Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

On ollut ristiriitaisia ​​tietoja koskien toimintaa miR-20a eri syöpätyyppien ja me aikaisemmin todennut sen olevan väärin säädellystä satunnaisissa versus familiaalinen papillaarisen kilpirauhassyöpä . Tässä tutkimuksessa tutkittiin ilmaus miR-20a normaalissa, hyvän- ja pahanlaatuiset kilpirauhasen näytteitä, ja sen vaikutus kilpirauhasen syöpäsoluja

in vitro

ja

in vivo

.

Menetelmät /Principal havainnot

ilmentyminen miR-20a normaalissa, hyvän- ja pahanlaatuisten kilpirauhaskudokseen määritettiin kvantitatiivisen RT-PCR. Kilpirauhassyöpä solut transfektoitiin miR-20a ja vaikutus soluproliferaation, kasvaimen pallomainen muodostumista, ja invaasio arvioitiin. Kohdegeenien miR-20 määritettiin genominlaajuisten mRNA-ekspression analyysi miR-20a yli-ilmentymisen kilpirauhasen syöpäsoluja ja kohde ennustus tietokantaan. Kohdegeenien todensi kvantitatiivinen PCR ja immunoblottauksen ja Lusiferaasimäärityksiä. MiR-20a ilmentyminen oli merkitsevästi korkeampi anaplastinen kilpirauhassyöpä kuin eriytetty kilpirauhassyöpä, ja hyvänlaatuisia ja normaali kilpirauhasen kudoksia. MiR-20a ehkäisi merkittävästi kilpirauhassyöpä soluproliferaatiota

in vitro

(p 0,01) ja

in vivo

(p 0,01), kasvaimen pallojakaantuminen muodostumista (p 0,05) ja invaasio (p 0.05) useita kilpirauhassyöpä solulinjoissa. Huomasimme, että

LIMK1

oli tavoite miR-20a kilpirauhassyöpä solulinjoissa ja suora knockdovvn LIMK1 kertasi vaikutuksen miR-20a kilpirauhasen syöpäsoluja.

Johtopäätökset /Merkitys

Tietääksemme tämä on ensimmäinen tutkimus osoittaa, että miR-20a on rooli tuumorisuppressorina kilpirauhasen syöpäsoluja ja tavoitteet

LIMK1

. Meidän tulokset viittaavat siihen ilmen- tymisen lisääntymisen ilmaus miR-20a anaplastinen kilpirauhassyöpä ehkäisee kilpirauhassyöpä etenemiseen ja voi olla terapeuttista potentiaalia.

Citation: Xiong Y, Zhang L, Kebebew E (2014) MiR-20a taso nousee Anaplastic kilpirauhassyöpä ja tavoitteet

LIMK1

. PLoS ONE 9 (5): e96103. doi: 10,1371 /journal.pone.0096103

Editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kiina

vastaanotettu: 31 tammikuu 2014; Hyväksytty: 03 huhtikuu 2014; Julkaistu: 23 toukokuu 2014

Copyright: © 2014. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat National Institutes of Health, National Cancer Institute. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kilpirauhassyöpä on yleisin hormonitoimintaa syöpä ja yksi nopeimmin kasvavista syövän diagnoosit Yhdysvalloissa [1], [2]. Kilpirauhassyövän peräisin follikulaarisen soluista ja parafollicular solut [3], [4]. Kilpirauhassyövän peräisin munarakkuloiden soluista yli 95% kaikista kilpirauhassyöpä tapauksissa ja luokitellaan neljään suurta histologinen ryhmää (papillaarinen kilpirauhassyövän (PTC), follikulaarinen kilpirauhassyöpä (FTC), Hürthle karsinooma (HCC), ja anaplastinen kilpirauhassyöpä (ATC)). MikroRNA (miRNA) on osoitettu olevan väärin säädellystä sisään kilpirauhassyövän peräisin follikulaarinen soluista [5] – [7]. MiRNA ovat pieniä, ei-koodaavan RNA: t, jotka ovat noin 21 nukleotidiä pitkä ja säädellä geeniekspressiota [8], [9]. Yleensä miRNA sitoutuvat 3′-transloimaton alue (3′-UTR) kohdegeenin, joka johtaa tukahdutettua käännöksen tai mRNA: n hajoaminen [9], [10].

MiR-20a on jäsen ja miR-17-92 klusteri sijaitsee kromosomissa 13. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että miR-20 voi toimia edistää tai estää tunnusmerkkejä pahanlaatuisten solujen fenotyypin solutyyppispesifisellä tavalla [11] – [13]. Esimerkiksi miR-20a yliekspressio estää solujen lisääntymisen, invaasio ja kasvaimen etäpesäke rintasyövän solulinjoissa [11], [12]. Toisaalta, miR-20a vaimentaa

E2F1

ilmentymistä ihmisen B-solulinjaa P-493-6, transkriptiotekijä, joka edistää G1-vaiheesta S-vaiheeseen etenemisen nisäkässoluissa [14]. Tämä havainto viittaa siihen, että miR-20a toiminto saattaa olla erilainen riippuen solutyypistä. Olemme aiemmin havaittu miR-20a voimistuvan vuonna familiaalinen PTC verrattuna satunnaisia ​​tapauksia, joiden arvellaan olevan aggressiivisempi [3], [15]. Takakura et ai. [16] havaitsivat myös, että miRNA on miR-17-92 klusteri (miR-17-3p, -17-5p, -18a, -19a, -20a, -19b, ja -92-1) on yli-ilmennetään ATC solussa linjat.

tässä tutkimuksessa olemme luonnehtia ilmaus miR-20a normaalissa, hyvän- ja pahanlaatuiset kilpirauhasen näytteitä, ja tutkitaan sen vaikutus kilpirauhasen syöpäsoluja

in vitro

ja

vuonna vivo

. Olemme myös suorittaa analyysi miR-20a kohdegeenien käyttämällä kohde ennustamista tietokantaa ja genominlaajuisten ilmaisutapoja miR-20a yli-ilmentymisen, ja validoitu kohdegeenien kanssa lusiferaasianalyysissä. Lopuksi osoitamme, että LIMK1 esitetään yhteenveto vaikutukset miR-20a kilpirauhasen syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Human kilpirauhasen kudosnäytteitä ja eläinkokeista

Kilpirauhasen kudosnäytteet jäädytettiin ajankohtana kilpirauhanen alla pöytäkirjan hyväksymä Office of ihmiskoe National Institutes of Health Clinical Center, kun kirjallinen suostumus. Kaikki kudosnäytteet kävivät toissijainen ylimääräistä histologia tarkistettavaksi hormonitoimintaa patologi diagnoosin varmistamiseksi ja tunnistaa näytteitä yli 80% kasvainsoluja. Kudosnäytteet luokiteltiin normaali, hyvänlaatuinen (monikyhmyinen struuma, follikulaarinen adenooma, Hürthle solu adenooma), kilpirauhassyöpäpotilailla [DTC] (klassinen PTC, follikulaarinen variantti PTC, FTC), ja ATC. Normaali kilpirauhaskudokseen saatiin potilailta, joille suoritetaan kilpirauhanen varten hyvän- tai pahanlaatuinen tauti contralateral kilpirauhasen koru. Kaikkiaan 8 ATC, 22 DTC, 24 hyvänlaatuinen, ja 11 normaali kilpirauhaskudokseen näytettä analysoitiin.

The National Cancer Institute Animal Care ja Käytä hyväksyi pöytäkirjojen eläinten hoito ja käsittely tässä tutkimuksessa. Jokainen hiiri kokee merkittävästi poikkeava neurologisia oireita, verenvuoto kuristimia, heikentynyt liikkuvuus, nopea painon lasku, heikentäviä ripuli, karkea turkki, kyyryssä asento, hengitys työlästä, uneliaisuus, jatkuva recumbence, keltaisuus, anemia, itseaiheutettu trauma, tulee kuolemaisillaan tai muuten ei kykene saamaan ruokaa tai vettä, tai kasvain 2 cm tai enemmän halkaisijaltaan on heti eutanasia CO

2 kammiossa.

Solulinjat ja viljelyolosuhteet

Human kilpirauhasen syöpäsolun linjat XTC-1 (HCC) (ystävällisesti tri Orlo H. Clark (San Francisco, CA)) [17], FTC-133 (FTC) (ystävällisesti Dr. Peter Goretzki (Saksa)), ja TPC-1 (PTC) (ystävällisesti toimittanut Dr. Nabuo Satoh (Japani) [18]) pidettiin DMEM: ssä, jossa on 4500 mg /l D-glukoosia ja L-glutamiinia, ja 110 mg /l natriumpyruvaattia, johon on lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), kilpirauhasta stimuloiva hormoni (TSH) (10 mU /ml), penisilliiniä (10000 U /ml), streptomysiiniä (10000 U /ml), Fungizonea (250 mg /ml) ja insuliini ( 10 ug /ml) standardin kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa 5% CO

2 ja 95% O

2 ilmakehässä. Seerumittomassa elatusaineessa (DMEM-F12-alusta), johon oli lisätty neljä hormonien (insuliini [10 ug /ml], somatostatiini [10 ng /ml], transferriini [5 ug /ml], ja hydrokortisoni [0,36 ng /ml]), käytettiin funktionaalisen genomiikan tutkimuksessa. Ihmisen ATC solulinja C643 luovutti ystävällisesti Dr. Rebecca Schweppe, luvalla Dr. N.-E. Heidin (Ruotsi) [18], ja pidettiin RPMI (Invitrogen, Carlsbad, CA), joka sisälsi 10% FBS: ää. Kaikki solulinjat todistaa oikeaksi lyhyitä tandem repeat 9. lokakuuta 2013 ja XTC-1-solulinjassa myös vahvistettiin ilmaista tyreoglobuliinin ja Natriumjodidi symporter kuten aiemmin raportoitu [17].

Mirna transfektion

Kypsät miRNA esiaste (pre-miR-20a; Applied Biosystems, Foster City, CA) transfektoitiin soluihin pitoisuutena 25 nM käyttäen Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA), seuraten valmistajan protokollaa. Oligonukleotidi ei aiheuta mitään tiedossa miRNA (Pre-miR miRNA prekursorimolekyylit-Negative Control # 1, Applied Biosystems, Foster City, CA) käytettiin negatiivisena kontrollina.

siRNA transfektion

LIMK1 siRNA #A (ID s8188), siRNA #B (ID s8189) ja siRNA #C (ID s 8190) (Applied Biosystems, Foster City, CA) transfektoitiin soluihin pitoisuutena 60 nM käyttäen Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad , CA), seuraten valmistajan protokollaa. Äänenvaimennin Valitse Negative Control # 1 siRNA (Applied Biosystems) käytettiin negatiivisena kontrollina.

RNA: n eristys ja kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR

Kokonais-RNA eristettiin solulinjoista käyttämällä TRIzol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA). Taqman miRNA Assay (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) käytettiin mittaamaan miRNA ekspressiotason. Kokonais-RNA käänteistranskriptio miRNA-spesifistä aluketta, mitä seuraa reaaliaikaisella PCR: llä, jossa TaqMan-koettimia. U6 käytettiin endogeenista ohjaus. Suhteellinen määrä mRNA

LIM kinaasi 1

(

LIMK1

) määritettiin käyttäen TaqMan Pitoisuus (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) ABI 7900 HT järjestelmä, ja ihmisen

GAPDH

käytettiin endogeenista ohjaus. ΔΔ Ct menetelmää käytetään laskettaessa ekspressiotasoja.

Western blot

Koko-solulysaatti valmistettiin RIPA-puskurilla (Thermo Scientific, Rockford, IL). LIMK1 proteiinin taso määritettiin Western blot käyttäen kaniinin polyklonaalista anti-LIMK1-vasta-ainetta (1:1500 laimennus; Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA). GAPDH proteiini havaittiin käyttämällä hiiren monoklonaalisia anti-GAPDH (# 0411) vasta-aineen (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).

Proliferaatiomääritys

Solujen proliferaatio määritettiin käyttäen CyQuant Cell proliferaatiotesti (Invitrogen, Carlsbad, CA), mukaisesti valmistajan protokollaa. Fluoresenssin intensiteetti mitattiin fluoresenssi mikrolevynlukijaa (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), jossa eksitaatio 485 nm ja emissio-detektiota 538 nm: ssä.

Invasion määrityksessä

Cellular hyökkäystä mitattiin käyttäen BD BioCoat matrigeelin Invasion jaosto (BD Biosciences, Bedford, MA), mukaan valmistajan ohjeiden. Soluviljelmän elatusainetta 10% FBS: ää käytettiin kemoattraktantti alempi hyvin Boyden-kammion. Uudelleenhydratoinnin jälkeen tyvikalvon, kilpirauhasen syöpä soluja siirrostettiin ylempään osastoon kammion seerumivapaassa väliaineessa (4 x 10

4 solua per kuoppa). Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa 22 tuntia, ei-tunkeutuvat solut poistettiin ylemmältä pinnalta, ja solut, jotka olivat tunkeutuneet kalvon alapintaan värjättiin Diff-Quik Stain Set (Siemens Healthcare Diagnostics, Inc., Newark, DE). Kuvat otettiin kalvon kunkin insertin mikroskoopilla (50-kertainen suurennus) käyttäen digitaalikameralla. Kuvat otettiin katsellaan tietokoneen näytöllä ja solut yksittäisillä aloilla kunkin insertin käsin laskettiin. Solujen prosenttiosuus tunkeutuvat määritettiin laskemalla solujen lukumäärä tunkeutuvat läpi Matrigel matriisi ja membraanin suhteen liikkuvien solujen lukumäärä kalvon läpi ohjaus inserttien ilman Matrigel matriisi. Invaasio indeksi laskettiin suhde prosenttia hyökkääviä solujen jaettuna prosenttia tunkeutuvat soluihin kontrollisolujen.

Sferoidiviljelmiä kulttuuri

Kaksi päivää sen jälkeen miRNA transfektion FTC-133-solut trypsinoitiin, laskettiin uudelleen suspendoitujen elatusaineissa ja levytettiin Ultra Low Cluster levy (Costar, Corning, NY) 3,5 x 10

4 kuoppaa kohti. Levyjä viljeltiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2, ja väliaine vaihdettiin joka 2-3 päivä. 2 viikon kuluttua viljelyn jälkeen solut värjättiin Crystal Violet ja valokuvattiin mikroskoopilla. Yhteenlaskettu pinta-ala pallosia kuvan sisällä mitattiin ympäröimällä kehä kunkin sferoidi, merkintä koko alueella, ja laskemalla pikselin numeroita ImageJ ohjelmistoa (Maryland, USA).

-tuumoriksenografti tutkimukset

FTC-133-solut transfektoitu miR-20a tai miR-NC ympättiin ihonalaisesti (10

5 elävät solut) vasemmassa ja oikeassa kyljet Kateenkorvattomien nude-hiirten. Kasvaimet mitattiin kaksi kertaa viikossa jarrusatulat, ja tilavuudet laskettiin pituus x leveys x korkeus. Ruumiinavaus kasvainnäytteet valokuvattiin dokumentoida brutto morfologia, ja sen jälkeen näytteet punnittiin.

migraatiokokeessa

kilpirauhassyöpä solujen vaeltamiseen arvioitiin käyttämällä scratch-haavan määrityksessä. 150000-solut transfektoitiin miRNA (25 nM) tai siRNA: ita (60 nM) ja maljattiin kuuden kuoppalevyille ja annettiin kiinnittyä ja kasvaa 44 tunnin ajan (miRNA) tai 72 tuntia (siRNA: t). Sen jälkeen kolme pystysuoraa haavat tehtiin steriilillä 10-il pipetin kärki ja vaakasuora viiva tehtiin yli kolme riviä, jotta solut voitiin havaita samassa pisteessä. Solut tutkittiin 12 tunnin välein ja mittaukset jopa 24 tuntia.

Genominlaajuiset mRNA: n ekspression array

FTC-133-solut transfektoitiin miR-20a ja miR-NC. Kolme päivää transfektion jälkeen solut kerättiin. Kokonais-RNA uutettiin soluista käyttäen Trizol (Invitrogen, USA). RNA laatu varmistettiin käyttämällä Agilent RNA 6000 Nano Kit ja Bioanalyzer 2100. Sata viisikymmentä nanogrammaa kokonais-RNA: ta käytetään suorittamaan cDNA Käänteistransskription synteesi, vahvistus, pirstoutuminen, ja terminaali merkintöjen kanssa GeneChip- WT Sense Target merkintöjen ja valvonnan reagenssit (Affymetrix, Santa Clara, CA). Noin 25 ng /ul: n cDNA hybridisoitui Affymetrix Human Gene 1,0 ST Array GeneChip. Taulukot pestiin ja värjättiin käyttäen fluidistori- protokollaa FS450_0007 menettelynä Affymetrix Fluidics Station 450. koetin intensiteetit skannattiin GeneChip Scanner 3000. raakadataa normalisoitui ja analysoitiin Partek Genomic Suite (Partek, Inc., St. Louis , MO). Varianssianalyysi käytettiin määrittämään anturin sarjaa, jotka olivat merkittävästi erilaisia ​​ryhmien välillä. Geeni lista suodatettiin taitettavalla muutos cutoff 1,5, jolloin tuloksena on lähtö merkittävä ero ilmentymisen p≤0.05 ja 1,5-kertaisesti tai enemmän eroja.

ennusteet mikro-RNA-kohteiden

TargetScan 5,1 (https://targetscan.org/) käytettiin tunnistamaan potentiaalisia miR-20a sääntelyn kilpirauhasissa.

lusiferaasireporttiterilla määritys

1223 emäsparin 3 ’ -UTR ihmisen

LIMK1

kloonattiin tyhjään lusiferaasireportteri- vektori pEZX-MT01 (GeneCopoeia, Rockville, MD), muodostetaan villityyppisen

LIMK1

UTR lusiferaasireportteri- konstruktilla (pEZX-LIMK1 -UTR). Sillä kaksi lusiferaasianalyysissä, FTC-133 solua maljattiin kolmena kappaleena osaksi 12-kuoppalevyille ja ko-transfektoitiin 0,25 ug reportteri-konstrukti ja 15 pmol miR-20a tai miR-NC käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen). 24 tunnin kuluttua solut lyysattiin ja analysoitiin sekä tulikärpäsen ja renilla lusiferaasi käyttämällä Luc-Pair miR Luciferase Assay Kit (GeneCopoeia, Rockville, MD), SpectraMax M5e mikrolevynlukijaa (Molecular Device, Sunnyvale, CA), mukaan valmistajien ”ohjeet.

Tietojen analysointi

tiedot esitetään keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon. Määrittämään tilastollista merkittävyyttä, varianssianalyysi ja t-testillä käytettiin tarvittaessa. P-arvo on alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

MiR-20a yliekspressoituu anaplastinen kilpirauhassyöpä (ATC) B

Olemme löytäneet ilmentymistason miR -20a oli huomattavasti korkeampi ATC kuin DTC, hyvänlaatuisia ja normaali kilpirauhasen kudoksia (Fig. 1). Ei ollut merkitsevää eroa miR-20a ilmentymisen tasolle

BRAF

mutaatiostatus (p = 0,62) tai sairauden laajuuden (p = 0,70 kasvaimen kokoa; p = 0,12 imusolmuke etäpesäke) DTC tai PTC .

Y-akseli edustaa suhteellista miR-20a ilmentymistason normalisoitu U6 (2

-ΔΔCt arvo). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR suoritettiin käyttäen kokonais-RNA: 65 ihmisen kudoksista (8 ATC, 22 verosopimukset, 24 hyvänlaatuinen, ja 11 normaali). Virhepylväät edustavat keskivirhettä (* osoittaa p 0,05).

MiR-20a säätelee kilpirauhassyöpä solujen lisääntymistä, pallomainen muodostumista, ja invaasio

yli-ilmentynyt miR-20a neljä kilpirauhassyöpä solulinjoissa (TPC-1, ekstaasi-1, FTC-133, ja C643) käyttäen miR-NC negatiivisena kontrollina määrittää sen vaikutus solujen proliferaatioon. MiR-20a yliekspressio esti merkittävästi solujen lisääntymistä 24% TPC-1 solujen 144 tuntia (p 0,001), 34% vuonna XTC-1 solujen 144 tuntia (p 0,001), 22% vuonna FTC-133 solujen 144 tuntia (p 0,001), ja 22% C643-soluissa 216 tuntia (Fig. 2A-D). Arvioimme vaikutus miR-20a kasvaimen kasvuun

in vivo

. Olemme havainneet, että tuumoriksenografteja peräisin FTC-133-solut, jotka on transfektoitu miR-20a olivat merkittävästi pienempiä kuin tuumoriksenografteja päässä miR-NC (p 0,01) (Fig. 2E), ja tuumorin paino peräisin FTC-133-solut transfektoitiin jossa miR-20a olivat myös merkittävästi vähemmän kuin kasvain painot miR-NC (p 0,05) (kuvio. 2F).

(A-D). Kilpirauhasen tasyöpäsolulinja leviämisen estämisen miR-20a yli-ilmentymisen. Y-akseli edustaa solujen määrä. (E-F) kilpirauhassyöpä

in vivo

kasvu,

ex vivo

kasvaimen satoa ja paino. Virhepylväät edustavat keskivirhettä (* osoittaa p 0,05; ** osoittaa p 0,01).

Tutkimme myös vaikutusta miR-20a kilpirauhassyöpä kasvain pallomainen muodostumista. FTC-133 solulinja muodostaa sferoideja kun viljellään ultra-low kiinnittyvä kulttuuri pulloon ja miR-20a transfektion lukumäärä ja koko pallosia oli merkittävästi vähentynyt (Fig. 3).

(A) edustaja kuva sferoidi- viljelmässä miR-20a yli-ilmentymisen. (B) kvantifiointi sferoidiviljelmiä ero miR-20a yli-ilmentymisen. Yhteenlaskettu pinta-ala pallojen sisällä kuvan mitattiin ympäröimällä kehä kunkin sferoidi, merkintä koko alueella, ja laskemalla pikselin numerot ImageJ ohjelmisto (Maryland, USA). Y-akseli edustaa koko ja lukumäärä palloset. Virhe pylväät edustavat SEM (* osoittaa p 0,05).

MiR-20a yliekspressio esti merkittävästi solujen invaasiota 85% vuonna TPC-1-solut (p 0,01), 67% vuonna XTC-1-soluissa (p 0,001), 61% vuonna FTC-133-solut (p 0,001), ja 87% vuonna C643-soluissa (p 0,01) (Fig. 4). Mitään merkittävää eroa ei havaittu transfektoitujen solujen miR-20a ja miR-NC arpeutumisprosessit määritys käyttäen TPC-1-soluja ja FTC-133-soluissa.

(A) TPC-1 kilpirauhassyöpä solulinja, (B) ekstaasi-1 kilpirauhassyöpä solulinja, (C) FTC-133 kilpirauhassyöpä solulinja, ja (D) C643 kilpirauhassyöpä solulinja. Y-akselilla on hyökkäyksen indeksi kilpirauhasen syöpäsoluja. Virhepylväät edustavat keskivirhettä (* osoittaa p 0,05; ** osoittaa p 0,01; *** osoittaa p 0,001).

MiR-20a säätelee LIMK1 ilmentymistä kilpirauhasen syöpäsoluja

Koska miR-20a ollut vaikutusta soluproliferaatioon ja invaasiota

in vitro

ja

in vivo

olimme kiinnostuneita määritettäessä kohdegeenin (t) asennuspalveli- 20a. Käytimme kaksi lähestymistapaa määrittämiseksi miR-20a tavoitteet: (1) kohteena ennusteen tietokantaan ja (2) genomin laajuinen ilmentymisen analyysi miR-20a yli-ilmentymisen. Löysimme 3635 ennakoi maalin geenit miR-20a käyttäen TargetScan 5.0 ohjelmisto. Löysimme 58 geenejä, joilla on muuttunut ilme upon miR-20a yli-ilmentymisen avulla genominlaajuisten ilmentymisanalyysiä. Niistä 45 geenejä, joiden ilmentymistaso oli alassäädetty, 37 geenit ennustivat kohdegeenien miR-20a (taulukko 1).

LIMK1

oli kaikkein vaimentua geeni tämän analyysin ja on aiemmin raportoitu olevan rooli tuumorisolun invaasiota ja etäpesäkkeiden [19] – [22]. Niinpä olimme kiinnostuneita onko

LIMK1

oli välittömänä kohteena miR-20a. Huomasimme, että LIMK1 proteiinin ilmentymistä kilpirauhassyöpä solulinjoissa (C643, XTC-1, FTC-133, ja TPC-1) oli väheni miR-20a yli-ilmentymisen (Fig. 5A). Lasku LIMK1 proteiinin ekspressio havaittiin jopa 14 päivää transfektion jälkeen (kuvio. 5B).

(A) Immunoblotit varten LIMK1 proteiinin ilmentymistä C643, ekstaasi-1, FTC-133, ja TPC-1 solulinjoja, jotka oli transfektoitu joko miR-20a tai miR-NC: ssa 72 tuntia. (B) Immunoblotit endogeenisen LIMK1 ja GAPDH FTC-133-solut transfektoitiin joko miR-20a tai miR-NC 7 päivää, 14 päivää ja 21 päivää.

Voit selvittää, onko

LIMK1

oli välittömänä kohteena miR-20a, käytimme lusiferaasireportteri- vektori pEZX-MT01 kanssa 3′-UTR ihmisen

LIMK1

kloonattiin se, tuottaa

LIMK1

3′-UTR lusiferaasireportteri konstruktilla (pEZX-LIMK1-UTR). Suoritimme Lusiferaasimäärityksiä kanssa pEZX-LIMK1-UTR (vektori 3′-UTR LIMK1) kotransfektoitiin FTC-133 solulinja miR-20a tai miR-NC. Löysimme laski merkitsevästi lusiferaasin aktiivisuus miR-20a yli-ilmentymisen verrattuna negatiiviseen kontrolliin (Fig. 6A), mikä viittaa siihen, että miR-20a suoraan downregulates

LIMK1

ilme. Koska miR-20a yliekspressio vaimentua

LIMK1

kilpirauhassyövän hoitoon solulinjoissa ja näkyvin vaikutus miR-20a kilpirauhasen syöpäsoluja oli estää solun invaasiota, tutkimme,

LIMK1

on vaikutusta solujen invaasio ja muuttoliike. Huomasimme, että knockdovvn

LIMK1

alensivat solujen invaasiota mutta ei muuttoliike (Fig. 6B ja C).

(A) Lusiferaasiaktiivisuutta of pEZX-LIMK1-UTR in FTC-133-solut kun kotransfektoitiin miR-20a tai miR-NC. Kaikki lusiferaasi mittaukset tehtiin kolmena rinnakkaisena, ja lukemat suoritettiin 24 tuntia transfektion jälkeen. Virhepylväät edustavat keskivirhettä (* osoittaa p 0,05). (B)

LIMK1

siRNA Knockdown in FTC-133 kilpirauhassyöpä solulinjassa. LIMK1 mRNA: n ilmentymisen kvantitatiivisen RT-PCR (yläpaneeli). LIMK1 proteiinin ilmentyminen Western blotilla (alapaneeli). Näytetyt tiedot koskevat 72 tuntia siRNA transfektion. (C) Cellular hyökkäyksen LIMK1 knockdown. Transfektio

LIMK1

siRNA esti FTC-133 kilpirauhasen syöpäsoluja hyökkäystä. Y-akselilla on hyökkäyksen indeksi kilpirauhasen syöpäsoluja. Näytetyt tiedot koskevat 72 tuntia siRNA transfektion. Virhepylväät edustavat keskivirhettä (* osoittaa p 0,05; ** osoittaa p 0,01). (D) transfektointi

LIMK1

siRNA ei ole vaikutusta muuttoa FTC-133 kilpirauhasen syöpäsoluja. Y-akseli edustaa haavan etäisyys. Näytetyt tiedot koskevat 72 tuntia siRNA transfektion. Virhepylväät edustavat keskivirhettä.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa löydettiin miR-20a yliekspressoitui ATC verrattuna DTC, hyvänlaatuinen ja normaaliin kilpirauhaskudokseen. Kohdunulkoinen yli-ilmentymisen miR-20a ehkäisi merkittävästi kilpirauhassyöpä soluproliferaatiota

in vitro

ja

in vivo

, ja esti merkitsevästi kasvaimen sferoidiviljelmiä muodostumista ja hyökkäys useita kilpirauhassyöpä solulinjoissa. Tämä viittaa siihen, että miR-20a on kasvain tukahduttava toimintoon, kun se on yliaktiivista kilpirauhassyöpä. Olemme myös havainneet, että miR-20a säätelee

LIMK1

ilmaisua, mikä viittaa siihen, että

LIMK1

on kohdegeenin, joka voi välittää tukahduttava vaikutus miR-20a kasvuun ja invaasion kilpirauhasen syöpäsoluja. Kuitenkin yksi rajoitus Tutkimuksemme on pieni määrä ATC kasvain analysoitujen näytteiden mutta se on harvinainen maligniteetti.

MiR-20a ja miR-17 (kutsutaan myös miR-17-5p) sijaitsevat yhdessä miR-17-92 klusterin, ja niillä on sama siemen järjestyksessä, AAAGUG. Tämä siemen sekvenssi on jaettu kolmen muun ihmisen kypsän miRNA (miR-106a, -106b, ja -20b), jotka sijaitsevat kromosomissa 7 ja kromosomin X MiR-20a tavoitteet monien geenien, mukaan lukien

VEGFA

,

TGFBR2

,

CCND1

,

IL-8

,

MAPK14

,

PCAF

,

RUNX1

,

STAT3

, ja

E2F1

[11] – [14], [23] – [26]. Monet näistä geeneistä tärkeä rooli säätelyssä solujen lisääntymistä, solusyklin, apoptoosin, ja solujen maahanmuuton ja hyökkäystä. MiR-20a voi toimia joko tuumorisuppressorina tai onkopsykologista miR, riippuen tietyn solutyypin ja solunulkoisen tekijät [11] – [13]. Todellakin, miR-20a yli-ilmentyminen on havaittu estävän solujen lisääntymistä, invaasiota ja kasvaimen etäpesäke rintasyövän solulinjoissa [11], [12], mikä viittaa tuumorisuppressori rooli miR-20a vastaa meidän tietojen kilpirauhassyövän solulinjoissa ja se on yläreguloituja ATC (15, 16). Sen sijaan, aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että miR-20a voi edistää proliferaatiota ihmisen munasarjasyöpäsoluja [27], ja muuttoliike ja invaasion ihmisen kohdunkaulansyövän solut, munasarjasyöpäsoluja, ja luusarkoomasoluissa [27] – [29], mikä viittaa siihen, että miR-20a toimii onkopsykologista miR.

Takakura ja osakkuusyhtiöissä kertoi miR-17-92 klusteri (miR-17-3p, -17-5p, -18a, -19a, -20a, – 19b, ja -92-1) yliekspressoitui ATC solulinjoissa [16]. Käyttämällä kvantitatiivista RT-PCR: llä, ne osoittivat, että miR-17-3p ja miR-17-5p oli yli-ilmentynyt kolmessa kuudesta ATC kudosnäytteiden verrattuna normaaliin kudosnäytteistä. He raportoivat, että transfektio inhibiittorit miR-17-5p tukahdutetaan ilmentymisen taso miR-17-perheen (miR-17-5p, miR-20a, ja miR-106a ja b) ARO soluissa, mikä johtaa solun kasvun vähenemistä. Kuitenkin meidän tutkimus toiminnan miR-20a kilpirauhassyöpä oli erilainen kuin tutkimuksessa Takakura ja työtovereiden. Ensinnäkin, me nimenomaan yli-ilmentynyt miR-20a ymmärtää sen vaikutukset kasvaimen solubiologian sekä erittelemätön ja eriytetty kilpirauhassyöpä solulinjoissa, ja emme käyttäneet estäjiä useiden jäsenten miR-17-92 klusterin mahdollisesti armottoman vaikutuksia, jotka ei voi olla ainoastaan ​​selektiivinen miR-20a. Toiseksi, huomasimme, että Takakura et ai. käytetyt solut käsiteltiin vain transfektioreagenssi negatiivinen kontrolli sijasta käyttää salatun oligonukleotideja, ja käytimme salattu oligonukleotidit negatiivisena kontrollina. Lisäksi solulinjoja käytimme (C643, TPC-1, FTC-133 ja XTC-1) olivat erilaisia ​​kuin käytetyt solulinjat (ARO ja FRO) mukaan Takakura ja työtovereiden. Lopuksi ARO solulinjoja käytettiin tutkimuksessa Takakura ja osakkuusyritysten ei ehkä ole todennettu kilpirauhassyöpä solulinjoissa [18].

Huomasimme, että miR-20a säätelee

LIMK1

ilmaisun kilpirauhasen syöpäsolulinjoilla.

LIMK1

säätelee Rho-signalointireitin, ja se moduloi aktiini dynamiikan säätelemällä aktiivisuutta cofilin proteiinit [30], [31]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että

LIMK1

keskeinen ja tärkeä rooli kasvainsolun invaasiota ja etäpesäkkeiden [19] – [22].

LIMK1

yli-ilmentyminen lisää invasiivisuus rinta- ja eturauhassyövän solut

in vitro

ja

in vivo

, ja kaatamalla on

LIMK1

tukahduttaa rinta- ja eturauhassyövän syöpäsoluinvaasiota

in vitro

ja

in vivo

[19] – [22], [32]. Tulosten perusteella meidän genominlaajuisten geenien ilmentyminen ja tavoite ennustus analyysit, kysyimme miR-20a yliekspressio vaikuttaa

LIMK1

ilmentymistä kilpirauhassyöpä solulinjoissa. Itse asiassa huomasimme, että

LIMK1

kaikissa kilpirauhassyöpä solulinjoissa (C643, ekstaasi-1, FTC-133, ja TPC-1) inhiboitui miR-20a yli-ilmentyminen, mikä viittaa siihen, että estävä vaikutus on miR -20a on solujen lisääntymistä ja hyökkäys saattaa välittää sen vaikutus

LIMK1

. Todellakin, suora knockdovvn

LIMK1

oli sama vaikutuksia solun invaasiota ja maahanmuuttoa havaittu yli-ilmentyminen miR-20a.

Koska kasvain tukahduttava vaikutus miR-20a kilpirauhasen syöpäsoluja havaitsimme

in vitro

ja

in vivo

, on mahdollista, että perillemeno miR-20a voi johtaa kasvaimen tukahduttaminen /regressio riippumatta solutyypistä ja tai pohjapinta miR-20a tasoa [ ,,,0],33]. Kasvain tukahduttava vaikutus miR-20a voitaisiin välittämä muita geenejä kuin

LIMK1

. Me validoitu

LIMK1

tavoitteeksi, koska se oli pienin lausekkeen miR-20a yli-ilmentymisen mutta kuten taulukossa 1 monissa ehdokas kohdegeenien muutettiin kanssa miR-20a yli-ilmentymisen ja siten voisi myös välittää sen kasvaimen ehkäisevästä vaikutuksia.

Tietääksemme tämä on ensimmäinen tutkimus luonnehtia vaikutus miR-20a kilpirauhasen syöpäsolujen fenotyyppejä ja osoittamaan, että miR-20a säätelee

LIMK1

ilme. Meidän tulokset viittaavat siihen voimistunut ilmentyminen miR-20a anaplastinen kilpirauhassyöpä ehkäisee kilpirauhassyöpä etenemiseen ja voi olla terapeuttista potentiaalia [34].

tukeminen Information

Taulukko S1.

Täydentävä taulukko.

doi: 10,1371 /journal.pone.0096103.s001

(DOC) B