Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpä kantasolut (CSCS) ovat vastuussa syövän etenemisen, etäpesäkkeitä, ja toistumisen. Tähän mennessä spesifisten CSCS jäävät havaitsematta. Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää uusien biomarkkereiden mahalaukun CSCS kliiniseen diagnoosiin käyttämällä proteomiikka tekniikkaa. CSC-, kuten SP-soluja, OCUM-12 /SP-soluja, OCUM-2MD3 /SP-soluja, ja niiden emo- OCUM-12-solujen ja OCUM-2MD3 soluja käytettiin tässä tutkimuksessa. Proteiini lysaatit kustakin solulinjasta analysoitiin QSTAR Elite nestekromatografia Tandem massaspekrometria yhdistettynä isobaaristen tunnisteita suhteellisen ja absoluuttisen kvantitointiin tekniikkaa. Ehdokas proteiinit havaitaan proteomiikka teknologian todensi immunohistokemiallisella analyysi 300 syöpien. Tulosten perusteella LC-MS /MS, kahdeksan proteiineja, mukaan lukien rbbp6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA, ja KRT18, oli säädelty sekä OCUM-12 /SP-soluissa ja OCUM-2MD3 /SP soluja verrattuna niiden vastaaviin kantasoluja. RT-PCR-analyysi osoitti, että ilmentymistaso on

rbbp6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1

, ja

CK18

oli korkea OCUM-12 /SP ja OCUM-2MD3 /SP, vuonna kontrolliin verrattuna vanhemman OCUM-12 ja OCUM-2MD3. Nämä proteiinit liittyivät merkittävästi kehittynyt invaasio syvyys, imusolmuke etäpesäke, kaukainen etäpesäke tai vietyyn kliiniseen vaiheeseen. Rbbp6, DCTPP1, HSPA4, ja ALDOA ilmaisun erityisesti liittyi merkittävästi huonoon ennusteeseen vuonna 300 mahasyövän potilaille. Rbbp6 määritettiin olevan riippumaton ennustetekijä. Motiliteettia stimuloiva kyky OCUM-12 /SP-soluissa ja OCUM-2MD3 /SP-soluissa estyi

rbbp6

siRNA. Nämä havainnot saattavat ehdottaa, että kahdeksan proteiinit, rbbp6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA, ja KRT18 hyödyntäen vertaileva proteomiikka-analyysi, koettiin mahdollisia CSC markkereita mahasyövän. Kahdeksan ehdokas proteiineja, rbbp6 ehdotettiin olevan lupaava prognostista biomarkkeri ja terapeuttinen kohde mahasyövässä.

Citation: Morisaki T, Yashiro M, Kakehashi A, Inagaki A, Kinoshita H, Fukuoka T, et al. (2014) Comparative Proteomiikka analyysi mahasyövän Stem Cells. PLoS ONE 9 (11): e110736. doi: 10,1371 /journal.pone.0110736

Editor: Anita B. Hjelmeland, University of Alabama at Birmingham, Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 toukokuu 2014; Hyväksytty: 16 syyskuu 2014; Julkaistu: 07 marraskuu 2014

Copyright: © 2014 Morisaki et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja. Liittyminen numerot proteiinin tiedot ovat mukana UniProt /Swiss-Prot taulukossa 2.

Rahoitus: Tämä tutkimus on osittain rahoittama KAKENHI (Grant-in-tuki Scientific Research, nro. 22390262, 23390329 ja 26293307 ), National Cancer Center tutkimus- ja kehitysrahasto (23-A-9), ja Priority Research Fund Osaka City University. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä kantasolut (CSCS) määritellään ainutlaatuinen alaryhmän kasvaimia, jotka omaavat kyvyn aloittaa kasvaimen kasvua ja ylläpitää itseuudistumisen [1]. On ehdotettu, että ne voivat aiheuttaa heterogeenisen linjaa syöpäsoluja, jotka muodostavat tuumorin sekä tärkeä rooli maligni kehittyminen karsinooma, kuten etäpesäkkeiden, toistuminen, ja chemoresistance [2] – [4]. CSCS alun perin tunnistettiin akuutti myelooinen leukemia [5], mutta on viime aikoina raportoitu olemassa erilaisia ​​syöpiä, mukaan lukien mahasyöpä [6]. Tunnistaminen CSC markkereita voivat avata uuden terapeuttinen näkökulma pohjalta valikoidusti kohdistettu tämän pienen populaation soluja [7], [8]. Viime aikoina on raportoitu, että CSCS mahdollisesti eivät ilmaista oman ainutlaatuisen markkereita, kuten aldehydidehydrogenaasin 1 (ALDH1) [9], CD44 [10], [11], ja CD133 [12]. Kuitenkin monet julkaistut markkereita eivät ole yksinomaan CSCS. Quantitative proteiinin ilmentymisen profilointi mahdollistaa tehokkaan tunnistamisen tarkkoja ja toistettavia differentiaalikaavojen arvot proteiinien [13]. Isobaaristen tageja suhteellisen ja absoluuttisen määritysrajan (iTRAQ) yhdistettynä moniulotteisten nestekromatografialla (LC) ja tandem-massaspektrometrialla (LC-MS /MS) analyysi on nousemassa voimakas menetelmää etsittäessä kasvaimen biologisten merkkiaineiden [14]. Olemme aiemmin raportoitu, että puoli väestöstä (SP) solut kykenevät itse uudistumaan ja tuottamaan ei-SP soluja, ja että syöpäsolujen SP jakeet omaavat korkean mahdollisesti tuumoreita, kaukainen etäpesäke [3], ja chemoresistance [2]. Tämä viittaa siihen, että SP solut mahasyövän hallussaan syövän kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia. Siksi Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli havaita uusi CSC merkki (t) mahasyövän vertaamalla proteomeja keskuudessa emosoluina ja kantasolujen kaltaisia ​​SP soluja, jotka ovat olleet tiedossa ovat rikas CSC väestöstä [15].

Materiaalit ja menetelmät

Cell Cultures

kaksi mahalaukun syövän solulinjat, OCUM-2MD3 [16] ja OCUM-12 [17], käytettiin tässä tutkimuksessa. Nämä solulinjat, jotka ovat peräisin diffuusi-tyypin mahasyöpä. Viljelyolosuhteet viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM; Nikken, Kioto, Japani), jossa oli 10% lämpöinaktivoitua vasikan sikiön seerumia (FCS; Life Technologies, Grand Island, NY), penisilliiniä ja streptomysiiniä ja 0,5 mM natriumpyruvaattia, ja inkuboitiin 37 ° C: ssa. OCUM-12 /SP ja OCUM-2MD3 /SP solulinjat olivat SP-soluja, jotka arvioitiin virtaussytometrianalyysin käyttämällä Hoechst 33342 niiden emosolulinjoista, OCUM-2MD3 ja OCUM-12, vastaavasti. Lajittelu suoritettiin kolme kertaa vakiintumaan SP-rikastettu soluissa. Jälkeen kolmen kuukauden itämisaika lajittelun jälkeen, OCUM-12 /SP-soluissa (6,5%) ja OCUM-2MD3 /SP-soluissa (12,2%) oli yhä suuri osa SP fraktion, verrattuna emo OCUM-12 (3,2% ) ja OCUM-2MD3 (6,3%) soluja (kuvio S1). Myöhemmin nämä SP-rikastettu solujen vakaa väestö olivat solulinjoja käytetään analyysissä, kuten aiemmin raportoitu [18].

Ihmisen kudosnäytteet ja Potilastiedot

Tissue näytteet saatiin 300 potilasta diagnosoitu mahalaukun syöpä sallittuja toimia Osaka City University. Taulukko 1 esittää ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia 300 mahasyöpäpotilaista. Oli 208 mies- ja 92 naispotilaita, jossa mediaani-ikä 64 vuotta (vaihteluväli, 28-85 vuotta) ajankohtana toiminta. Diagnoosit varmistettiin ainakin kaksi ihmistä. Staging määritettiin mukaisesti Japani luokittelu mahakarsinooman (14

th edition) [19]. Tutkimus hyväksyttiin Osakan City University eettisen komitean (Osaka, Japani). Kirjallinen suostumus luovuttajalta saatiin käyttöön Tämän näytteen tutkimukseen.

Proteiinin tunnistaminen ja kvantifiointi mukaan QSTAR Elite LC-MS /MS

Syöpäsolut (60 ug kutakin ) homogenisoitiin ja sitten lyysattiin käyttämällä joko 100 ui T-PER lyysipuskuria (Thermo Scientific) tai 500 ui 9 M ureaa, 2% CHAPS lyysipuskuria, jossa on proteaasin estäjä. Tämän jälkeen solu- lysaatti käsiteltiin sitten ultraäänikäsittelyllä. Jälkeen asetonilla saostamalla, proteiinikonsentraatiot mitattiin BCA Protein Assay (Pierce, IL, USA). Reduction, alkylointi, ruoansulatus, ja myöhemmin peptidi merkinnöistä 50 ug proteiinia kustakin näytteestä tehtiin käyttämällä AB Sciex iTRAQ Reagent Multi-Plex Kit (AB Sciex, Concord, ON, Kanada) [20]. ITRAQ-leimattuja näytteitä lastataan ICCAT kationinvaihto kasetti (AB Sciex). Peptidit eluoitiin kuusi fraktiot (1 ml KCL, jossa oli 10, 50, 70, 100, 200, ja 350 mM), ja supernatantti kustakin haihdutettiin tyhjössä sentrifugia. Näytteet olivat sitten suolanpoisto ja konsentroitiin käyttämällä Sep-Pak Light C18 patruunat (Waters Corporation, Milford, MA), haihdutettiin tyhjössä sentrifugin, suspendoitiin uudelleen 20 ul: aan 0,1% (v /v) muurahaishappoa, ja sen jälkeen levitetään QSTAR Elite LC -MS /MS. Kukin näyte ajettiin 150 minuuttia. MS /MS-tiedot on vastaavuushaku Sveitsin Protein tietokanta (ihmisen) käyttäen ProteinPilot ohjelmistoa (versio 2.0, AB Sciex) trypsiinillä asetettu pilkkovan entsyymin ja metyyli methanethiosulfinate kuin kysteiini muutos. Jotta voitaisiin poistaa tarpeeton osumia ja vertaileva kvantitointi, hakutulokset saadut jatkokäsitteli ProteinPilot ohjelmisto avulla Paragon algoritmi. Tämä johti minimaalinen joukko perusteltua tunnistettu proteiineja. Raportoitu aineisto on käytetty 95%: n luottamusväli cut-off rajan. Suhteellinen kvantitointi peptidien laskettiin suhteena jakamalla iTRAQ toimittaja intensiteettiä. Suhteet peptidejä, jotka tukevat olemassa yhden proteiinin laskettiin keskiarvo suhteellisen proteiinin kvantitoimiseksi. Sen jälkeen ProteinPilot analyysi ja kekseliäisyyttä koulutusjakson analyysi (IPA) (Ingenuity System, Mountain View, CA) tehtiin. Suorittamisen jälkeen Simple t-testi yksi laskettu keskimäärin proteiinin suhde vastaan ​​1 pätevyyden arvioimiseksi proteiinin ilmentyminen muuttuu, p-arvo oli raportoitu. Proteiini suhteet, joiden p-arvo on alle 0,05 pidettiin luotettavina. On tunnettua, että 90% iTRAQ koeajojen tehty aiemmin, keskihajonnat proteiinin suhde, jotka johtuvat teknisistä vaihteluista, raportoitiin olevan alle 0,3. Näin ollen ilmaisu muuttuu enemmän kuin 1,2-kertainen tai pienempi kuin 0,8-kertainen normalisoitujen ekspressiotasoja pidettiin alueen ulkopuolella teknisiä vaihtelua. Meillä on myös suoritettu ei-leimatun analyysi, ja havaitaan proteiinien läsnäolo ainoastaan ​​OCUM-12 /SP-soluissa ja OCUM-2MD3 /SP-soluissa, mutta ei sisällä kantasoluja [21]. Kukin näyte ajettiin kahdesti. Sovellettu LC-MS /MS-tutkimuksen yhdessä iTRAQ tekniikka on raportoitu luotettava kvantitatiivinen menetelmä proteiinin ilmentymistä, ovat vieläkin herkempi kuin western blot, joka riippuu siitä, minkä tyyppistä käytetään vasta-aineita, [22].

IPA ja valinta Candidate proteiinit

IPA tietokantaa käytetään pääasiassa alalla omaa ontologian, joka sisältää jopa 300000 biologisia tuotteita kuten geenien, proteiinien, molekyyli- ja solutason prosesseja. Siksi IPA käytettiin analysoitaessa proteiinia molekyylien toimintoja, lokalisointi. Lisäksi yksityiskohtaiset tiedot toiminnoista ja solujen sijainnit tunnistettu proteiinien saatiin. Tulosten perusteella LC MS /MS ja IPA analyysit, proteiineja, jotka havaittiin olevan yli-ilmentynyt SP solulinjojen, verrattuna niiden vastaaviin taajuus ilmentymistä vanhemman solulinjojen, valittiin ehdokkaaksi biomarkkereita SP soluja mahalaukun syöpä. Tunnistaminen verkostojen vuorovaikutuksessa proteiinien sekä toiminnalliset ryhmät ja reitit tuottivat IPA, ja analyysi riippuu aiemmin tunnettu yhdistysten.

Quantitative Reaaliaikainen käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio (RT-PCR ) B

Mahasyöpää soluja viljeltiin. Ja solun kokonais-RNA uutettiin käyttäen RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Carlsbad, CA). cDNA valmistettiin 2 ug RNA: ta käyttämällä satunnaisia ​​alukkeita (Invitrogen). Määrittää kertainen muutokset kunkin geenin RT-PCR suoritettiin ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA), jossa kaupallisesti saatavilla geenin ilmentymisen määrityksissä (Applied Biosystems) ja

rbbp6

(

retinoblastoomaa sitovan proteiinin 6

, Hs00544663),

HSPA4

(

lämmön shock 70 kDa proteiini 4

, Hs00382884),

HSPA9

(

lämmön shock 70 kDa proteiinia 9

; Hs00269818),

GLG1

(Golgi glykoproteiinin 1, Hs00939452),

DCTPP1

(

dCTP -pyrofosfa- 1

, Hs00225433),

VPS13A

(

vakuolaarisen proteiini lajittelu 13 homologi

, Hs00362891),

CK18 (keratiini 18

, Hs028277483),

ALDOA (aldolaasisekvenssien

, Hs00605108),

CD44

(Hs01075862),

CD133

(Hs01009250) ja

Nanog

(Hs02387400). GAPDH (SIGMA) käytettiin sisäisenä standardina normalisoida mRNA-tasoja. Kynnys (Ct) arvot käytettiin laskettaessa suhteellisen ekspression suhteet kontrollin ja käsiteltyjen välillä soluja.

Western blot-analyysi

Expression tason rbbp6 ja ALDOA syöpäsoluissa tutkittiin seuraavasti. Solulysaatit kerättiin eri käsittelyjen jälkeen. Sen jälkeen, kun proteiinin konsentraatio kussakin näytteessä säädettiin, elektroforeesi suoritettiin käyttäen 10% Tris /Gly geeleissä (Life Technologies, Carlsbad, CA). Proteiinivyöhykkeet saadut siirrettiin Immobilon-P Transfer kalvo (Amersham, Aylesbury, UK). Sitten kalvo pantiin PBS-T liuosta, joka sisälsi anti-rbbp6 (WH0005930M1, Sigma-Aldrich, MO, USA), anti-ALDOA (HPA004177, ATLAS), ja anti-β-aktiini (1:300 laimennus; Sigma- Aldrich), ja annettiin reagoida huoneen lämpötilassa 2 tuntia. Tasot tiettyjen proteiinien kussakin lysaatin havaittiin tehostetulla kemiluminesenssin avulla ECL plus (Amersham) seurasi autoradiografia.

Sirna malli

sekvenssit

rbbp6

pieni häiritsevä RNA (siRNA), rakenne on seuraavanlainen: si

rbbp6

mielessä, 5′-GAAAGAAGAAUAUACUGAUtt-3 ’; antisense, 5’-AUCAGUAUAUUCUUCUUUCgt-3 ’, ja nontargeting siRNA (negatiivinen-siRNA) hankittiin Ambion (Life Technologies, Carlsbad, CA) .OCUM-12 /SP ja OCUM-2MD3 /SP-soluja valmistettiin 60% konfluenssin kuuden hyvin ruokia. Transfektioseos valmistettiin lisäämällä 150 ui Opti-MEM, mukaan lukien 9 ui Lipofectamine-RNA: Imax Regant (Life Technologies) ja 150 ui Opti-MEM, mukaan lukien 90 pmol siRNA ja inkuboimalla 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Lopuksi, edellä transfektioseos lisättiin valmis kuusi hyvin lautasen. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen, RT-PCR suoritettiin.

Haavan paranemista määritys

Cancer-soluja viljeltiin 96-kuoppalevyillä (Essen Instruments, Birmingham, UK). Sen jälkeen, kun solut saavuttivat semi-yhtymäkohta, haava luotiin yksisolukerros 96-by WoundMaker (Essen Bioscience, MI, USA). Naarmuuntunut kentät otettiin kuvassa 3 tunnin välein ja seurattiin Incucyte live-Cell Imaging System ja ohjelmistot (Essen Instruments). Aste solujen vaellukset analysoitiin 24 tunnin kuluttua haavan hoidon prosentteina haavan yhtymäkohta. Keskiarvo 4 kenttien laskettiin näytteen arvo.

invaasiomääritys

Käytimme chemotaxicell kammiot (Kubota, Osaka, Japani), jossa on 12-um huokosia kalvosuodattimella päällystetty 50- ug Matrigel (Collaborative Research Co., Bedford, MA). Kammio (ylempi komponentti) asetettiin 24-kuoppaisen kuoppalevyn kuoppaa (alempi komponentti). Mahasyöpä solut suspendoitiin uudelleen lopulliseen konsentraatioon 5 x 10

3 solua /ml. Seuraavaksi 500 ui alempi komponentteja. Kun oli inkuboitu 48 tuntia, syöpäsolut yläpintaan kalvon poistettiin pyyhkimällä ja värjättiin hematoksyliinillä. Syöpäsolut, jotka tunkeutuivat suodattimen läpi, päällystetty Matrigel alempaan kalvoon manuaalisesti laskettiin mikroskoopilla x 200 suurennuksella. Kuusi satunnaisesti valitun kentät laskettiin kutakin määritystä varten. Keskimääräinen neljästä kentästä laskettiin näytteen arvo. Kullekin ryhmälle, viljelmä tehdään kolmena kappaleena.

Validation of Protein Expression immunohistokemiallisesti

Immunohistokemia suoritettiin formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut kudosnäytteet, jotka poistettiin parafiini ksyleenillä ja kuivattu kautta arvostellaan etanolia. Leikkeitä kuumennettiin 10 minuuttia 105 ° C: autoklaavissa Target Retrieval Solution (DAKO). Näytteet tämän jälkeen inkuboitiin 3% vetyperoksidia endogeenisen peroksidaasin salpaamiseksi toimintaa. Seuraavia vasta-aineita käytettiin immunohistokemiallisessa prosessi: anti-rbbp6 (retinoblastooma sitova proteiini 6, WH0005930M1, 6:1000; Sigma-Aldrich), anti-GLG1 (Golgi glykoproteiinin 1, HPA010815, 1:80, Atlas), anti-VPS13A (vakuolaarisen proteiini lajittelu 13 homologi A; NBP1-85642, 1:500; Novus Biologicals), anti-ALDOA (aldolaasi A, fruktoosi-bifosfaatin; HPA004177, 1:400, Atlas), anti-DCTPP1 (dCTP Pyrophosphatasea 1; HPA002832, 1:200, ATLAS), anti-HSPA9 (lämpösokkiproteiini 70 kDa: n proteiini 9, HPA000898, 1:200, Atlas), anti-HSPA4 (lämpösokkiproteiini 70 kDa proteiini 4, HPA010023, 1:200, ATLAS), ja anti-KRT18 (keratiini 18; ab668, 1:500; Abcam). Näytteitä inkuboitiin vasta-aineen kukin yön yli noin 4 ° C: ssa. Sen jälkeen näytteitä inkuboitiin haltuun immunoglobuliini G: ssa 10 minuuttia, minkä jälkeen suoritettiin kolme pesua PBS: llä. Kaikki näytteet käsiteltiin sitten streptavidiini-peroksidaasilla reagenssia ja inkuboitiin PBS: ssä diaminobentsidiinillä ja 1% vetyperoksidia (tilavuus /tilavuus), jota seurasi counterstaining Mayerin hematoksyliinillä.

immunohistokemiallinen arviointi

rbbp6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA, ja KRT18 ekspressiotasot arvioitiin sekä värjäytymisen intensiteetti ja osa värjätään syöpäsoluja. Värjäytymisintensiteettiä pisteytettiin asteikolla 0-3 (0 = ei, 1 = lievä, 2 = kohtalainen, 3 = voimakas). Värjäystä osuudet pisteytettiin asteikolla 0-4 (osuus oli erilainen kullakin vasta-aineella), joka perustuu prosenttiosuus positiivisesti värjäytyneiden solujen. Näin ollen lopullinen värjäys pisteet, joka laskettiin moninkertainen värjäytymisintensiteettiä pisteet ja värjäys osuus pisteet, olisi asteikolla 0-12. Ekspressiotasot DCTPP1 katsottiin positiiviseksi, kun se sai arvioinnissa 3. ekspressiotasot HSPA4 katsottiin positiiviseksi, kun se sai arvioinnissa 6. ekspressiotasot ALDOA, KRT18, VPS13A, ja GLG1 katsottiin positiiviseksi, kun jokainen sai arvioinnissa 8. rbbp6 arviointi joista vain värjäytyminen osuus pisteet käytettiin laskennassa, pidettiin positiivisena, kun se sai arvioinnissa 3. HSPA9 arviointi joista vain värjäytymisintensiteettiä pisteet käytettiin laskennassa, pidettiin positiivisena, kun se sai arvioinnissa 3. Kaikki arvioinnit tehtiin kaksi tarkkailijaa, jotka eivät olleet tietoisia kliinisten tietojen ja tuloksista. Kun poikkeava arviointi kahden riippumattomat tarkkailijat todettiin, objektilasit uudelleen ja reevaluated keskustelun jälkeen.

Tilastollinen analyysi

SPSS ohjelmisto (SPSS Japani, Tokio, Japani) käytettiin tietojen analysointi. Tilastollisesti merkittävä assosiaatioita proteiinien ilmentymiseen ja eri kliinispatologiset muuttujia, kuten ikä, sukupuoli, makroskooppinen tyyppi, kasvain eriyttäminen, kokonaismäärä resektoitiin imusolmuke, ja kirurgian tyyppi (D1 tai D2 gastrectomy) arvioitiin käyttämällä Fisherin ja Chi -squared testejä. Survival käyrät laskettiin päivänä leikkauksen kuolinhetkellään tai viimeiseen seurannan havainto käyttäen Kaplan-Meier Method. Lisäksi mahdolliset erot eloonjäämiskäyrien arvioitiin käyttäen log-rank testi. Monimuuttuja analyysit suoritettiin Cox regressiomallin määrittää assosiaatioita kliinis muuttujien ja kuolleisuutta. P-arvot 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Euroopan stemness mahalaukun syövän solulinjoista

prosenttiosuudet SP solut olivat korkeammat OCUM-12 /SP ja OCUM-2MD3 /SP-soluissa kuin vanhempiensa OCUM-12 ja OCUM-2MD3 soluissa (kuvio S1). Cancer kantasolujen merkkiaineita SP-solujen, OCUM-12 /SP ja OCUM-2MD3 /SP, kuten CD44, CD133, ja Nanog, analysoitiin RT-PCR: llä. Ilmaisu taso Näiden merkkiaineiden oli merkittävästi kasvanut sekä SP solulinjoissa, verrattuna niiden emosolulinjoista (kuva S2). Määrä pallomainen pesäkkeitä oli huomattavasti korkeampi sekä OCUM-12 /SP ja OCUM-2MD3 /SP-soluissa kuin vanhemman OCUM-12 ja OCUM-2MD3 soluja (tietoja ei esitetty).

Detection of Candidate Proteiinit

olivatko proteiinit differentiaalisesti tai itsenäisesti ilmaistuna SP-soluissa, ja verrattuna meidän havaintoja kuin niiden kantasolujen avulla QSTAR Elite LC-MS /MS. Analysoitaessa biologisia prosesseja, ja 95%: n luottamusväli katkaisuraja ja p 0,05 tunnistimme, että proteiinit todellakin ilmentyvät eri. Tulokset näistä tulokset esitetään kuviossa 1. Useimmat proteiinit yli-ilmentyy sytoplasmassa tuumorisolujen (kuvio 1A). P-arvon mukana nerokkuus analyysi esitetty taulukossa S1. Nämä proteiinit määritettiin liittyvän solun prosesseja, kuten solukuoleman, aineenvaihduntaa, solujen organisaatio, DNA aineenvaihduntaa, proteiinien hajoaminen, ja käsittely RNA: n (kuvio 1 B). Top kanoninen reitit liittyvät näihin tavoitteisiin ja tunnistetaan IPA on esitetty taulukossa S2.

(A) Localization; (B) Biologiset prosessit tunnistettujen proteiinien. Olemme luokiteltu proteiinit perustuen niiden toiminnallisten tehtävien avulla Ingenuity Pathway Analysis. Molekyyli- toiminnot raportoitiin sisältävät solukuoleman, aineenvaihduntaa, solujen organisaatio, aineenvaihduntaa DNA, proteiinin hajoaminen, käsittely RNA, reaktiivisten hapen lajien, typpioksidi, molekyyli- liikenteen, solusyklin, taitto-proteiinia, ja solujen liikkumisen. % = 100 x tunnistettujen proteiinien /kaikki 932 proteiinit analysoitiin. (C), Venn kaavio antaa taulukon 2 neljäkymmentä proteiinit lisättiin merkittävästi OCUM-12 /SP-soluissa verrattuna niiden emo OCUM-12-soluissa. Kolmekymmentäviisi proteiinit lisääntyneet huomattavasti OCUM-2MD3 /SP-soluissa verrattuna niiden emo OCUM-2MD3cells. Kahdeksan ehdokas proteiineja, rbbp6, HSPA4, HSPA9, GLG1, DCTPP1, VPS13A, CK18 ja ALDOA, päällekkäisyyksiä sekä OCUM-12 /SP ja OCUM-2MD3 /SP-soluissa. (D), mRNA: n ilmentymistä. RT-PCR-analyysi osoitti, että ilmentymistaso on

rbbp6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1

, ja

CK18

oli korkea OCUM-12 /SP (9,15-kertainen, 9,36-kertaiseksi, 4,14 kertainen, 7,80 kertainen, 2,08 kertainen, 1,46 kertainen, 3,44 kertaiseksi, ja 1,99 kertaiseksi) ja OCUM-2MD3 /SP (6,15 kertainen, 1,71 kertainen, 2,33 kertainen, 2,30 kertainen, 2,03 kertainen, 1,32 kertainen, 1,35 kertaiseksi, ja 1,31 kertaiseksi) ja kontrolliin verrattuna vanhemman OCUM-12 ja OCUM-2MD3. (E), korrelaatio signalointireittien välillä rbbp6 ja Differentially-ilmaistuna proteiinit CSC kaltaisia ​​SP-soluissa. Rbbp6 on yli-ilmentynyt (punainen) CSC-, kuten SP-soluja (OCUM-12 /SP-soluissa ja OCUM-2MD3 /SP-soluja). Hsp90, HSPA4, ja TAGLN2 (vaaleanpunainen) säädellään ylöspäin CSC kaltaisia ​​SP solut liittyvät rbbp6 signalointireitin.

Kun verrataan niiden vastaavaan emosoluina, 40 proteiinit olivat säädellään ylöspäin OCUM-12 /SP, ja 35 proteiinit olivat säädellään ylöspäin OCUM-2MD3 /SP. Näiden proteiinien joukossa, oli kahdeksan säädelty sekä OCUM-12 /SP-soluissa ja OCUM-2MD3 /SP-soluissa, kun taas tällaista yhdistyksen välillä havaittiin niiden vastaavia kantasoluja (taulukko 2 ja kuvio 1 C). Näiden kahdeksan proteiineja, näiden kolmen proteiinin, rbbp6, GLG1, ja VPS13A, jotka itsenäisesti havaittiin sekä SP solulinjoissa, mutta ei niiden vastaavia kantasoluja. Viisi proteiinit, DCTPP1, HSPA9, HSPA4, ALDOA, ja KRT18, olivat huomattavasti yli-ilmentynyt ainakin 1,2-kertainen sekä SP-soluissa verrattuna niiden vastaaviin kantasoluja.

mRNA: n ekspression taso näistä 8 ehdokas molekyylejä,

rbbp6, HSPA4, DCTPP1, HSPA9, VPS13A, ALDOA, GLG1

, ja

CK18

nostettiin OCUM-12 /SP (9,15 kertainen, 9,36 kertainen, 4,14-kertaiseksi, 7,80 kertainen, 2,08 kertainen, 1,46 kertainen, 3,44 kertaiseksi, ja 1,99 kertaiseksi) ja OCUM-2MD3 /SP (6,15 kertainen, 1,71 kertainen, 2,33 kertainen, 2,30 kertainen, 2,03 kertainen, 1,32 kertainen, 1,35 kertaiseksi, ja 1,31 kertaiseksi) soluja, verrattuna niihin, jotka valvonnan vanhemman OCUM-12 ja OCUM-2MD3 soluissa (kuvio 1 D). Western blot-analyysi osoitti, että ilmentymistaso rbbp6 ja ALDOA oli korkea CUM-12 /SP ja OCUM-2MD3 /SP-soluissa, verrattuna, että OCUM-12 ja OCUM-2MD3 soluissa (kuvio S3).

verkko esitetty kuvassa 1E tuottivat IPA, ja analyysi riippuu aiemmin tunnettu ja raportoitu proteiinien vuorovaikutusta. Näin ollen, rbbp6, joka havaittiin olevan yli-ilmentynyt CSC-, kuten SP-soluja, OCUM-12 /SP-soluissa ja OCUM-2MD3 /SP-soluissa, liittyy suoraan HSPA4 ja Rb, ja epäsuorasti liittyy Hsp90 ja TAGLN2. HSPA4, Hsp90 ja TAGLN2 todettiin myös olevan säädellään ylöspäin CSC kaltaisia ​​SP-soluissa.

vaikutus siRBBP6 transfektion maahanmuutto- ja invasiivisia kyvyt mahalaukun syöpäsolujen

Kuvio 2A osoittaa, että si

rbbp6

transfektio vähensi merkittävästi mRNA: n ilmentymisen tasoa sekä SP solulinjojen (OCUM-12 /SP oli 12%, p 0,01, OCUM-2MD3 /SP oli 2,5%. p 0,01), vuonna verrattuna että negatiivinen-siRNA transfektiota.

rbbp6

siRNA Knockdown vähensi hyökkäyksen (kuva 2B) ja muuttoliike aktiivisuus (kuvio 2C) molempien SP soluja.

(A), OCUM-12 /SP ja OCUM-2MD3 /SP osoittivat korkeampaa

rbbp6

mRNA ilmaisu kuin vanhemman soluja, OCUM-12 ja OCUM-2MD3. Rbbp6 ilmentyminen OCUM-12 /SP ja OCUM-2MD3 /SP-soluissa tehokkaasti vaimentua SI

rbbp6

transfektion. (B), Kuvat ovat hyökkäävän OCUM-12 /SP-solut osoittivat määrä syöpäsolujen valtaavat huokosten kalvosuodattimella väheni

rbbp6

siRNA hoitoon. si

rbbp6

transfektion OCUM12 /SP-soluissa merkittävästi esti hyökkäyksen kykyjä. Data esitetään keskiarvo ja SD (virhepalkkeja) neljästä kokeesta. *

p

0,05, **

p

0,01. (C), si

rbbp6

hoito OCUM12 /SP ja OCUM-2MD3 /SP-soluissa merkittävästi esti siirtymisen kykyjä, verrattuna kuin valvonta

negatiivisten-siRNA

hoitoa. Data esitetään keskiarvo ja SD (virhepalkkeja) neljästä kokeesta. *

p

0,05, **

p

0,01.

immunohistokemiallinen arviointi Candidate Proteiinit ja niiden Assosiaatio kliinis-

rbbp6, DCTPP1, ja HSPA9 havaittiin ensisijaisesti ilmaistaan ​​sytoplasmassa ja ytimet mahalaukun syövän soluja. GLG1, VPS13A, HSPA9, HSPA4, ALDOA, ja KRT18 havaittiin ensisijaisesti ilmaistaan ​​sytoplasmassa (kuvio 3A). Normaalissa epiteelisolujen, rbbp6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, ja HSPA9 ilme havaittiin joitakin solujen epiteelin rauhanen. KRT18 ilmennettiin useimmissa epiteelisoluissa. HSPA4 ja ALDOA ekspressiota ei havaittu normaaleissa soluissa. BBP6, DCTPP1, ja HSPA9 ilmennettiin sytoplasmassa ja ytimet normaalien epiteelisolujen. GLG1, VPS13A, HSPA9, ja KRT18 havaittiin sytoplasmassa epiteelisolujen (kuvio 3B).

(a) ekspressio syöpäsoluissa. Rbbp6, DCTPP1, ja HSPA9 ilmentyminen havaittiin pääasiassa sytoplasmassa ja tumassa. GLG1, VPS13A, HSPA4, ALDOA, ja KRT18 ilmennettiin sytoplasmassa. (B), Expression epiteelisoluissa. Rbbp6, GLG1, VPS13A, DCTPP1, ja HSPA9 ilme havaittiin joitakin solujen epiteelin rauhanen. KRT18 ilmennettiin useimmissa epiteelisoluissa. HSPA4 ja ALDOA ilmaisua ei löytynyt normaaleissa soluissa.

Selvitimme assosiaatio ilmentymistason kahdeksan ehdokkaan proteiinit ja kliinis. Tapausten lukumäärä kullekin pistemäärän kahdeksan tavoitteet on esitetty taulukossa S3. Nämä kahdeksan proteiinit määritettiin liittyvän mahdollisesti pahanlaatuinen prosesseja, kuten kaukainen etäpesäke, imusolmuke (LN) etäpesäkkeiden invaasio syvyyttä tai vaiheen eteneminen (taulukko 3). Lasketut p-arvot olivat seuraavat: rbbp6 oli merkitsevästi yhteydessä invaasio syvyys (p 0,001), LN etäpesäke (p 0,001), kaukainen etäpesäke (p = 0,013), ja kliininen vaihe (p 0,001); GLG1 oli merkitsevästi yhteydessä vain kaukainen etäpesäke (p = 0,045). VPS13A oli merkitsevästi yhteydessä invaasio syvyys (p = 0,005), LN etäpesäke (p 0,001), ja vaihe etenemistä (p = 0,005); DCTPP1 oli merkitsevästi yhteydessä invaasio syvyys (p 0,001), LN etäpesäke (p 0,001), kaukainen etäpesäke (p 0,001), ja vaihe etenemistä (p 0,001); HSPA9 oli merkitsevästi yhteydessä invaasio syvyys (p 0,001), LN etäpesäke (p 0,001), ja vaihe etenemistä (p 0,001); HSPA4 oli merkitsevästi yhteydessä invaasio syvyys (p 0,001), LN etäpesäke (p 0,001), kaukainen etäpesäke (p = 0,007), ja vaihe etenemistä (p 0,001); ALDOA oli merkitsevästi yhteydessä invaasio syvyys (p = 0,034), LN etäpesäke (p = 0,004), ja vaihe etenemistä (p = 0,029); ja KRT18 oli merkitsevästi yhteydessä invaasio syvyys (p = 0,001), LN etäpesäke (p = 0,001), kaukainen etäpesäke (p = 0,034), ja vaihe etenemistä (p = 0,004).

Ennuste

Kaplan-Meier tonttien ehdotti, että kahdeksan yliekspressoitujen proteiineja, rbbp6, DCTPP1, HSPA4, ja ALDOA, olivat merkitsevästi yhteydessä huonoon säilymiseen kaikilla potilailla (kuva 4). Kumulatiivinen viiden vuoden yleinen eloonjäämisluku rbbp6-positiivisia tapauksia (61%) oli merkitsevästi vähemmän (p = 0,002) kuin rbbp6-negatiivinen tapauksissa (78%). Lisäksi potilailla vaiheessa III, yleinen eloonjäämisluku rbbp6-positiivisia tapauksia oli merkitsevästi vähemmän (p = 0,034) kuin rbbp6-negatiivinen tapauksissa. Ennuste potilailla, joilla on DCTPP1-positiivisia kasvaimia (63%), oli merkittävästi huonompi (p = 0,016) kuin DCTPP1-syöpäkasvain (75%). Viiden vuoden yleinen eloonjäämisluku HSPA4-positiivisia tapauksia (66%) oli merkitsevästi vähemmän (p = 0,047) kuin HSPA4-negatiivinen tapauksissa (75%). Viiden vuoden yleinen eloonjäämisluku ALDOA-positiivisten kasvainten näytteille yli-ilmentyminen (61%) oli merkitsevästi huonompi (p = 0,043) kuin ALDOA-syöpäkasvain (72%). Sen sijaan ei ole merkittäviä korrelaatioita ei havaittu muita proteiineja ja potilaan eloonjäämisen. Sen jälkeen univariate analyysi, rbbp6, DCTPP1, HSPA4, ja ALDOA ekspressiotasot olivat merkittävästi yhteydessä huonoon ennusteeseen 300 mahasyöpäpotilaista (taulukko 4). Lisäksi makroskooppisia tyyppi (tyyppi 4), histologinen tyyppi (diffuusi), T-luokan (T2-4), alus invaasio tunkeutuminen kuvio (INF b, c), vatsakalvon etäpesäke, ja LN etäpesäkkeitä todettiin olevan merkittävästi liittyvän huono ennuste. Monimuuttuja-analyysi suoritettiin käyttäen Coxin suhteellisten riskien Malli kaikille muuttujat yksiulotteista analyysiin. Kun analyysi loppuun, rbbp6 ilmaisu (p = 0,023), Borrmann tyypin 4 (p 0,001), vatsakalvon positiivinen (p = 0,001), LN etäpesäkkeiden (p = 0,003), ja maksan etäpesäkkeiden (p = 0,001) on vahvistettu riippumattomia tekijät korreloi elinaika (taulukko 3).