Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aikaisemmat tutkimukset ryhmämme ovat osoittaneet, että ekspressiotasot Orc6 olivat erittäin koholla peräsuolen syövän potilasnäytteiden ja induktio Orc6 liittyi 5-fluorourasiilin (5-FU) hoitoon. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia molekyyli- ja solutason vaikutuksia Orc6 paksusuolen syöpä. Tässä tutkimuksessa käytämme HCT116 (wt-p53) ja HCT116 (nolla-p53) koolonsyöpäsolulinjaa mallina järjestelmä tutkimaan vaikutuksia Orc6 soluproliferaatioon, kemosensitiivisyys ja reitit mukana Orc6. Olemme osoittaneet, että säätelyä alaspäin Orc6 herkistää koolonkarsinoomasoluissa sekä 5-FU: n ja sisplatiinin (cis-pt) hoitoon. Vähentynyt Orc6 ilmentyminen HCT-116 (wt-p53) solujen RNA-interferenssi laukaisi solusyklin pysähtymisen G1 vaiheessa. Pitkäaikainen esto Orc6 ilmaisun johti monitumaisia ​​soluissa HCT-116 (wt-p53) solulinjassa. Western immunoblottaus analyysi osoitti, että säätelyä alaspäin Orc6 aiheuttama p21 ilmentymistä HCT-116 (wt-p53) soluissa. Induktioon p21 välittämä tehostettuun fosforyloidun p53 at ser-15. Sitä vastoin ei ole kohonnut ilmentyminen p21 HCT-116 (null-p53-solut). Orc6 säätelyä alaspäin myös lisääntynyt ilmentyminen DNA: ta vaurioittavat korjaus- proteiinin GADD45β ja vähentää ilmentymistason JNK1. Orc6 voi olla potentiaalinen uusi kohde tulevalle anti syövän terapeuttista kehitystä paksusuolen syövän.

Citation: Gavin EJ, Song B, Wang Y, Xi Y, Ju J (2008) vähentäminen Orc6 Expression herkistää ihmisen paksusuolen syövän solut 5-fluoriurasiili ja sisplatiinia. PLoS ONE 3 (12): E4054. doi: 10,1371 /journal.pone.0004054

Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Ordway Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 26 marraskuu 2008; Hyväksytty: 01 joulukuu 2008; Julkaistu: 29 joulukuu 2008

Copyright: © 2008 Gavin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Mitchell Cancer Institute syövän genomiikka laboratorio käynnistysvaiheen rahasto (J. Ju) ja NIH CA114043 (J. Ju). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Orc6 on yksi kuudesta alkuperän tunnistaminen kompleksin proteiinin ihmisen soluissa. Se toimii alkuperäisen kokoonpanon alustan, joka vaaditaan DNA: n replikaatiota. Roolit Orc6 DNA-replikaatioon on tutkittu laajasti sekä hiiva- ja Drosophila [1], [2], [3], [4], [5], [6]. Mutta on rajoitetusti tietoa ihmisen syövän [7], [8]. On raportoitu, että lisäksi sen toimintaa DNA-replikaation aloittaja proteiinia, se on tärkeässä asemassa transkription geenien ja heterochromatin muodostumiseen [8]. Ei kuitenkaan ole selvää aikana aloittamisen mutkikkaaksi, jossa vaihe, joka Orc6 osallistuu [9]. On osoitettu, elegantisti jonka Prasanth

et al.

Dynamiikka Orc6 lokalisointi aikana koko solusyklin, mukaan lukien DNA: n replikaatioon, kromosomi regregation, ja sytokineesi. Ne viittaavat myös siihen, Orc6 voivat toimia signaloinnin solusyklin ohjaus [8]. Kiinnostuksemme Orc6 johtui aikaisemmista tutkimuksista kattavan genomiikan analyysi paljasti, että Orc6 liittyy 5-FU liittyvän resistenssin ihmisen koolonsyöpäsolulinjaa [10]. Meidän follow up study käyttäen peräsuolen potilaan näytteitä edelleen vahvisti, että ilmaus Orc6 on erittäin koholla paksu- tuumorikudoksista verrattuna pariksi normaaliin yksilöt [11]. Nämä tulokset vahvistivat kliinistä merkitystä Orc6 johtaa meidän hypoteesi, että Orc6 voivat olla avainasemassa, joka on mukana peräsuolen syöpä. Ylevällä taso voi myös olla merkittävä tekijä chemoresistance. p53 on yksi useimmin muuttunut tuumorisuppressoreilla kolorektaalisyövässä ja koska sen kriittinen toiminto Syklikontrollin [12], [13]. Tässä tutkimuksessa käytämme parin koolonsyöpäsolulinjaa joko villityypin p53 tai null p53 kuin meidän malli järjestelmä.

Tässä tutkimuksessa, tarjoamme kokeellista näyttöä, että vähentämällä Orc6 ilmentymisen RNA-interferenssi voi herkistää paksusuoli syövän solulinjojen kaksi suurta kemoterapeuttisten aineiden 5-FU: n ja sisplatiinin hoitoon. Vähenevät Orc6 ilmentymisen siRNA knock-down laukaisi solusyklin pysähtymiseen ja laski soluproliferaatiota in HCT-116 (wt-p53) soluissa. Sen sijaan tämä vaikutus oli merkittävästi heikentynyt HCT-116 (null-p53) soluissa. Muuttaminen solusyklikontrollin vähentynyt Orc6 ilmentyminen johtui induktion p21, on merkittävä solusyklin kontrolli-geenin. Induktio p21 johtui lisääntyneestä tasolle phosphorylatd p53 at ser-15 laukaisee knock-alas Orc6 ilmaisua. Orc6 voi olla mahdollinen uusi tavoite uusille anti kasvaimen terapeuttista kehitystä.

Tulokset ja keskustelu

Vähentämällä Orc6 ilmentymistä HCT-116 (wt-p53) solujen estää soluproliferaatiota

lisääntynyt tasot Orc6 ihmisen paksusuolen syövän yksilöitä johti meidät tutkimaan roolit Orc6 solusyklin ohjaus ja huumeiden herkkyys. Käyttämällä siRNA knock-down lähestymistapa, ensin vahvisti, että proteiini tasot Orc6 pienennettiin käyttämällä Western immunoblot-analyysi sekä HCT (wt-p53) soluja (kuvio 1A, kaista 1, epäspesifinen kontrolli siRNA, kaista 2, siRNA vastaan Orc6) ja HCT-116 (null-p53) soluja (kuvio 1A, kaista 3, ei-spesifinen ohjaus siRNA; kaista 4, siRNA vastaan ​​Orc6). Ekspressio Orc6 proteiinin väheni enemmän kuin 5-kertaisesti HCT (wt-p53-soluja) ja HCT-116 (null-p53-soluja).

α-tubuliinin käytettiin kontrollina (A). Lisääntynyt multinucleation kun vaiennettu Orc6 HCT-116 (wt-p53) soluissa siRNA. Vasen paneeli, kevyet kuva; Oikea paneeli, DAPI tumavärjäystä (B).

On osoitettu aikaisemmin, että knock-down Orc6 HeLa-soluissa indusoi polypoidy [8]. Tuloksemme vahvisti tämän koolonkarsinoomasoluissa, toistuvan transfektion 3 päivän välein, HCT-116 (wt-p53) solujen vähensi Orc6 ilme tuli monitumaisten (kuvio 1 B). Tämä väestö lisääntyi ajan. Kromatiinin värjättiin 4 ’, 6’-diamino-2-fenyyli (DAPI) näyttää monitumaisia ​​soluihin jälkeen yllä Orc6 pudotus siRNA (vasen ruutu, valonsironta solu kuvaa, oikea paneeli, DAPI tumavärjäystä kuva kuvassa 1B). Solujen lisääntyminen korko aleni yli 50% (avoin baari), jossa Orc6 knock-down (kuva 2). Kuitenkin vähentäminen Orc6 ilmentymisen HCT-116 (null-p53) soluihin vähennetään soluproliferaatiota vain 23% (katkoviiva bar). Tutkia pienentymisen vaikutusta Orc6 solusyklin kontrolli, HCT-116 (wt-p53) ja HCT-116 (null-p53) soluja transfektoitiin ensin 100 nM Orc6 siRNA. Transfektoidut solut altistettiin 10 uM 5-FU: ssa 12 tuntia. Havaitsimme, että 12 tuntia myöhemmin, sekä ohjaus HCT-116 (wt-p53) solujen ja solujen pienentää Orc6 ilmentävien solujen pystyivät edelleen suurelta osin G1 vaiheessa ilman solusyklin re-entry (kuvio 3A). Sitä vastoin, HCT-116 (null-p53) kontrollisoluja ja Orc6 vähentää solut uudelleen tuli S-vaiheen solusyklin huolimatta DNA-vaurioita 5-FU: n ja Orc6 vähentäminen (kuvio 3B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että solusyklikontrollin jälkeen DNA-vaurio riippuu läsnäolo villityypin p53.

vaikutus Orc6 on kemosensitiivisyys 5-FU ja cis-pt

tutkimiseksi mahdollisia vaikutuksia Orc6 on kemosensitiivisyys joitakin ensilinjan kemoterapeuttisen yhdisteet, kuten 5-FU ja cis-pt kolorektaalisyövässä, HCT-116 (wt-p53) soluja käytettiin mallimme järjestelmän avulla transfektoitu jossa Oligofectamine yksin, epäspesifisiä siRNA, ja Orc6 erityisiä siRNA. Solut käsiteltiin sitten 5-FU tai sisplatiinin kanssa sarjalaimentamalla. 72 tunnin kuluttua, soluproliferaatiota kvantifioitiin WST-1 määrityksessä. Kuvio 4A osoitti, että HCT-116 (paino-p53-soluja), joilla on alentunut Orc6 ilmentyminen oli 5 kertaa herkempi 5-FU hoitoon verrattuna kontrollisoluihin, joka perustuu IC

50-arvo. HCT-116 (paino-p53-solut) vähensi Orc6 ilmentyminen oli myös herkempiä sisplatiinihoitoon kontrollisoluihin verrattuna (kuvio 4B). Tämä vaikutus oli suurelta osin puuttui HCT116 (nolla-p53) soluja (tietoja ei näytä).

Down stream signalointipolkujen aikaan Orc6

alkaa ymmärtää alavirran signalointia reittejä mahdollisesti mukana Orc6, suurikapasiteettisten geenin ilmentyminen analyysiä käytettiin määrittämään geenin ilmentyminen muuttuu välillä HCT-116 (paino-p53), jotka on transfektoitu Orc6 erityisiä siRNA ja ei-spesifistä siRNA ohjaus. Expression ja GeneOntology analyysi osoitti, että useat geenit vaikuttavat Orc6 esto (Data, S1). Tutkimustulosten perusteella, on joukko hyvin tunnettuja solusyklikontrollin geenien vahvistettiin käyttämällä Western immunoblot-analyysillä. Tulokset osoittavat, että ekspressio p21 indusoituu merkittävästi HCT-116 (paino-p53) soluissa, sen jälkeen Orc6 knock-down (kuvio 5, kaista 1, ei-spesifinen oligo valvonta; kaista 2, siRNA on Orc6). Olemme edelleen vahvisti, että ilmentyminen DNA-vaurion korjauksen proteiinia Gadd45β indusoitui myös vähentämällä Orc6 ilmentyminen HCT-116 (paino-p53) soluissa (kuvio 5, kaista 1, ei-spesifinen siRNA valvonta; kaista 2, Orc6 erityisiä siRNA). On hyvin dokumentoitu, että Gadd45β tärkeä rooli solusyklin pysähtymiseen, DNA korjaus, luontaisen immuniteetin ylläpito genomin vakautta ja apoptoosin [7], [14], [15], [16]. Toiminta Gadd45β välittyy vuorovaikutus muiden proteiinien, kuten cdc2 häiritsemällä vuorovaikutusta ccd2 ja sykliini B1 puhkeamisessa G2 /M solukierron pysähtymisen alle genotoksinen stressi [17], [18]. Tuloksemme osoittivat, että Gadd45β on ainakin osittain vastuussa DNA: n replikaation vika laukaisee vähentää Orc6 ilmentymisen paksusuolen syöpäsoluissa. Ilmentyminen JNK1 taso laski alentunut Orc6 ilmentyminen (kuvio 5). On osoitettu, että roolit JNK1 olivat melko monimutkainen, koska sen vuoksi tehtävä niin apoptoottisia ja selviytyminen signalointireitteihin [19], [20]. Fibroblastien JNK-aihiot ovat herkempiä TNF-aiheuttamaa apoptoosia [21]. Hiiren alkion fibroblasteissa, joilla ei ole MKK7 (ylävirtaan aktivaattori JNK) tehdään solujen vanhenemista ja G2 /M kasvun pysähtymisen, edelleen tukemaan päätelmää, että alennettu ilmentyminen JNK1 voi olla yksi vaikuttavista tekijöistä, G2 /M pidätyksen aiheuttama knock-down of Orc6 ilmaisun [22]. Nämä muutokset olivat pääosin poissa HCT-116 (null-p53) soluja (tietoja ei näytä). Tämä on yhdenmukaista aikaisempien raportoidussa tutkimuksessa että p53: lla keskeinen rooli solusyklikontrollin vastauksena DNA-vaurioita. Induktion kanssa p21 ilmaisun odotamme myöhemmin p53 voi nousta, koska p21 on tunnettu solusyklin tarkastuspisteiden ohjaus geeni välittämä p53. Kuitenkin koko solun p53-proteiinin tasoa ei muutettu kanssa knock-down p53 ilmaisun (kuvio 6A, kaista 1 ja 2). Induktio p21 puuttui HCT-116 (null-p53) solujen Orc6 knock-down (kuvio 6A, kaista 3, ohjaus, kaista 4, siRNA of Orc6). Tämä osoittaa, että induktio p21 ilmentymisen on oltava p53 riippuu puuttumisesta huolimatta p53-ilmentymisen tasolla. Vaikka koko p53 taso ei kasvanut HCT-116 (wt-p53) soluissa, me spekuloida, että taso p53 tumafraktios- voidaan korottaa johtuen tunnetun p53 translokaatio tapahtuma. Erottamalla ytimet ja sytoplasmassa, osoitimme, että taso koko p53-proteiinin tumissa ei koholla HCT-116 (wt-p53) solujen vähensi Orc6 ilme hoitaa Orc6 erityisiä siRNA (kuvio 6A). Sen sijaan, taso fosforyloidun p53 ser-15 nostettiin ydin- osa HCT-116 (paino-p53-solut) vähensi Orc6 ilmentymistä (kuvio 6B). Tämä on erittäin yhdenmukainen hyvin dokumentoitu p53 vasteena DNA-vauriolle (14). Fosforyloitua p53 at ser-15 jäämiä voi vähentää sen vuorovaikutusta negatiivisen säädin, onkoproteiinia MDM2.

(A) Western immunoblot-analyysi p53 ja p21 ilmaisun jälkeen Orc6 pudotus siRNA sekä HCT-116 (wt-p53) soluja (kaista 1, epäspesifinen kontrolli; kaista 2, erityinen siRNA varten Orc6) ja HCT-116 (null-p53) soluja (kaista 3, ei-spesifinen kontrolli; kaista 4, erityisiä siRNA varten Orc6) . (B) Western immunoblot-analyysi fosforyloitua p53 ilmentymisen ser-15 sekä sytoplasman ja tumafraktios- valvonta HCT-116 (wt-p53) soluja (kaista 1, sytoplasmisen, kaista 2, ydin-) ja HCT-116 (wt-p53 ) käsiteltyjä soluja siRNA vastaan ​​Orc6 (kaista 3, sytoplasman, kaista 4, ydinvoima). Yhteensä p53-proteiinin ilmentymisen tasot, käytettiin kontrollina proteiinin ydin- fraktiot ja α-tubuliinin käytettiin kontrollina sytoplasman jakeet.

Näyttää siltä, ​​että DNA-vaurioita vaste, jonka on aiheuttanut vähentynyt Orc6 tasolla välittyy p53 riippuvainen solusyklikontrollin kautta. Me spekuloida, että korkean tason Orc6 kolorektaalisyövässä voi edistää genomiin epävakautta ja ehkä kertynyt miss-ampumisen DNA-replikaation p53 deleetioita /mutaatiot yli 50%: Kolorektaalituumorien. Menetys p53 Kolorektaalituumorien edelleen edistää genomiin epävakautta ja kertynyt mutaatioita. Jatkotutkimuksissa tarvitaan täysin ymmärtää molekyyli- ja solutason mekanismi Orc6 kolorektaalisyövässä. Huolimatta keskeinen rooli alkuperäiseen kokoonpanoon alustan vaaditaan DNA: n replikaatiota, Orc6 voi olla potentiaalinen kuin uusi kohde syövän vastaista terapeuttista kehitystä. Tilanne ehkä samanlainen 26S-proteasomin tavoitteeksi vasta-aineen lääkkeen bortetsomibia. Aluksi luultiin, että kohdistaminen 26S-proteasomin ei ole hyvä strategia, koska sen kaikkialla rooli proteiinien hajoaminen [23]. Uusimmat raportti Chen

et al.

Viittaa siihen, että Orc6 on tarpeeton DNA sitova aktiivisuus örkit hiivassa. Tämä edelleen tukee käsitystä, että kohdistaminen Orc6 peräsuolen syöpä on toteuttamiskelpoinen strategia tulevaa terapeuttista kehittämiseen [24].

Yhteenvetona olemme osoittaneet, tässä tutkimuksessa, että alas säätely Orc6 paksusuolen syöpäsoluissa herkistää soluja 5-FU: n ja sisplatiinin hoitoon. Yhdessä aiempien tutkimusten että Orc6 oli erittäin yli-ilmentynyt kolorektaalisyövässä potilailla, uskomme, että Orc6 saattaa olla potentiaalia uutena syövänvastainen tavoite tuleville kasvaimia vastustavaa hoidollista kehittämiseen.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

ihmisen koolonsyöpäsolulinjaa, HCT-116 (wt-p53) ja HCT-116 (null-p53) solut olivat lahja professori Bert Vogelstein (Johns Hopkins University, Baltimore, MD) , ja pidettiin McCoyn 5A-alustassa (Gibco Laboratories). 5-FU ja sisplatiinin hankittiin Sigmalta.

siRNA Transfektio

HCT-116 (wt-p53) ja HCT-116 (null-p53) maljattiin 6-kuoppaisille lokeroiden 1 × 10

5cells /hyvin ja transfektoitu Oligofectamine, epäspesifinen kontrolli siRNA tai siRNA vastaan ​​Orc6 100 nM pitoisuus perustuu valmistajan protokollan (Invitrogen Inc.) B

RNA: n eristäminen

kokonais-RNA eristettiin solulinjoista käyttämällä TRIzol-reagenssia (Invitrogen, San Diego, CA) valmistajan ohjeiden 24 h transfektion jälkeen siRNA.

Western immunoblot-analyysi

Solut kaavittiin ja lyysattiin RIPA-puskuriin (Sigma). Yhtä suuret määrät proteiinia näytettä (50 ug) erotettiin SDS-PAGE 12% geeleissä menetelmällä Laemmli, ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi kalvoja (PVDF) (BIO-RAD Laboratories). Membraanit blokattiin sitten 5% rasvatonta maitoa TBS-T (Tris-puskuroitu suolaliuos ja 0,5% Tween-20) huoneenlämpötilassa 1 tunti. Proteiinit koetettiin rotan anti-orc6 monoklonaalinen vasta-aine (1:1000 laimennus, Upstate Technology), hiiren anti-α-tubuliinin (1:1000 laimennus; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Ca), hiiren anti-p53 (1:1000 , Santa Cruz), jota seurasi inkubaatio piparjuuriperoksidaasilla konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (1:1,000 laimennus, Bio-Rad, Hercules, CA). Proteiinit visualisoitiin kemiluminesenssidetektiolla järjestelmän avulla Super Signal alustan (Pierce, Rockford, IL) B

Reaaliaikainen qRT-PCR-analyysi

cDNA-synteesi toteutettiin High Capacity cDNA synteesi kit (Applied Biosystems) käyttäen 1 ug kokonais-RNA: ta templaattina. PCR Master Mix, joka sisältää TaqMan 2 x Universal PCR Master Mix (o AmpErase UNG), 10 x TaqMan-määritys ja RT tuotteiden 25 ul: n tilavuudessa käsiteltiin seuraavasti: 95 ° C 3 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C: ssa 15 sekuntia ja 60 ° C: ssa 35 sekuntia (n = 3). Signaali kerättiin päätepisteessä jokaisen jakson. Geeniekspressiota arvoja Orc6 kustakin näytteestä laskettiin normalisoimalla sisäisen valvonnan GAPDH ja suhteellinen kvantitointi arvot piirrettiin.

Solusyklianalyysiä virtaussytometrialla

HCT-116 (wt-p53) ja HCT-116 (null-p53) maljattiin 6-kuoppaisille lokeroiden 1 x 10

5cells /hyvin ja transfektoitu Oligofectamine, epäspesifinen kontrolli siRNA tai Orc6 geenispesifisistä siRNA 100 nM pitoisuus. Soluja käsiteltiin 5-FU: ta (10 uM) 12 tunnin ajan, ja solut kerättiin trypsiini, pestiin ja leimattiin propidiumjodidilla, pestiin ja suspendoitiin uudelleen Krisham modifioidussa puskurissa ja suodatetaan virtaussytometria-analyysiä (BD FACS Caliber).

tukeminen Information

Data S1.

GeneOntology. Gene Expression ja GeneOntology analyysi ilmentyvät eri geenien ohjaus ja Orc6 knock-down HCT116 (wt-p53) soluihin.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0004054.s001

(2,77 MB TIF) B