Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Olemme aiemmin osoittaneet, että ilmentyminen CBX7 on huomattavasti vähentynyt yhteys useisiin ihmisen syöpäsairauksiin ja sen ilmentymistä progressiivisesti pienenee ulkonäkö erittäin pahanlaatuisten fenotyyppi. Tavoitteena tutkimuksemme on ollut tutkia mekanismia, jolla menetys CBX7 ilmentyminen voi edesauttaa entistä pahanlaatuisen fenotyypin.

Methods

Analysoimme geeniekspressioprofiili a kilpirauhasen masolulinjassa palauttamisen jälkeen CBX7 ja sitten analysoi kopioinnin säätely tunnistettujen geenien. Lopuksi arvioitiin ilmaus CBX7 ja säännellyn geenien paneelia kilpirauhasen ja keuhkojen karsinoomat.

Tulokset

Huomasimme, että CBX7 negatiivisesti tai positiivisesti säätelee useiden geenien ekspression (kuten SPP1 , SPINK1, STEAP1, ja FOS, FosB, EGR1, vastaavasti), joka liittyy syövän etenemisen vuorovaikutuksessa niiden promoottori- alueet ja moduloivan niiden transkriptionaalisen aktiivisuuden. Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysit ihmisen kilpirauhasen ja keuhkosyöpä kudoksia paljasti negatiivinen korrelaatio CBX7 ja sen alas geenien, kun taas positiivinen korrelaatio havaittiin jopa geenien.

Johtopäätös

Lopuksi menetys CBX7 ilmaisun voisi olla ratkaiseva merkitys vaiheissa syövän synnyn purkamalla ilmentymistä erityisten efek- geenejä.

Citation: Pallante P, Sepe R, Federico A, Forzati F, Bianco M, Fusco A (2014) CBX7 moduloi geenien ilmentymistä Kriittinen Cancer Progression. PLoS ONE 9 (5): e98295. doi: 10,1371 /journal.pone.0098295

Editor: Tanya V. Kalin, Cincinnati Lasten Hospital Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 lokakuu 2013; Hyväksytty: 30 huhtikuu 2014; Julkaistu: toukokuu 27, 2014

Copyright: © 2014 Pallante et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia: Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro-AIRC (IG 5346), Ministero dell’Università e della Ricerca SCIENTIFICA e Tecnologica-MIUR (PRIN 2008), ”Progetto di Interesse strategico Invecchiamento (PNR-CNR Aging Program) PNR-CNR 2012-2014 ”ja Progetto PON01-02782:” Nuove strategie nanotecnologiche per la ilmoitustaulu punto di Farmaci e Presidi diagnostici Diretti verso cellule cancerose circolanti ”. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat vahvistavat, että Pierlorenzo Pallante ja Alfredo Fusco ovat Academic toimittajat PLoS One. Pierlorenzo Pallante ja Alfredo Fusco toteavat, että tämä ei muuta niiden noudattamista PLoS One Pääkirjoitus politiikan ja kriteerit.

Johdanto

CBX7 on Polycomb- proteiini jäsen Polycomb tukahduttavia kompleksi 1 (PRC1), multiproteiinikompleksissa joka yhdessä Polycomb tukahduttavia monimutkainen 2 (PRC2), ylläpitää tärkeä kehityshäiriöitä geenien kopiointia tukahdutettu valtio [1] – [3]. Olemme aiemmin osoittaneet, että CBX7 geeni on merkittävästi säädellä vähentävästi kilpirauhasen karsinoomat ja sen ilme vähitellen vähenee pahanlaatuinen laatu ja neoplastisia vaiheessa [4]. Lisäksi lisätutkimukset ovat osoittaneet, että korrelaatio menetys CBX7 kanssa erittäin pahanlaatuisten fenotyyppi ja sen seurauksena huono ennuste on yleinen tapahtuma onkologian. Itse asiassa, menetys CBX7 ekspression on äskettäin osoitettu liittyvän yhä pahanlaatuisuuteen luokka paksusuolen [5], virtsarakon [6], haiman [7], rintojen [8], mahan [9] ja keuhkosyöpä [10] , kun taas säilyttämisestä CBX7 ilmaisun korreloi pidemmän selviytymisen paksusuolen ja haiman syöpäpotilaiden [5], [7]. Palauttaminen CBX7 ilmentymisen kilpirauhasen, mahalaukun ja paksusuolen syöpäsolulinjoissa inhiboi solun kasvua kertymistä solupopulaation G1 vaiheen solusyklin, mikä viittaa siihen, negatiivinen rooli CBX7 valvonnassa G1 /S siirtymistä solusyklin.

äskettäin on osoitettu, että CBX7 pystyy positiivisesti säätelemään koodaavan geenin E-kadheriinin [11], joka on tunnettu olevan keskeinen rooli ylläpitää normaalia epiteelin solujen morfologia, ja jonka menetys ilmentymisen edustaa yleinen piirre, epiteelin-mesenkymaalitransitioon [12], [13]. Itse asiassa, se on osoitettu, että CBX7 pystyy säilyttämään ilmentymisen E-kadheriinin vuorovaikutuksessa histonideasetylaasi 2 ja inhiboimaan sen aktiivisuus on CDH1 promoottori [11]. Johdonmukaisesti, suora korrelaatio tasojen E-kadheriinin ja CBX7 ilme on raportoitu kilpirauhasen ja haiman karsinoomat [7], [11]. Siksi nämä tulokset viittaisivat siihen, että menetys CBX7 geeniekspression voi olla ratkaiseva rooli loppuvaiheissa ihmisen karsinooman etenemisen.

tuumorisuppressorin rooli CBX7 on aivan äskettäin vahvistanut fenotyyppi cbx7 hiirien. Itse asiassa nämä hiiret kehittävät maksan ja keuhkojen adenoomien ja karsinoomien, ja sen mukaisesti, hiiren alkion fibroblasteja (MEF) johdettu cbx7 hiirten on suurempi kasvunopeus ja alentunut herkkyys vanhenemista kuin niiden villityypin kollegansa [10]. Sykliini E yli-ilmentyminen, koska ei ole cbx7, että säätelee negatiivisesti sen ilmentyminen todennäköisesti osuus fenotyypin cbx7 hiirten. Samanlainen mekanismi on todennäköisesti mukana ihmisen keuhkojen syövän synnyn jälkeen sykliini E ylössäätöä, liittyy menetys CBX7 ilmaisun, on havaittu useimmissa ihmisen keuhkosyövän analysoitu [10].

Tavoitteena esillä oleva tutkimus on ollut tutkia muita mekanismeja, joiden menetys CBX7 ilmentyminen voi myötävaikuttaa ulkonäön erittäin pahanlaatuisen fenotyypin. Ensin tuotetaan kuuden kilpirauhaskarsinoomaa solukloonien, joissa ilmentyminen CBX7 on palautettu, sitten, käyttämällä voimakkaita oligonukleotidin microarray -hybridisaatiotekniikkaa, olemme analysoineet geeniekspression profiilin FRO solulinjan, jossa ilmentyminen CBX7 palautettiin, kun samaan solulinjaan eivät ilmennä CBX7.

Huomasimme, että CBX7 pystyi positiivisesti säädellä 120 geenien ja säätelemään negatiivisesti 196 geenejä. Niistä tunnistimme useita erityisiä efektori geenejä, kuten SPP1 (koodaava osteopontiiniin proteiinia), jonka tehtävänä on tunnetusti välttämätöntä hankintaan täysin pahanlaatuisen fenotyypin. Kromatiinin immunosaostus kokeet osoittivat, että CBX7 proteiini sitoutuu suoraan promoottorit näiden geenien ja toiminnalliset tutkimukset vahvistivat, että CBX7 ilmaisu pystyi muuntamaan edistäjiä CBX7 geenien. Lopuksi, kvantitatiivinen RT-PCR-analyysit osoittivat käänteinen korrelaatio CBX7 ja sen alas geenien ja positiivinen korrelaatio sen säädelty olevista ihmisen kilpirauhasen ja keuhkosyöpä näytteitä eri asteen maligniteetin.

Yhdessä data raportoitu tässä osoittavat, että CBX7 negatiivisesti tai positiivisesti säätelee useiden geenien ekspression koodaavat proteiineja, joilla on keskeinen rooli ihmisen syövän etenemiseen.

Materiaalit ja menetelmät

mikrosiruanalyysillä

GeneChip- Human Gene 1.0 ST Arrays (Affymetrix, Santa Clara, CA), joka koostuu 764885 koetinsarjojen kattaa yli 28869 geenejä, käytettiin arvioimaan geenejä differentiaalisesti ilmaisi. Koko hybridisaatio menettely suoritettiin seuraavien Affymetrix ohjeita. Vahvistuksen ja merkintöjä prosesseja varmennettiin käyttäen GeneChip- Eukaryotic Poly-A-RNA ohjaus Kit (Affymetrix) eksogeenisillä positiiviset kontrollit. 15 ug kutakin biotinyloitua cRNA valmistelu oli hajanainen ja sijoitettiin hybridisointiseoksessa sisältävä biotinyloitua hybridisaatio valvonnan (GeneChip- Expression hybridisaatio Controls, Affymetrix). Sitten näytteet hybridisoitiin päälle GeneChip Human Gene 1,0 ST Array 45 ° C: ssa 16 tunnin ajan vakiona kierto (60 rpm) on hybridisaatio uuni (Affymetrix). Microarray skannatut kuvat saatiin kanssa GeneChip- Scanner (Affymetrix) oletusasetuksia käyttäen. Kuvat analysoitiin Affymetrix Gene Expression Analysis Software (Affymetrix). Tehtiin vertailuja FRO-EV-1 ja FRO-CBX7-1 näytteitä, ottaen FRO-EV-1 lähtötilanteessa. Kansi muuttaa arvoja, mikä osoittaa suhteellista muutosta ilmentymisen tasojen FRO-EV-1 ja FRO-CBX7-1, käytettiin geenien tunnistamiseksi ilmentyvät differentiaalisesti.

Microarray tiedot ovat saatavilla ArrayExpress tietokantaan (www .ebi.ac.uk /arrayexpress) hakunumerolla E-MTAB-2420.

Human kudosnäytteitä

ihmisen kilpirauhassyöpä kudoksiin, viereisten normaaleissa kudoksissa tai normaali kontralateraalista lohkoa, saatu kirurginen näytteet, kerättiin Palvelun d’anatomis-Pathologie, Centre Hospitalier Lyon Sud, Pierre Bénite, Ranska, ohjeiden mukaan eettisen komitean tämän instituutin, ja jäädytettiin välittömästi nestetypessä myöhemmin suorittaa RNA: n.

”TissueScan Reaaliaikainen Lung Cancer Disease Panel III” cDNA ostettiin Origene (Origene Technologies Inc., Rockville, MD). Tämä keuhkosyöpä cDNA paneeli (HLRT103) sisältää 8 normaali keuhko yksilöitä ja 40 keuhkosyövän yksilöiden eri histotype, jonka kliiniset patologiset ominaisuudet ovat vapaasti käytettävissä seuraavassa osoitteessa: https://www.origene.com/qPCR/Tissue-qPCR- Arrays.aspx.

RNA, kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) ja mikrosiruanalyysillä

Yhteensä RNA uutettiin solulinjoista ja kudoksista käyttäen RNAeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). Eheyden RNA arvioitiin denaturoivalla agaroosigeelielektroforeesilla. Tuottaa cDNA, QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen) käytettiin reverse puhtaaksi 1 ug kokonais-RNA: ta kustakin näytteestä. Optimoitu sekoitus oligo-dT ja satunnaisia ​​alukkeita käytettiin.

Real-Time Kvantitatiivinen PCR suoritettiin CFX 96 lämpösyklilaitteessa (Bio-Rad, Hercules, CA) 96-kuoppalevyillä käyttäen lopulliseen tilavuuteen 20 pl. PCR käytettiin 10 ui 2 x SYBR Green (Applied Biosystems, Foster City, CA), 200 nM kutakin aluketta, ja cDNA tuotettu 20 ng kokonais-RNA: ta. Käytetyt alukkeet raportoidaan Dataset S1. Terminen protokolla oli seuraava: 2 min 95 ° C; sitten 45 sykliä 20 s 95 ° C: ssa ja 1 min 60 ° C: ssa. Jokainen reaktio suoritettiin kahtena kappaleena ja 2

-ΔΔCT menetelmää käytettiin laskettaessa suhteellisia ekspressiotasoja [14]. G6PD käytettiin viitteenä geeni.

Soluviljelmät ja transfektiot

kilpirauhaskarsinoomaa solujen FRO [15] saatavilla laboratoriossamme ja HEK 293-solut (American Type Culture Collection, LGC Standards Srl, Sesto San Giovanni, Italia) kasvatettiin DMEM (Life Technologies, Grand Island, NY), johon oli lisätty 10% vasikan sikiön seerumia (Life Technologies), 1% glutamiinia, 1% penisilliiniä /streptomysiiniä (Life Technologies), 5% CO

2 ilmakehässä. FRO ja HEK 293-solut transfektoitiin käyttämällä joko Lipofectamine-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA) ja Neon elektroporaatio System (Invitrogen) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tuottaa CBX7 vakaa ilmentävien solujen, transfektoidut solut valittiin väliaineessa, joka sisälsi genetisiiniä (Life Technologies), useita klooneja poimittiin ja laajennettiin jatkotutkimuksiin. Rotan normaali kilpirauhanen PC Cl3-solujen [16], viljeltiin modifioidussa F12 -alustassa, johon oli lisätty 5% vasikan seerumia (Life Technologies) ja kuusi kasvutekijät (tyrotrooppisen hormoni, hydrokortisoni, insuliini, transferriini, somatostatiini ja glysyyli-histidyyli-lysiini; Sigma, St . Louis, MO). PC Cl3 solut transfektoitiin ohjaus siRNA ja siRNA vastaan ​​rotan cbx7 kuten aiemmin raportoitu [11]. Hiiren alkion fibroblasteja (MEF) alkaen cbx7 hiirten perustettiin, kasvatettiin ja transfek- (passage P3 ja P4) kuten kuvattu muualla [10].

Proteiinin uutto ja western blot analyysi

Proteiinin uutto ja western blot menettely suoritettiin, kuten aiemmin on raportoitu [11]. Elektroforeesin jälkeen ja blotting -menetelmiä, nitroselluloosakalvot inkuboitiin yön yli primaarisen vasta-aineen kylmähuoneessa (+4 ° C). Sitten kalvoja inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineen (piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua, 1:3000) 60 min (huoneenlämmössä) ja reaktio havaittiin western blot tunnistusjärjestelmä (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). Käytetyt vasta-aineet olivat anti-HA (Roche Applied Science, Mannheim, Saksa), anti-CBX7 (sc-70232, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA), anti-CBX7 (ab21873, Abcam, Cambridge, UK) , anti-His-anturi (sc-804, Santa Cruz Biotechnology), anti-Egr1 (sc-189, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-c-Fos (sc-52, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-Fos B (sc-48, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), anti-Tubulin γ (sc-17787, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) ja anti-β-Actin (klooni AC-15 A5441, Sigma-Aldrich Co. ., St. Louis, MO).

Lusiferaasiaktiivisuutta määritys

Luciferase transaktivointimääritys suoritettiin raportoitu muualla [11]. Alueella, joka kattaa 1000 bp ylävirtaan tanscriptional aloituskohdasta (TSS) ja CBX7-geenien (alukkeet sekvenssit ovat saatavilla Dataset S1) PCR-monistettiin ja insertoitiin ylävirtaan avoin lukukehys lusiferaasigeenin sisältyvät pGL3 vektori (Promega, Fitchburg, WI). Kaikki reportterirakenteet luotu tarkastettiin mutaatioiden suoralla sekvensoinnilla. CMV-β-galaktosidaasin ekspressiovektorilla normalisointiin käytettiin transfektiota toiminnan mukaan galaktosidaasin aktiivisuutta. Proteiini lysaatit saatiin 36 tuntia transfektion jälkeen ja HEK 293-solut, ja lusiferaasin aktiivisuus mitattiin kunkin kohdan käyttämällä Lumat LB9507 luminometrillä (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Saksa) ja Dual Light System Kit (Life Technologies). Kaikki määritykset suoritettiin kahtena kappaleena, ja tulokset ovat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Kromatiini immuunisaostustesti (ChIP) B

Kromatiini näytteestä saatujen solujen ja kudosten prosessoitiin kromatiinin immunosaos- kuten on raportoitu muualla [ ,,,0],10], [11]. Näytteet altistettiin immunosaostus anti-CBX7 vasta-aineita (ab21873, Abcam). Ei liittyvät IgG käytettiin negatiivisena kontrollina ja immunosaostus. Sillä qPCR 3 ui 150 ul IP DNA: ta käytettiin ja syöttää DNA arvoja käytettiin normalisoimaan arvojen määrällisistä chippinäytteet. Prosentuaalinen tulo laskettiin kaavalla 2

ACt × 3, jossa ACt on ero Ct

input ja Ct

IP [10]. Laatua koskevat tiedot olivat peräisin kolmesta itsenäisestä kokeesta, ja kutakin koetta qPCR suoritettiin kolmena kappaleena. Sekvenssit käytetyt alukkeet on esitetty tietojoukon S1. Promoottori Ihmisen ja hiiren GAPDH-geenin käytettiin negatiivisena valvonnassa CBX7 chromatin vuorovaikutusta [4].

Ethics

Eettisen komitean lääketieteellisen tiedekunnan ja valtion lääketieteellinen hallituksen keskuksen hospitalier Lyon Sud, Pierre Bénite, Ranska, suostui näitä tutkimuksia, ja kirjallinen suostumus saatiin kaikki potilaat mukana tässä tutkimuksessa.

Tilastolliset analyysit

tilastollinen arviointi suoritettiin käyttäen graph Pad Prism. Studentin t-testiä käytettiin vertailuun kahden kokeita. Tulokset ilmoitetaan keskiarvoina ± SD ja erot katsottiin olevan merkittäviä, jos p 0,05. Jakelu qRT-PCR kertaluokkamuutos arvoiltaan kunkin geenin papillaarinen kilpirauhasen karsinoomat ja keuhkokarsinoomia saatiin ja kuvattu käyttämällä laatikkoon ja viikset (min max) ja persentiilin menetelmällä. Korrelaatio analyysi, kertaluokkamuutos arvoja käytettiin rakentaa hajontakuvioiden, saada suuntaus linja ja laskea Pearson r arvon.

Tulokset

Geenien ilmentyminen profiilia kilpirauhaskarsinoomaa seuraavaa solujen uudelleen ilmaus CBX7

tutkimiseksi mekanismi, jonka menetys CBX7 ilmentyminen voi myötävaikuttaa hankinnan pahanlaatuisen fenotyypin, olemme analysoineet geeniekspression profiilin kilpirauhaskarsinoomaa solulinja (FRO), jossa ilmentymisen CBX7 palautui (FRO-CBX7, kuvio 1A). RNA: t uutetaan FRO-EV-1 (klooni stabiilisti transfektoitu tyhjällä vektorilla) ja FRO-CBX7-1 klooni, hybridisoitiin Affymetrix oligonukleotidi joukko, joka sisältää useita tuhansia kopioita. Ilmentymisen profiili FRO-CBX7-1 soluja verrattiin sitten kuin FRO-EV-1. Useita kopioita, johti muuttaa niiden ilmentymistaso välillä FRO-CBX7-1 ja FRO-EV-1 (taulukko 1 ja 2, taulukko S1 ja S2). 53 selostukset (17 säädelty ja 36 alassäädetty) oli absoluuttinen kertaluokkamuutos arvo yli 2,0 (taulukko 1 ja 2), kun taas 263 selostukset (103 säädelty ja 160 alassäädetty) esittävät absoluuttisen kertaluokkamuutos tuotua 1,5-2,0 (taulukko S1 ja S2). Kontrollina mikrosiruanalyysi, me havaitsimme, että CBX7 oli hyvin ilmaistu FRO-CBX7-1 (taulukko 1).

A) CBX7 ilmentyminen arvioitiin qRT-PCR-analyysi FRO (painosta), ja useita FRO-EV (tyhjä vektori) ja FRO-CBX7 solukloonien. Arvot ilmaistaan ​​Suhteellinen ilmentyminen suhteessa FRO näyte, joka on asetettu yhtä suureksi kuin 1. B, C) Valittu CBX7 geenien analysoitiin qRT-PCR-analyysi FRO (paino), ja useita FRO-EV ja jäädytetyt CBX7 solukloonit. FOS, FosB ja EGR1 geenin ilmentyminen oli runsaampaa FRO-CBX7 solukloonien kuin FRO-EV solujen päinvastoin, SPP1, SPINK1 ja STEAP1 ilmentyminen oli vähemmän ilmeinen FRO-CBX7 soluissa verrattuna FRO-EV edestakaisin (p- ) solut. Arvot ilmaistaan ​​Suhteellinen ilmentyminen suhteessa FRO näyte, joka on asetettu yhtä suureksi kuin 1. D) ekspressio FOS, FosB ja EGR1 arvioitiin yhdessä FRO-CBX7 solukloonin (FRO-CBX7-1), yksi FRO-EV (FRO-EV-1) ja FRO villityypin soluista. p-Actin arvioitiin latauskontrollina. Nuolet osoittavat vastaavat vyöhykkeet FOS ja EGR1.

Niistä geenit säätelevät CBX7 ihmisen kilpirauhaskarsinoomaa solujen keskityimme huomiomme FOS, FosB ja EGR1 (taulukko 1) jotka olivat positiivisesti säännelty, ja SPP1, SPINK1 ja STEAP1 (taulukko 2), jotka olivat sitä vastoin säätelee negatiivisesti CBX7, koska nämä geenit ovat tunnetusti merkittävä asema hankintaan täysin pahanlaatuisen fenotyypin. Itse asiassa, FOS, FosB ja EGR1 ovat proteiineja, jotka on raportoitu alassäädetty useissa ihmisen karsinoomissa viittaa siihen, on kriittinen rooli näiden proteiinien syövän etenemisessä [17] – [19]. Toisaalta, SPP1, SPINK1 ja STEAP1 ovat proteiineja, jotka ovat ajan säädellä monella ihmisen karsinoomia ja niiden yli-ilmentyminen liittyy myös syöpään etenemiseen [20] – [22]. Arvioimme ilmentymistä näiden transkriptien qRT-PCR useissa CBX7 ilmentävien FRO klooneja (kuvio 1 B ja C) verrattuna FRO-EV kloonien kanssa ja FRO (paino) soluja. Kaikki ne, qRT-PCR-analyysi vahvisti ero ilmentyminen liittyy ilmentymisen CBX7 proteiinia (kuvio 1 B ja C). Lisäksi Western blot vahvistivat, lisääntynyt ilmentyminen FOS, FosB ja EGR1 proteiinit yhdessä FRO-solukloonin, jotka ekspressoivat stabiilisti CBX7 (FRO-CBX7-1) verrattuna FRO-EV (FRO-EV-1) ja FRO paino- soluja ( Kuva 1 D).

analyysi CBX7 geenien rotan kilpirauhassoluja ja MEF ilmaiseminen tai ei cbx7 geeniä

vieressä tarkistanut, geenit ilmentyvät differentiaalisesti FRO-CBX7 solut osoittivat differentiaalikaavojen myös MEF eristetty cbx7 hiirten [10]. Kuten kuviossa 2 on esitetty, qRT-PCR-analyysi vahvisti modulaatio valitun CBX7 geenien myös tämän solun järjestelmässä, itse asiassa geenien säätää positiivisesti cbx7 havaittiin alas-säädellä cbx7

– /- MEF-soluihin (kuvio 2A), kun taas geenejä säätelee negatiivisesti cbx7, havaittiin ajan säännelty cbx7

– /- MEF, verrattuna cbx7

+ /+ MEF (kuvio 2B). Western blot kokeet osoittivat, että ilmentyminen fos ja egr1 proteiinien pienenee cbx7

– /- MEF-solut, jos niitä verrataan cbx7

+ /+ MEF (kuvio 2D).

Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi suoritettiin analysoida ekspressiotasoja CBX7-geenien in cbx7

+ /+ ja cbx7

– /- MEF-soluihin. Arvot ilmaistaan ​​Suhteellinen ilmentyminen suhteessa cbx7

+ /+, joka asetetaan yhtä suureksi kuin 1.) Fos, FosB ja egr1 oli vähemmän ilmaistuna cbx7

– /- MEF-verrattuna cbx7

+ /+ MEF. B) Päinvastoin, spp1, spink1 ja steap1 geenit lisää ilmaistu MEF cbx7

– /- verrattuna MEF cbx7

+ /+. C) Cbx7

– /- MEF-soluihin transfektoitiin väliaikaisesti nisäkkään vektori ekspressoi hiiren cbx7 (myc-His-merkitty) mRNA (cbx7

– /- R). Palauttaminen cbx7 ilmaisun pystyy palauttaa fenotyypin cbx7

– /- MEF (A, B). Arvot ilmaistaan ​​Suhteellinen ilmentyminen suhteessa cbx7

+ /+, joka asetetaan yhtä suureksi kuin 1. D) ekspressio fos ja egr1 proteiinien arvioitiin western blot MEF saatu cbx7

– /- hiirillä verrattuna cbx7

+ /+ MEF. β-Actin ilmentyminen arvioitiin normalisoida proteiinia lastaus.

Palauttaminen cbx7 geeniekspression cbx7

– /- MEF (kuvio 2C) lisäsi ilmaus fos, FosB ja egr1 (kuvio 2A) ja vähentynyt ilmentyminen spink1, spp1 ja steap1 (kuvio 2B) vahvisti asetus näiden geenien CBX7 ilmentymistä.

varmistamiseksi edelleen roolia CBX7 moduloinnissa näiden geenien, me arvioineet ilmentyminen normaalissa rotan kilpirauhasen solulinja PC Cl3 jossa synteesissä cbx7 tukahdutettiin RNA-interferenssi. Vaiennettaisi on cbx7 geenin tarkastettava usean tunnin kuluttua siRNA hoidon (kuvio 3A), johti vähentäminen CBX7 positiivisesti geenien (kuvio 3B) ja lisääntynyt ilmentyminen CBX7 negatiivisesti geenien (kuvio 3C), verrattuna käsittelemättömän solut tai saaneista ei-hiljentäminen ohjaus siRNA (salattu).

A) PC Cl3 soluja transfektoitiin ohimenevästi sirna (siRNA) vastaan ​​rotan cbx7 mRNA. Transfektion jälkeen voimme todeta tehokas Knockdown on cbx7 mRNA-tasojen, kuten arvioitiin qRT-PCR-analyysillä. B, C) CBX7 geenien ilmentymistä arvioitiin qRT-PCR rotan PC Cl3 solujen transfektion jälkeen rotan cbx7 siRNA. Ilmentyminen arvioitiin 48 tuntia transfektion jälkeen. Arvot ilmaistaan ​​Suhteellinen lausekkeen suhteessa tietokoneeseen Cl3 transfektoiduissa soluissa ei hiljentämiseen ohjaus siRNA (salattu), jotka oli asetettu yhtä suuri kuin 1.

CBX7 sitoutuu promoottorit säänneltyjen geenien ja säätelee niiden aktiviteetti

sen arvioimiseksi, CBX7 oli suoraan osallisena ero näiden geenien ilmentymistä

in vivo

, teimme chromatin immunosaostus (chip) määritys. Sitten FRO-EV-1 ja FRO-CBX7-1 solut silloitettuja ja immunosaostettiin anti-CBX7 tai IgG. Immunosaostus kromatiinin myöhemmin analysoitiin qPCR käyttäen alukkeita kattavat alueen näiden geenien promoottorin (Dataset S1). Tulokset on esitetty kuviossa 4A osoittaa, että CBX7 kykeni sitoutumaan näistä promoottoreista. Itse asiassa, anti-CBX7 vasta saostettiin alue promoottorin näiden geenien FRO-CBX7-1 soluissa, verrattuna FRO-EV-1-soluissa (kuvio 4A). Lisäksi väkevöimättömien havaittiin näytteissä, immunosaostettiin normaalin kaniinin IgG ja kun alukkeita ihmisen GAPDH kontrolli-promoottorin käytettiin, mikä osoittaa, että sitoutuminen on spesifinen nämä promoottorit (kuvio 4A). Sama tulos saatiin aikaan käyttämällä Kromatiini saatu HEK 293-solut transfektoitiin ohimenevästi CBX7 ekspressiovektorilla (kuvio S1).

A) FRO-EV-1 ja FRO-CBX7-1 solut altistettiin siru määrityksessä, jossa käytettiin vasta-aineita CBX7. Negatiivisina kontrolleina liittymättömät IgG vasta-aineita käytettiin. Siihen liittyvä DNA monistettiin qPCR käyttämällä spesifisiä alukkeita vastaavan geenin promoottorin ja, kontrollina ChIP spesifisyys, alukkeita tunnistamaan ihmisen GAPDH-geenin promoottorin. B) MEF saatu cbx7

+ /+ ja cbx7

– /- analysoitiin sitoutumisen cbx7 proteiinin promoottorit sen säännellyn geenejä. Negatiivisina kontrolleina liittymättömät IgG vasta-aineita käytettiin ja kontrollina siru spesifisyys, alukkeita tunnistamaan hiiren GAPDH-geenin promoottorin käytettiin. Tiedot raportoidaan prosenttia tulo ja laskettiin käyttäen seuraavaa kaavaa: 2

ACt × 3, jossa ACt on ero Ct

input ja Ct

IP.

vahvista sitovan endogeenisen CBX7 proteiinin promoottorit näiden geenien, otimme myös hyväkseen MEF ja kudosten saatu cbx7 hiiressä [10]. ChIP-kokeet suoritettiin MEF, munuaisten ja pernan kudoksia on saatu cbx7

+ /+ ja cbx7

– /- hiirissä. Anti-CBX7 vasta-aineet kykenivät tunnistamaan endogeenisia cbx7 ja saostamiseksi chromatin välillä cbx7

+ /+, mutta ei cbx7

– /- MEF-solut (kuvio 4B) ja kudoksissa (kuvio S2) vahvistetaan sitova endogeenisen cbx7 ja näiden promoottori alueilla. Nämä ChIP kokeet siis osoittivat, että CBX7 fyysisesti vuorovaikutuksessa promoottorialueissa näiden geenien

in vivo

, siis suoraan modulointiin niiden ilmaisua.

Myöhemmin arvioida vaikutus CBX7 ilme transkription näistä geenien, HEK 293-solut olivat ohimenevästi kotransfektoitiin ekspressiovektorilla, joka koodaa CBX7 ja reportteri vektori, jossa lusiferaasigeenin valvonnassa 1000 bp promoottorialueen, joka sijaitsee ylävirtaan TSS jokainen näistä geeneistä. Kuten on esitetty kuviossa 5, CBX7 lisäsi transkriptionaalista aktiivisuutta FOS, FosB ja EGR1 promoottorit (kuvio 5A), kun taas se tukahduttaa transkriptionaalista aktiivisuutta SPP1, SPINK1 ja STEAP1 promoottorit (kuvio 5B). Lisäksi vaikutukset CBX7 on näistä promoottoreista oli annoksesta riippuvainen. Näin ollen, ChIP ja lusiferaasianalyysissä kokeet osoittavat, että CBX7 pystyy suoraan säädellä transkription valitun CBX7 geenien sitoutumalla niiden promoottoreita.

HEK 293-solut olivat väliaikaisesti transfektoitiin yhdessä kasvavien määrien CBX7 ilmaisun vektori ja vakiomäärä vektori, joka sisältää lusiferaasigeenin valvonnassa promoottorit CBX7 geenien. Yhä enemmän CBX7 täytäntöön ilmentymisen reportterigeeni valvonnassa FOS, FosB ja EGR1 promoottorialueet (A), kun taas tukahdutettu aktiivisuus reportterigeenin kontrollin SPP1, SPINK1 ja STEAP1 promoottorit (B). suhteellinen aktiivisuus tulikärpäsen lusiferaasi-ilmentyminen on standardoitu transfektio ohjaus, käyttäen β-galaktosidaasi. Mittakaava edustavat keskimäärää ± SD (n = 3).

ilmentäminen CBX7 geenien korreloi CBX7 ilme myös ihmisen karsinoomia

Koska edellinen Tulosten mukaan CBX7 ilmentyminen väheni kilpirauhasen, paksusuolen ja keuhkojen karsinoomat [4], [5], [10], jossa ekspressiotasot lähes täysin huomaamaton useimmissa kehittyneissä kilpirauhassyövän, me arveltu, että menetys CBX7 geenin voivat olla mukana myöhemmissä vaiheissa kilpirauhanen syövän synnyn siitä aiheutuvalla modulaatio näiden geenien. Siksi olemme analysoineet CBX7 ja valittu CBX7 geenien ihmisen kilpirauhasen ja keuhkokarsinoomia by qRT-PCR. Sikäli kuin papillaarinen kilpirauhasen karsinoomat ovat huolissaan, FOS, FosB ja EGR1 geenien alassäädetty, kuten CBX7, kun taas SPP1, SPINK1 ja STEAP1 oli säädelty (kuvio 6A). Samoin ilmaus analyysi näiden geenien keuhkosyövän osoitti samaa käyttäytymistä (kuvio 6B). Korrelaatio analyysi PTC ja keuhkokarsinoomia (Pearson r) osoitti korrelaatio CBX7 ja sen säännelty geenejä (PTC: FOS, p = 0,0438; keuhkokarsinoomien: FOS, p 0,0001; FosB, p 0,0001; EGR1, p 0,0021 Kuvio S3 ja S4).

Analysoimme ilmentymisen CBX7, FOS, FosB, EGR1, SPP1, SPINK1 ja STEAP1 by qRT-PCR papillaarinen kilpirauhasen karsinoomat (PTC) (A) ja ihmisen keuhkosyöpä näytteitä (B). Ilmaisu FOS, FosB ja EGR1 on alassäädetty, koska se esiintyy CBX7, että neoplastiset kudokset nähden normaaliin kollegansa. Toisaalta, ilmaus SPP1, SPINK1 ja STEAP1 säädeltiin neoplastisissa näytteissä suhteen normaaleissa kudoksissa, joka osoittaa vastakkaiseen taipumus, jos verrataan CBX7. Tulokset ilmaistaan ​​fold muutos (PTC) tai Suhteellinen Expression (keuhkojen karsinoomat) suhteessa altaan normaali näytteitä, jotka oli asetettu yhtä kuin 1. vaihteluväliä CBX7 ja CBX7 säädelty geenin ilmentymisen normaalissa kilpirauhasessa ja keuhkojen kudokset oli alle 10%.

Näin ollen, nämä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että menetys CBX7 geeniekspression voitaisiin edistää ulkonäön pahanlaatuisen fenotyypin moduloimalla joukko geenejä kriittinen etenemisen vaihe syövän synty.

keskustelu

aiemmin on havaittu, että alennettu CBX7 ilmentyminen liittyy useisiin ihmisen karsinoomien, ja täydellinen menetys sen ilmaisun korreloi pisimmällä vaiheissa maligniteettien [5] – [10]. Siksi on järkevää oletuksen, että menetys ilmentyminen CBX7 voi olla keskeinen rooli syövän etenemistä. Johdonmukaisesti, CBX7 pystyy torjumaan vähentynyt ilmentyminen E-kadheriinin geeni, jonka menetys ilmaisun edustaa piirre epiteelin-mesenkymaalitransitioon [11], niillä on keskeinen rooli ylläpitää normaalia epiteelisolujen solun muotoon [12], [13] .

jotta voidaan paremmin ymmärtää roolin menetystä CBX7 geeniekspression syövän etenemisen työmme tavoitteena oli tunnistaa geenit säätelevät CBX7. Sitten, käyttämällä Affymetrix cDNA microarray, olemme analysoineet geeniekspressioprofiili of kilpirauhaskarsinoomaa soluja, joissa CBX7 ilmentyminen oli palautettu, ja tunnistaneet useita geenejä ylä- ja alassäädetty. Niistä geenit ajan säätelee CBX7 keskityimme huomiomme FOS, FosB ja EGR1.

FOS ja FosB kuuluvat AP-1 (aktivoiminen Protein 1) monimutkaisia ​​ja voivat olla vuorovaikutuksessa jäsenten kanssa kesäkuu perhe [23]. FOS on liitetty lähinnä signaalin siirtoon, solujen erilaistumiseen ja proliferaatioon [24]. Monissa tutkimuksissa on raportoitu, että FOS moduloitu useita tärkeitä geenejä tuumorigeneesiä aiheuttaen alas-säätely kasvaimeen synnyssä [25] ja johtavat invasiivisia syöpäsolujen kasvua [26]. Kuitenkin jotkut uudemmat tutkimukset esittivät, että FOS voi olla myös kasvaimen-EHES ja voi olla toiminto apoptoosin [17], [27].

Lisäksi FOS, FosB on myös osoitettu olevan toiminnon etenemistä eri kasvaintyypeille ollessa alas-säädellä huonosti eriytetty nisäkarsinoomia [18]. Toisaalta FOSL-1 ja FOSL-2, jonka yli-ilmentyminen johtaa tehostetun kasvain solun liikkuvuus ja hyökkäyksen paksusuolen ja peräsuolen syöpä ja mesoteliooma [28], ei säännellä CBX7 (tuloksia ei ole esitetty).