Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tässä sisältö, pieni molekyyli ligandi eturauhasen kalvon antigeenin (SMLP) konjugoitua poly (kaprolaktoni) (PCL) -b-poly (etyleeniglykoli) (PEG) kopolymeerit, joilla on eri lohkonpituudet syntetisoitiin rakentaa tyydyttävän lääkkeen antojärjestelmän. Neljä eri dosetakseli-ladattu polymeeriset misellit (DTX-PM) valmistettiin dialyysillä, jossa hiukkaskoko on alle 60 nm ominaista dynaamisella valonsironta (DLS) ja siirto elektronimikroskoopilla (TEM). Optimointi valmis misellien tehtiin perustuu lyhyen aikavälin vakaus ja huumeiden lastaus sisältöä. Tulokset osoittivat, että optimoidut järjestelmät pystyivät pysyvät koko 7 päivää. Verrattuna Taxotere, DTX-PMS kanssa samassa suhteessa hydrofiilisten /hydrofobisten ketjun pituus näkyy samanlainen pitkävaikutteisen käyttäytymistä. Sytotoksisuus optimoidun kohdennettujen DTX-PCL

12K-PEG

5K-SMLP misellejä (DTX-PMS2) ja ei-kohdennettu DTX-PCL

12K-mPEG

5K misellejä (DTX-PMs1) arvioitiin MTT-määritysten avulla eturauhasen kalvo (PSMA) positiiviset eturauhasen adenokarsinoomasoluja (LNCaP). Tulokset osoittivat, että kohdennetun misellit oli paljon alhaisempi IC50 kuin ei-kohdennettu kollegansa (48 h: 0,87 ± 0,27 vs. 13,48 ± 1,03 ng /ml; 72 h: 0,02 ± 0,008 vs. 1,35 ± 0,54 mikrog /ml).

In vitro

soluunottoa PMS2 osoittivat 5-kertainen fluoresenssin intensiteetti kuin PMs1 4 h inkubaation jälkeen. Näiden tulosten perusteella uusi nano-kokoinen lääkeaineen, joka perustuu DTX-PCL-PEG-SMLP tarjoaa suuren lupauksen hoitoon eturauhasen syöpä.

Citation: Jin J, Sui B, Gou J, Liu J, Tang X, Xu H, et al. (2014) PSMA Ligandin Conjugated PCL-PEG Polymeerieristeet Misellit Kohdennettu syöpäsolujen. PLoS ONE 9 (11): e112200. doi: 10,1371 /journal.pone.0112200

Editor: Gnanasekar Munirathinam, University of Illinois, Yhdysvallat

vastaanotettu: 14 heinäkuu 2014; Hyväksytty: 13 lokakuu 2014; Julkaistu: 11 marraskuu 2014

Copyright: © 2014 Jin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Kirjoittajat ole rahoitusta tai tukea raportti.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Polymeerieristeet misellit ovat saaneet merkittävää huomiota lupaavana syöpälääkettä kantajia, koska niiden merkittäviä etuja, kuten pienen koon, kapea kokojakauma, korkea biologinen yhteensopivuus, ja liukenemiseen hydrofobisten lääkeaineiden [1], [2], [3], [4], [5]. Itseasentuvalla polymeeristä misellien kanssa ydin /kuori rakenteita mahdollistaa järjestelmän sisällyttää heikosti vesiliukoisia lääkkeiden hydrofobisen ytimen ja suojaa niitä hajoamiselta fysiologisessa väliaineessa [6]. Esimerkiksi hydrofobinen ydin misellien koostuu PCL-PEG tarjoaa säiliö sisällyttämistä huumeita, kun taas pegyloitu kuori yhdessä sen nanoscopic koko takaa operaattorin pysyvät YK-tunnustettu retikuloendoteliaalijärjestelmä ja läpikäyvät pitkän kierron aikana veressä [7], [8], [9].

Vaikka polymeeristä misellit esillä useita etuja, yksi suuri haaste on niiden paikkakohtaisia ​​lääkeaineen. Ligandimodifioitu polymeeriset misellin lääkeaineen järjestelmät pystyvät paikkakohtaisten lääkeaineen. Viime aikoina lukuisia aktiivisia kohdistaminen kuljetusjärjestelmiä on suunniteltu konjugoimalla NP ligandien kanssa, jotka sitoutuvat spesifisesti biomarkkerit solunulkoisten domeenien syöpäsoluja. PSMA kuten folaatti hydrolaasi I ja glutamaattikarboksipeptidaasi II, on tunnettu transmembraaniproteiiniksi [10] yli ilmentyy eturauhassyövän epiteelisolujen [11], [12] ja on osoitettu olevan suuria mahdollisuuksia eturauhasen syöpä (PCA) hoito. PSMA on heikkoa ilmentymistä normaalissa eturauhasessa epiteelisoluissa ja eturauhasen hyvänlaatuista liikakasvua. Se on myös ilmaistu uudissuonittumisen useimpien muiden kiinteiden kasvainten, mutta ei normaa- lien kudoksien suonistossa [13], [14]. Kaikki nämä ominaisuudet tekevät PSMA houkuttelevan biomarkkereiden havaitsemiseksi, diagnoosi ja hoito Eturauhassyövän [15], [16]. A novel pieni molekyyli-ligandin ((S) -2- (3 – ((S) -5-amino-1-karboksipentyyli) ureido) pentaanidionihapon, SMLP) sitoutuu spesifisesti PSMA on osoittanut potentiaalia syövän hoidossa viime vuotta [17]. Urea-pohjainen PSMA estäjä, SMLP, on korkea affiniteetti PSMA vahvan vetysidoksen [10]. Hrkach ja Langer

et al.

Kehitetty ACUPA (PSMA ligandi) konjugoituna DTX NP muodostuu PEG-b-PLGA tai PEG-b-PLA käyttäen nano-emulgointimenetelmä kohdistaa PSMA ja arvioi antituumoritehoon NPS

in vitro

ja

in vivo

[18]. Erinomainen tarjoamia mahdollisuuksia ajoneuvon-ligandin kohdistaminen PSMA ehdottaa välttämättömyys kehittää monipuolisempaa käsittelymenetelmien ja operaattorin-materiaalien alalla.

Tässä tutkimuksessa, nano-kokoinen itse koottu lääkeaineen, joka perustuu ligandi konjugoitua PEG-b-PCL misellien havaittiin lupaavia alalla kohdistuva lääkkeiden annostelu. Kopolymeerit PCL ja PEG ovat molemmat tunnettuja biohajoavia ja bioyhteensopivia materiaaleja käytetään laajasti kliinisen kemian alalla [19], [20], [21], [22], [23]. Käyttöönoton vuoksi glykolihapon (GA) ja maitohappoa (LA), joka häiritsi määräsi rakenne molekyyli ketjuja, PLGA oli pieni kiteisyys. Tämän seurauksena misellien ydintä PCL jotka osoittivat suurempi kiteisyys ovat vakaampia kuin ne, joilla PLGA ydintä. Lisäksi, koska PLGA on satunnaiskopolymeeri, se on suhteellisen vaikea hallita suhde GA LA tarkasti suuren mittakaavan tuotantoon. Kuitenkin suhde kahden monomeerin on keskeinen tekijä vaikuttaa omaisuutta PLGA [24]. Joten PCL käytettiin ytimen muodostavan lohkon ansiosta parempi vakaus ja helposti tuottaa. PCL-mPEG tai PCL-PEG-COOH syntetisoitiin renkaanavautumispolymerointina polymerointi ε-kaprolaktonin aloittaman mPEG-OH tai HOOC-PEG-OH [25], [26]. PCL-mPEG ja PCL-PEG-SMLP misellejä valmistettiin käyttämällä DTX mallina lääke tutkia sytotoksisia vaikutuksia LNCaP. Lisäksi, kaavamainen kuva valmisteen ja endosytoosin menetelmä DTX-PCL-PEG-SMLP on esitetty kuviossa 1.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

L -glutamiinihappo di-tertbutyyli hydrokloridi ja H-Lys (Z) OT-Bu hydrokloridi saatiin En lai Biotekniikka Co, Ltd (Chengdu, Kiina). mPEG-OH (mp: 2 kDa) ja mPEG-OH (mp: 5 kDa) (Aladdin Agentti Co, Shanghai, PR Kiina) ja OH-PEG-COOH (mp: 2 kDa), OH-PEG-COOH (Mw : 5 kDa) (Shanghai Seebio Biotekniikka Co, Shanghai, PR China) poistettiin vesi atseotrooppisella tislauksella tolueenilla ennen käyttöä. DTX (Shanghai Sanwei Pharma Ltd, Co, Shanghai, P R Kiina) ja selluloosan esterin dialyysi laukku molekyyli- cut-off 7000 Da (Bioscience Ltd, Co, Shanghai, P R Kiina) käytettiin sellaisinaan. ε-kaprolaktoni (ε-CL, Aladdin Agent Co, Shanghai, P R Kiina) kuivattiin CaH

2 huoneenlämpötilassa 48 tuntia ja tislattiin alennetussa paineessa. Tinaoktoaatin ostettiin Aladdin Agent Co (Shanghai, P R Kiina). Kaikki orgaaniset liuottimet käytetyt synteesimenetelmät hankittiin National Medicine Chemical Reagenssi Ltd Co (Shanghai, PR China).

Eturauhasen LNCaP ja PC3 solulinjat saatiin Type Culture Collection of Kiinan Academy of Sciences (Shanghai, Kiina). LNCaP Soluja viljeltiin käyttäen solu- sitoa kulttuuri pullot (Corning, USA).

Methods

synteesi PCL-mPEG (PMs1) ja PCL-PEG-SMLP (PMS2) kopolymeerit.

sekapolymeerit joiden valikoima lohkonpituudet valmistettiin renkaanavautumispolymerointina kopolymerointi ε-CL aloittanut hydroksyyli PEG. Lyhyesti, ennalta määrätty määrä ε-CL ja tinaoktoaattia lisättiin reaktioastiaan, joka sisälsi mPEG-OH tai OH-PEG-COOH kuivassa argonatmosfäärissä (tinaoktoaatti /ε-CL 1:1000 moolisuhde). Sitten reaktioastia laitettiin öljyhauteeseen ja sitä pidettiin 120 ° C: ssa 24 tuntia. Sitten raaka kopolymeerit liuotettiin DCM: ään ja saostettiin kylmään dietyylieetteriin poistamiseksi reagoimatta monomeerin ja oligomeerin. Sitten tuote suodatettiin ja kuivattiin, jolloin saatiin valkoinen sakka.

PCL

12k-PEG

5k-COOH (1 g, 0,059 mmol) liuotettiin 5 ml: aan vedetöntä tetrahydrofuraania (THF) 1-etyyli-3- [3-dimetyyliaminopropyyli] karbodi-imidihydrokloridia (EDC) (57,4 mg, 0,3 mmol, 5 ekvivalenttia) ja N-hydroksisukkinimidiä (NHS) (27,6 mg, 0,24 mmol, 4 ekvivalenttia). Sitten liuosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa yli 12 tunnin ajan argonatmosfäärissä. PCL

12k-PEG

5k-NHS-kopolymeeri saostettiin jää- kylmää dietyylieetteriä, jolloin saatiin valkoinen sakka, joka otettiin talteen ja kuivattiin, jolloin saatiin haluttu tuote valkoisena jauheena (saanto 90%). SMLP (300 mg) liuotettiin vedettömään THF: ään (20 ml), valmistamiseksi 10 mg /ml (SMLP /THF) turkoosi. PCL-PEG-NHS (500 mg, 0,03 mmol) ja di-isopropyylietyyliamiinia (0,7 ml), lisättiin 5 ml (SMLP /THF) aqua, ja reaktioliuosta sekoitettiin huoneenlämpötilassa 20 tuntia argonin alla. Sen jälkeen, kun reaktio on mennyt loppuun, liuos puhdistettiin dialysoimalla 24 tuntia ja kuivattiin lyofilisoimalla, jolloin saatiin valkoista höytälemäisenä jauheena (saanto 90%). Lopullisten kopolymeeriä leimasi

1 H-NMR-spektroskopialla.

PCL

4.8K mPEG

2K ja PCL

4.8k-PEG

2k-SMLP valmistettiin käyttäen samaa menetelmää aiemmin todennut.

Polymer luonnehdinta.

1 H-magneettikuvaus (

1H NMR) kaikista näytteistä rekisteröitiin Bruker DMX 300 tai 600 spektrometri (Billerica, MA). Kemialliset siirtymät (δ) annettiin ppm käyttäen tetrametyylisilaania sisäisenä standardina. Fourier-muunnos infrapunaspektroskopiaa spektrit rekisteröitiin Bruker Tensor 27 spektrometri, ja näytteet valmistettiin käyttämällä KBr-levyjä (Scharlau Chemie, Barcelona, ​​Espanja). Gel (GPC) määritys suoritettiin Waters 1515 GPC väline (Waters Corp., Milford, MA) varustettu kolmella Styragel saraketta (Waters Corp; 10

5, 10

4, ja 103 Å) tandem ja 2414 ero taitekerroindetektori. DMF: ää valittu eluenttina virtausnopeudella 1,0 ml /min 35 ° C: ssa. Näytteen pitoisuudet olivat noin 2 mg /ml. Molekyylipainojen kalibroitiin käyttäen polystyreenistandardeja.

Polymeeristen misellejä.

DTX-ladattu misellejä valmistettiin dialyysillä. Ensimmäinen, 7 mg DTX ja 50 mg kopolymeeriä liuotettiin täydellisesti 2 ml THF: ää. Sitten 4 ml fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS; 10 mM, pH 7,4 tai 10 mM, pH 5,5), lisättiin tipoittain liuokseen jatkuvasti sekoittaen yhden tunnin ajan. Sitten THF poistettiin dialysoimalla PBS: ää (10 mM, pH 7,4 tai 10 mM, pH 5,5) 24 tunnin aikana käyttäen selluloosa-esteriä dialyysipussiin (MWCO: 7000 Da). Ulompi väliaine korvattiin kolme kertaa (2, 6, ja 12 tuntia). Lopuksi seos johdettiin 0,45 pm suodattimen kalvo poistamiseksi saostajina.

Huumeisiin sisällön lataamista ja kapselointi tehokkuutta.

Voit selvittää huume-sisällön lataamisen ja kapselointi tehokkuutta, 500 ui DTX-ladattu miselliliuos ja 5 ml THF: a siirrettiin 25 ml: n mittapulloon, sonikoitiin 180 W: ssa 10 minuuttia ultraäänihauteessa, ja sitten se laimennettiin liikkuvalla faasilla. Pitoisuus tuloksena olevassa liuoksessa määritettiin sitten HPLC: llä. Kromatografinen analyysi suoritettiin käyttäen Hitachi L-2130 pumppu ja Hitachi L-2400 UV-Vis-detektori toimi aallonpituudella 230 nm, käyttäen Unitary C18-pylvästä (5 um, 150 x 4,6 mm). Liikkuva faasi on asetonitriiliä ja vettä (60/40, v /v) on valittu. Virtausnopeus asetettiin 1 ml /min. Piikin pinta-ala vaste vs. DTX pitoisuus oli lineaarinen 0,5-30 ug /ml (r

2 = 0,9999).

Lääke-sisällön lataamisen ja kapselointi tehokkuutta laskettiin seuraavalla kaavalla :

hiukkasten koon mittaukset.

hiukkaskoon ja jakelu misellejä mitattiin DLS käyttäen NICOMP 380 Submicron Particle Sizer (Particle Sizing Systems, Santa Barbara, CA). Lasersäde aallonpituudella 632,8 nm käytettiin. Sirontakulman asetettiin 90 °, kun mittaukset tehtiin.

Pinta morfologia.

Näytteet TEM havainto valmistettiin laittamalla pisara näyteliuoksen (2 mg /ml kopolymeeri) on on kupari verkkoon päällystetty hiilellä. Ylimääräinen liuos pyyhitään pois suodatinpaperilla. Verkkoon annettiin kuivua vielä 15 minuuttia. Sitten näytteet tutkittiin käyttämällä Hitachi H-600 TEM toimi kiihtyvällä 100 kV.

In vitro

Release.

in vitro

DTX vapautumiskinetiikka lääkeaineella täytetyt miselliliuokset tai DTX injektio (Taxotere, Sanofi-Aventis, Pariisi, Ranska), joka sisälsi 300 ug DTX suoritettiin dialyysi diffuusion. Lääke-ladattu miselliliuos ja vapaan lääkeaineen liuos sijoitettiin dialyysipusseihin (MWCO: 14000). Nämä pussit upotettiin 15 ml: aan PBS: ää, pH 7,4 (10 mM) tai pH 5,5 (10 mM), joka sisälsi 0,5% paino /tilavuus Tween 80. Tämän jälkeen pullot pantiin ravistamalla inkubaattorissa ravistamalla nopeudella 100 rpm alle 37 ° C ± 0,5 ° C. Vapautuminen alustat korvattiin tuoreella PBS: llä ennalta määrätyin väliajoin (1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h, 36 h, 48 h, 60 h, 72 h, 84 h ja 96 h), jotta mitata lääkeaineen pitoisuus. Pitoisuus DTX mitattiin HPLC: llä.

Soluviljely ja Sytotoksisuus.

Eturauhasen LNCaP ja PC3 solulinjoja viljeltiin RPMI 1640 väliaineessa ja Hamin F12K (Invitrogen, USA), täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (Hyclone, USA), vastaavasti. Viljelmiä pidettiin 95% ilmaa kostutetussa atmosfäärissä, joka sisälsi 5% CO

2 37 ° C: ssa.

MTT-määritystä suoritettiin arvioimaan sytotoksisuuden DTX-PMs1 (nontargeted) ja DTX-PMS2 ( kohdennettua). LNCaP-solut suspendoitiin elatusaineeseen ja ympättiin 5000 solua /kuoppa 96-kuoppaisilla levyillä 24 tunnin ajan. Sitten dispergoitu DTX-PMs1, DTX-PMS2, ja DMSO-liuosta DTX (DSD), joka sisälsi neljä lääkeainepitoisuudet (0,1, 1, 10 ja 20 ug /ml) kussakin näytteessä inkuboitiin LNCaP-soluissa. Lopuksi, solun elinkelpoisuus määritettiin 48 tunnin kuluttua ja 72 h käyttäen Microplate Reader (Bio-Rad imark, USA).

IC50 kunkin järjestelmän laskettiin sitten. Kaikki määritykset suoritettiin viisi rinnakkaista näytettä.

sisäänotto soluihin tutkimuksissa.

Tässä tutkimuksessa, kumariinin 6 käytettiin fluoresenssi koettimena. Androgeeniriippuvaisen ja androgeeni-riippumaton eturauhasen solulinjoissa (LNCaP ja PC3, vastaavasti) käytettiin. Soluunottoa kohdennetun ja ei-kohdennettu PM (200 ug /ml), joka kantaa kumariinia 6 (100 ug /ml) (PMs1 ja PMS2, vastaavasti) käytiin LNCaP ja PC3 solulinjojen tutkimiseksi vaikutuksen SMLP konjugaation solu- oton. Soluja inkuboitiin 96-kuoppalevyillä misellien 4 tuntia, pestiin kylmällä PBS: llä kolme kertaa, ja sitten kiinnitettiin 70% etanolissa 2 tuntia -20 ° C: ssa. Kilpailukykyinen esto suoritettiin myös vapaalla SMLP tarkistaa, onko hiukkaset kuljetettiin soluihin on SMLP välittämän tavalla. Vapaa SMLP kolmella eri pitoisuuksilla (4 ug /ml, 20 ug /ml ja 100 ug /ml) lisättiin elatusaineeseen yhdessä PMS2, inkuboidaan 4 tuntia, pestiin kolme kertaa kylmällä PBS: llä ja kiinnitettiin 70% etanolissa 2 tuntia -20 ° C: ssa. Solujen tumat värjättiin Hoechst 33342.

Solut tutkittiin käyttäen ImageXpress Micro XL Widefield korkea Content Screening System (ImageXpress Micro XL, Molecular Devices, USA) kanssa MetaXpress Software. Kuvat soluista määritettiin ero häiriö kontrastia kanava tekniikka ja kuvien kumariinin 6 ladattu PMS ja ytimet solujen värjätään Hoechst 33342 tallennettiin seuraavat kanavat: sinisen kanavan (Hoechst 33342) virityksen ollessa 350 nm ja vihreä kanava (kumariinia 6) virityksen ollessa 485 nm. Sitten MetaXpress ohjelmisto käytettiin määrittämään fluoresenssin voimakkuutta solua kohti.

Tilastot.

Kaikki tiedot käsiteltiin käyttämällä alkuperä 8.5 ohjelmistoa ja esitetään keskiarvona ± SD, ja analysoidaan Studentin

t

-testi. Tilastolliset analyysit tehtiin ja P 0,01 pidettiin sellaisena tilastollisen merkitsevyyden.

Tulokset ja keskustelu

synteesi ja karakterisointi PCL-mPEG ja PCL-PEG-COOH kopolymeerit

amfifiilinen lohkokopolymeeri koostuu PCL lohkon hydrofobinen osa ja PEG-lohkon hydrofiilinen osa syntetisoitiin kautta renkaan avaaminen polymerointi käyttäen hydroksyyliterminaalista PEG suurimolekyylistä initiaattorina.

molekyylipainot kopolymeerit laskettiin

1H-NMR tiedot vertaamalla huippuintensiteeteillä metyleeniprotonien PEG kanssa metyleeniprotonit PCL, kuten on esitetty kuviossa 2E. Suhde ja hydrofobisen lohkon hydrofiiliseen lohkoon määritettiin suhteellisista intensiteeteistä PCL protonin signaalin 2,31 ppm ja PEG protoni signaalin 3,62 ppm. GPC-analyysi, vain yksi piikki esiintyi GPC-käyrän (kuvio 2A), mikä tarkoittaa, että renkaan avaaminen kopolymerointi ε-kaprolaktonin kanssa PEG-OH oli täydellinen ja kaikki jäämät poistettiin puhdistuksen jälkeen. Polydispersiteetti-kopolymeerin (Mw /Mn) on esitetty taulukossa 1.

synteesi ja karakterisointi PCL-PEG-SMLP

Surface kopolymeerin funktionalisoimisen PCL- PEG-COOH kanssa SMLP saavutettiin vakio Amidikytkentään olosuhteet läsnäollessa EDC ja NHS [27], [28]. Kytkimen tehokkuutta amiinin nukleofiilien voidaan lisätä muodostamalla NHS esterivälituote [29].

synteesi polymeerin PCL-PEG-SMLP saatiin aikaan seuraavalla menetelmällä. Ensinnäkin karboksyyli PCL-PEG-COOH aktivoitiin EDC ja NHS saavuttaa väli- PCL-PEG-NHS. Sitten aktiivinen esteri (NHS) ja PCL-PEG-NHS saatettiin reagoimaan amiinin funktionaalisen ryhmän SMLP saada lopullisen polymeerin PCL-PEG-SMLP (kuvio 3).

polymeeri PCL

12k-PEG

5k-SMLP karakterisoitiin käyttäen FT-IR, kuten kuviossa 2F. Keskeisiä piikit kuvassa 2F klo 1671 ja 1557 cm

-1 syyksi amidi bändi I (karbonyyliryhmä) ja amidin band II (aminoryhmä) vastaavasti, kun taas häviäminen näiden huippujen (kuvio 2G) osoitti muodostumista amidisidoksen välillä SMLP ja PCL

12k-PEG

5k-COOH. Rakenne konjugaatin edelleen tutkittiin

1H-NMR. Kuvio 2C esittää

1H-NMR-spektri konjugaation ligandin ja kopolymeerin PCL

12k-PEG

5k-COOH. Ominainen signaali esiintyvät 3,60 ppm (a) siirrettiin PEG yksikköön. Huiput PCL yksiköt näkyvät 4,04-4,08 ppm (b), 2,28-2,33 ppm (c), 1,61-1,70 ppm (d) ja 1,35-1,43 ppm (e), kuten on esitetty kuviossa 2C. Lisäksi signaalit 2,49 ppm ja 3,25-3,49 ppm jaettiin liuottimen piikkiä (DMSO) ja vesi huippu, vastaavasti. Kuvion 2E, ei ole olemassa SMLP liittyvien signaalien esitetty

1H-NMR-spektri konjugoimattoman PCL

12k-PEG

5k-COOH, mikä osoittaa, että ei ole häiriöitä SMLP signaaleja kuviossa 2C .Comparing huiput PCL-PEG-SMLP kuviossa 2C ja huiput ligandin SMLP kuviossa 2B, kemialliset siirtymät olivat samanlaiset. Kampaus tulokset FT-IR ja

1 H-NMR osoitti, että ligandi SMLP oli saatu konjugoitu PCL

12K-PEG

5K-COOH. Puhtaus ligandin konjugoitu polymeereihin, jotka on kriittisesti liittyy

in vitro

suorituskykyä misellien, varmistettiin geelipermeaatiokromatografialla. Kuten kuviossa 2D, jälkeäkään vapaa SMLP havaittiin kromatogrammit joko PCL

12K-PEG

5K-SMLP tai PCL

4.8K-PEG

2K-SMLP, mikä osoittaa, että liiallinen vapaa ligandi poistettiin täysin.

valmistelu ja luonnehdinta misellien

tässä työssä, dialyysi käytettiin valmistamiseksi dosetakselia misellien, joka johtaa onnistuneeseen valmisteluun nontargeted [PCL

12K-mPEG

5k (PMs1), PCL

4.8k mPEG

2K (PMs3)] ja kohdennettuja [PCL

12K-PEG

5K-SMLP (PMS2), PCL

4.8K-PEG

2K-SMLP (PMs4)] misellejä. Lisäksi, nanopartikkelit, joiden halkaisija on suurempi kuin 100 nm, ovat todennäköisesti poistettava retikuloendoteelijärjestelmän [30], kun taas heidän kollegansa, joiden halkaisija on alle 100 nm olivat todennäköisesti kerääntyä tuumorikudoksissa [31], [32].

keskimääräinen halkaisijat misellien (PMs1, PMS2, PMs3 ja PMs4) valmistettiin dialyysillä olivat 51,4 ± 1,3 nm, 50,5 ± 1,1 nm, 37,1 ± 0,5 nm ja 38,6 ± 0,7 nm. Polydispersiteetti-indeksi (PDI) arvot neljän misellien on esitetty taulukossa 1. DLS kuvaajat PMs1 ja PMS2 on esitetty kuviossa 4 (A, B). Morfologia ja alhainen PDI misellien varmistettiin vielä TEM kuvantaminen. TEM valokuva (kuva 4 A

1 ja B2) sekä PMs1 ja PMS2 olivat mukaisesti tulosten DLS. Mitä pienempi halkaisija on hiukkaset saatu TEM testeissä verrattuna DLS voitaisiin katsoa johtuvan kutistumisen PEG kuoren aiheuttama veden haihtumisen ennen TEM mittaus [33]. Tämän seurauksena, halkaisija antama DLS oli suurempi kuin TEM johtuen nesteytystä PEG kuori.

TEM kuvaajat DTX-PMs1 (A

1) ja DTX-PMS2 (B

2).

arvioimiseksi suurin lääke-sisällön lataamisen ja huumeiden lastaus tehokkuutta neljä misellejä pelkkä lyhyen aikavälin vakauden tutkimus DTX-ladattu sisältö oli suoritettu ja tulokset on esitetty kuviossa 5. Ensimmäinen, ylimäärä DTX lisättiin valmistuksen aikana neljän DTX-PM. Yli ladattu PM pidettiin huoneenlämmössä ja näytteet ennalta määrätyn ajan. Sitten DTX-sisällön lataamista näytteiden mitattiin HPLC: llä käyttäen kuvattua menetelmää. Profiili osoitti, että alkuperäisen DTX-sisällön lataamista neljän hiukkaset oli 10,4%, 10,8%, 9,6% ja 9,8%, vastaavasti. Arvot DTX-sisällön lataamista laski vähitellen ja pysyi vakiona 12 h PCL

12k-PEG

5k ja 24 h PCL

4.8k-PEG

2k (kuva 5, ympyröity neliöt ). Väheneminen huumeiden lastaus sisältö saattaa johtua esiintyminen faasin erottaminen DTX ja PCL. Lääke-sisällön lataamisen jälkeen 7 päivää koeaika voitiin pitää kyvyksi PCL lastaukseen DTX. Myös suurempi kapasiteetti PMs1 ja PMS2 verrattuna PMs3 ja PMs4 voitaisiin katsoa johtuvan pidemmän PCL ketjuja PMs1 ja PMS2. Kun sama suhde hydrofiilisen lohkon pituus hydrofobisen lohkon pituus, viimeinen lääke-sisällön lataamisen ja kapselointi tehokkuutta neljä PM on esitetty taulukossa 1. Nämä tulokset osoittivat hyvää lyhyen aikavälin vakautta DTX-sisällön lataamisen , lääke-sisällön lataamisen ja tehokkuutta, vahvistaa, että misellit perustuva PCL

12K-PEG

5K-SMLP ja PCL

12K-mPEG

5k kopolymeerit olivat optimaaliset muotoiluja.

(n = 3).

in vitro

vapauttaa

in vitro

vapautumisen käyttäytymistä neljän DTX-yksityisviesteistä tutkittiin dialyysihoidon Immunodiffuusiomentelmää [34]. Vapauttamista käyttäytyminen Taxotere käytettiin kontrollina, ja DTX vapautumisen profiilit neljän hiukkaset pH: ssa 7,4 (simuloitu ympäristön normaaleissa kudoksissa) ja pH 5,5 (simuloidussa kasvaimen kudokset) on esitetty kuviossa 6. Lähes 90% DTX vapautettiin Taxotere 24 tunnin sisällä. Toisin kuin Taxotere, kaikki misellit osoitti nopea vapautuminen DTX alkuvaiheessa (ensimmäinen 24 h) ja pitkävaikutteista seuraavien 72 h. Lisäksi samanlainen vapauttamaan profiilit PMs1 ja PMS2 osoittivat, että ligandi konjugaatio ei vaikuttanut vapautumismalliin.

neljän PMS, koska poly esterin rakenne PCL on herkkä happo, vapauttamista DTX misellit oli hitaampaa pH-arvossa 7,4 kuin pH: ssa 5,5. Tämä vaikutus edistää vapautumista DTX kasvainkudoksissa ja endosomeihin jotka ovat happamia kuin veri [35]. Määrä ei-julkaissut DTX oli 20-25%. Tämä osuus huumeiden olemassa misellifaasin ytimet; loukkuun precipitations tuottama lämpö ja tween 80 aiheuttama misellifaasi jakautuminen ja adsorboitu dialyysipussi ja lasiesineet [36].

Cell sytotoksisuus

PSMA on validoitu molekulaarinen merkkiaine yli-ilmentää LNCaP [37] , [38]. Sytotoksisuus tehostajavaikutuksen PSMA ligandin (SMLP) konjugoitua DTX-yksityisviesteistä arvioitiin in vitro sytotoksisuuden kokeellisesti LNCaP ja PC3-soluissa, vastaavasti. Bioyhteensopivuutta PCL

12K-mPEG

5K ja PCL

12K-PEG

5K-SMLP varmistettiin inkuboimalla lääkkeetön koostuvien misellien näiden kahden polymeerin eri pitoisuuksina kanssa LNCaP ja PC3-solut vastaavasti. Solujen elävyys ei vaikuttanut yli 72 tunnin inkuboinnin ajan, joka vahvistettiin hyvä biologinen yhteensopivuus näiden polymeerien (kuvio 7). Tulokset myös osoittivat, että soluja ei voida puuttua läsnä ollessa ligandien.

(n = 5).

Tässä tutkimuksessa DMSO-liuosta DTX (DSD) oli sijasta Taxotere positiivisena kontrollina, koska Tween 80 Taxotere on sytotoksinen ja tämä voi vaikuttaa [39]. Tulosten mukaan MTT määritykset (kuvio 8), sen jälkeen 48 h inkubaation, sytotoksisuus PMs1 oli lähes sama kuin DSD. Kuitenkin PMS2 oli huomattavasti pienempi LNCaP solujen elinkelpoisuuden ollenkaan pitoisuuksilla. PC3 solulinjoissa, ei kuitenkaan havaittu merkittävää eroa solujen elinkelpoisuuden keskuudessa DSD, PMs1 ja PMS2 (kuvio 8). Tämä osoitti, että ligandi konjugaatio on hyödyllistä helpottaa soluunottokokeissa misellien: kun PMs1 ja PMS2 osoitti vastaavia -vapautumisprofiileja, alentunut solujen elinkelpoisuuden voitaisiin katsoa johtuvan tehostetut solunsisäisen lääkkeen kertymisen kautta reseptorivälitteisen endosytoosin. 72 tunnin kuluttua inkubaation sekä PMs1 ja PMS2 osoittivat merkittäviä eroja DSD LNCaP solulinjassa, ja PMS2 osoittivat suurinta sytotoksisuutta. Lisäksi merkittävät alempi elinvoimaisten solujen havaittiin PC3 solulinjoissa käsitelty joko PMs1 tai PMS2 kuin DSD huumeiden pitoisuutena 20 ug /ml, mikä tarkoittaa, että riittämätön soluunottoa misellien voitaisiin kompensoida pitemmän inkubointiajan ja lääkeainepitoisuuden. Kuitenkin, ei ollut merkittäviä eroja PMs1 ja DSD jälkeen 48h inkuboinnin LNCaP. Ilmiö vahvisti lääkeaineen pitkittyneen vapautumisen käyttäytymistä DTX PMs1

in vitro

.

(*) merkittävästi erilainen kuin DSD; (#) Merkitsevästi erilainen PMs1; (N = 5). Huomautus: * P 0,01,

# P 0,01.

Solujen elinkelpoisuus PMS2 20 ug /ml oli melkein puolet PMs1 varten LNCaP jälkeen joko 48 h tai 72 h inkuboinnin jälkeen. Nämä tiedot osoittivat, että DTX-PMS2 oli vähemmän tehokkaasti parantaa sytotoksisuuden PC3-soluissa, kun taas se estää selektiivisesti proliferaatiota LNCaP. Vuonna Toisin sanoen, nämä tulokset viittaavat siihen, korkea affiniteetti SMLP PSMA: lle voisi tehostaa sytotoksisuutta LNCaP-soluissa. 72 tunnin kuluttua inkuboinnin LNCaP-solujen määrä DTX annetaan kiinteä pitoisuudessa 20 ug /ml, solujen kasvun esto DSD, PMs1 ja PMS2 olivat 58,4%, 67,7% ja 83,9%, vastaavasti.

IC50 kullekin näytteelle on esitetty taulukossa 2. LNCaP-solut, IC50 DTX-PMS2 oli paljon pienempi kuin DTX-PMs1 ja DSD jälkeen 48 h tai 72 h inkuboinnin jälkeen. Kuitenkin IC50 DTX-PMs1 oli lähes sama kuin DSD jälkeen 48 h inkubaation, mutta se oli 5 kertaa pienempi 72 tunnin kuluttua inkubaation LNCaP-soluja, tämä vahvistettiin edelleen jalostettuja vaikutus sytotoksisuuden misellien pitkäaikainen inkubaatioajan. Vaikka DTX-PMS2 (kohdennettu), osoitti suurinta solu-tappamisen tehokkuutta, DTX-PMs1 näytetään myös vaikutusta LNCaP. Koska molemmat misellit hallussaan samankaltaisia ​​-vapautumisprofiileja, erot sytotoksisuuden liittyivät erilaiset solun merkintä kyky, joka näkyi eroja sukua PSMA.

otto solun sisään

tutkimaan vaikutusta PSMA kohdistaminen ligandin ottoa solun sisään hiukkaset, fluoresenssimikroskopiaa tehtiin LNCaP sekä kohdistettuja (PMS2) ja ei-kohdennettu (PMs1) misellit merkitty kumariinin-6. 4 tunnin kuluttua inkuboinnin jälkeen 37 ° C: ssa, HCSS kuvia LNCaP-soluja otettiin ja kuviossa 9A on esitetty. Fluoresenssin intensiteetti soluja inkuboitiin kohdennettuja misellejä (PMS2) oli huomattavasti suurempi kuin sen ei-kohdistetut vastine (PMs1), sekä määrällisesti fluoresenssi-intensiteetti oli arviolta 5-kertaisesti (kuvio 9C). Kyky SMLP konjugaation parantamisessa soluunottokokeissa voi heijastua solujen elinkelpoisuuden määrityksissä. Edelleen todentamiseksi roolia SMLP endosytoosiin, ligandi kilpailee koe. Kuten kuviossa 8B, lisäämällä vapaa ligandien eri pitoisuuksilla pienenevät asteittain oton PMS2, ja määrä endosytoidut misellien saavutti vastaavalla tasolla ei-kohdistetut kollegansa runsaasti SMLP (100 ug /ml, kuvio 10B) , joka osoitti, että läsnä vapaan SMLP keskipitkällä esti endosytoosin PMS2 sitoutumalla pintaan PSMA kilpailukykyisesti vastaan ​​miselli-konjugoidun SMLP. Edelleen todentamiseksi tehostamista ligandin välittämisessä endosytoosin, solun oton tutkimukset molempien valmisteiden kanssa /ilman SMLP ligandia tehtiin PC-3 solulinja, joka eivät ilmaise PSMA-proteiinia [40]. Kuten on esitetty kuviossa 9 (B ja C), targeted- ja ei-kohdennettu misellien osoittivat samanlaisia ​​solunsisäisen fluoresenssin voimakkuus, mikä tarkoittaa sitä, konjugaatio SMLP on keskeinen tekijä edistää ottoa solun sisään valmis misellien PSMA ilmentävissä soluissa. Myös edellä esitetyt tulokset osoittivat, että PMS2 oli endosytoosin LNCaP kautta useita reittejä: osa misellien otettiin mukaan LNCaP soluja SMLP välittämän tavalla, vaikka oli misellit tulevat solut muilla väyliä myös caveolin endosytoosin tai clathrin- ja caveolin riippumaton endosytoosin [41], kuten ottoa solun sisään misellien ei ollut täysin inhiboi SMLP lisäksi. Nämä tulokset selitti suurempi sytotoksisuus kohdennettujen misellien (PMS2) MTT määrityksissä ja osoitti hyödyksi PMS kanssa kohdistaminen ligandin eturauhassyövän hoidossa.

Soluytimien värjättiin Hoechst 33342 kanssa sinisen kanavan, kumariinin 6 ladattu PMS ovat vihreä kanava. Ottoa soluun visualisoitiin päällystämällä kuvat näytetään ytimet kanavan ja hiukkaset kanava. Fluoresenssin intensiteetin /solu kuvaaja 100 ug /ml kumariinin 6-ladattu PMs1 ja PMS2, jonka pitoisuus on 200 ug /ml sen jälkeen, kun 4 h inkubaation LNCaP-solujen ja PC3-solut (C).

Johtopäätökset

tässä tutkimuksessa uutta koottavien DTX-PEG-PCL-SMLP misellien kohdistaminen LNCaP kehitettiin. Samalla hydrofiilinen /hydrofobinen lohko pituuden suhde, sarja polymeeristen misellien, joiden halkaisija on alle 60 nm, valmistettiin dialyysillä. Vakaa Kohdentamattoman PM ja kohdennettuja hiukkaset vakio huumeiden lastaus sisältöä saatiin lyhyen aikavälin vakauden määrityksissä. Luotettava lääkemäärän ja pitkään vapauttavina käyttäytyminen saatiin johtuen poistamisen ylikuormitettu huumeita.