Krooninen sairaus

tiivistelmä

nopea kehitys massaspektrometriaa on mahdollistanut arvioiden absoluuttisten pitoisuuksien poikki koko proteomeja, sallien kuulusteluun monia tärkeitä biologisia kysymyksiä. Tässä keskitymme määrällinen inhimillisen syöpäsolu aineenvaihdunta joka on rajoittanut vähäisyys saatavilla tietojen runsaudesta metabolisia entsyymejä. Yhdistämme tietoja viimeaikaisista absoluuttisten proteiinikonsentraatio analysoida tilastojen proteiinin runsauden kautta ihmisen aineenvaihdunnan verkkoon. Maailmanlaajuisesti, huomaamme, että entsyymien Glykolyysivaiheen kuuluu noin puolet kokonaismäärästä metabolisen proteiineja ja voi olla jopa 10% koko proteomiin. Sitten käyttää tätä analyysiä tutkia useat vielä ongelmia syöpää aineenvaihdunnan, mukaan lukien kulkeutumisen glykolyyttisen flux biosynteesissä, suhteellinen osuus typen rinnastamalla polkuja, ja alkuperä solu redox-potentiaali. Löydämme paljon koostumukseltaan olevissa malleissa tunnistaa useita ristiriitaisuuksia, ja löytää yleistyksiä, jotka ulottuvat nykyistä ymmärrystä. Yhdessä tuloksemme osoittavat, että suhteellisen yksinkertainen analyysi runsaasti metabolisia entsyymejä pystyi paljastaa monia oivalluksia järjestämistä ihmisen syöpäsolu metabolista verkon.

Citation: Madhukar NS, Warmoes MO, Locasale JW (2015 ) Organisaatio entsyymipitoisuuden poikki Metabolinen Network syöpäsoluissa. PLoS ONE 10 (1): e0117131. doi: 10,1371 /journal.pone.0117131

Academic Editor: Vasu D. Appanna, Laurentian University, Kanada

vastaanotettu: 16 syyskuu 2014; Hyväksytty: 19 joulukuu 2014; Julkaistu 26. tammikuuta 2015

Copyright: © 2015 Madhukar et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: CPC, Kinetic ja Gibss vapaa energiat toimitetaan täydentävä materiaali S1 ja S2 taulukot. LTQ proteiini kvantifiointi tiedot, joiden CPC tietoja käytetään tässä käsikirjoitus saadaan, on saatavilla osoitteessa: https://wzw.tum.de/proteomics/nci60.

Rahoittajat: JWL myöntää tukea National Institutes of Health ( https://www.nih.gov/) palkinnot CA168997 ja AI110613 ja International Life Sciences Institute. NSM tukivat Tri-Institutional harjoitusohjelma Laskennallisen biologian ja lääketieteen (https://www.triiprograms.org/cbm/), Ohjelman numero: 1T32GM083937. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Aineenvaihdunta perustavanlaatuinen osa solun fysiologian. Se mahdollistaa käsittelyä ravinteiden kemiallisen reaktion verkkoja, jolloin energian tuotanto ja biosynteettisten komponentteja ja sääntely signaalitransduktioprosesseista vaikuttamalla tasot aineenvaihduntatuotteiden, jotka ohjaavat toimintaa proteiineja. Sen tehtävänä on välttämätöntä ihmisten terveydelle ja poikkeava tila on ominaista monien sairauksien [1,2]. Määrällinen, ennakoiva ymmärrystä aineenvaihdunta on lukemattomia mahdollisuuksia [3-5], mutta on ollut rajoittaa tietojen puutteesta tasolla metaboliittitasoihin, entsyymi ilme, ja muutostilassa.

Yksi merkittävä rajoitus tässä järjestelmät tason ymmärrys johtuu puutteesta kvantitatiivisia mittauksia proteiinia runsaasti [6]. Absoluuttinen proteiinipitoisuus on välttämätöntä ymmärtämisen entsyymin kinetiikkaa ja sen vuoksi vuon kautta metaboliareitti [7]. Mistään kemiallinen reaktio, johon entsyymi, määrä, joka reaktio on verrannollinen entsyymin runsautta, mikä absoluuttinen pitoisuus entsyymin paikoista rajaa aineenvaihduntaan vuon ja toimii kohtuullisen arvion toiminnastaan ​​ja verrattuna muiden entsyymien kilpailussa ja substraatin, voidaan käyttää arvio suhteellisesta käyttö substraatille. Muut tekijät, kuten Michaelis-vakio ja vaihtuvuus ovat myös tärkeitä, mutta kukin näistä parametreista on riippumaton entsyymi konsentraatio. Siten analyysi proteiinin pitoisuuksien välillä ja sisällä reittejä ja, verrattuna entsyymejä, jotka käyttävät samalle alustalle, voi antaa arvion suhteellisesta vuot peräisin verrattuna entsyymejä.

Aikaisemmat tutkimukset ovat suorittaneet laajoja analyysejä transkription runsaasti metabolisen geenien [3]. Nämä tutkimukset ovat keskittyneet muutoksiin että mukana onkogeeninen transformaatio ja on kattamatonta oivalluksia polkuja, geenit, ja reaktioita, jotka ovat muuttuneet [1,3,8-11]. Kuitenkin se on myös osoitettu, että siellä on, monissa tapauksissa vain vaatimaton korrelaatio transkriptio ja proteiinin runsauden takia monet tekijät, kuten translaation sääntely ja proteiini vakauteen vaikuttavat suhde mRNA ja proteiini [12-14]. Lisäksi nämä tutkimukset ovat keskittyneet tuumorin normaali vertailuja sijasta pitoisuusjakaumat verkossa, joka on erilainen, mutta silti tärkeitä, biologia liittyy analyysinsa.

Advances in massaspektrometriaa perustuu proteomiikan sallineen perusteellisesti tunnistaminen ja kvantitointi nisäkkäiden proteomeja biologisista näytteistä [15-17]. Nämä tekniikat ovat myös sallittua arvioita proteiinin runsauden biologisista näytteistä käyttämällä regressiomallinnus. Näiden tietojen käsillä, se on sitten mahdollista arvioida jakelun proteiinin pitoisuuksien kautta metabolisen verkon ja tehdä määrällisiä arviointeja entsyymin runsaus poikki reittejä, sivukonttorissa kohdissa, joissa aineenvaihdunnan virtaamista eroavat, ja entsyymejä, jotka hyödyntävät yhteistä alustoille. Siksi suoritettu tämän analyysin ja paljasti useita yllättäviä tuloksia, jotka liittyvät järjestämisestä proteiinin pitoisuudet poikki ihmisen aineenvaihdunnan verkkoon.

Methods

Curation on metabolinen, Pathway-Based, Proteome

Ennen analyysimme käsittelimme NCI-60 solulinja paneeli, joka on joukko solulinjoja kehittää ja ylläpitää National Cancer Institute, jota on käytetty laajasti integroitujen molekyyli- analyysejä ja huumeiden herkkyys profilointi [18]. Proteomiikan kvantifiointi varten NCI- 60 paneeli tekee käyttämällä standardisoitua solun proteiini kopioluku (CPC) metrinen (ks S1 taulukossa), joka on johdettu Label Free kvantifiointi (LFQ) kvantifiointi alkaen Gholami ym. [19]. NCI-60 proteomiin aineisto sisältävä LFQ data on vapaasti saatavilla https://wzw.tum.de/proteomics/nci60. Aloitimme suodattamalla pois proteiineja CPC aineisto, joka havaittiin vain yksi näyte tai kudos tyyppiä. Nämä näytteen proteiinit sisälsi myös huomattavasti alhaisempi keskimääräinen CPC kuin kaikki muut näytteet (~ 3000 CPC vs 71000 CPC) osoittaa, että ne eivät ehkä ole merkityksellisiä tehdä maailmanlaajuisia ennusteita aineenvaihduntaan. Jokainen proteiini tähän luetteloon kartoitettiin 86 tunnettujen metaboliatiet käyttäen Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomit (Kegg, Release 69,0, 01 tammikuu 2014) kartoitus geenien polkuja. Mikä tahansa proteiini, joka on sisällytetty ainakin yksi reitti oli osa aineenvaihdunnan proteomin. Keskimääräinen CPC-arvot kaikkien solulinjojen kullekin aineenvaihdunnan ja ei-aineenvaihdunnan proteiinia käytettiin laskettaessa metabolisen prosenttiosuus. Reitti prosentit on laskettu samalla tavalla, vaikka yksi proteiini voi olla mukana useita eri reittejä pitkin, ja näin ollen summa kaikki prosentit tämä ei välttämättä tarkoita 100%. Jotta voidaan laskea erilaisten todennäköisyysjakauman toimintoja eri proteiinia luokkia, kaikki CPC mittausten poikki solulinjat syötetty PRISM (versio 6.03), jossa on standardoitu analyysin tietojenkäsittely bin keskuksia.

Glykolyysi Pathway Analyysi

kunkin proteiinin mukana Glykolyysi /Glukoneogeneesi reitin päässä Kegg tietokannasta, jakelun luokiteltiin CPC arvoja kaikissa solulinjoissa. Ydin glykolyyttisen reitin määriteltiin asteittaisen vaiheet, joiden kautta glukoosi syöttämällä Glykolyysivaiheen muunnetaan laktaatti tai voidaan ohjata useita eri biologisia reittejä. Jotta visualisoida eroista proteiinin laskee koko ydin Glykolyysivaiheen, väylän luotiin CytoScape (versio 3.1.1) koon solmujen vastaa keskimääräistä CPC kunkin proteiinien [20,21].

Branch Point Analysis

eristämiseksi aineenvaihduntareitit sisältäviä aluevaltaus vaiheet, käytimme Recon 2.2 stoikiometria matriisi erillistä reittiä, jossa yksi aineenvaihduntatuote toimi reagoivana useille eri reaktioita-nämä olivat määriteltiin meidän oksat [ ,,,0],22]. Koska jotkut oksat voi liittyä useampaan kuin yhteen reaktantti metaboliitiksi, me jätetty mitään toistoja etsiä tuotettu. Kunkin sarjan oksat (kutakin jolla on sama reagoivan aineen metaboliitti) me vain mukana aina kun kaikki katalysoivat entsyymit olivat mukana aineenvaihdunta proteomiin. Laskimme kahta tietoa siitä CPC: näiden haarautuvia entsyymejä, joista kukin perustuu lukumäärän harkita entsyymejä. Kaikille haarautuvan reittejä me sijoittui mukana entsyymejä perustuu niiden keskimääräinen CPC kaikissa solulinjoissa, jossa haarautuminen eroavuus (BD) Pisteet määritellään seuraavasti: For haarakohtiin jossa oli ainakin kolme erillistä tuotemahdollisuuksia, me redid tämä laskelma, tällä kertaa mukaan lukien kolme parasta paremmuusjärjestykseen entsyymien sijaan yksinkertaisesti alkuun 2.

Erotimme sitten haarautuu 2 lisäluokkia-meno kallellaan polkuja jossa aluevaltaus tulokset tuotti pisteet yläpuolella. 8, ja tasaisin polkuja, jossa alkuun 2 BD tilanne oli alle. 2 tai 3 ylimmässä BD tilanne oli alle 0. oksat suodatettiin varmistaa mitään reaktioita toistettiin jokaisessa sarjassa. Sillä molemmat haarat, joko ylä- 2 tai top 3 osallistuvien entsyymien riippuvaista siitä, minkä tyyppinen pisteet käytettiin erottamaan niitä, erotettiin ja kartoitettu niiden Kegg reittejä. Kunkin asetettu määrä entsyymeihin kuhunkin polku oli tiivistää ja Fischerin Exact Test tehtiin nähdä, onko mitään polkuja, jotka erosivat huomattavasti eri puolilla kaksi haaraumapareja. Suhteet lukumäärät lasketaan jakamalla määrä mukana Yksipuolinen entsyymeistä useissa jakaudu Entsyymit kullekin Kegg polkuja.

kofaktoripeptidi Analysis

määritellään oksidoreduktaaseja kuten proteiineja, jotka oli joko NADP + /NADPH tai NAD + /NADH lähtöaineen tai tuotteen. Sekä reagenssien ja tuotteiden sisällytettiin niin mahdollistaa proteiineja käänteisiä reaktioita. EY Numbers asianmukaiset reaktiot eristettiin käyttäen Braunschweig entsyymiä Database (BRENDA, Release 2014,2, heinäkuu 2014) tietokannasta ja sitten kartoitetaan niiden asianmukaisen UniProt (Release 2013_11) tai Entrez (julkaisupäivä 15 joulukuu

th 2013) tunnisteet [22] . Suoritimme samanlainen analyysi aminotransferaasien korvaamalla NAD yhdisteet α-ketoglutaraatin jotta seurata Typen käyttö koko solun. Graafisesti rikas esitys kofaktorin käyttö on luotu CytoScape.

Kinetic Parameter Analysis

Jokaisen metabolisen proteiinin käytimme BRENDA Database voi poimia kaikki kokeellisesti raportoitu K

M arvot. Simple Object Access Protocol (SOAP) liitännän saamiseksi käytettiin kineettiset ominaisuudet kaikkien aineenvaihdunnan proteiineja. Me sulkea kaikki arvot eivät viitattu kuin villityypin kokeilu (kuten K

M-arvot saadaan, kun proteiini mutaation) ja edelleen puhdistettu luetteloa lukuun ottamatta outlier mittauksia. Sitten käytettiin aiemmin julkaistu luettelo käytettävissä AG-° arvot [23] piirretty log

10 (CPC), log

10 (K

M), AG-o-arvot proteiineja josta meillä saanut kaikki kolme näistä muuttujista (ks S2 taulukko). Saat yhteyden analyysi, CPC, AG-° ja K

M-arvot skaalataan välillä 0 ja 1, sittemmin visualisoida CytoScape ja käsin jaettiin neljään ryhmään.

Tulokset

Global analyysi metabolinen Proteome

ilmentymisen tutkimiseksi ja määrän metabolisen proteiinien ensin koottu osajoukko liittyvien proteiinien aineenvaihduntaan. Meillä pitää viimeaikaisten tietojen joukko, joka hyödyntää syvä proteomic mittauksia poikki NCI-60 solulinja paneelissa ja regressiomallia arvioida proteiinin runsaussuuntaukseen massaspektrometriaa data (S1 taulukko) [19]. Määrittelimme aineenvaihdunnan proteiineja tahansa proteiinia valittu tunnetun metaboliareitti on Kegg tietokannassa [3,24]. Määrällisesti suhteellinen koko on osajoukko, huomasimme, että keskimäärin yli 59 solulinjat mitataan, aineenvaihdunnan komponentti osuus oli noin 18,5% koko proteomiin (Fig. 1a). Tutkinnan perusteella jakelu myös havaittu suunnilleen log normaalijakaumaa ja totesi, että jakelun metabolisen proteiinien seurasi suunnilleen samaa kaavaa kuin koko proteiinin jakelua (Fig. 1b).

(a) Ympyräkaavio diagraming kokonaisprosenttiosuus metabolisen proteiinien kaikissa solulinjoissa. Metabolinen proteiinit eriytetään eri värillä keskiösyvyys. (B) todennäköisyysjakauma funktio solun proteiinin kopio (CPC) arvot kaikki proteiinit ja metabolisen osajoukon-eri osa on merkitty eri väreillä. Log

10 arvot binned kanssa bin ero 10

0.3 ja suhteellinen taajuus, tai prosenttiosuus arvoja joutumasta että bin, piirrettiin.

Tarkastellaan proteiinit käsittävät metabolisia entsyymejä olemme järjestetty mukaisia ​​proteiineja 86 aineenvaihdunnan Kegg metaboliareitit heidät määrättiin. Koska yksittäinen proteiini on usein mukana useita biokemiallisia reaktioita, emme rajoittaa kunkin proteiinin yhden reitin, mutta lasketaan kunkin proteiinin koko kunkin väyliä, johon entsyymi kuului. Näistä 86 Kegg polkuja, löysimme 6 polkuja ei sisältynyt havaittu proteiineja eivätkä edelleen pitää näitä polkuja. Tämän perusteella jako pystyimme määrällisesti kokonaisproteiinin laskee ja osa kaikkia proteiineja, jotka olivat mukana tietyssä reitin poikki joukko solulinjoja (Fig. 2). Dramaattisesti, pitoisuudet glykolyyttisten entsyymien havaittiin olevan hyvin suuri, ja yhteensä johti lähes puolet proteiinin kokonaismäärästä jaetaan metabolisia entsyymejä soluissa. Tämä havainto saattaa vahvistaa oletuksen, että suurin osa aineenvaihdunnan vuon tapahtuu Glykolyysivaiheen ja Keski hiili aineenvaihdunta [1,25-29]. Tärkeää osallistuvia entsyymejä sitruunahappokierto (TCA) oli tyypillisesti suuruusluokkaa tai kahdella alemmalla ilmentymisessä kuin Glykolyysivaiheen ja nämä numerot paikka bounds juoksutteen voidaan ylläpitää jokaisessa näistä reiteistä. Muut keinot, joiden substraatteja ovat välittömästi johdettu glykolyyttisiä hiili-, kuten pentoosifosfaattireitin ja ne, joihin liittyy rasvahappojen synteesi-oli myös paljon pienempi proteiinin pitoisuudet kuin glykolyysin.

Kunkin jakelu mediaani, keskihajonnat, max ja min on ilmoitettu. Upotettavat sisältää suurennettu katsomaan reitit korkein prosenttiosuudet metabolista proteomiin.

Analyysi Glykolyysi

Havaitsimme, että osuus proteomin että syöpäsolut omistaa glykolyysistä kääpiötä määrän proteiinia omistettu muille metaboliareitit (Fig. 2). Tämä on erityisen merkittävä ottaen huomioon, että vain 32 proteiinit siirrettiin glykolyyttisellä reitin taas reittejä kuten puriinimetabolia, pyrimidiini aineenvaihdunta ja oksidatiivisen fosforylaation jaettiin ylöspäin 60 proteiineja. Vaikka vaihtelua esiintyy kaikkialla solulinjat, tämä analyysi osoittaa, että glykolyyttisissä proteiinit voivat muodostaa jopa 10% kaikista proteiineista syöpäsolu. Olemme myös havaita kaksihuippuisuutta jakeluun kaikkien glykolyyttisen proteiinien syntyy runsaasti hyvin ilmenevien proteiinien ja jotkut isoformit näytteille pienempi ekspressiotasoja (Fig. 3b). Tämä havainto sitten motivoi meitä tutkimaan tarkemmin järjestämiseen proteiinin ilmentymistä glykolyysissä. Tutkimme entsyymit polulle siinä järjestyksessä, että entsymaattisia reaktioita. Mielenkiintoista on, että ei-monotonista kaavaa etenemisen entsyymin tasot glukoosi metaboloituu glykolyysin, jolloin saatiin laktaattia, jonka huippu on fosforylaation glyseraldehydi-3-fosfaatti 1,3-biphosphoglycerate-katalysoivat glyseraldehydi-3-fosfaatti (GAPDH) -ja lisäksi myöhemmin huippu, joka tapahtuu konversio 2-fos- ja fosfoenolipyruvaattia-katalysoi enolaasi (Fig. 3c). Tämä ilmeisesti ei-satunnainen kuvio todennäköisesti on biologisia vaikutuksia, miten hoitotasapaino jaetaan koko polku ja mahdollisesti kuinka haara pistettä reitin koordinoidaan. Siksi pyrkimyksistä tämä hypoteettinen suhdetta entisestään.

(a) jakelu solun proteiinin kopio (CPC) arvot kaikille glykolyyttisissä /glukoneogeenisistä proteiineja kaikissa solulinjoissa. Kunkin proteiinin mediaani, keskihajonnat, max ja min on ilmoitettu. (B) todennäköisyys kertymäfunktio CPC arvot kaikille aineenvaihdunnan proteiineja ja glykolyyttisen /glukoneogeenisistä osajoukon-eri osa on merkitty eri väreillä. Arvot binned kanssa bin ero 10

0,2 ja suhteellinen taajuus, tai prosenttiosuutta arvojen joutumasta että bin, piirrettiin. (C) Distribution of 11 glykolyyttisen proteiinien peräkkäisessä reitin järjestyksessä. Keskus piste kuvaa keskimääräistä CPC arvon jokaiselle proteiini baareja osoittaa max ja min mittauksia kaikissa solulinjoissa. (D) Pathway kaavio Glykolyysivaiheen toimintaa. Sininen neliö osoittaa haarautuvia muita biologisia polkuja, sininen laput osoittavat väli aineenvaihduntatuotteita, ja violetti ympyrät osoittavat reagoivat entsyymit. Koko violetti ympyrä on verrannollinen keskimääräiseen CPC arvon kyseiselle entsyymin kaikilla solulinjoissa.

Lukuisat pistettä pitkin glukoosin konversio laktaatti esiintyä jolloin alusta voidaan ohjata toiseen polku ja siten toinen lopputuote. Itse asiassa monet ovat ehdottaneet, että tehostettu glukoosiaineenvaihdunnan havaittu syöpäsolujen on seurausta metabolisen sopeutumista lisätä kulkeutumisen glykolyyttisen välituotteiden biosynteesireiteissä [1,3,30,31]. Tutkia, missä määrin glykolyyttisissä vuo voidaan ohjata muuta tuotetta kuin laktaatti, vertasimme glykolyyttisellä entsyymi intensiteetti tasolle tasot haaran pisteen (BP) entsyymien toimivat samalle alustalle (Fig. 3d). Olemme havainneet, että koko glykolyysin ilmentymistasojen BP entsyymit olivat huomattavasti alhaisemmat kuin entsyymit, jotka vastaavat pääasiassa kautta. Mielenkiintoista oli kuitenkin, että tietyissä haara pistettä, kuten yhden peräisin 3-fosfoglyseraatti-, ilmaus entsyymin, joka katalysoi sitoutunut vaiheessa haaraan anabolisten polku oli vertailukelpoinen ja joissakin tapauksissa oikeassa suhteessa ekspressiota vastaavaa entsyymiä glykolyysiin . Erityisesti tämä tapahtuu phosphoglyceromutase (PGAM) vaiheen Glykolyysivaiheen jossa 3PG voidaan edelleen metaboloituu pitkin Glykolyysivaiheen tai sitä voidaan ohjata de novo seriini synteesiä hapettamalla kautta fosfoglyseraattidehydrogenaasia (PHGDH). Vaikka keskimääräinen pitoisuus PHGDH oli pienempi, monissa syöpäsolulinjoissa pitoisuus PHGDH oli verrattavissa tai jopa korkeampi kuin PGAM joissakin tapauksissa.

Global Branch Point Analysis

Kun otetaan huomioon, mielenkiintoisia havaintoja havaitsimme glykolyysissä, meidän vieressä pyrittiin järjestelmällisesti arvioida proteiinipitoisuus rakenteen kautta ihmisen aineenvaihdunnan verkkoon. Analysoidakseen suhteelliset tasot BP entsyymien ulkopuolella ytimen glykolyyttisen reitin, käytimme Recon 2 tietokannan poimia kaikki pisteet tunnetuissa metaboliareitit jossa BP tapahtunut. BPS suodatettiin sisältämään vain ne, jotka sisälsivät proteiineihin havaittu kvantitatiivisia proteomiikan aineisto. Tämä suodatus johti 251 BPs ainakin kahden mitattu entsyymejä, ja 105 ainakin kolme. Kunkin BP, laskimme kaksi erillistä Branch Divergence tulokset (Fig. 4a, katso menetelmät) perustuu joko ylä- kaksi tai kolme pisimmälle ilmaistu osallistuvien proteiinien haaran. Ensimmäinen pisteet käsitteli osa proteiinipitoisuus korkeimmalla runsas proteiinin mukana haara verrattuna toiseksi korkein proteiinia. Toinen pidetään osa proteiinipitoisuus korkeimmalla runsaasti proteiinia, joka liittyy haara verrattuna toisen ja kolmannen korkein proteiinia. Tarkastuksen Näiden pisteiden (Fig. 4c) paljasti ei-Gaussin jakauman huippu lähellä yhtä ensimmäistä metrinen (Fig. 4b). Sillä pisteet, joka pidetään kahden korkeimman ilmaisi proteiineja, todettiin, että jakelu oli korkeimmillaan yksi ilmaisee, että yleisin esiintyminen tapauksissa BP pitkin ihmisen aineenvaihdunnan verkko oli, kun proteiini tasot olivat keskittyneet pitkin yhtä hallitseva reitin aineenvaihduntaan. Kuitenkin havaittiin myös, että monia poikkeuksia olemassa jakelu näytteillä pitkä häntä riittävän tiheyden lähellä nollaa. Tarkastuksen histogrammin toisen metristä (Fig. 4c) paljasti samankaltainen rakenne kanssa selvä ero osoittaa, että hännän, proteiini pitoisuuksia jakautuneet useiden entsyymien ja siten läpi useita reittejä. Me tutkimme seuraavaksi joka väyliä ovat yleensä proteiineja jakautuu tasaisesti haara pistettä ja jotka yleensä on ilmaus esiintyy yhdellä reitillä. Todettiin, että haara pistettä hallitseva reitti, reitit, joihin liittyy rasvahappojen biosynteesi, rasvahappojen aineenvaihduntaan ja alaniini aineenvaihdunta Yleisimmin havaittu. Tämä havainto on ilmeistä sekä tilastot (Fig. 4d) ja suhde laskee (Fig. 4e). Sillä väyliä proteiini jakautuu tasaisesti koko haara pistettä, ainoa tilastollinen signaali havaittu oli puriinimetabolia, ilman muita tilastollisia signaaleja yhteisiä väyliä havaittavan viittaa siihen, että nämä navat olivat hajallaan satunnaisesti koko aineenvaihdunnan verkkoon.

( a) kaavio selventää menetelmää laskemiseksi eri Branch Divergence pisteet 2 eri olosuhteissa. Orange neliöt osoittavat reaktantin ja tuotteen aineenvaihduntatuotteiden sininen soikio osoittaa reagoivat entsyymit. (B) Histogrammi Branch Erot Pisteet perustuvat päälle 2 arvoihin. Jokainen säiliö on alapäässä inclusive bin kokoa 0,1. (C) Histogrammi Branch Erot Pisteet perustuvat top 3 arvoihin. Jokainen säiliö on alapäähän inclusive bin kokoa 0,1. (D) Plot osoittaa p-arvot väyliä jotka ovat merkittävästi erilaiset laskee in yksipuolista ja tasaisin reitit (määritellään p-arvo 0,05). (E) suhde yksipuolinen laskee tasapuolisesti jakautunut laskee merkittäviä polkuja.

kofaktoripeptidi Analysis

Toinen tärkeä johtopäätös, joka voidaan vetää tämän tyyppinen aineisto olisi miten tietyt kofaktoreita tai ratkaiseva alustat jakautuneet tiettyjä entsymaattisia reaktioita. Tutkimme jakelua entsyymejä käytetty tiettyjä kofaktoreita, ja pidetään analyysi ratkaiseva solun aineenvaihdunnan toimintoihin mukaan lukien palkan redoxpotentiaalin mukana sekä keskeisiä kofaktoreita NADH ja NADPH ja rinnastaminen typen.

Ensin yritettiin analysoida suhteellinen käyttö typen, tai jotka aminotransferaasit olivat yleisimpiä solussa. Käyttämällä BRENDA tietokantaa me eristää kaikki aminotransferaasit havaitsemia sisällä aineisto, ja totesi, että joukossa runsaimmin entsyymit olivat GOT2, GLUD1, ja IDH2 (Fig. 5). Yhdessä tämä havainto tunnistaa keskeiset solmut typen assimilaatio. Seuraavaksi me pidetään hyödyntämistä kofaktorien mukana hapetus ja pelkistys, NADP

+ /NADPH, ja NAD

+ /NADH. Ensin katsotaan NAD

+ /NADH ja todettu, sopusoinnussa havaintomme että glykolyyttisiä entsyymit kuuluvat runsain entsyymejä soluissa, että GAPDH ja LDH käsitti suurimman osan proteiinipitoisuus käytetään NADH välittämän redox kytketty reaktioita soluissa. Alempien runsaus olivat ne entsyymit osallistuvat TCA sykli ja biosynteettisiä ja ylläpito reaktioita sekundaarimetaboliassa. NADPH, viimeaikaiseen toteamukset ovat tunnistaneet hapettumista folaatit merkittävänä lähteenä solun NADPH, entsyymi MTHFD on eräs yleisin entsyymejä, jotka syntetisoivat NADPH [32]. Suurkuluttaja NADPH oli rasvahapon nopaliinisyntaasin (FASN), joka on sopusoinnussa tarve

de novo

lipidisynteesiin käytetään solukalvon muodostumista nopeasti leviämisen soluissa. Sekä suurkuluttajat (LDHA, FASN) ja tuottajien (GAPDH, MTHFD ja MDH2) NAD (P) H kohdistuu merkittäviä tutkimustyötä huumeiden tavoitteet syöpää vastaan ​​[11,33-36].

Verkon kaavio glykolyysin havainnollistaa runsaasti aminotransferaasien ja entsyymejä, jotka käyttävät NAD (P) /NAD (P) H: ta kofaktorina. Koko solmujen vastaa keskimääräistä runsaasti proteiineja.

korrelaatiot kineettiset parametrit

Viime kädessä voidaan todeta, että, että reaktionopeus tai vuon kautta pisteeseen metaboloituu ei ainoastaan ​​entsyymin pitoisuuden, mutta kineettiset parametrit ja termodynamiikka kemiallisten yhdisteiden mukana reaktiossa samoin. Näitä parametreja ovat Michaelis-vakio (K

M) ja standardi Gibbs vapaa energia (AG-°) reaktioiden (S2 taulukko). Siksi tutkittiin niiden välinen suhde perusparametrit. Yllättäen ei korrelaatiota keskimääräisen proteiinin taso ja AG-° (Fig. 6a), K

M arvot ja AG-° (Fig. 6b), ja keskimääräinen proteiinin taso ja K

M-arvot (Fig. 6c) havaittiin. Saadakseen lisänäyttöä suhde näiden kolmen muuttujan, myös visualisoida nämä kolme muuttujaa yhdessä kunkin entsyymiä. Käyttämällä tätä lähestymistapaa me erottaa 4 ryhmää (Fig. 6D). Suurin osa entsyymien värjätä tällä tavoin oli kohtalainen AG-°, K

M arvot ja proteiinin kopio numerot (ryhmä 1) ja olivat siksi vastuussa yleisestä välisen korrelaation puuttuminen näiden kolmen muuttujan. Tämä havainto on vastakohtana aiemmin oletetaan, että suurempi proteiini pitoisuuksia tarvitaan reaktiot lähellä tasapainoon [37]. Lisäksi tämä analyysi on myös vahvaa näyttöä siitä, että kukin näistä keskeisistä muuttujien solun metabolisen reaktio on kytketty irti mahdollistaa itsenäisen virityksen näiden kolmen parametrit kehittymisestä ihmisen aineenvaihdunnan verkkoon. Myös tämä puute korrelaatio viittaa siihen, että kaiken proteiinin ilmentyminen on tunnusomaista reaktionopeus, koska K

M ja AG-° jokaisen reaktion, jossa tietyn proteiinin pitoisuus ilmestyy korreloimattomia. Oli kuitenkin muutamia poikkeuksia tähän yleiseen sääntöön. Ensinnäkin, proteiinit ryhmän 2 (Fig. 6D) vastasi pitkälti aiemmin mainittu glykolyyttisissä proteiinit ilmeisesti ilman suuria K

M tai erittäin alhaiset AG-° arvoista. Tämä vastaa käsitystä, että nämä proteiinit on erittäin ilmaistaan ​​varmistaa korkea glykolyyttistä flux, jotka voivat johtaa kertyminen glykolyyttisen välituotteiden ja myöhemmin parantaa vuon osaksi eri biosynteesireitin oksat. Kaksi muuta ryhmää (ryhmä 3 ja 4) sisälsi entsyymejä joko erittäin suuri K

M-arvoja tai erittäin alhainen AG-°. Äärimmäinen K

M-arvot osoittavat, että nämä entsyymit tarvitsevat huomattavan kertyminen alustoille, jotta tuloksena tuntuvasti eteenpäin vuon taas reaktiot hyvin alhainen AG-° ovat erittäin peruuttamattomia reaktioita. Itse asiassa kolme entsyymit suuret K

M-arvot (GNPDA, GPT2 ja GART) suoraan valua glykolyyttisissä välituotteiden osaksi biosynteesireiteissä taas kolme entsyymien hyvin alhainen AG-° (ATIC, PPAT ja QPRT) hyödyntävät fosforibosyylitransferaasin difosfaatti (PRRP) johdettu pentoosifosfaattireitin NAD (P) H ja nukleotidisynteesiä. Myös useita entsyymien ryhmään 3 (GLS, NAGS, OAT, GOT1 ja ASL) osallistuvat arginiini, aspartaatti, glutamiinia aineenvaihduntaa, jonka aineenvaihduntatuotteet ovat joitakin korkein solunsisäisten pitoisuudet ja /tai virtaamista.

( a) sirontakuvaajan tukin keskimääräisen K

M ja AG-° arvo jokainen piste edustaa eri aineenvaihdunnan proteiinia. (B) sirontakuvaajaan tukin keskimääräisen solun proteiini kappale (CPC) ja AG-o-arvot Jokainen piste edustaa eri aineenvaihdunnan proteiinia. (C) sirontakuvaajaan tukin sekä keskimääräisen K

M ja keskimääräinen CPC arvoa Jokainen piste on eri aineenvaihdunnan proteiinia. (D) Connectivity analyysi CPC, AG-° ja K

M arvot erilaisia ​​entsyymejä.

Keskustelu

On tärkeää huomata, että nämä analyysit suoritettiin tietoihin kerätään paneelin syöpäsolulinjoja sen sijaan, että ihmisen kudosta ja siten tämän analyysin tulokset on edeltävät joukon varovaisuudella. Vaikka analyysejä solulinjoissa voi usein valottaa yleistä solujen käsitys, on suuri metabolinen monimuotoisuus eri kudosten tyyppejä, jotka voivat vaikuttaa tulokseen tahansa globaalin proteomiikka-analyysi. Esimerkiksi cardiomyocytes arvellaan purkaa enemmistön energiansa rasvahappojen hapettumista ja noin 50% niiden tilavuudesta on käytössä mitokondrioiden [39]. Lisäksi sen on osoitettu, että tiedotusvälineet käytetyt olosuhteet kudosviljelmässä on merkittäviä ellei hallitseva vaikutukset solujen aineenvaihduntaan ja vaikutus entsyymiaktiivisuus [38-40]. Niinpä erityisiä edellytyksiä solulinjan ja mikroympäristön muuttaa jakautumista proteiineja. Selvitys kuitenkin proteiinin runsauden verkossa tarjoaa oivalluksia konkreettisia esimerkkejä siitä, kuinka nisäkkään syöpäsolujen jaella entsyymikonsentraati-

Kaiken kaikkiaan pidetään analyysi proteiinipitoisuus metaboliaentsyymien poikki ihmisen syöpäsolu metabolista verkon monipuolinen määrä soluja. Tämä analyysi osoittaa, että suhteellisen yksinkertainen laskutoimitus ja arviointi voi tuottaa useita oivalluksia järjestämistä syövän metabolisen verkkoon. Toisin kuin aiemmin käsitteitä, metaboliaentsyymeistä eivät näytä olevan enempää ilmentyy voimakkaasti kuin mikään muu proteiini soluissa. Suurin poikkeus on Glykolyysivaiheen, jonka osuus jopa 10% koko solun proteomiin. Merkittävä jakaminen proteiinipitoisuus yhden metaboliareitti korostaa sen keskeisyys hyödyntäminen suurten MAKRORAVINTOAINEEN, glukoosia, jota käytetään energialähteenä. Se tarjoaa myös oivalluksia suuri vuot, joita havaitaan Glykolyysivaiheen ja miten nämä vuot voi olla niin nopea. Havainto asettaa kyseenalaiseksi myös monia valvontamekanismeja, joita on ehdotettu säännellä Glykolyysivaiheen. Esimerkiksi, on todennäköistä, että monissa tapauksissa, post-translaation modifikaatioita, kuten asetylaatio tai fosforylaation ei ehkä ole suurta sääntelyn rooleja, koska niiden stoikiometria on rajoitettu pieni määrä kinaasien ja ase- tyylitransferaaseja, jotka on ilmaistu suorittaa nämä reaktiot.