Krooninen sairaus

tiivistelmä

phosphatidylinositide-3-kinaasi (PI3K) signalointireitin on kriittinen useita solun toimintoja, kuten aineenvaihdunta, leviäminen, angiogeneesi, ja apoptoosin, ja se on yleisimmin muuttaa reitin ihmisen syövissä. Viime aikoina olemme kehittäneet uuden hiirimallissa paksusuolensyöpä, joissa kasvaimet muodostuvat hyvin hallitseva aktiivinen PI3K (

FC PIK3ca *

). Syöpien näissä hiirissä ovat kohtalaisen eriytetty invasiivisia mucinous adenokarsinoomia proksimaalisen paksusuolen joka kehittää 50 päivän iässä. Mielenkiintoista, nämä syövät muodostavat ilman hyvänlaatuinen välittäjä tai poikkeava WNT signalointia, joka ilmaisee ei-kanoninen mekanismi kasvaimen. Koska nämä kasvaimet ovat riippuvaisia ​​PI3K koulutusjakso, tutkimme mahdollisuuksia kasvaimen vaste kohdistamista tämän reitin kanssa rapamysiini, joka on mTOR-estäjä. Kohortin

FC PIK3ca *

hiiriä käsiteltiin rapamysiinin annoksella 6 mg /kg /vrk tai lumelääkettä 14 päivää. FDG dual hybridi PET /TT kuvantaminen osoitti dramaattisen tuumorivaste rapamysiiniklusterissa käsivarteen ja tämä vahvistettiin ruumiinavaus. Kasvain kudos jälkeen jäljellä hoidon rapamysiinistä havaittu olevan pERK1 /2 tai pysyviä fosforyloidun ribosomaalisen proteiinin S6 (PS6), mikä osoittaa mahdollisia resistenssimekanismit. Tämä ainutlaatuinen malli edelleen ymmärrystämme ihmisten sairauksien ja kehittämisen helpottamiseksi terapeuttisten kautta farmakologisen seulonnan ja biomarkkereiden tunnistamiseen.

Citation: Deming DA, Leystra AA, Farhoud M, Nettekoven L, Clipson L, Albrecht D, et al. (2013) mTOR esto saa aikaan dramaattinen vaste PI3K-Dependent paksusuolisyöpiin. PLoS ONE 8 (4): e60709. doi: 10,1371 /journal.pone.0060709

Toimittaja: Rakesh K. Srivastava, University of Kansas Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 26 lokakuu 2012; Hyväksytty: 01 maaliskuu 2013; Julkaistu: 09 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Deming et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Projekti tukivat Conquer Cancer Foundation of American Society of Clinical Oncology kautta Young Investigator Award (DAD); National Cancer Institute Yhdysvaltain National Institutes of Health kautta T32 CA009614 (DAD), P50 CA095103 Mahalaukun erikoistunut ohjelma huippututkimuksen Grant, Vanderbilt Ingram Cancer Center), R01 CA123438 (ja RBH), P30 CA014520 (Core Grant, University of Wisconsin (UW) Carbone Cancer Center); ja käynnistysvaiheen varat (jotta RBH) päässä UW Division gastroenterologian ja Hepatology, UW Sisätautien, ja UW School of Medicine and Public Health. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kehitys suunnattu hoitojen syövän hoitoon on ollut aihe suurta kiinnostusta ja vaivaa. Viime aikoihin asti, uusi suunnattu hoitoja on tutkittu laajalti valitsemattomat populaatioissa. Limited teho on osoitettu käyttämällä tätä lähestymistapaa. Kuitenkin kun kehitymme lähempänä aikakauden henkilökohtaisen lääketieteen, kukin histologisen alatyypin syöpä on tulossa paremmin ymmärretään kokoelma harvinaisia ​​syöpiä kunkin määritelty sen mutaatio profiilia. Siksi testaus kohdennetun lääkeaineita tulisi suorittaa valitun populaation mutaatioita tiedetään aktivoivan signalointireittien kohdistetaan.

Ihmisen paksusuolen kasvaimet sisältävät useita mahdollisia kasvaimia synnyttävän kuljettajan mutaatioita, jotka saattavat kohdistaa, kuten

KRAS

,

BRAF

, ja

PIK3CA

[1] Nämä mutanttikinaaseihin ovat olleet keskeisiä tavoitteita jatkuvaa kehittämistä terapeuttisia aineita. He ovat myös olleet tärkeitä ymmärtämään biologian resistenssin kasvutekijän reseptorin suunnattu hoitoja, setuksimabi ja panitumumabi [2], [3]. Vaikka merkittäviä edistysaskeleita hoidossa tätä tappavaa tautia, peräsuolen syöpä on toiseksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat Yhdysvalloissa [4]. Edistää hoitovaihtoehtoja potilaille, lisätutkimuksia koskien biologia Näiden mutaatioiden on tarpeen. Näin saadaan parempi ymmärtäminen, jotka potilaat ovat todennäköisimmin reagoivat tiettyihin hoitoihin.

PIK3CA

mutaatioita esiintyy 20- 30% ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syöpiä [5], [6]. Kolme hotspot mutaatiot ovat yleisesti, mukaan lukien H1047R, E542K, ja E545K, joka johtaa konstitutiivisesti aktiivisen muodon PI3K p110α katalyyttinen alayksikkö [7]. Tämä hallitseva aktiivinen PI3K sitten johtaa lisääntyneeseen AKT /mTOR-reitin signalointi ja lisääntynyt solujen lisääntymistä (kuvio S1) [8]. Vaikka useat tutkijat ovat tutkineet vaikutuksia näillä mutaatioiden solulinjoissa, laboratoriossamme viime aikoina kehitetty hiirimallissa paksusuolen syöpä, joka aloitetaan määräävässä aktiivinen PI3K (

FC PIK3ca *

) [9]. Tässä mallissa suuret kohtalaisen eriytetty mucinous invasiivisia adenokarsinoomia kehittyy proksimaalisessa paksusuolessa vain 50 päivän iässä. Nämä kasvaimet muodostuvat hyvin ei-kanoninen reitin riippumaton poikkeavan WNT signalointi. Koska nämä kasvaimet aloittanut PI3K, me haluttiin selvittää, jos nämä kasvaimet ovat riippuvaisia ​​tämän reitin. Tässä osoitamme, että hoito

FC PIK3ca *

hiirten mTOR inhibiittorin, rapamysiini, johtaa dramaattiseen vaste pitkälle paksusuolen syöpiä. Tämä osoittaa, että ihmisen kasvaimista riippuvainen PI3K /AKT-reitin ovat todennäköisesti alttiita estäjiä loppupään välittäjäaineiden.

Materiaalit ja menetelmät

Hiiri Husbandry

Kaikki eläinkokeet olivat harjoitettuun protokollien hyväksymien Institutional Animal Care ja Käytä komitean University of Wisconsin-Madison, ohjeiden American Association for arviointi ja akkreditointi Laboratory Animal Care. Homotsygoottinen

FC

+

naarashiirillä (FVB /N-Tg (Fabp1-Cre) 1Jig; NCI Hiiri Repository; Strain numero – 01XD8) risteytettiin homotsygoottiseen

PIK3ca *

+ uroshiirillä (C57BL /6-

Gt (ROSA) 26Sor

TM7 (Pik3ca *, EGFP) Rsky /

J; The Jackson Laboratory, tuotenumero – 012343) tuottaa

FC PIK3ca

* hiiriä käytettiin tässä tutkimuksessa. Hiiret genotyypitettiin

FC

ja

PIK3ca *

kuten aiemmin on kuvattu [10], [11].

Eläimille

FC PIK3ca

* hiiret välillä 50 ja 60 päivän iässä valittiin tutkimuksessa ilmoittautuminen niin kauan kuin ne eivät olleet kuolemaisillaan. Lähtötilanteessa dual hybridi

18F-FDG PET /TT tehtiin ennen ja 15 päivän kuluessa hoidon aloittamisesta. Tuumorin koko subjektiivisesti määritettiin esikäsittelyn raaka kuvia ja käytetty ositus aikana satunnaistamisesta rapamysiinin ja valvoa aseiden. Animals in ohjausvarsi saivat etanolia liuotetaan veteen 1% lopullinen pitoisuus letkulla suun kautta päivittäin 14 päivän ajan. Eläimet satunnaistettiin rapamysiini varteen saivat 6 mg /kg rapamysiinin (LC Labs, Woburn, MA) letkulla suun kautta vuorokaudessa 14 peräkkäisenä päivänä. Rapamysiiniä liuotettiin etanoliin konsentraatioon 50 mg per ml ennen liettämällä veteen lopulliseen tilavuuteen 200 ui antamista varten.

Imaging

Eläimet paastosivat vähintään 6 tunnin ajan ennen injektiota

18F-FDG (160 pCi; IBA Molecular, Romeoville, IL) tai

18F-FLT (140 pCi, University of Wisconsin syklotronia, Madison WI). Injektion jälkeen eläimiä pidettiin nukutuksessa 60 min ja sitten valmistettiin virtuaalinen colonography kuten aiemmin on kuvattu [12]. 10 minuutin PET hankinta suoritettiin, välittömästi CT skannaus. Enimmäisintensiteetti ennusteet luotiin Siemensin Inveon Research työpaikka (Knoxville, TN). PET kuvat rekonstruoitiin käyttämällä OSEM3D /MAP (OSEM3D, 2 toistojen; MAP 18, toistojen 16 subsets). Vaimennus korjaus suoritettiin käyttäen CT data. CT kuvat rekonstruoitiin tavallisilla conebeam jälleenrakentamiseen. Baseline ja jälkikäsittely PET normalisoituivat pistetään annos, annos rappeutuminen, aktiivisuus, ja paino. Kasvaintilavuudet arvioitiin mittauksista PET /TT (kuva S2). PET kuvantaminen käytettiin paikantamaan kasvaimia ennen tilavuuden estimointi. Tuumoritilavuudet voidaan vain arvioida, koska rajattu tarkat kasvain rajat on vaikeaa. Tämä johtuu siitä, että nämä syövät eivät ole luminaali ja hienovarainen FDG signaali muuttuu liittyvät hyperplastista normaalin epiteelin ympäröivä kasvainten olemassa. Kasvain volyymit kunkin kohortin verrattiin käyttäen kaksipuolista Studentin tarkka t-testiä. P-arvo on alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Histologia ja immunohistokemia

Hiiret tapettiin CO

2 tukehtumisen seuraavat niiden jälkikäsittelyä kuvantaminen. Ohutsuolesta ja paksusuoli poistettiin, huuhdeltiin PBS: llä, pituussuunnassa halkaistut, harallaan ulos, ja kiinnitettiin 10% puskuroituun formaliiniin 24 tunnin ajan. Kudokset säilytettiin sitten 70% etanolia, käsitellään, upotetaan parafiiniin ja leikataan 5 um: n leikkeitä. Joka kymmenes jakso värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H E ja Ki67 värjäys, vastaavasti (

ja

B

). Ei merkittävää eroa Pakt välillä havaittiin kasvainten plaseboa ja rapamysiini käsiteltyihin hiiriin (

C

). Vuonna kudosta plaseboa saaneilla hiiri, lisääntynyt PS6 nähtiin kasvainkudoksessa ja päällä hyperplastiset kudoksen odotetusti (

D

). Mielenkiintoista on, että kudosta rapamysiini-käsitellyn

FC PIK3ca *

hiiri, vähentynyt PS6 on huomattava, että hyperplastisten kudoksessa, mutta kasvoi PS6 signalointia pysyy kestävä kasvainkudoksessa huolimatta rapamysiinin hoitoon. Tämä osoittaa, että jatkuva PS6 asettamiseksi kasvaimia voi olla kasvainten vastustuskyvyn. Tämä sama värjäyskuvio havaittiin kaikissa kasvaimet (3/3) noin neoplastisten solujen jäljellä hoidon jälkeen rapamysiini, jotka tutkittiin. Koko baareja:

,

C

ja

D

, 1 mm;

B

, 500 um.

Keskustelu

kohdistaminen kasvaimia synnyttävän väyliä on johtanut viime aikoina jännittävä edistysaskeleet useita syöpiä, kuten vemurafenib vuonna

BRAF

mutantti melanooma, erlotinibin

EGFR

mutantti ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, ja crizotinib keuhkosyövässä kanssa EMLA4-ALK translokaatio [16] – [18]. Näitä aineita käytetään asetusta erityisten geneettisiä muutoksia, jotka koodaavat onkogeenisten proteiineja. Kohdentamalla kuljettaja proteiineja johtaa suuri vastausprosentti tekijöille suunnattu niitä vastaan. Tämä lähestymistapa mahdollisti tarkoituksenmukaista arviointia ja FDA näistä aineista näitä merkkejä [19]. Kehittäminen näiden aineiden erityisiä molekyyli asetuksista on johtanut ymmärtämään, että jokainen histologinen syöpätyyppi on oikeastaan ​​kokoelma lukuisia harvinaisia ​​alatyyppejä. Nämä alatyypit on kukin eroavat toisistaan ​​niiden profiili mutaatioita.

PI3K /AKT-reitti on yleisin geneettisesti muutettu signalointiryöpyn syövän. Merkittäviä kliinisiä kiinnostus kohdentamisessa PI3K /AKT /mTOR polku kasvaa uutena inhibiittorit tämän reitin kehitetään edelleen. Esto PI3K väylän syövissä joilla

PIK3CA

mutaatiot ovat osoittaneet kliinistä hyötyä rintasyövän ja gynecologic pahanlaatuisia kasvaimia, mutta läsnäolo näistä mutaatioista ei yksin ennustaa herkkyyttä näitä lähestymistapoja [20]. Alaryhmässä potilailla, jotka ovat todennäköisimmin hyötyvät jatkuvaa kehittämistä uusia estäjiä PI3K reitin jää epäselväksi.

Viime aikoihin asti, vaikutukset aktivoidun PI3K on nisäkkäiden suolistossa ei ollut tutkittu. Olimme ensimmäisiä, joissa kuvattiin kehittyneiden invasiivisen mucinous adenokarsinoomia kehittää proksimaalisessa paksusuolessa seurauksena ilmaus määräävän aktiivisen PI3K [9]. Mielenkiintoista nämä kasvaimet kehittyvät nopeasti, ilman merkittävää luminal osan tai poikkeavuuksia WNT signalointia, joka ilmaisee ei-kanoninen kasvainten aloittamista. Tässä osoitamme, että kasvaimia muodostuva

FC PIK3ca *

hiiret ovat pitkälti riippuvaisia ​​PI3K koulutusjakso. Tässä mallissa on määräävä aktiivinen PI3K ilmaistaan ​​paksusuolen tuloksena kasvaimen aloittamista. Nämä syövät ovat hyvin aggressiivisia ja voivat seurata pituussuunnassa dual hybridi

18F-FDG PET /TT colonography. Kun vain kaksi viikkoa rapamysiinin hoidon merkittävä vaste havaittiin kuvantaminen ja vahvistettu ruumiinavauksessa. Nämä tulokset osoittavat, että

FC PIK3ca *

kasvaimet ovat riippuvaisia ​​tämän reitin kautta. Jos samanlainen kasvaimet ovat läsnä ihmisissä, estämällä PI3K reitin voi aiheuttaa huomattavaa kliinistä hyötyä asianmukaisista potilaille.

Hypoteesimme että alapopulaatio ihmisen kasvain muodossa seurauksena määräävän aktiivisen PI3K ja että nämä kasvaimet riippuvat tämän reitin. Tuoreessa patologinen sarja, aktivoivat mutaatiot

PIK3CA

havaittiin yleisemmin mucinous paksusuolensyövät ihmisissä, samanlainen kuin meidän malliin, ja liittyi heikentyneet ennusteeseen [21]. Aktivoivat mutaatiot

PIK3CA

oli käänteisesti yhteydessä translokaatio β-kateniinin [21]. Translokaatio β-kateniinin olisi odotettavissa, jos näitä kasvaimia aloitettiin poikkeava WNT signalointia osana aiemmin kuvattu kanoninen mekanismeja tuumorigeneesiä paksusuolen syövissä [22]. Yhdessä nämä havainnot osoittavat, että alaryhmä ihmisen paksusuolen syöpien syntyä asettaminen PI3K, samanlainen kuin mitä nähdään mallimme. Vain pieni määrä kasvaimia on kuulusteltiin poikkeavuuksia WNT signalointi ja mutaatioita

PIK3CA

siten lisätutkimuksia perusteltua edelleen luonnehtia tässä potilasryhmässä. Näiden pohjalta ennen tutkimuksiin, uskomme, että tämä todennäköisesti edustaa 1-5% kaikista paksusuolen syövistä.

Vaikka merkittäviä vasteita nähdään tässä tutkimuksessa, vastustuskykyä rapamysiinin hoidon todettiin. Lisääntynyt pERK1 /2, PS6 tai molemmat havaittiin kasvainten pysyviä huolimatta rapamysiiniä hoitoa. Nämä resistenssimekanismeja voi olla luontainen kasvaimia tai aiheuttama toissijainen rapamysiini hoitoon. Rapamysiini tiedetään estävän ribosomaalisen S6 kinaasien (S6K1 ja S6K2) kautta vuorovaikutuksessa mTOR [23]. Estyminen S6Ks pienenee alavirran fosforylaation S6 Ser

240/244 ja Pa

235/236 [24]. Studies in S6K1 /S6K2-null hiiren alkion fibroblasteissa vahvisti, että nämä S6Ks olivat merkittäviä kinaasien vaikuttavat S6, mutta myös osoittanut MEK1 /2-riippuvaista mekanismia S6 fosforylaation Pa

235/236 [25]. Lisäksi ERK1 /2 on osoitettu aktivoida p90 ribosomaalinen S6-kinaasi (RSK), joita voidaan myöhemmin fosforyloivat S6 Pa

235/236 riippumaton mTOR signalointi (Kuva S7) [26]. Kaikissa kasvaimia

FC PIK3ca *

hiiriä, vietämme fosforylaatio S6 arvellaan liittyvän aktivoinnin PI3K reitin. Alaryhmässä kasvainten, myös tarkkailla kasvoi pERK1 /2 ja pysyviä PS6. Nämä tiedot osoittavat, että vaihtoehtoinen fosforylaatiota S6 välittämän ERK1 /2 aktivointi EK saattaa olla mekanismi, jolla nämä kasvaimet ovat resistenttejä rapamysiiniä. Yhdistelmät kohdennettujen hoitomuotojen todennäköisesti tarpeen joissakin olosuhteissa voittaa nämä resistenssimekanismeja. PI3K ja Raf /MEK /ERK-reitin estäjä yhdistelmähoitoihin jatkossakin aktiivinen alue prekliinisen ja kliinisen tutkimuksen [27] – [29].

Vaikka rapamysiini on tunnettu estäjä mTOR ja PI3K koulutusjakso, uusia aineita kehitetään edelleen kohdistaa tämän reitin.