava arvoja NR24 (ja BAT25), verrattuna jäljellä

kolme

markkereita (BAT26, NR21, ja nR 27). BAT26 on lähes monomorphic markkeri, joka sijaitsee välittömästi 3′-

MSH2

eksonin 5, ja pidetään hyvin herkkiä ja spesifisiä MSI testaus. Kuitenkin suuret deleetiot

MSH2

, jotka sisältävät BAT26 lokuksen eivät ole harvinaisia ​​CRC, ja tällaisissa tapauksissa, vaikka kasvain on MMR-puutteellinen, PCR on BAT26 lokuksen johtaa väärän negatiivisen monistaminen villityypin alleelit normaalista solujen kasvain massa [16]. Nämä tiedot varoittavat perinteisen viisauden, että vaikka BAT26 käytetään usein MSI-määritystä käyttäen BAT26 yksin tai yhdessä epätarkempi markkeri kuten NR24 voi aliarvioida MSI, ja se estä havaita mahdollisia MMR-puutosta CRC. Lisäksi havaintomme Suurherkkyystilan ja positiivinen ennustearvo alennetusta paneeli

kolme

markkereita (BAT26, NR21 ja nR 27) verrattuna kaikkiin

viisi

päättäjät ovat taloudellisia vaikutuksia tulevien MSI- perustuvissa määrityksissä.

Toinen kriittinen ongelma käytön pentaplex määritys on puute sopimus vähimmäismäärä epävakaa markkereita tarvitaan luokitella kasvain kuin MSI. Tässä yhteydessä alkuperäistä raportissa ehdotettiin ≥3 /5 epävakaa merkkiaineiden kasvainten DNA olisi määriteltävä MSI-positiivisten CRC [10], kun taas myöhempi tutkimus ehdotti, että epävakaus vain ≥2 /5 markkereita riitti havaitsemaan MMR puutosta CRC [15]. Me uudelleen tätä kysymystä analysoimalla dataa useita lähestymistapoja ja tuloksemme osoittavat, että herkkyys ja spesifisyys pentaplex PCR ei vaikuttanut riippumatta siitä meillä pitää katkeamisen ≥2 tai ≥3 5 markkereita havaitsemiseksi MLH1, MSH2 ja PMS2 puutteesta CRC. Kuitenkin ehdotamme, että kriteerinä ≥2 5 epävakaa markkereita on tarkempi, koska se parantaa seulonta määrityksen suorituskykyyn tunnistamalla ylimääräisiä MSH6 puutosta kasvaimet lisäämättä mitään vääriä positiivisia.

Yksi rajoituksista NCI-paneeli markkereita on sen kyvyttömyys tunnistaa MSH6 puutteesta CRC. Tuloksemme osoittavat, että käyttö mono-merkkiaineiden pentaplex paneelissa voi tunnistaa valtaosa MSH6 puutteellinen CRC. Tämä on merkittävä, koska MutSα monimutkainen, heterodimeeri MSH2 ja MSH6, tunnistaa edullisesti emästä /emäsyhteensopimattomuuksia sekä pieniä insertio /deleetio silmukoita, jotka sisältävät 1 tai 2 paritonta nukleotidin DNA-sekvenssin ja ohjaa korjaus näiden leesioiden [17] . Siksi voisi odottaa, että toiminnallinen menetys MutSα johtuu MSH6-puutos johtaisi etuoikeutettu epävakauteen loci sisältävä mononukleotidi toistoja [18].

Yhteenvetona esitämme näyttöä siitä, että suositaan optimoidun pentaplex PCR järjestelmä seulontaan MMR-puutteellisia CRC. Tuloksemme osoittavat, että yhden kerran optimoitu QMVR tekee tarpeettomaksi monistamiseen vastaaviin normaaleihin DNA määrittää epävakautta kasvainkudoksen, ja että epävakaus on ≥2 5 markkereita tarjoaa eniten vankka strategia tunnistaa MMR puutteesta CRC. Tuloksemme viittaavat siihen, että merkki paneeli koostuu BAT26, NR21 ja nR 27 markkereita oli niin tarkka kuin viiden markkeripaneeli MSI analyysiä. Tärkeää on, että pentaplex markkereita osoitti suurempaa herkkyyttä diagnosoimaan MSH6-puutosta CRC. Ehdotamme, että tämä määritys korvaa olemassa olevia menetelmiä ja parantaa MSI-pohjainen CRC seulonnan tulevaisuudessa.

tukeminen Information

Kuva S1.

taajuus alleelin Kokoerojen (BP) välillä normaalin ja kasvaimen DNA jokaisessa merkki, ja MSI aseman määrityksen QMVR (vaakapalkeilla sininen ja punainen vasemmalla puolella) sekä tilan MMR-proteiinin ilmentymisen IHC (vaakapalkeilla vihreä ja oranssi oikealla puolella). Numerot Y-akselilla ovat alleelin koot ero (BP) välillä normaalin ja kasvaimen DNA. Numerot punaisella heijastavat mikrosatelliittien epävakaus cut-off vaihteluvälit määritellään kullekin merkkiaineiden perustuu niiden poikkeama QMVR alue ja IHC tiedot.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0009393.s001

(1,59 MB TIF) B

Kiitokset

Haluamme kiittää Johannes Gebert, PhD ja Matthias Kloor, MD (Institute of Pathology, University of Heidleberg, Saksa) anteliaasti tarjota paksusuolensyöpä yksilöitä, ja niiden hyödyllisiä keskusteluja ja kriittinen tarkastelu käsikirjoituksen.