Krooninen sairaus

tiivistelmä

RBP2 on todettu osallistua aktiivisesti syövän etenemiseen. Se estää vanhenemista syöpäsolujen, välittää syöpäsolujen lisääntymistä ja edistää syövän etäpesäkkeiden. On myös tärkeää lääkkeiden sietokykyyn. Kuitenkin vaikutukset RBP2 epiteeli–mesenkymaalitransitioon ei vielä tunneta. Tässä tutkimuksessa olemme analysoineet vaikutuksia RBP2 epiteeli–mesenkymaalitransitioon ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. Tulokset osoittivat, että RBP2 alas-säädellä ilmentymistä E-kadheriinin estämällä promoottorin aktiivisuutta E-kadheriinin ja sääteli ilmentymisen N-kadheriinin ja etanat aktivaation kautta Akt signalointia, ja yli-ilmentyminen RBP2 indusoidun epithelial- mesenkymaalitransitioon ei-pienisoluinen keuhkosyöpä soluja. Tutkimuksemme osoittivat lisäksi thatRBP2 voi olla potentiaalinen kohde anti- keuhkosyövän hoidossa.

Citation: Wang S, Wang Y, Wu H, Hu L (2013) RBP2 indusoi epiteelisolujen-mesenkymaalitransitioon in Non-Small Cell Keuhkosyöpä. PLoS ONE 8 (12): e84735. doi: 10,1371 /journal.pone.0084735

Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Lasten Hospital Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 18 elokuu 2013; Hyväksytty: 19 marraskuu 2013; Julkaistu: 20 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Natural Science Foundation Shandongin maakunnassa [Z2005C02]. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yleisin syy syövän kuolleisuus, ja sen sairastuvuus kasvaa maailmanlaajuisesti [1]. Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) osuus 85% kaikista keuhkosyöpää. Valitettavasti monet NSCLC potilaille kehittyy etäinen etäpesäke aikana alkuvaiheessa tauti. Lisäksi kuolleisuus pienisoluista keuhkosyöpää useammin aiheuttama etäpesäkkeiden eikä niiden ensisijainen kasvaimia. Siksi varhaistoteamiseen ja ennaltaehkäisyyn metastaasin on keskeinen vaihe pysäytetään sen eteneminen NSCLC [2].

Retinoblastooma sitova proteiini-2 (RBP2) tunnistettiin alun perin kriittinen retinoblastoomaproteiinia (pRB) sitoutuvilla proteiini [3]. Vuonna 2007 RBP2 löytyi ensimmäisen olevan histoni demetylaasientsyymin varten tri- ja dimetyloitujen lysiini 4 histoni H3 (H3-K4me2 ja H3K4me3) [4,5]. On yleisesti hyväksytty, että histoni metylaatio on erittäin tärkeää, että ekspression eri geenien ja sillä on tärkeä rooli syövän etenemistä [6-8]. Poikkeava metylaatio edistää liiallista solujen lisääntymistä ja kasvaimen kehittymisen, ja H3K4me0 tila korreloi huonon ennusteen syöpäpotilaista [9]. Koska histoni demetylaasientsyymin, RBP2 osallistuu aktiivisesti syövän etenemiseen. Kuitenkin, toisin kuin muut histoni-modifioivia entsyymejä, RBP2 voivat suoraan sitoutua kohde-DNA: ta. Se on AT-rikas vuorovaikutus domain (kuiva), joka tunnistaa spesifisesti DNA-sekvenssi CCGCCC [10]. Tämä erityinen DNA-sekvenssi on rikastettu promoottorialueiden RBP2 kohdegeenien. Mahasyövän, RBP2 sitoutuu promoottori alueille p16

INK4a, p21

CIP1 ja p27

kip1 geenejä estävän niiden ilmaisuja ja vähentää vanhenemista syöpäsolujen [11]. Keuhkosyövän, RBP2 sitoutuu promoottorialueen p27, sykliini D1 ja integriini pi 1 välittää syöpäsolujen lisääntymistä ja etäpesäkkeiden [12]. Tässä tutkimuksessa olemme analysoineet vaikutuksia RBP2 epiteeli–mesenkymaalitransitioon (EMT) NSCLC.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Potilaan tiedot ja näytteet saatiin kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen. Jokainen potilas tässä tutkimuksessa antoi kirjallisen tietoisen suostumuksen julkaista nämä runko-osat. Tutkimus hyväksyttiin eettinen komitea Qilu sairaalan.

Potilaat

keuhkosyöpä yksilöt (n = 61) ja kaukana normaali keuhkojen kudoksia (n = 47, 5 cm marginaali keuhkosyövän) kerättiin potilailta NSCLC Qilu sairaala vuodesta 2007 vuoteen 2008. kudoksia säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Kaikki näytteet olivat peräisin potilaista, jotka eivät ole suorittaneet ennen leikkausta sädehoitoa tai kemoterapiaa. Patologinen lavastus 61 potilasta suoritettiin kasvain-solmu-etäpesäke (TNM) pysähdyspaikan järjestelmä [13].

immunohistokemia

kudosnäytteiden upotettiin parafiiniin. Leikkeet poistettiin parafiini ksyleenillä ja niihin lisätään etanoli kaltevuus. Sen jälkeen, kun antigeenejä haettiin, leikkeet käsiteltiin 3% H

2O

2 10 min, jota seurasi 5% naudan seerumin albumiinia (BSA) 30 minuutin ajan. Sitten leikkeitä inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineita RBP2 (1: 250 laimennus), E-kadheriinin (laimennos 1: 200), N-kadheriinin (1: 200 laimennos) tai etana (laimennos 1: 200) yön yli 4 ° C: ssa ja sekundäärisiä vasta-aineita on konjugoitu HRP: tä (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA, USA) lisättiin 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Visualisointi vasta-aineen sitoutuminen suoritettiin käyttäen DAB värjäystä. Tumat värjättiin hematoksyliinillä. Immunovärjäyksen Tulokset itsenäisesti arvioineet kaksi patologia. Prosenttiosuus positiivisten syöpäsolujen arvioitiin seuraavien kriteerien: 0 = ei positiivinen syöpäsoluja, 1 = 10% positiivisia syöpäsoluja, 2 = 10% -35% positiivisia syöpäsoluja, 3 = 35% -75% positiivisia syöpäsoluja ja 4 = 75% positiivisia syöpäsoluja. Värjäytymisintensiteettiä arvioitiin seuraavien kriteerien: 1 = ei värjäystä, 2 = vaaleankeltainen värjäytymistä (heikko värjäytyminen), 3 = keltainen värjäytyminen (väli värjäys) ja 4 = ruskea värjäytyminen (voimakas värjäytyminen) [14]. Lopullinen tilanne oli sama kuin alueen pisteet ja intensiteetti pisteet [15]. Lopullinen värjäys pisteet ≥ 4 määriteltiin yliekspressio, ja lopullinen värjäys pisteet 4 määriteltiin nonoverexpression [15].

Cell Culture, RNA-interferenssi ja Gene Yliekspressio

Ihmisen keuhkosyöpä solulinjat A549 ja SK-MES-1 ja ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen linja Beas2B saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Beas2B ja A549-soluja kasvatettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 RPMI-1640 (Sigma, Santa Clara, CA, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Gibico, Carlsbad, CA, USA). SK-MES-1-soluja kasvatettiin MEM (Gibico, Carlsbad, CA, USA), jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Kun olemme analysoineet vaikutuksia Akt signaloinnin ilmaisu N-kadheriinin ja etanat, A549-soluja käsiteltiin 24 uM PI3K-estäjä (LY294002) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) 24 tuntia. RNA häiriöitä ja geenin yli-ilmentyminen, soluja viljeltiin 6-kuoppaisille levyille (1,0 x 10

5 solua /kuoppa) yön yli, minkä jälkeen transfektio 5 ui RBP2 siRNA (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) tai 2 ug pcDNA3-HA-RBP2 plasmidi (antelias lahja WG Kaelin) käyttäen 5 ui Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA); soluja viljellään sitten 48 tuntia. Seuraavat siRNA-sekvenssejä käytettiin tässä tutkimuksessa: RBP2 siRNA1 5′-AAUAUCCAGGGCCUUCAUGUAGCCC-3 ’; RBP2 siRNA2 5’-UUGUGUACUCGUCAAACUCUACUCC-3 ’; RBP2 siRNA3 5’-UUAACAUGCCGGUUAUCCAGGCUCU-3 ’; ohjaus siRNA 5’-UUCUCCGAAGGUGUCACGUTT -3 ’. RBP2 siRNA, joka voi tehokkaimmin heikentävistä RBP2 käytettiin seuraavissa kokeissa.

RNA uuttaminen ja määrälliset Real-Time PCR

Kokonais-RNA kudosnäytteet ja solulinjat eristettiin käyttäen Trizol -reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). cDNA syntetisoitiin käyttämällä First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo, San Jose, CA, USA). Reaaliaikaista PCR-analyysiä, cDNA: t monistettiin käyttäen SYBR Esiseos Ex Taq (Takara, Otsu, Shiga, Japani) ja havaittiin käyttämällä Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System. Suhteellinen geenin ilmentymisen normalisoitiin ilmentymisen β-aktiini ja laskettiin käyttäen 2

(- △△ CT) menetelmän [16]. Seuraavia alukkeita käytettiin tässä kokeessa: β-aktiini eteenpäin 5′-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3 ’ja reverse 5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′; RBP2 eteenpäin 5’-GCTTGGCAATGGG AACAAAA-3 ’ja reverse 5′-CCGTTGTCTCATTTGCATGTTAA-3’.

Western Blot

Yhteensä solun proteiinit uutettiin käyttäen Radio Immunoprecipition Pitoisuus lyysipuskuria, ja 50 ug yhteensä proteiineja käytettiin western blot -analyysiin. Polyvinyli- dimembraaneille koettimena vasta-aineiden β-aktiini (laimennus 1: 1000), RBP2 (laimennus 1: 1000), E-kadheriinin (laimennus 1: 1000), N-kadheriinin (laimennus 1: 1000), etana (1 : 1000 laimennos), p-Akt (laimennus 1: 1000) tai Akt (1: 1000-laimennos) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), jonka jälkeen inkuboitiin anti-kani-piparjuuri-peroksidaasi (HRP) konjugoidun immunoglobuliinin G (IgG) (1: 2000 laimennos). Täplät kehitetään käyttäen tehostettua kemiluminesenssin menetelmällä (Millipore, Billerica, MA, USA). Β-aktiini-signaali käytettiin kontrollina.

Immunofluoresenssi

A549-soluja viljeltiin 96-kuoppaisen levyn ja transfektoitiin RBP2 siRNA 48 tuntia. Sitten solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä, tehdään läpäiseviksi 0,2% Triton X-100, ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla vastaan ​​RBP2 (1: 250-laimennos) tai E-kadheriinin (1: 200 laimennos) 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa . Sitten soluja inkuboitiin FITC-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA, USA) 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Fluoresoivat kuvat otettiin käyttäen konfokaalisella laserkeilauksen mikroskooppi.

TranswellTM Invasion Analyysit

TranswellTM kalvoja (8 um huokoskoko, 6,5 mm, Corning, Tewksbury, MA, USA) olivat ennen päällystetty Matrigel (1 ug /ml, laimennettiin seerumittomalla RPMI-1640-väliaine). Sen jälkeen, kun RNA-interferenssi tai geenin yli-ilmentyminen hoitoa 48 h, 1,0 x 10

5 solua 200 ul: ssa RPMI-1640-väliaineessa ilman FBS: ää maljattiin yläkammiot. Sitten 500 ui RPMI-1640 väliaineessa, jossa oli 10% FBS: ää lisättiin alempaan kammioon. 12 tunnin kuluttua solut on yläpinnan transwell kalvot poistettiin pumpulipuikolla. Solut, jotka tunkeutuivat läpi kalvon alapintaan kiinnitettiin metanolilla ja värjättiin eosiinilla. Solut laskettiin valomikroskoopin alla.

Wound Healing määritykset

Haavan paranemista määritykset suoritettiin, kuten aiemmin on raportoitu [17]. Lyhyesti, solut transfektoitiin ja viljeltiin 48 tuntia ja kasvatettiin konfluentin yksisolukerrokselle. Sitten lineaarinen ”” haava ”” vedettiin yksisolukerros muovinen pipetin kärjen. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa, ja haava kuvattiin välittömästi ja seurataan 24 tunnin kuluttua. Välinen etäisyys kahden istunnon ”haava” on laskettu.

Lusiferaasimäärityksiä

A549-soluja transfektoitiin RBP2 siRNA päivänä 1 ja E-kadheriinipromoottorin reportteriplasmidilla (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) päivänä 2. seurata transfektion tehokkuus, Renilla lusiferaasi ohjaus reportteriplasmidilla ohjataan tymidiinikinaasipromoottoriin transfektoitiin soluihin. Beas2B solut kotransfektoitiin pcDNA3-HA-RBP2 plasmidi ja kahden edellä mainitun toimittaja plasmideja. 48 tunnin kuluttua, kaksi lusiferaasireportteri- määritystä (Promega, Madison, WI, USA) käytettiin määrittämään lusiferaasiaktiivisuus. E-kadheriinin reportteriplasmidi oli sama promoottorisekvenssin (-799–579), joka on aiemmin kuvattu [18].

Tilastollinen analysointi

Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS17.0 ohjelmisto. Χ

2 testiä käytettiin analysoitaessa suhde kliinis ja RBP2 ilme. Bivariate korrelaatiot RBP2, E-kadheriinin, N-kadheriinin ja etana myös analysoitiin χ

2 testiä. Muut tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen Studentin t-testi. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD 3 itsenäisestä määrityksissä. Tilastollisesti merkittävä ero otettiin huomioon

P

0.05.

Tulokset

väliset suhteet RBP2 ja kliinis-NSCLC

Tutkia roolit RBP2 keuhkosyövän, me ensimmäinen havaittu ilmentymistä RBP2 NSCLC kudoksissa ja niiden vastaavat normaalit kudokset käyttäen immunohistokemia (kuvio 1A). Tulokset esitetään yhteenvetona taulukossa 1. Näytteet, että yli-ilmentynyt RBP2 osuus 52,46% syöpä näytteitä, ja useimmat näistä näytteet omasivat välituote voimakasta värjäytymistä. Kuitenkin yksilöt RBP2 yliekspressio oli vain 29,79% viereisen normaalin keuhkojen kudoksia, ja useimmat näistä näytteet omasivat heikko väli värjäystä. Ilmaus RBP2 oli huomattavasti korkeampi NSCLC yksilöitä kuin normaalissa keuhkojen kudoksia (taulukko 1). Tasot RBP2 10 keuhkosyövän kudoksia ja niiden vastaavia normaalin keuhkojen kudokset edelleen havaita käyttäen Western blot ja reaaliaikainen PCR-analyysit. Tulokset osoittivat, että sekä RBP2 proteiini ja mRNA lisääntyi keuhkosyöpä kudoksissa (kuviot 1 B 1C).

. Immunohistochemistrical analyysi RBP2, E-kadheriinin, N-kadheriinin ja etanat (suurennos x 200). RBP2, N-kadheriinin ja etana olivat vahvasti positiivisia sekä adenokarsinooma ja suomuinen karsinoomanäytteistä, kun taas E-kadheriinin oli heikosti värjätään tai värjäämättä. B. Western blot analyysi RBP2 proteiinia. N = normaali keuhkokudoksessa, C = keuhkosyöpä kudosta. C. Reaaliaikainen PCR-analyysi RBP2 mRNA. Taso RBP2 mRNA oli suurempi keuhkosyövän kudoksiin kuin normaalissa keuhkojen kudoksia (

P

= 0,0011). *

P

0,05 ja **

P

0,01.

Variable

n

Yliekspressio * (n) B-ilmentymän korko (%) B χ

2

P

Cancer tissue613252 .465.5810.018Adjacent tissue471429.79Table 1. ilmentäminen RBP2 NSCLC kudosten ja niiden viereisten normaaleissa kudoksissa.

*: lopullinen värjäys pisteet ≥ 4 määriteltiin yliekspressio, ja lopullinen värjäys pisteet 4 määriteltiin nonoverexpression. CSV Lataa CSV

Sitten analysoimme suhdetta RBP2 ja potilaiden kliinis ominaisuuksia, kuten potilaiden ikä, sukupuoli, patologinen tyyppi, erilaistumista ja TNM luokittelu. Tulokset osoittivat, että ei ollut selvää yhteyttä välillä yli-ilmentyminen RBP2 ja nämä ominaisuudet (taulukko 2).

RBP2 (yliekspressio *)

Variable

No. potilaista

ei

kyllä ​​

P

Age0.099≤50 years321220 50 years291712Gender0.167Male331320Female281612Pathological type0.757Squamous371720Adeno241212Differentiation0.532Well1064Moderate261313Poor251015T classification0.415T1-2411823T3-420119N classification0.533N0291514N1321418Table 2 . korrelaatio kliinis muuttujien RBP2 proteiinin NSCLC kudoksissa.

*: lopullinen värjäys pisteet ≥ 4 määriteltiin yliekspressio, ja lopullinen värjäys pisteet 4 määriteltiin nonoverexpression. CSV Lataa CSV

Effects of RBP2 on NSCLC solumigraatiota

tutkia roolia RBP2 keuhkosyövän etäpesäke, me tutkimme, RBP2 säätelee solujen muuttoliikettä. Ensin havaitsimme estyminen RBP2 kolmen RBP2 siRNA: t A549 solujen valita tehokkain siRNA. Western blot-analyysi osoitti, että taso RBP2 proteiini oli korkea ohjaus A549-soluja ja laski sen jälkeen, kun RNA-interferenssiä RBP2. Tärkeää on, että RBP2 siRNA2 ryhmä osoitti alimman ilmentymisen RBP2 proteiinia (kuvio 2A). Lisäksi ilmaus RBP2 on RBP2 siRNA2 ryhmän havaittiin immunofluoresenssianalyysillä. Tulokset osoittivat, että RBP2 oli negatiivinen RBP2 siRNA2 ryhmä mutta positiivisen kontrolliryhmän (kuvio 2B). Näin ollen, olemme valinneet RBP2 siRNA2 ehtymisen RBP2 seuraavissa kokeissa. Sitten solu muuttavien käyttäytymistä ja A549-soluja ja Beas2B solut tutkittiin siirtokuoppaan invaasiomääritys ja haavoja määritys. Verrattuna kontrolliryhmään, vähemmän A549-soluja läpi matrigeeliä jälkeen deleption on RBP2 kun taas Beas2b solut siirretään, kun RBP2 oli säädelty (kuviot 3A 3D). Nämä tulokset osoittivat, että RBP2 todennäköisesti on rooli solun muuttoliikkeen.

. Tasot RBP2 proteiinin A549 erikseen käsitelty eri siRNA. B. Immunofluoresenssianalyysi of RBP2 käsittelemättömissä A549-soluja ja soluja käsiteltiin RBP2 siRNA2 (suurennos x 200).

. TranswellTM invaasio analyysi (suurennos x 200). B. lukumäärä hyökkäsi soluja. Enemmän Beas2B solut tunkeutuu transfektion jälkeen pcDNA3-HA-RBP2 plasmidi (

P

= 0,0011), kun taas määrä hyökkäsi A549-solut laski merkitsevästi hoidetuilla RBP2 siRNA2 (

P

= 0,0005 ). *

P

0,05, **

P

0,01 ja ***

P

0,001. C. lukumäärä siirtynyt solujen. Lukumäärä siirtynyt Beas2B solujen lisääntyi merkittävästi, kun transfektoitu pcDNA3-HA-RBP2 plasimid (

P

= 0,0010), kun taas vähemmän A549-soluja siirretty keskelle tilaa, kun transfektoitu RBP2 siRNA2 (

P

= 0,0014). *

P

0,05, **

P

0,01 ja ***

P

0,001. D. Haavojen parantumisen määritykset (suurennus x 100).

kaksimuuttujainen korrelaatiot RBP2 E-kadheriinin, N

–

kadheriinin tai etana NSCLC kudoksissa

tutkimiseksi roolit RBP2 syövän etäpesäkkeiden, me tutki vaikutusta RBP2 EMT, kuten EMT korreloi syövän etäpesäkkeitä [19]. Ensinnäkin E-kadheriinin, N-kadheriinin ja etanat havaittiin keuhkosyöpä kudosten ja niiden vastaavat normaalin keuhkojen kudoksia käyttäen immunohistokemia (kuvio 1A). Käyttöön otettu näytteet, jotka yli-ilmentynyt E-kadheriinin vähentynyt syövän kudoksissa verrattuna niiden viereisten normaaleissa kudoksissa (normaali vs syöpä, 80.85% vs 40.98%,

P

0,01), mutta määrä näytteitä että yli-ilmentynyt N-kadheriinia tai etana kasvoi syövän kudoksissa (normaali vs syöpä, N-kadheriinin, 12,77% vs. 72,13%,

P

0,01; normaali vs syöpä, etana, 17,02% vs. 68,85%,

P

0,01). Myöhemmin bivariate korrelaatiot RBP2 kanssa kunkin kolmen proteiinien analysoitiin χ

2 testiä. Tulokset osoittivat, että ilmentyminen RBP2 oli merkittävästi korreloi käänteisesti ilmentymisen E-kadheriinin (taulukko 3), mutta ei ollut merkittävää yhteyttä välillä RBP2 ja N-kadheriinin tai etanat (taulukko 3).

RBP2 (yliekspressio *)

Variable

No. of patients

no

yes

P

E-cadherin0.032overexpression*25169nonoverexpression*361323N-cadherin0.095overexpression*441826nonoverexpression*17116Snail0.276overexpression*421824nonoverexpression*19118Table 3. väliset korrelaatiot RBP2 ja E-kadheriinin, N-kadheriinin ja etanan NSCLC kudoksissa.

*: Lopullinen värjäys pisteet ≥ 4 määriteltiin yliekspressio, ja lopullinen värjäys pisteet 4 määriteltiin nonoverexpression. CSV Lataa CSV

Effects of RBP2 EMT NSCLC solulinjoissa

edelleen varmistamiseksi vaikutuksia RBP2 EMT, havaitsimme ilmaus RBP2, E-kadheriinin, N-kadheriinin ja etana Beas2B solut, A549-solut ja SK-MES-1-soluissa käyttämällä western blot ja reaaliaikainen PCR-analyysit. Western blot-analyysi osoitti, että ekspressio RBP2, N-kadheriinin ja etanat lisääntynyt, kun taas ilmentyminen E-kadheriinin vähentynyt Beas2B transfektoitujen solujen pcDNA3-HA-RBP2 plasmidi (kuvio 4A). Samaan aikaan sekä A549 ja SK-MES-1-solut osoittivat alempia RBP2, N-kadheriinin ja etanat proteiineja ja korkeamman tason E-kadheriinin proteiinia, kun transfektoitu RBP2 siRNA2 (kuvio 4A). Samoin, reaaliaikainen PCR-analyysi osoitti lisäksi, että RBP2, N-kadheriinin ja etanat mRNA: iden lisääntynyt ja taso E-kadheriinin mRNA väheni Beas2B käsiteltyjen solujen kanssa pcDNA3-HA-RBP2 plasmidi (kuvio 4B). Lisäksi alhaisempi RBP2, N-kadheriinin ja etanat mRNA: t, ja korkeamman tason E-kadheriinin mRNA havaittiin sekä A549 ja SK-MES-1-soluja, joita oli käsitelty RBP2 siRNA2 (kuvio 4C).

. Western blot-analyysi RBP2, E-kadheriinin, N-kadheriinin ja etana ilmaisun Beas2B, SK-MES-1 ja A549-solut. Kun Beas2B solut transfektoitiin pcDNA3-HA-RBP2 plasmidi, tasot RBP2, N-kadheriinin ja etanat proteiinien lisääntynyt, ja taso E-kadheriinin proteiinin vähentynyt. Kun SK-MES-1 ja A549-soluja transfektoitiin RBP2 siRNA2 tasot RBP2, N-kadheriinin ja etanat proteiinit lisättiin, ja taso E-kadheriinin proteiinin vähentynyt. B. Reaaliaikainen analyysi tasojen E-kadheriinin, N-kadheriinin ja etanat mRNA-molekyylien Beas2B soluissa. Taso E-kadheriinin mRNA oli suurempi Beas2B käsiteltyjen solujen kanssa pcDNA3-HA-RBP2 plasmidi kuin vertailuryhmässä Beas2B solut (

P

= 0,0005), mutta tasot N-kadheriinin ja etanat mRNA: iden olivat alhaisemmat (N-kadheriinin,

P

= 0,0063, etana,

P

= 0,0101). *

P

0,05, **

P

0,01 ja ***

P

0,001. C. Reaaliaikainen analyysi tasojen E-kadheriinin, N-kadheriinin ja etanat mRNA A549-soluissa. Taso E-kadheriinin mRNA oli pienempi A549-soluja käsiteltiin RBP2 siRNA2 kuin vertailuryhmässä A549-soluja (

P

= 0,0007), mutta tasot N-kadheriinin ja etanat mRNA: t olivat korkeampia (N- kadheriinin,

P

= 0,0037, etana,

P

= 0,0014). *

P

0,05, **

P

0,01 ja ***

P

0,001.

vaikutukset RBP2 E-kadheriinipromoottorin

Koska Huang et al. vahvisti, että RBP2 voi sitoutua suoraan promoottorialue (-799–579) E-kadheriinin [18] käyttämällä sirun määritystä, tutkimme aktiivisuus saman E-kadheriinin promoottorialueen käyttämällä lusiferaasin määritystä A549 ja Beas2B solut. Kun A549-soluja transfektoitiin RBP2 siRNA2, E-kadheriinin promoottorin aktiivisuus lisääntyi merkittävästi (kuvio 5A), kun taas E-kadheriinin promoottorin aktiivisuus laski jyrkästi, kun RBP2 yli-ilmentymisen Beas2B soluissa (kuvio 5B).

. Eelevated E-kadheriinipromoottorin aktiivisuus A549-soluja oli transfektoitu RBP2 siRNA2 (

P

= 0,0098). *

P

0,05, **

P

0,01. B. inhibitio promoottorin aktiivisuuden Beas2B transfektoitujen solujen pcDNA3-HA-RBP2 plasmidi (

P

= 0,0075). *

P

0,05, **

P

0,01. C. ilmentyminen p-Akt ja Akt proteiinien A549 käsitelty RBP2 siRNA2. D. tasot p-Akt, N-kadheriinin ja etana proteiinien A549-soluja. Kun A549-soluja käsiteltiin LY294002: n ilmentyminen näiden kolmen proteiinin väheni.

vaikutukset RBP2 on N

–

kadheriinin ja etana

Sekä N- kadheriinin ja etana on osoitettu olevan alavirtaan PI3K /Akt-reitin [20,21]. Siksi me arveltu, että RBP2 säännelty N-kadheriinin ja etanat aktivoitumisen kautta Akt signalointia, ja tutkimme tasot p-Akt ja Akt että A549-soluja Western blot -analyysiä käyttämällä. Tulokset osoittivat, että p-Akt-proteiinia oli korkea A549-soluja ja laski sen jälkeen ehtyminen RBP2 (kuvio 5C). Ekspression p-Akt korreloi positiivisesti ilmentymisen RBP2. Seuraavaksi vaikutusten vahvistamiseksi Akt signaloinnin ilmaisu N-kadheriinin ja etanat, käsittelimme A549-soluja, joilla on PI3K-estäjä (LY294002) 24 tunnin ajan ja tarkasteltiin tasot N-kadheriinin ja etanat proteiineja. LY294002: n on osoitettu estää PI3K-riippuvainen Akt-fosforylaation ja kinaasiaktiivisuutta. Mielenkiintoista on, että tasot sekä N-kadheriinin ja etanat väheni (kuvio 5D). Siten ilmaisu N-kadheriinin ja etanat positiivisesti liittyy ilmentymisen p-Akt.

Keskustelu

RBP2, äskettäin tunnistettu histoni demetylaasin, kuuluu JARID perheen ja hallussaan kuivilla (A /T rikas vuorovaikutus domain). Se usein vie ja säätelee promoottorit useiden geenien, jotka sisältävät H3K4me3 [5,22]. Vielä tärkeämpää on, RBP2 uskotaan osallistuvan monissa solun biologisia toimintoja, erityisesti kasvaimen biologiaan. Tutkimuksemme paljastaa romaanin käsityksen patofysiologia EMT, ja tarjoamme todisteita siitä, että RBP2 indusoi EMT NSCLC.

RBP2 on tärkeä rooli ihmisen syövässä. Esimerkiksi yli-ilmentyminen RBP2 estää vanhenemista mahalaukun syövän soluihin [11]. Ehtyminen RBP2 heikentää leviämisen mutta edistää vanhenemista ja erilaistumista hiirillä puuttuu MEN1 ja RB1 [23]. Drug toleranssi keuhkosyövän soluista vaatii RBP2 [24]. Knockdovvn RBP2 johti kohonneeseen H3K4me3 klo edistäjiä DAF ja HMOX1 geenien Beas2B soluissa [25]. RBP2 up-säätelee ilmentymistä sykliini D1, sykliini E1 ja integriini pi 1 parantaa solujen jakaantumiseen, kulkeutumiseen ja invaasio [12]. Tässä tutkimuksessa olemme myös havainneet ekspressiota RBP2 NSCLC kudoksissa ja analysoitiin suhteita RBP2 ja kunkin kliinis-NSCLC. Tulokset osoittivat, että RBP2 oli yli-ilmentynyt ihmisen NSCLC, mutta ei ollut merkittävää suhdetta yliekspressio RBP2 ja kunkin kliinis ominaisuus. Lisäksi vaikutukset RBP2 siirtyvien keuhkosyövän soluja tutkittiin, ja huomasimme, että RBP2 voisivat tehostaa NSCLC solumigraatiota. Kaikki nämä tiedot viittaavat siihen, että RBP2 on onkogeeni ja annetaan ohjeita syövän hoitoon.

EMT on keskeinen askel syövän etäpesäkkeiden. Tämän prosessin aikana syöpäsolut peräisin epiteelisolujen menettävät epiteelisolujen ominaisuuksia, kuten soluadheesiota, mutta hankkia mesenkymaalisten ominaisuuksia, kuten solun liikkuvuus, paeta ensisijaisen kudoksesta ja hyökätä ympäröivän strooman [26-30]. Epiteelin kadheriinin (E-kadheriinin), joka on adheesiomolekyyli, on keskeinen molekyyli EMT. Se on tärkeä rooli ylläpitämisessä epiteelin fenotyyppi. Koska E-kadheriinin kanssa johtaa epiteelin morfologian [31]. Mielenkiintoista on, että alennettu ilmentyminen E-kadheriinin liittyy usein lisääntynyt ilmentyminen hermoston kadheriinin (N-kadheriinin) [32]. N-kadheriinin on osoitettu heikentää soluadheesiota ja edistää rintasyövän solujen invasiivisuus [32,33]. Snail on toinen tärkeä molekyyli EMT. On vahvistettu, että etana yliekspressio parantaa syövän invaasio edistämällä solun liikkuvuus [34]. Tässä kokeessa RBP2 osoitettiin ajan säätelemään E-kadheriinin ja alas-säätelemään N-kadheriinin ja etanat. Nämä tulokset osoittavat, että RBP2 pystyy aiheuttamaan EMT. Äskettäin, Teng et ai. vahvistanut, että RBP2 edistää syövän etäpesäkkeiden aktivoimalla integriini β1 [12]. Tässä esittelemme uuden mekanismin, joka RBP2 voi olla rooli syövän etäpesäkkeiden aiheuttamalla EMT.

E-kadheriinin on hyvin osoitettu olevan keskeinen välittäjäaine EMT häiriöitä sekä E-kadheriinin on osoittautunut olla syynä EMT. Esimerkiksi Cheng et ai. ja Masszi et ai. havaittu, että TGF-β1 ei kyennyt indusoimaan EMT: n läsnä ollessa solu-solu-kontakti [35,36]. Masszi et ai. jopa totesi, että puuttuminen E-kadheriinin välittämiä solun solukontakti oli salliva induktioon EMT. Yhdenmukainen Masszi et al., Zheng et ai. kertoi, että TGF-β1 voinut aiheuttaa EMT konfluenteissa putkimainen epiteelisolujen, mutta että yli-ilmentyminen E-kadheriinin fibroblasteissa aiheuttama mesenkymaalisten-epiteelin siirtyminen ja esti EMT putkimainen epiteelisolujen [37]. Useat transkriptiotekijät on osoitettu ohjaamaan EMT estämällä E-kadheriinin promoottorin aktiivisuus ja tukahduttaa E-kadheriinin ilmentymisen [38,39]. Tässä artikkelissa, me tutkimme, RBP2 aiheuttama EMT tukahduttamalla E-kadheriinipromoottorin toimintaa ja estämällä E-kadheriinin ilmentymisen. Koska Huang et ai. vahvisti, että RBP2 suoraan sitoutunut E-kadheriinin promoottorialue (-799–579) [18], tutkimme aktiivisuus saman E-kadheriinin promoottorialueen ja havaitsi, että RBP2 todellakin heikentynyt E-kadheriinin promoottorin aktiivisuutta. Nämä tulokset osoittavat, että RBP2 alas-säätelee ilmentymistä E-kadheriinin estämällä promoottorin aktiivisuutta E-kadheriinin.

Mekanismi, jolla RBP2 säätelee N-kadheriinin ja etanat tutkittiin myös tässä asiakirjassa. Paljon todisteita viittaa kriittiseen rooliin Akt signalointia EMT. Esimerkiksi aktivointi Akt signalointi edistää TGFβ- ja EGF-riippuvaisten EMT [40,41]. Akt voi myös fosforyloida IKKα lisätä etana ilmaisun [20]. Biflorin estetty invasiivisuus solujen by alaspäin säätäminen N-kadheriinin, todennäköisimmin kautta Akt signalointi [21]. Täällä meidän havainnot osoittivat, että RBP2 sääteli ilmentymistä N-kadheriinin ja etana aktivaation kautta Akt signalointi, ja Akt estäjä voi estää vaikutuksia RBP2 ilmenemistä N-kadheriinin ja etana.

Äskettäin Teng et al. teki cDNA microarray analyysi NSCLC soluissa [12]. Ja he havaitsivat, että 10 geenit osallistuvat etäpesäkkeitä merkittävästi muuttuneet sen jälkeen, kun ehtyminen RBP2, kuten Dihydropyrimidinaasi kaltainen 3, integriinin β1, liuenneen aineen kantaja perhe 7 osa 11, liuenneen aineen kantaja perhe 7 jäsen 5, desmogleiini 2, sfingosiini-1-fosfaatti lyase 1 , kollageeni tyyppi 1 α1, tropomyosin 1α, solunjakautumisen sykli 42 ja protocadherin β10. Kuitenkin tässä tutkimuksessa ei analysoida vaikutuksia RBP2 E-kadheriinin, N-kadheriinin ja etanan jotka ovat tärkeitä molekyylejä osallisina syövän etäpesäkkeiden. Tutkimuksemme rikastaa mekanismeja RBP2 välittämän syövän etäpesäkkeiden.

Lisäksi, EMT on osoitettu johtavan kehittynyt resistenssi gefitinibin NSCLC soluissa [42]. Samalla RBP2 on olennaista gefitinibille resistenssin NSCLC soluissa [24]. Saamiemme tulosten, päättelemme, että RBP2 välittämää gefitinibi resistenssin NSCLC-soluja voidaan läheisesti vaikutus RBP2 EMT.

Lääkehoito on tärkeä hoito keuhkosyövän. Kun otetaan huomioon nykyinen huono eloonjäämisaste, uusia terapeuttisia kohteita tarvitaan kiireesti. On osoitettu, että RBP2 yliekspressoituu keuhkosyöpä, ja sen ilme on erittäin liittyy syöpäsolujen lisääntymistä, invaasiota, maahanmuutto ja huumeiden toleranssi. Meidän kokeet osoittivat, että RBP2 voivat aiheuttaa EMT NSCLC. Kaikki nämä tutkimukset osoittavat, että RBP2 on potentiaalinen kohde anti- keuhkosyövän hoidossa.

Kiitokset

Haluamme kiittää William G. Kaelin, Jr. (Howard Hughes Medical Institute, Dana -Farber Cancer Institute ja Brigham and Women n sairaala, Harvard Medical School, USA) plasmidien.