Krooninen sairaus

tiivistelmä

Yksi haasteista hoidossa paksusuolen syövän potilaiden että nämä kasvaimet osoittavat Säteilynsietotestin. MikroRNA (miRNA) osallistuvat olennaisia ​​biologisia vaikutuksia, kuten chemoresistance ja radioresistance. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että miRNA ollut tärkeä rooli herkistävät soluvastetta ionisoiva säteily (IR). Tässä tutkimuksessa havaittiin, että miR-124 oli merkitsevästi alassäädetty sekä CRC-solulinjat ja kliinisistä CRC näytteitä verrataan viereisen ei-kasvain peräsuolen kudoksiin, MiR-124 voi herkistää ihmisen peräsuolen syövän soluja IR

vuonna vitro

ja

in vivo

. Tunnistimme PRRX1, uusi EMT indusoija ja stemness säädin uutena välittömänä kohteena miR-124 käyttämällä kohde Ennustusalgoritmien ja lusiferaasianalyysissä. PRRX1 pudotus voi herkistää CRC soluja IR samanlainen aiheuttamat vaikutukset miR-124. N yli-ilmentyminen PRRX1 stabiilisti yli-ilmentynyt-miR-124 solulinjat voitaisiin pelastaa vaikutuksia radioherkkyyttä lisälaite tuomat miR-124. Kun nämä seikat huomioon, olemme osoittaneet, että miR-124 voisi lisätä radioherkkyyttä CRC-solujen ekspression estämiseksi PRRX1, mikä osoitti miR-124 voisi toimia suuren terapeuttisena kohteena CRC potilaille.

Johdanto-osan: Zhang Y, Zheng L, Huang J, Gao F, Lin X, hän L, et al. (2014) MiR-124 herkistää säteilylle ihmisen peräsuolen syövän solut mukaan Targeting PRRX1. PLoS ONE 9 (4): e93917. doi: 10,1371 /journal.pone.0093917

Editor: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Espanja

vastaanotettu: 03 tammikuu 2014; Hyväksytty: 11 maaliskuu 2014; Julkaistu: 04 huhtikuu 2014

Copyright: © 2014 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Tiedesäätiö of China (Grant nro 81272507). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on kolmas johtava syy syöpäkuolemista [1]. CRC tapaukset käsitellään kirurgisen resektion koska se on ainoa parantava tekniikka, joka on saatavilla asti mennessä. Kuitenkin, peräsuolen syöpä liittyy korkea kuolleisuus kuin noin 30%: lla potilaista diagnosoidaan, kun syöpä on edennyt pitkälle. Nämä potilaat satama paikallisesti edennyt, leikkaushoitoon, ei-etäpesäkkeitä, joka kutsutaan nimellä ”paikallisesti edennyt peräsuolen syövän.” Nämä potilaat saivat chemoradiation hoitoa. Koska kuitenkin on luontainen kyky paksusuolen syövän tulla solunsalpaajaresistentti ja säteilyresistenteille (RR), yhdistetyt modality hoito on jättänyt yleisesti parantaa tuloksia. On vaikea hoitaa potilaita, joilla on paikallisesti edennyt kolorektaalisyöpä koska nämä syöpäsolut vastustuskykyisiä sädehoidon. Tämä on yksi vaikeimpia asioita hoidettaessa peräsuolen syöpä. Siksi meidän täytyy valaista molekyylitason mekanismeista säteilyherkkyydestä tai vastustusta, koska tämä lopulta auttaa meitä parantamaan hoitotulosten.

Aiemmat tutkimukset ovat vahvistaneet yhdistyksen välillä radioresistance ja geenien ilmentymistä, jotka aiheuttavat DNA-vaurioita tarkistuspiste vaste ja lisäys DNA korjauskapasiteettia [2] – [4]. Vaikka tällaiset löydöt ovat parantaneet ymmärrystä molekulaarisia mekanismeja, jotka vaikuttavat solujen radioherkkyyttä yksityiskohtainen mekanismeja, joilla tämä prosessi on säädetty ei ole tiedossa till mennessä.

MikroRNA (miRNA) ovat luokan pieni (

~ 22 nukleotidin

) koodaamattomalla RNA-molekyylejä, jotka säätelevät transkription jälkeisen geenin ilmentymistä. Sitomalla osittain komplementaarisia sekvenssejä lähetti-RNA (mRNA), miRNA kohde-mRNA-molekyylejä hajoamista ja /tai translaation inhiboimiseksi, mikä vähentää proteiinien ekspression [5]. Useat kokeelliset todisteet ovat ehdottaneet, että useat ihmisten sairauksia, kuten syöpää ovat aiheuttanut johtuu vapauttamisen miRNA [6]. Jotkut miRNA ilmentymisen moduloimiseksi tunnettujen onkogeenien tai tuumorisuppressorigeeneille, kun taas toiset toimivat oncomiRNAs tai kasvaimeen vaimennin miRNA [7]. Useita miRNA ovat korreloineet potilaiden selviytymistä. Nämä miRNA voi olla hyödyllistä ennustettaessa ja muuttamalla syöpähoitoihin (mukaan lukien kemoterapia, sädehoito, ja immunoterapia) [8], [9]. Viime aikoina olemme havainneet, että miRNA ollut tärkeä rooli soluvasteen ionisoivan säteilyn [10] – [13].

MiR-124 on aivojen rikastettu miRNA, joka on merkittävästi alassäädetty monissa ihmisen pahanlaatuisia kasvaimia, mukaan lukien glioblastooma, mahasyöpä medulloblastoma, maksasyövän, ja CRC [14] – [22]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että miR-124 herkistää säteilylle ihmisen glioomasoluihin kohdistamalla CDK4 [23]. Kuitenkin toiminta miR-124 radioresistance on tuskin ymmärtänyt asti päivämäärä.

PRRX1 on hiljattain tunnistettu EMT (epiteelin-mesenkymaalitransitioon) indusoija ja stemness säädin [24], [25], jotka molemmat jotka liittyvät läheisesti radioresistence [26]. Lisäksi runsas PRRX1 ilmentyminen korreloi huonon ennusteen ja etäpesäkkeiden CRC tapauksissa. Lisäksi runsas ilmentyminen PRRX1 myös liittyy huono kliinisiä tuloksia [27]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat myös osoittaneet, että PRRX1 ollut keskeinen rooli haiman uudistumista ja syövän syntymistä [28]. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että miR-124 parantaa herkkyyttä säteilylle, sekä CRC-soluissa ja ihmisen ksenograftikasvaimissa. Lisäksi PRRX1 on uusi, välittömänä kohteena miR-124, joka indusoi säteilytys vastarintaa. PRRX1 Knockdown voi herkistää soluja ionisoivalle säteilylle. Lisäksi, yliekspressio miR-124 aiheuttaisi modulaatio EMT ja stemness liittyvien geenien ilmentymistä, jotka molemmat liittyvät läheisesti radioresistence. Palauttaminen PRRX1 voisi pelastaa aiheuttamia miR-124. Tähän tutkimukseen, olemme osoittaneet, että miR-124 herkistyneet peräsuolen syövän solut sädehoitoa jossain määrin vähen- tämisessä PRRX1. Nämä havainnot on paljastunut ensimmäistä kertaa, mikä osoittaa, kuinka miR-124 on keskeisessä asemassa edistävät solut vastustuskykyä ionisoivaa säteilyä.

Materiaalit ja menetelmät

potilasnäytteiden

Kliininen CRC näytettä otettiin Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou, Kiina. Potilaat oli tehty maksimaalinen kirurginen resektio seuraa sädehoito ja kemoterapia. Kirjallinen suostumukset saatiin aiheista, jotka osallistuivat tähän tutkimukseen. Kudos kerättiin ja käytettiin saatuaan hyväksynnän eettisen komitean Nanfang Hospital.

Solulinjat ja reagenssit

Ihmisen CRC solulinjat, mukaan lukien SW480, SW620 ja LOVO solut ostettiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). HCT-116, LS-174T ja HT29 ostettiin Shanghai Cell Biology, University of Kiinan Academy of Sciences. Soluja viljeltiin RPMI-1640-alustassa (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), joka on täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Gibco, CA, USA) kosteassa märkä ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2 37 ° C: ssa . Anneksiini V-FITC /7-AAD KIT ostettiin Beckman Coulter. Täyspitkä PRRX1 cDNA, että kokonaan puuttui 3′-UTR hankittiin GeneCopeia (Rockville, MD, USA) ja subkloonattiin eukaryoottiseen ekspressiovektoriin pcDNA3.1 (+) (Invitrogen, USA). Pre-miR-124-sekvenssi monistettiin ja kloonattiin pCDH-CMV-MCS-EF1-coGFP konstruktit (System Biosciences, California, USA). Viruspartikkelit kerättiin 48 tuntia transfek- tion jälkeen pCDH-CMV-miR-124, jossa pakkaus plasmidin pRSV /PREV, pCMV /pVSVG, ja pMDLG /pRRE 293T-soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 reagenssia (Invitrogen, USA). PRRX1 Knockdown ja ohjaus lentivirukset ostettiin GENECHEM (Shanghai, Kiina). MiR-124 matkivat, ei-spesifisen miR ohjaus, anti-miR-124, ja ei-spesifisen anti-miR ohjaus ostettiin Thermo Scientific Dharmacon (USA).

RNA: n eristämistä, Käänteinen transkriptio, ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR

Kokonais-RNA uutettiin soluista käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen, USA). Mir-124, käänteistranskriptio ja qRT-PCR-reaktiot suoritettiin käyttäen qSYBR-vihreä sisältäviä PCR Kit (GenePharma, Shanghai, Kiina). U6 snRNA käytettiin endogeenista ohjaus. Edeltäjä muodossa miR-124 monistettiin. Havaitsemiseksi PRRX1 mRNA, cDNA syntetisoitiin 1 ug kokonais-RNA: sta käyttämällä käänteisen transkription reaktio mukainen pakkaus valmistajan ohjeiden (Promega, USA). Ihmisen GAPDH monistettiin rinnakkain sisäisenä kontrollina. Alukkeet luetellaan Täydentävä taulukossa S1. Kaikki nämä näytteet normalisoitiin sisäisen valvonnan ja kertamuutoksia laskettiin läpi suhteellisen kvantifioinnin (2-ΔΔCt).

Western Blot analyysi

Yhtä suuret määrät proteiinia erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi (PVDF) (Millipore, USA). Membraanit blokattiin 5% rasvatonta kuorittua maitoa /TBST [20 mM Tris-HCI (pH 7,4), 150 mM NaCl, ja 0,1% Tween-20] huoneen lämpötilassa 1 tunti. Sen jälkeen, ne havaittiin primaarisilla vasta-aineilla 4 ° C: ssa yön yli. Sitten ne blotattiin 1 h huoneenlämpötilassa avulla sopivan sekundäärisen vasta-aineen. Sen jälkeen, parannettu kemiluminesenssidetektiolla reagensseja käytettiin (Amersham Pharmacia Biotech, USA). Primaarisen vasta-aineen PRRX1was ostettu Abcam (UK). Kaspaasi-3-, Bcl-2, andγ-H2AX ostettiin Epitomics (UK). E-kadheriinin, ZO-1, vimentiinin, N-kadheriinin ostettiin Becton, Dickinson and Company (USA). GAPDH hankittiin Boster (Kiina).

Luciferase Assay

täyspitkän PRRX1 3′-UTR monistettiin PCR: llä ja kloonattiin alavirtaan tulikärpäsen lusiferaasi-geenin pGL3-vektoria (Promega , USA). Vektori nimettiin villityypin (wt) 3′-UTR. GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen, USA) käytettiin suorittamaan kohdennettu mutageneesi on miR-124-sitoutumiskohta PRRX1 3′-UTR: tuloksena nimettiin mutantti (mt) 3′-UTR. Nämä solut transfektoitiin toimittaja plasmidit ja sijoitettiin 96-kuoppalevyille. Sen jälkeen, kun soluja on inkuboitu 48 tuntia, solut kerättiin ja analysoitiin käyttäen Dual-lusiferaasireportteri- määritystä (Promega, Madison, WI), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lusiferaasiaktiivisuudet normalisoitiin β-galaktosidaasin aktiivisuus. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

klonogeeninen määritys ja virtaussytometria

ennalta määrätty määrä soluja siirrostettiin 6-kuoppaisille viljelylevyille. Sitten ne inkuboitiin 24 tuntia joka auttoi kotiutumisessa näissä soluissa. Soluja käsiteltiin eri IR-annoksia (0, 2, 4, 6 ja 8 Gy, Nasatron (Cs-137) säteilytysuunin). Kun oli inkuboitu näitä soluja 37 ° C: ssa 14 päivää, ne pestiin kahdesti PBS: llä ja värjättiin kristalliviolettiliuoksella. Pesäkkeiden lukumäärä, jotka sisältävät ≥50 solut laskettiin mikroskoopin alla käyttämällä seuraavaa kaavaa: Plate klooni muodostumisen tehokkuutta = (pesäkkeiden määrä /solujen lukumäärä siirrostettiin) x 100%. Hengissäsäilymisosuudet (SF) laskettiin normalisoinnin maljaustehokkuus asianmukaisten kontrolliryhmiin. Käytimme GraphPad Prism (GraphPad Software, LaJolla, CA, USA) sopimaan solujen selviytymistä käyrän mukaisesti standardin lineaarinen-neliöllinen (LQ) malli. Sen jälkeen saimme arvot hengissäsäilymisosuus erilaisia ​​IR-annoksia. On useita tärkeitä parametreja tässä mallissa kuten SF2 (eloonjääntifraktion 2 Gy), α (parametri DNA-katkosten aiheuttama sokki) ja β (parametri DNA-katkosten aiheutuu kahdesta iskut).

havaitsemaan apoptoosia, solut kerättiin ja värjättiin käyttäen 7-AAD ja anneksiini-V-FITC: llä. Virtaussytometria analysoitiin käyttäen BD FACS Diva ohjelmisto V6.1.3 (BD ​​Biosciences).

Eläinkokeet

Kateenkorvattomia nude-hiirissä (Guangdong Experimental Animal keskus) käytettiin tuumorin implantaatioon. Nämä hiiret olivat noin 4-6 viikkoa vanhoja. Kaikki eläinkokeet tiukasti kiinni asetuksissa varten hallinnon asioiden osalta Experimental Animals, Kiinan kansallinen ohjenuorana eläinkoetta, myönnetty vuonna 1988. Tässä tutkimuksessa kaikki menettelyt, joissa käytetään eläimiä ja niiden hoitoon hyväksyttiin ja suoritettiin Southern Medical University: n Institutional Animal Care ja käyttö komitea. Solut kerättiin trypsinisaatiolla ja pestiin kahdesti kylmällä seerumia. Sen jälkeen nämä solut suspendoitiin uudelleen 200 ul: aan seerumia. Sillä ksenograftikasvaimissa määritystä, 5 x 10

6 SW480 solua ihon alle ruiskutetaan takaosaan nude-hiirten. Sen jälkeen, kun kasvaimet havaittiin, kasvaimen koko mitattiin työntömitalla kolmen päivän välein. Arvioimaan tuumorin radioresistance

in vivo

, kasvaimet säteilytettiin yhdellä annoksella 10 Gy IR 11 päivää injektion jälkeen. Kasvaimen tilavuus laskettiin kaavalla (a x b2) x 0,5, jossa a ja b ovat pitkät ja lyhyet mitat, vastaavasti. Hiiret tapettiin 35 päivää injektion jälkeen. Sitten tuumorit poistettiin. Kukin ryhmä sisälsi 5 hiirtä. Nämä korjatut kasvaimet kuvattiin heti eläinten lopettamisen jälkeen.

Tilastollinen analyysi

Kaikki arvot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± keskihajonta. Tulokset analysoitiin käyttäen ANOVA tai kaksisuuntaista Studentin t-testiä.

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

MiR-124 usein Down-säädellään CRC Solulinjat ja kudokset

Paneeli ihmisen CRC solulinjoissa analysoitiin kvantitatiivisesti määrittää ekspressiotaso miR-124. Verrattuna normaaliin paksusuolen limakalvon yhdistettiin kolmesta terveitä yksilöitä, ilmentymistason miR-124 oli pienempi kuudessa tarkasteltiin CRC solulinjoissa. (1A) B

(A) miR-124 ilmentyi huomattavasti pienemmässä määrin kuudessa CRC solulinjoissa verrattuna normaalissa paksusuolen limakalvon yhdistettiin kolmesta terveitä yksilöitä. Kuvio on esimerkkinä kolmesta kokeesta samanlaisin tuloksin. **

P

0,01, *

P

0,05. (B) ekspressio miR-124 CRC kudoksissa ja vastaaviin normaaleihin kudoksiin havaittiin qRT-PCR ja normalisoitu kuin U6. Tiedot esitetään yksittäisten näytteiden (N = 24), jossa linjan osoittaa keskimääräisen tason.

Lisäksi olemme tutkineet ilmentymistaso miR-124 CRC yksilöiden ja vastaaviin normaaleihin kudoksiin. Mukaisesti saatuja tietoja CRC solulinjoista, keskimääräinen ekspressiotaso miR-124 oli merkitsevästi pienempi CRC specimenscampared viereisiin normaaleissa kudoksissa (kuvio 1 B) B

MiR-124 herkistää peräsuolen syövän solut sädehoitoa

yhdyskunnan säilymiseen määritys pidetään kanoninen standardi määrittää radioherkkyyttä [29]. Niin, pyrimme tutkimaan vaikutuksia miR-124 pesäkkeen eloonjäämiseen CRC-solujen läsnä ollessa ionisoivaa säteilyä. Klonogeeniset määritys Tulokset vahvistivat, että yli-ilmentyminen miR-124 olivat paljon herkempiä IR kuin heidän kollegansa (2A ja täydentävä taulukko S2). Se on hyvin dokumentoitu, että kapasiteetti anti-apoptoosin syöpäsolujen liittyy läheisesti radioresistance. Lisäksi olemme mitattu IR-indusoitua apoptoosia CRC-soluissa, jotka transfektoitiin miR-124 jäljittelee tai miR ohjaus. Olemme huomanneet, että kun yhdessä IR, yliekspressio miR-124 merkittävästi parannettu apoptoosin solujen CRC soluissa kuin kontrolleissa (kuvio 2B). Lisäksi havaitsimme, että miR-124 hoito yksinään voi pienentää Bcl-2, ja vaikutus oli paljon voimakkaampaa, kun se yhdistetään sädehoitoon. Toisaalta, kaspaasi-3 ja fosforylaation histoni H2AX (γ-H2AX) [30], joka on indikaattori soluvasteen DNA-vaurion kasvoi, kun solut joko käsiteltiin miR-124 yksinään tai altistetaan yhdistetyn hoidon miR -124 ja sädehoitoa (kuvio 2C). Yhdessä nämä havainnot kuvitettu synergistisen vaikutuksen välillä miR-124 palauttaminen ja IR.

(A) LOVO ja SW480-soluissa stabiilisti yli-ilmentyminen miR-124 käsiteltiin 0, 2, 4, 6, tai 8Gy IR. Hengissäsäilymisosuudet laskettiin, kuten on kuvattu kuviossa 2A. Tulokset esitetään keinona SD arvoista, jotka saatiin 3 itsenäisestä kokeesta. Tilastollinen merkitys eroja ryhmien välillä laskettiin käyttäen Student t testejä. * P 0,05. (B) Apoptoosin määritys osoittaa apoptoosin induktion jälkeen miR-124 yliekspressio, erityisesti yhdistettynä säteilyn miR-124-yli-ilmentynyt solulinjoissa LOVO ja SW480. * P 0,05. (C) tyypillisen western blot vaikutuksella miR-124 yliekspressio ja /tai säteily (4Gy) ilmenemistä apoptoosin ja DNA aiheutuvia vahinkoja geenejä (Caspase-3, Bcl-2 andγ-H2AX).

PRRX1 on suora Tavoite miR-124

Teimme bioinformatiikan analyysin avulla TargetScan ja Pictar ja ennusti, että miR-124 voi kohdistaa PRRX1 3’UTR alueella. Itse asiassa oli täydellinen emäspariutumisessa välillä siemen sekvenssi kypsän miR-124 ja 3’UTR PRRX1 mRNA, ja nämä siemenet sekvenssit konservoituneet kaikilla eläinlajeilla (3A). Sen määrittämiseksi, onko 3’UTR PRRX1 mRNA on toiminnallinen kohde miR-214 CRC-soluissa, kohteena sekvenssi PRRX1 3’UTR (paino- 3′-UTR) tai mutantin sekvenssin (mt 3’UTR) kloonattiin lusiferaasireportteri- vektori (Fig.3E). Sen jälkeen, HEK293-solut transfektoitiin paino- tai mt 3’UTR vektorin ja miR-124 jäljittelee. Tulokset osoittivat merkittävää laskua lusiferaasin aktiivisuuden verrattuna miRNA ohjaus (Fig.3E, kaistat 2 ja 3; P 0,05). Aktiivisuus mt 3’UTR vektori ei vaikuttanut samanaikaisesti transfektoimalla miR-124 (Fig.3E, kaistat 7 ja 8) .Mitä enemmän, kotransfektio anti-miR124 ja p- 3’UTR vektori HEK293-soluissa johti lisäys lusiferaasin aktiivisuuden (Fig.3E, kaistat 4 ja 5, P 0,05). PRRX1 ilmentymistä havaittiin qRT-PCR ja western blot jälkeen modulaatio ilmentymisen miR-124 (3B, 3C, 3D). Yhdessä kaikki nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että PRRX1 on tavoite miR-124 CRC-soluissa.

(A) Ennustetut sitovat sekvenssit miR-124 sisällä ihmisen PRRX1 3’UTR. Seed sekvenssit on korostettu ja alleviivattu. (B), (C) ja (D) PRRX1 ilmentyminen määritettiin peräsuolen syövän solut stabiilisti yli-ilmentynyt-miR-124 ja transfektoitujen solujen miR-124-inhibiittorit, tai antimiR-con reaaliaikaisella PCR: llä ja Western blot -analyysillä. ANOVA ja Studentin t-testejä käytettiin tilastollisen merkittävyyden määrittämiseksi eroja ryhmien välillä. * P 0,05. (E) Lusiferaasiaktiivisuus, joissa käytetään lusiferaasireport- villityypin tai mutantti-ihmisen PRRX1 3’UTRs tehtiin sen jälkeen, kun kotransfektoimalla miR-124 jäljittelee tai inhibiittorit HEK293-soluihin. Ja mt 3’UTR on huomattavasti verrattuna wt 3’UTR.The pylväsdiagrammi osoitti keskiarvo ± SD kolmessa riippumattomassa transfektiokokeissa. * P 0,05.

PRRX1 Knockdown annetaan radioherkkyyttä CRC Cell Lines

Stable solulinjoissa shRNA -PRRX1 perustettiin. PRRX1 proteiinin ilmentyminen näissä soluissa varmistettiin western blot-analyysi solulysaateista, joissa spesifisten vasta-aineiden (Fig. 4A). Yhdyskunnan säilymiseen määritys suoritettiin myöhemmin. Todettiin, että PRRX1-vaiennettu, elossa jakeet solujen pesäkkeiden väheni huomattavasti enemmän verrattuna kontrolliryhmään, kun ne oli säteilytetty eri IR annoksina (Fig. 4B ja täydentävä taulukko S3). Apoptoosimäärityksessä osoittivat, että PRRX1 hiljentäminen yhdistettynä säteily aiheutti paljon apoptoosin kuin silloin, kun vain yksi hoito käytettiin (4C), mikä osoittaa synergistisen vaikutuksen. Western blot-määritys osoitti, että kun yhdessä säteilyn PRRX1 hiljentäminen aiheutti merkittävän alas-säätely Bcl-2 tason vaan ylös-säätely kaspaasi-3 ilmaisu andγ-H2AX (Fig. 4D).

(A ) Western blot analysoitiin PRRX1 häiriöitä tehokkuutta LoVo ja SW480-soluja (B) Kun määritellään numeron muodostettu CRC soluista, jotka oli stabiilisti tartunnan tyhjällä vektorilla lentiviruksien (kontrolli shRNA) ja PRRX1-shRNA lentiviruksien (PRRX1 shRNA) tai ilman lentivirus infektio ( käsittelemätön). (C) anneksiini-V-määritys apoptoosin varten PRRX1 pudotus solujen kontrolliin verrattuna soluihin. * P 0,05. (E) tyypillisen western blot vaikutuksella PRRX1 Knockdown tai /ja säteily (4Gy) on ilmaisuja apoptoosin liittyvien geenien (Caspase-3, Bcl-2 andγ-H2AX).

pakotettu ilmentymä of PRRX1 Palauttaa vaikutuksia miR-124 radioherkkyyttä

Valaistaan ​​onko vaikutuksen miR-124 radioherkkyyttä välitti tukahduttamisen PRRX1, pcDNA3.1-PRRX1 transfektoitiin miR-124-yliekspressoitu soluissa. PRRX1 ilmentyminen varmistettiin western blot (Kuvio 5A). Tulokset osoittivat, että PRRX1could pelastaa vaikutukset miR-124. Klonogeeniset määritys ja solujen apoptoosin ehdotti, että kohdunulkoinen ilmaus PRRX1 vähensi merkitsevästi miR-124 aiheuttama säteilyherkkyyttä (Fig.5B ja täydentävä TableS4, Figure.5C). Western blot-analyysi osoitti myös PRRX1 voisi palauttaa ilmaisun kaspaasi-3: n ja Bcl-2, joka on ollut seurausta miR-124 (Fig.5D). Nämä havainnot osoittivat, että miR-124 herkistyneet solujen IR, jonka vähen- tämisessä ilmentymistä PRRX1.

(A) PRRX1 ilmentymistä havaittiin Western blot jälkeen transfektoimalla pcDNA3.1-PRRX1 osaksi miR-124-yli-ilmennetään soluissa. (B) Soluja seuraa käsittely, kuten on kuvattu kuviossa 2A. Hengissäsäilymisosuudet laskettiin kullekin ryhmälle. Tulokset esitetään keskiarvoina ± SD arvoista, jotka saatiin 3 itsenäisestä kokeesta. ANOVA tai Student t testejä käytettiin määrittämään tilastollista merkitystä ryhmien välisten erojen. Tilastollinen merkitys (*

P

0,05) on merkitty vs LV-con ja miR-124 ryhmä. (C) tyypillisen western blot vaikutuksella PRRX1 ennalleen tai /ja säteily (4Gy) on ilmaisuja apoptoosin liittyvien geenien (Caspase-3, Bcl-2 andγ-H2AX).

Kohdunulkoisia PRRX1 kääntää ilmaus EMT ja Stemness liittyvien geenien vakaasti miR-124-yli-ilmentynyt solulinjoissa

viime tutkimuksissa todettiin, että PRRX1 indusoi EMT ja edistää stemness fenotyyppi CRC solulinjoissa [27]. Viime tutkimuksissa, on raportoitu, että EMT liittyy syövän kantasoluja. Lisäksi menetys E-kadheriinin ja myöhemmin EMT edistetään radioresistance ihmisen kasvainsoluissa [31] – [33]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat sidoksissa CSC fenotyypin tuumorisoluihin käynnissä EMT, joka havainnollistaa monimutkainen suhde EMT ja CSCS [34] – [40]. Ihmettelemme onko miR-124 tuo tästä vaikutusta vähen- tämisessä PRRX1.Thereafter, transfektoimme pcDNA3.1-PRRX1 osaksi miR-124-yli-ilmentyy CRC solulinjat SW480 ja LOVO. Western blot-analyysi osoitti, että PRRX1 voisi kääntää ilmaus EMT ja stemness liittyvien geenien aiheuttama yli-ilmentymisen miR-124 (Kuva 6).

Western blot analysoi EMT liittyviä geenejä, kuten E-kadheriinin, ZO -1, vimentiinistä ja N-caherin ja stemness liittyviä geenejä, kuten ABCG2, Sox2 ja Oct4 in miR-124-transfektoiduissa soluissa ja miR-124-PRRX1 co-transfektoituja soluja verrattuna kontrolliryhmään. Data ehdotti yli-ilmentyminen miR-124 voisi vaimennussäätelevät vimentiinista, N-kadheriinin, ABCG2, Sox2 ja Oct4 ilmaisun ja säätää ylös E-kadheriinin, ZO-1 ilmentymisen, kun taas yli-ilmentyminen PRRX1 voisi pelastaa tätä vaikutusta.

in vivo -tuumoriksenografti radioherkkyyttä Pitoisuus

Voit selvittää miR-124 herkistää kasvaimia IR

in vivo

, me säteilytetään kasvaimen alueella vain kerran käyttäen annosta 10 Gy 11 päivää injektion jälkeen. Huolimatta saavat saman säteilyannoksen (d11,10Gy) (kuvio 7A, 7B), koko ksenograftien peräisin miR-124-yli-ilmennetään soluissa olivat paljon pienempiä kuin johdettu ohjaus käsitellyistä soluista. Nämä tulokset osoittivat, että miR-124 aiheutti

in vivo

herkistyminen kasvaimia säteilylle.

(A) yli-ilmentyminen miR-124 herkistyneet SW480 tuumoriksenografteja IR-in vivo. Kasvaimen koot mitattiin paksuus ja säteilytys toimitettiin kasvaimen alueelle yhdentenätoista päivänä (IR: 10Gy, D11). (B) määrä käyrät ksenograftien tuottaman LV-con, LV-miR-124, LV-con + Säteily, LV-miR-124 + säteily. (

p

0,05).

Keskustelu

CRC kliinisen hoidon, hankittu ja luontainen radioresistance on haastava este. Meidän tehdä enemmän tutkimuksia puuttua tähän haastavaan ongelmaan. Hankinta radioresistance on monimutkainen prosessi, johon liittyy yli-ilmentyminen DNA: n korjaus proteiinien [41], [42], poikkeava aktivaatio useita signalointireittien [43] – [45], angiogeneesin [46], [47], syövän kantasoluja [48], ja autophagy [49], [50]. Useat aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että miRNA olivat läheistä sukua kasvain radioherkkyyttä. Tämä johtuu siitä, miRNA on kyky lisätä ja vähentää radioherkkyyttä kasvainten [8], [23], [51] – [54]. Koska miRNA on kyky säädellä useita kasvaimia synnyttävän prosesseja, kuten vastata terapia, meidän täytyy tutkia roolia miRNA säteilyn kestävyys. Kestävyys IR on osaltaan hoitoon haasteisiin potilaita kärsi CRC. Siten ymmärtäminen molekyyli- mekanismeista säteilyherkkyydestä ja kestävyys on edelleen tärkeä harjoittamisesta.

Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että miR-124 säädeltiin vähentävästi sekä CRC-solulinjat ja kliinisistä CRC näytteitä verrattuna normaaleihin kudoksiin. Saadakseen käsityksen toimintaa miR-124, suoritimme

in vitro

kokeiluja ja ihmisen ksenograftin tutkimuksia. Näiden tutkimusten ovat osoittaneet, että yli-ilmentyminen miR-124 voisi radiosensitize CRC soluja ja miR-124 Knockdown aiheuttama solun resistentiksi säteilytys.

Havaitsimme PRRX1 oli välittömänä kohteena miR-124 lusiferaasianalyysissä. Edelleen paljastaa toimintoja PRRX1 solun radioherkkyyttä, rakensimme vakaa PRRX1-pudotus solulinjoja LOVO ja SW480 ja havaitsi, että PRRX1 pudotus indusoi solun herkkyyttä säteilytyksen tavalla, joka on samanlainen kuin aiheutuvaa yliekspressio miR-124. Lisäksi PRRX1 ylössäätö pelasti vaikutuksia miR-124-ilmentymisen vaikutus radioherkkyyttä soluja. Nämä tulokset osoittavat, että vaikutus miR-124 solun herkkyyttä säteilytyksen osittain välittyy tukahduttaa ilmaus PRRX1. Kuten raportoitu aiemmin, PRRX1 aiheuttama EMT ja parannettu itsensä uudistaa ominaisuuksia. Tuloksemme viittaavat siihen, että säätely ylöspäin miR-124 kasvattaa ilmentymisen epiteelin merkkiaineiden, kuten E-kadheriinin ja ZO-1 samalla pienentää ilmentymisen mesenkymaalisten markkereita, kuten N-kadheriinin ja vimentiinista. Lisäksi säätely ylöspäin miR-124 johtivat samanaikaisesti downregulation ilmaus stemness liittyviä geenejä, nimittäin ABCG2, Sox2, ja Oct4. Lisäksi yli-ilmentyminen PRRX1 voisi pelastaa vaikutusta miR-124 EMT mukaan johtuvien geneettisiä muutoksia. Viime aikoina on raportoitu, että EMT on syöpään liittyvän kantasoluja. Lisäksi solut meneillään EMT osoittivat suurempaa radioresistance ihmisen kasvainsoluissa [26], [31] – [33] Kun nämä seikat huomioon, me päätellä, että miR-124 voisi radiosensitize CRC solujen vähen- tämisessä PRRX1, joka liittyy EMT ja syöpä kantasoluja. Kuitenkin kaikki nämä havainnot on tutkittava tarkemmin ja todentaa enemmän tutkimustyötä. Olemme tutkineet rooli miR-124 säätelyssä radioherkkyyttä, joka voi merkittävästi vaikuttaa syövän biologian ja syövän hoidossa. Näiden havaintojen perusteella, me arveltu, että downregulation PRRX1 päinvastaiseksi EMT ja samalla heikentänyt itseuudistumisen ominaisuuksia solujen, jotka molemmat liittyvät läheisesti radioresistence.

Yhteenvetona voimme tarjota todisteita siitä, että miR-124 herkistää CRC solut sädehoitoa estämällä PRRX1. Tämä osoittaa, että miR-124 on houkutteleva prognostisia /ennustavan biomarkkeri, jota voidaan käyttää diagnosoinnissa CRC tapauksissa. Lisäksi olemme kehittäneet uuden lähestymistavan herkistävä säteilyresistenteille syöpiin kohdistamalla miR-124.

tukeminen Information

Taulukko S1.

Alukkeet miR-124 ja PRRX1 kvantifiointiin.

doi: 10,1371 /journal.pone.0093917.s001

(DOC) B Taulukko S2.

radioherkkyyttä parametrit jälkeen yli-ilmentymisen miR-124.

doi: 10,1371 /journal.pone.0093917.s002

(DOC) B Taulukko S3.

radioherkkyyttä parametrit jälkeen PRRX1 knockdown.

doi: 10,1371 /journal.pone.0093917.s003

(DOC) B Taulukko S4.

radioherkkyyttä parametrit jälkeen yliekspressio PRRX1 in miR-124-yliekspressoidaan solulinjoissa.

doi: 10,1371 /journal.pone.0093917.s004

(DOC) B