Krooninen sairaus

​​

tiivistelmä

Väylät mukana synteesissä välittäjäaine gamma-aminovoihappo ( GABA) on patogeneesiin korkealuokkaisesta neuroendokriinisten (NE) kasvaimet sekä kasvainten ei-NE linjaa. Käyttäen Cancer Genome Atlas, yliekspressio GABA synteettinen entsyymi, glutamaatti dekarboksylaasin 1 (

GAD1

), havaittiin olevan yhteydessä vähentynyt taudista vapaan eloonjäämisen eturauhasen adenokarsinooma ja pieneni eloonjäämisen selkeä solussa munuaissolukarsinooman . Lisäksi

GAD1

havaittiin ilmentyvän kastraatiotason kestävä eturauhassyövän solulinjoissa, mutta ei androgen-reagoiva solulinjat. Käyttämällä uutta fluoresenssi-kytketyssä entsymaattisessa mikrolevyn määritys GABA välittyvät vähentämisen resatsuriinia on eturauhasen neuroendokriinisen karsinooma (PNEC) solulinja, happo mikroympäristölle aiheuttama stressi lisääntynyt GABA-tasoja, kun emäksinen mikroympäristölle aiheuttama stressi väheni GABA kautta modulaatio GAD1 ja glutamiinisyntetaasi- (GLUL) toimintaa. Lisäksi glutamiini mutta ei glukoosin poisto vähentynyt GABA kautta modulaatio GLUL. Yhdenmukainen todisteet prokaryoottisissa ja eukaryoottisissa organismeja, GABA-synteesin välittyvät GAD1 voi olla ratkaiseva rooli elossa stressi, GABA voi olla tärkeä välittäjä stressin eloonjäämisen kasvaimet. Nämä havainnot tunnistaa GABA synteesiä ja aineenvaihduntaa potentiaalisesti tärkeä koulutusjakson säätelemiseksi syöpäsolujen stressivaste sekä potentiaalinen kohde hoitostrategioita.

Citation: Ippolito JE, Piwnica-Worms D (2014) fluoresenssiin Coupled määritys Gamma aminovoihappo (GABA) paljastaa Metabolinen stressin aiheuttama modulaatio GABA sisältö Neuroendokriininen Cancer. PLoS ONE 9 (2): e88667. doi: 10,1371 /journal.pone.0088667

Editor: Domenico Coppola, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu 22 lokakuuta, 2013 Hyväksytty: 15 tammikuu 2014; Julkaistu: 13 helmikuu 2014

Copyright: © 2014 Ippolito, Piwnica-Worms. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoittivat avustusta Radiological Society of North America (RR1031, https://www.rsna.org) ja National Institutes of Health (P50 CA94056). HTS ydin tukee osittain avustuksen, jonka Siteman Cancer Center (P30 CA091842). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

neuroendokriini (NE) järjestelmä on hajanainen verkosto solujen jaetaan koko eri kudoksia ja elimiä, jotka voivat tuottaa paikallisia tai systeemisiä vaikutuksia fysiologiaan kautta hormonien eritykseen tai välittäjäaineiden. Vaikka jotkut solut syntyvät hermostopienasta, suurin osa on peräisin multipotentti epiteelisolujen kantasolujen [1]. Neuroendokriini (NE) karsinoomat, uskotaan johtuvan NE järjestelmä, esiintyy lähes kaikissa anatomisia sijainteja ja näyttää monenlaisia ​​fenotyyppisten käyttäytymismalleja hyvälaatuisesta metastaattisen [2], [3]. Esimerkiksi ”klassinen” karsinoidituumorit tai huonolaatuisen NE karsinoomat ovat hyvin eriytetty, on alhainen mitoosi-indeksi, ja muistuttavat NE soluhyperplasiaa [2], [3], kun taas pienet solukarsinoomat tai korkealaatuista NE karsinoomat ovat aggressiivisia ja huonosti eriytetty [4] – [9]. Laadukas NE karsinoomat tyypillisesti on lukuisia alueita kuolion, korkea mitoosi-indeksi [2], [3], ja huono ennuste. Perinteiset hoitomuodot eivät paranna potilaan selviytymistä potilailla, joilla on korkean asteen NE syöpä [10].

adenokarsinoomat, jotka ovat paljon yleisempiä, syntyvät epiteelin alkuperä ja näyttää rauhas kasvumalli [11]. Mielenkiintoista, adenokarsinoomat voi esiintyä NE ominaisuuksia ominaista molecularly kuten ilmentymistä liittyviä geenituotteita NE solulinjaan. Tämä ilmiö on osoitettu useissa eri adenokarsinooma, mukaan luettuina keuhko-, eturauhas- ja paksusuolen ja korreloi kasvaimen aggressiivisuus, etäpesäke, ja lyhentää selviytymisen [12] – [19]. Erityisesti kun kyseessä on eturauhasen syöpä, ilmaus NE on tarjolla positiivisesti korreloi metastaattista potentiaalia ja kastraatio kestävä kasvu [19] – [21]. Valitettavasti biologia NE solujen sekä niiden panosta elimeen homeostaasin pysyvät epätäydellisesti määritelty, mikä johtuu osittain vähäisyys näiden solujen normaalissa elimissä [22].

Aiemmin käytimme yhdistelmää geeniekspression profilointi, massaspektrometria, ja ydinmagneettiresonanssispektroskopialla valaista useita metabolisen verkkojen osallisena aggressiivinen NE syövissä käyttäen geenitekniikalla hiirimallissa metastasoituneen eturauhassyövän NE syöpä, ja johdannainen eturauhasen NE karsinooma (PNEC) solulinja, jossa cryptdin 2-promoottori ohjaa ekspressiota onkogeenisten suurta T-antigeeniä (CR2-tAg) [13], [23] – [25]. Näiden analyysien tulokset tunnistettu synteesiä ja aineenvaihduntaa gamma-aminovoihapon (GABA) on johdettu molempien trikarboksyylihappo (TCA) kierto välituotteiden ja polyamiinit (yhteisesti nimitystä GABA shuntin) kuin metabolisen verkko näkyvästi esille säädellään aggressiivinen NE karsinoomia [ ,,,0],13].

moderni erikoistunut instrumentointi käytetään metabolisen analyysejä, kuten massaspektrometriaa (MS) ja ydinmagneettisen resonanssin (NMR) ovat kalliita, vaativat merkittäviä koulutus toimia, ja ne eivät helposti saatavilla monia korkeakoulujen laboratorioiden . Klassinen entsymaattinen-pohjainen metaboliitin määritysrajan, toisaalta, tarjoaa kustannustehokkaan, helposti, herkkä väline kvantitatiivinen analyysi aineenvaihduntatuotteiden [26]. Vaikka pysty toimittamaan samanaikaisesti tietoa määristä useiksi metaboliiteiksi, entsymaattinen kvantitointi tarjoaa mahdollisuuden samanaikaisesti kvantitoimiseksi tietyn metaboliitin monilla näytteet suurikapasiteettisten platform [27] – [29].

Pyridiiniä nukleotidi- pohjainen entsyymitestejä, että pari tuotanto NADH tai NADPH (jäljempänä yhteisesti NAD (P) H) ja biokemiallista reaktiota ovat houkuttelevia, koska ne vähentää nukleotidien fluoresoivat, ja siksi sitä voidaan käyttää kvantitatiivista lukeman entsyymiaktiivisuuden tai metaboliitin tasoja. Kuitenkin tausta-fluoresenssin biologisten kudosten voi rajoittaa herkkyys NAD (P) H havaitseminen [26].

Useita strategioita, joilla parannetaan fotoni tuotannon ja herkkyyden parantamiseksi entsymaattisten reaktioiden on kehitetty [26], [ ,,,0],30] – [32]. Yksi strategia edellyttää kytkimen ja NAD (P) H synteesi mitokondrion Lipoyl dehydrogenaasi (diaforaasia), joka aktivoi kemialliset substraatteja kromogeenisen tai fluoresenssimääritysten. Resatsuriini on yksi tällainen yhdiste, jota voidaan käyttää entsymaattisesti-kytketty ja solujen elinkelpoisuuden määritykset [27], [33], [34]. Täällä me raportoimme uusi entsymaattinen määritys kvantifiointiin GABA ja onnistuneesti käyttää tässä määrityksessä luonnehtia muutoksia solujen GABA PNEC soluja metabolisen stressin.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

Kaikki kemialliset ja entsymaattiset reagenssit hankittiin Sigma.

Cell Culture

Kaikki solulinjat testattiin rutiininomaisesti mykoplasma negatiivinen. Kaikkia solulinjoja viljeltiin varhainen tavanomaisissa olosuhteissa mukaan ATCC protokollia 95% O

2/5% CO

2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa. Itse kiinnittämiseksi subklooni eturauhasen Neuroendokriininen Cancer (PNEC) solulinjassa [35] viljeltiin kuten aiemmin on kuvattu [36]. Lyhyesti, DMEM /F12-väliaineessa (Invitrogen), jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua FBS: ää (Gibco), 1% ei-välttämättömiä aminohappoja (NEAA, Gibco), B27 seerumilisää (Invitrogen), 5 ng /ml EGF: ää (BDBiosciences), 5 ng /ml bFGF: ää (Sigma), ja 15 mM 4- (2-hydroksietyyli) -1-piperatsiinietaanisulfonihappo (HEPES) puskuria (Gibco). Kaikki solut kasvatettiin ja enintään 75% konfluenssiin. Solut trypsinoitiin, neutraloitiin kasvualustaa ja -jaettuja. Solupelletit RNA tai biokemiallisia määrityksiä sentrifugoitiin 125 x g 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Solut pestiin jääkylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella, ja sentrifugoitiin uudelleen. Supernatantit aspiroitiin ja pelletit jäädytettiin nestetypessä. Kaikki näytteet säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes sitä tarvitaan.

Evaluation of Survival käyrät Cancer Genome Atlas (TCGA) B

cBioPortal syövän Genomics [37], [38] säädetty kautta Cancer Genome Atlas Data Portal käytettiin pääsyn ja visualisoida kliinisen ja geeniekspression aineistoja ihmisen eturauhasen adenokarsinooma [39] ja ihmisen selkeä solu munuaissyövän [40]. Vain ”mRNA ilmaisu z-arvoja vs. Normaali” ruksattiin. ”Kaikki kasvaimet” valittiin kyselyn. RNASeq tietoja käytettiin selkeä cell carcinoma aineistoja. Survival käyrät arvioitiin perustuen geenien ilmentymistä sisällä GABA shuntti. Näytteitä joilla on lisääntynyt

GAD1

lauseke (z pisteet +2 tai +3) ja väheni

GLUL

lauseke (z -2) tunnistettiin ja kliiniset tiedot viedään. Survival konstruoitiin kanssa GraphPad Prism.

Real Time PCR Primer suunnittelu

Alukkeet reaaliaikaista PCR suunniteltiin käyttäen PrimerBLAST.

GAD1

(NM_000817.2), mutta ei 18S rRNA (

RNA18S5

, NR_003286.2), on suunniteltu koko introni-eksoni-risteykseen. Valittu alukkeilla ei ollut ennustettu off-tavoite vahvistus ihmisen genomissa. Primer sulamislämpötilat suunniteltiin välillä 61 ° C ja 63 ° C. Alukkeet testattiin PCR cDNA syntetisoitiin NCI-H660 ja LNCaP solulinjoissa. Amplikonit odotettua pituus (GAD1:145 bp, 18S: 182 bp) saatiin cDNA valmisteet ja ei havaittavissa PCR-reaktioissa käyttäen genomista DNA: ta templaattina ja vedellä. Sulata käyrät ja vahvistusta tehokkuutta kaikkien alukepareja tehtiin. Alukesekvenssit ovat seuraavat:

GAD1

(forward): 5′-ATGGGGTTCGCACAGGTCATCC-3 ’,

GAD1

(reverse): 5′-TCCATGAGGACAAACACTGGTGCA-3′;

RNA18S5

(eteenpäin): 5′-GGGCATTCGTATTGCGCCGC-3 ’,

RNA18S5

(käänteinen): 5′- GAATAACGCCGCCGCATCGC-3′.

Real Time PCR

RNA eristettiin jäädytettiin solupelleteistä käyttäen RNeasy (Qiagen). Seuraavat RNA, RNA-näytteet eriin ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Kaikki RNA-näytteet käsiteltiin TURBO Dnase (Ambion) poistamiseksi genomista DNA: ta. RNA käytettiin kvantitatiivista PCR heti käänteiskopioitua kanssa iScript (BioRad). Puhtaus cDNA arvioitiin 18S rRNA PCR-monistus cDNA näytteen ja negatiivisen kontrollin RNA: ta, joka ei ollut käänteistranskriptaasia. Kaikki näytteet, joita käytetään myöhemmin QPCR kokeissa ei ollut havaittavissa genomisen DNA-kontaminaation, mikä käy ilmi puuttuminen 18S amplikonin seuraavat 40 sykliä reaktion puuttuu käänteistranskriptaasia. Kukin näyte testattiin kolmena rinnakkaisena 50 ng cDNA. Reaaliaikainen PCR suoritettiin SYBR green master mix (BioRad) ja 100 nM konsentraatio aluke asetettu Bio-Rad CFX96 PCR väline (95 ° C: ssa 10 min, sitten 40 sykliä 95 ° C 30 s , 61 ° C 1 min, ja 74 ° C 1 min). 18S rRNA alukkeita käytettiin sisäisenä standardina.

metabolisen stressin Kokeet

ravinteiden puutetta kokeissa, DMEM /F12, joista puuttuu glukoosi, pyruvaatti ja glutamiini (USBiological) käytettiin. Media täydennettiin seuraavista komponenteista: lämpöinaktivoitua dialysoitua seerumia, jossa on 10 kD molekyylipainon cutoff (Sigma), 1% ei-välttämättömiä aminohappoja (NEAA, Gibco), 5 ng /ml EGF (BDBiosciences), ja 5 ng /ml bFGF (Sigma). Glukoosi ja glutamiinia (Gibco) täydennettiin Erityistuomioistuimiin mediaa tarvittaessa. Glukoosi lisättiin väliaineeseen käyttäen standardia DMEM /F12 formulaatio pitoisuudet 17,5 mM. Glutamiinia käytettiin 6 mM. Ennen metabolisen stressin kokeissa, PNEC solut maljattiin tiheydellä 400000 solua per kuoppa 12-kuoppalevyllä 1,5 ml: lla standardin kasvualustaa. Solujen annettiin kasvaa 24 tunnin ajan. Media oli silloin vaihdettiin 1,5 ml stressiä media. Kaikkien pH stressi kokeissa tavanomaisia ​​PNEC kasvualustaa käytettiin ilman bikarbonaattia tai HEPES puskureita ja modifioitiin seuraavasti. Hapon stressi, 2 – (

N

-morfolino) etaanisulfonihappo (MES), pH 6,5 lisättiin loppukonsentraatioon 20 mM. Tavanomaisia ​​pH, HEPES, pH 7,4, lisättiin loppukonsentraatioon 20 mM ja natriumbikarbonaattia lisätään loppukonsentraatioon 0,34 g /l. Emäksiset stressi, tris (hydroksimetyyli) aminometaani (Tris), pH 8,5 lisättiin loppukonsentraatioon 20 mM ja natriumbikarbonaattia lisätään loppukonsentraatioon 0,34 g /l. Sitten soluja inkuboitiin kosteutetussa kammiossa ilman CO

2 37 ° C: ssa 24 tunnin ajan.

Näytteiden esikäsittely

Näytteiden valmistus entsymaattista määritystä modifioitiin aikaisemmin kuvatulla menetelmillä [13 ], [26]. Stressin kokeissa, väliaine nopeasti imettiin pois kuopista ja solut huuhdeltiin 1 ml: lla PBS: ää. Hapon ja emäksen stressi kokeita, kaivot huuhdeltiin suolaliuoksella puskuroitu sopivaan pH 20 mM MES tai HEPES kuten edellä. Sitten solut hajotettiin 200 pl jääkylmää lyysiliuosta (50 mM natriumhydroksidia ja 1 mM EDTA) ja ravisteltiin varovasti 30 sekuntia. Yhtä suuri tilavuus 100 mM suolahappoa lisättiin sitten happamaksi lysaatti. Levyt peitettiin liima PCR elokuva tiiviste ja inkuboidaan vesihauteessa 60 ° C: ssa 30 minuuttia tuhoamaan endogeeniset entsyymin aktiivisuutta sekä endogeeninen NADH. Inkuboinnin jälkeen levyjä sentrifugoitiin lyhyesti 100 x g (Allegra 6R, Beckman-Coulter) poistamiseksi lauhde. Kalvo poistettiin ja 100 ui 400 mM Tris Base, lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja kokonaistilavuus on 500 ui lysaattia kuhunkin kuoppaan (lopullinen pH noin 8). Lysaatit sentrifugoitiin 15000 x g 5 minuuttia pelletoimaan roskat ja supernatantit kerättiin ja pakastettiin -80 ° C: ssa myöhempään käyttöön saakka.

resatsuriini-pohjainen määritys GABA ja sukkiinisemialdehydiksi määrittäminen

seuraavat reagenssi optimoinnin perusseosta kvantifioimiseksi GABA ja sukkiinisemialdehydiksi (SSAL) näytteistä sisälsi 0,063 U /ml GABase, 0,063 U /ml diaforaasi, 6,25 uM resatsuriinia, 100 uM nikotiiniamidiadeniinidinukleotidifosfaatin (NADP), 5 mM a-ketoglutaraattia ja 3.125 uM ditiotreitolia (DTT) 100 mM Tris-emästä, pH 8,8. Perusseosta tehtiin tuore ennen kutakin koetta.

perusseosta kvantifioimiseksi vain SSAL sisältyvät edellä mainituista reagensseista sekä 50 mM 2-aminoetyyli sulfaattia, estäjä GABA transaminaasin komponentti GABase entsyymivalmisteen. Inhibiittori lisättiin perusseosta 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ennen kuin lisättiin Mastermixin näytteitä. Tuote valmiste, inhibiittorin valmistettiin ennen kaikkia kokeita.

alikvootit näytteen (10 ui) lisättiin kuoppiin 96-kuoppaisella kirkas pohja musta kulttuuri levy (Costar), minkä jälkeen lisättiin 90 ui Mastermix elektroninen monikanavainen pipetin. Kaksi erää, että samasta näytteestä käytettiin määritykseen yhteensä GABA plus SSAL tai SSAL yksin samalla levyllä. Ellei toisin ole määritelty, reaktio suoritettiin huoneen lämpötilassa ja suojattiin valolta 30 minuuttia. Signaali saatu resorufiini, fluoresoiva tuote resatsuriinia, kvantitatiivisesti käyttäen Fluostar Optima mikrolevylukijalla (BMG Labtech), jossa on 544 nm: n virityksellä /590 nm emissio suodatin setti (voitto, 1327; 10 välähdystä hyvin). Kinetic analyysit suoritettiin 1 minuutin jaksoissa.

signaali yhteensä GABA plus SSAL kussakin näytteessä vähennetään SSAL pelkästään signaalin signaalin saamiseksi GABA. Standardikäyrien GABA ja SSAL rakennettiin varten kvantitoimiseksi ja korjattiin reaktiolle tyhjän kanssa ja ilman läsnäoloa 2-aminoetyyli vety sulfaatti. GABA ja SSAL mittaukset normalisoitiin proteiinia lysaateissa, kvantitatiivisesti kanssa bikinkoniini- happo (BCA) -määrityksellä (Pierce) käyttäen naudan seerumialbumiinia standardikäyrää. Tietojen käsittelyssä oli GraphPad Prism. Ravinteiden ja pH stressi ryhmiä analysoitiin yksisuuntainen ANOVA ja Dunnettin testin jälkeen tilastollista analyysiä.

Resatsuriini-pohjainen määritys Glutamaatti määrittäminen

Entsymaattinen määritys määrittämiseksi glutamaatin suoritettiin aiemmin on kuvattu [41]. Lyhyesti, reaktio sisältyvien komponenttien 10 uM resatsuriinia, 4 U /ml glutamaattidehydrogenaasi, 0,25 U /ml glutamiini–pyruvaattitransaminaasi, 100 uM alaniinia, 0,5 mg /ml NAD +, ja 0,5 U /ml diaforaasi 100 mM Tris-HCl, pH 7.5. 10 ui edellä näytteet lisättiin 90 ui reaktioseosta ja määritykset suoritettiin pimeässä huoneenlämpötilassa. Resorufiinin signaali mitattiin 15 minuuttia. Ravinteiden ja pH stressi ryhmiä analysoitiin yksisuuntainen ANOVA ja Dunnettin testin jälkeen tilastollista analyysiä.

NAD (P) H Fluoresenssi-pohjainen GABase määritys

Koe muokattu Passoneau [26 ]. Mastermix muodostui 0,08 U /ml GABase, 5 mM alfa-ketoglutaraatti 500 uM NADP, 100 uM DTT ja 4 mM EGTA 100 mM natrium- pyrofosfaatti, pH 8,6. Alikvootit näytettä (10 ui) lisättiin 96-kuoppaisille optiset levyt (Falcon 353261), jota seuraa 90 ui perusseosta kanssa. Reaktio suoritettiin huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan ja mitattiin Fluostar Optima kanssa 340 nm: n virityksellä /450 nm emissiosuodatinta setti (voitto, 2103, 10 välähdystä hyvin).

Western blottaus metaboliaentsyymien

PNEC solut maljattiin korosti, ja pestiin kuten edellä on kuvattu. 100 ui jääkylmää RIPA-puskuria (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA: ta, 140 mM natriumkloridia, 0,1% natriumdodekyylisulfaattia (SDS), 0,1% natriumdeoksikolaatti, ja 1% Triton X-100), joka sisältää 1 mM natriumortovanadaattia ja fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF) lisättiin. Solut kaavittiin kuopista jäällä ja lisättiin mikrofugiputkiin. Näytteitä sentrifugoitiin 10 minuuttia nopeudella 10000 x g 4 ° C: ssa poistamaan liukenematon sakka. Proteiini kvantifioitiin kanssa BCA-määrityksellä edellä kuvatulla tavalla.

yhteensä 30 ug proteiinia ladattiin 4-12% Bis-Tris polyakryyliamidigeelillä (Bolt, Life Technologies), jossa pelkistysaineen kohti valmistajan ohjeiden. Geeli siirrettiin Immobilon-kalvolle (Millipore) ja estettiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella, joka sisälsi 5% naudan seerumin albumiinia ja 0,1% Tween-20. Seuraavat ensisijainen vasta-aineita käytettiin: anti-GAD1 (MAB5406; Millipore) at 1:5000 laimennus, anti-ALDH5A1 (HPA029716; Sigma) 1:1000 laimennus, anti-GLUL (MAB302; Millipore) at 1:1000 laimennus, ja anti-ACTB (ab8226; Abcam) klo 1:4000 laimennus. Ensisijainen vasta-aineita inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa. Toissijainen vuohen anti-hiiri- tai anti-kani-piparjuuri-peroksidaasi konjugoitu vasta-aine (Cell Signaling), sitten käytettiin 1:5000 laimennus. Sama blot käytettiin ekspression tutkimiseksi kaikki proteiinit. Käytön jälkeen kunkin vasta-aineen, blotti stripattiin Western Re-koetin (G Biosciences) valmistajan tiedot. Blotit kehitettiin ja kuvattiin käyttäen WesternBright Quantum detektioreagenssipakkaus (Advansta).

entsyymitestejä

PNEC solut maljattiin korosti, ja pestiin kuten edellä on kuvattu. Solut kaavittiin 100 ui jääkylmää lyysipuskuria (100 mM natriumfosfaattia, pH 7,0, 20 uM pyridoksaalifosfaatti, ja 0,1% Triton X-100), ja toistetaan toisen kerran kuhunkin kuoppaan. Näytteet sonikoitiin (2-3 sekuntia) jäissä ja sen jälkeen sentrifugoitiin 10 minuuttia nopeudella 10000 x g 4 ° C: ssa liukenemattoman materiaalin poistamiseksi. Ennen näytteen kvantitointi, kaikki analyysit arvioitiin lineaarisuus ajan suhteen ja lisätyn lysaattia. Kaikki entsyymiaktiivisuudet normalisoitiin ajan ja proteiinin määrä lysaatissa. Tilastolliset analyysit tehtiin, kuten edellä on kuvattu.

Glutamaatti dekarboksylaasin määrityksessä.

Menetelmä modifioitu alkuperäisestä protokollaa [42]. Koepuskuriin sisälsi 100 mM natriumfosfaattia, pH 7,0, 250 uM pyridoksaalifosfaatti, 50 mM glutamaattia, ja 0,4% beta-merkaptoetanolia. Reaktio tyhjä suoritettiin kullekin näytteelle ja ei sisältänyt pyridoksaalifosfaattia tai glutamaatti. 50 ui lysaattia lisättiin 50 ui reaktiopuskuria PCR-levylle ja inkuboitiin jopa 8 tuntia 37 ° C: ssa thermocycler ilman lämmitetty kansi. Määritys lopetettiin lisäämällä 17 ui 350 mM HCI: a ja kuumennettiin 30 minuutin ajan 60 ° C: ssa termosyklerissä. Levy poistettiin ja lyhyesti lingotaan poistamaan lauhde. 17 ui 400 mM Tris-emästä lisättiin neutraloimaan näytteen ja levy sentrifugoitiin 10 minuutin ajan 1000 x g poistaa proteiinia sakan. Kuopat laimennettiin sitten kymmenkertaisesti mittausta varten GABA, tuotteen entsymaattisen reaktion, käyttäen GABase-resatsuriini menetelmää edellä kuvatulla tavalla.

glutamiinisyntetaasin määrityksessä.

Menetelmä modifioitu alkuperäisestä protokollan spektrofotometrinen määritys γ-glutamyyli hydroksamaatti [43]. Koepuskuriin sisälsi 50 mM imidatsolia, pH 6,8, 50 mM hydroksyyliamiini, pH 6,8, 100 mM glutamiinia, 25 mM Natriumarsenaatin, 0,2 mM adenosiinidifosfaatin (ADP), ja 0,5 mM mangaanikloridia. Reaktio tyhjä suoritettiin kullekin näytteelle ja eivät sisältäneet arsenate, ADP, tai glutamiini. 10 ui lysaattia lisättiin 90 ui reaktiopuskuria PCR-levylle ja inkuboitiin jopa 8 tuntia 37 ° C: ssa thermocycler ilman lämmitetty kansi. Reaktio lopetettiin lisäämällä 100 ui kehittää reagenssia (0,37 M rauta (III) kloridi, 0,3 M trikloorietikkahappo, 0,6 M HCl: a). Näytteitä sentrifugoitiin poistamiseksi sakan ja absorbanssi mitattiin 505 nm: ssä. Näyte absorbanssi kalibroitiin γ-glutamyyli hydroksamaatti standardia.

ALDH5A1 (SSADH) määritys.

Menetelmää muokattu aiempien pöytäkirjojen [26], [44]. Koepuskuriin sisälsi 100 mM Tris pH 8,8, 50 mM kaliumkloridi, 1 mM ditiotreitolia, 2,5 mM nikotiiniamidiadeniinidinukleotidi (NAD), 1,25 mM SSAL, ja 0,02% naudan seerumin albumiinia. Reaktio tyhjä suoritettiin kullekin näytteelle ja eivät sisältäneet SSAL. 10 ui lysaattia lisättiin 90 ui reaktiopuskuria PCR-levylle ja inkuboitiin jopa 8 tuntia 45 ° C: ssa thermocycler ilman lämmitetty kansi. Reaktiot siirrettiin mikrolevyn ja absorbanssi NADH, entsymaattisen tuotteen, mitattiin 355 nm: ssä. Näyte absorbanssi kalibroitiin NADH standardin.

Tulokset

Clinical Implications of GABA Shunt

Olemme aiemmin määritetty ilme analyysit että GABA synteesi on rikastettu korkealaatuista NE syöpäsairauksia [13] ja vahvisti läsnäolo funktionaalisen GABA shunttia eturauhasen NE syöpä (PNEC) solulinjassa yhdistämällä geenien ilmentymisen profilointi, aineenvaihduntatuote ja entsyymiaktiivisuus kvantitointi [13], [25]. GABA voidaan johtaa trikarboksyylihappo (TCA) kierto välituotteiden ja polyamiini /kationinen aminohappo tuotteita, pari GABA aineenvaihdunta useita reittejä solujen energia-aineenvaihduntaan (Fig. 1). Yhdessä koulutusjakson, GABA tuotetaan glutamaatti dekarboksylaasin 1 (GAD1) ​​-välitteisen dekarboksylaatiota glutamaatin peräisin joko glutamiini tai alfa-ketoglutaraattiin päässä TCA sykli. Toisessa reitissä tuotteita polyamiinia ja kationisten aminohappo hajoamista läpi putreskiiniä tapahdu redox välittämää muuntaminen GABA. GABA voidaan sitten metaboloituu aminobutyraatti transaminaasin (ABAT, GABA-T) ja meripihkahapposemialdehydiksi dehydrogenaasin (ALDH5A1, SSADH) osaksi sukkinaatti tuloa TCA sykli.

Glud: glutamaattidehydrogenaasin; GLS: gluta-; GLUL: glutamaatti-ammoniakki ligaasia; GAD1: glutamaatti dekarboksylaasin; ODC1: ornitiinidekarboksylaasin; ABP1: diamiinioksidaasin; ABAT: GABA transaminaasin; SSAL: sukkiinisemialdehydiksi; ALDH5A1: meripihkahapposemialdehydiksi dehydrogenaasi; ALDH9A1: aldehydidehydrogenaasin; SAT1: spermidiinin /spermiini N-asetyylitransferaasientsyymin.

Ensimmäinen, onko yli-ilmentymisen GABA shuntin entsyymien olivat havaittavissa ihmisen eturauhasen maligniteettien ja jos yli-ilmentyminen korreloi kliinisiä haittatapahtumia, käytimme cBioPortal [37] , [38] on TCGA kuulustella julkisesti saatavilla eturauhassyövän geenin ilmentymisen aineisto ja sen vastaavat kliiniset tiedot [39] varten ikäryhmälle potilaille, joiden syöpä yli-ilmentyy komponenttien GABA shuntin. Kaikista entsyymien lueteltujen kuvassa. 1,

GAD1

oli ainoa geeni, jonka yli-ilmentyminen oli yhteydessä heikentyneeseen tautivapaan elinajan. Olemme tunnistaneet yhteensä 6 potilasta yhteensä 216 potilasta (2,8%), jonka syövistä näytetään

GAD1

yliekspressio kanssa z-arvoksi yli +2. Potilaat, joilla on syöpiä, jotka yli-ilmentynyt

GAD1

oli keskimääräinen taudista vapaa elinaika 19,8 kuukautta vs. 110,3 kuukautta (p = 0,003) (Kuva. 2A). Tämä kohortin potilaista oli monenlaisia ​​eturauhasen seerumin antigeeni (PSA) vaihtelivat 3,5-40,2 mg /dl, Gleason laadut vaihtelevat 3 + 3 4 + 5, ja lavastus vaihtelevat T2C ja T3b. Vaikka oli vain yksi dokumentoitu tapaus metastaattisen lymfadenopatia aikaan leikkauksen, kaikki näytteet osoittivat ekstrakapsulaarinen laajennus. Mielenkiintoista, vähentynyt ilmentyminen glutamiinisyntetaasia (

GLUL

), jotka saattavat kilpailla GAD1 entsyymin glutamaatti liittyi myös laskenut taudista vapaa elinaika. Kaikkiaan 14 potilaalla on z-arvoja alle -2 tunnistettiin kanssa mediaanielossaolosta 27,9 kuukautta vs. 110,3 kuukautta (p = 0,006; Kuva. 2B).

.

GAD1

mRNA yli-ilmentymisen eturauhasessa adenokarsinooman korreloi vähentynyt tautivapaan elinajan. Kasvaimet, joiden

GAD1

ilmaisu z-pisteet yli +2 näyttö laski tautivapaan elinajan (mediaani 19,8 kuukautta) suhteessa kasvaimia, jotka eivät ole lisääntynyt

GAD1

lauseke (mediaani 110,3 kuukautta; p = 0,002). B.

GLUL

downregulation eturauhasessa adenokarsinooman korreloi tautivapaan elinajan (mediaani 27,9 kuukautta) verrattuna tuumoreihin

GLUL

downregulation (mediaani 110,3 kuukautta; p = 0,006). C.

GAD1

mRNA: n ekspression eturauhassyöpäsolulinjoissa mitataan kvantitatiivinen PCR.

GAD1

ilme on havaittavissa kastraatiotason kestävä solulinjoja NCI-H660, PC3 ja DU145, mutta ei androgen reagoiva solulinjoissa LNCaP ja LAPC4. 18S rRNA käytettiin sisäisenä standardina. ACk

t on ero kynnys on

GAD1

ja kynnys sykli 18S rRNA. ND: Ei määrätty. D.

GAD1

mRNA yli-ilmentymisen selvä solussa munuaiskarsinoomia korreloi vähentynyt kokonaiselossaolo. Kasvaimet, joiden

GAD1

z-pisteet +2 näyttö pieneni eloonjäämisen (mediaani 52,5 kuukautta) suhteessa kasvaimia, jotka eivät ole lisääntynyt

GAD1

lauseke (mediaani 80,6 kuukautta; p = 0,01 ). Kasvaimet, joiden

GAD1

z-pisteet +3 näyttö enemmän vähentynyt mediaani elinaika (mediaani 31,1 kuukautta) suhteessa jäljellä kasvainten (mediaani 78,4 kuukautta; p = 0,002).

Koska ilmaus NE geenien on liitetty kastraatiotason kestävä eturauhassyövän, erityisesti suhteessa lisääntynyt ilmentyminen NE merkki aromaattisen aminohapon dekarboksylaasin (

DDC

) in kastraatiotason kestävä eturauhasen syöpä [21], päätimme jos

GAD1

mRNA rikastettiin ihmisen kastraatiotason kestävä eturauhassyöpä. Mielenkiintoista on, että

GAD1

mRNA: n ekspressio oli havaittavissa vain kastraatiotason-resistenttejä solulinjoja (Fig. 2C), joilla on samanlaiset ekspressiotasot NCI-H660 NE syövän solulinja, ja PC3 ja DU145 adenokarsinooma solulinjat. Mitään havaittavaa ilmentymistä GAD1 tunnistettiin joko androgeenien reagoiva LNCaP ja LAPC4 solulinjat.

Koska raportin GAD1 proteiinin ilmentymisen osajoukko munuaiskarsinoomia [45], me kuulusteltiin äskettäin julkaistun tutkimus selkeän solun alatyyppiä munuaiskarsinoomia [40] kautta tarjottavia cBioPortal selvittää, onko olivat samanlaisia ​​selviytymisen ominaisuudet. Havaitsimme 39 potilasta kaikkiaan 499 potilasta (8%), joiden kasvaimet yli-ilmentyy

GAD1

mRNA joiden z-pistemäärä yli +2. Tämä ryhmä näkyy huomattavasti vähentynyt kokonaiselinaika suhteessa koko selkeä syöpä väestön mediaani elinaika 52,5 kuukautta verrattuna 80,6 kuukautta (p = 0,01). Sitten eristetty kohortin

GAD1

yliekspressoivat kasvain (n = 18), jossa z-arvoksi yli +3, ja havaitsi edelleen lasku kokonaiselossaoloaikaa mediaani elinaika 31,1 kuukautta verrattuna 78,4 kuukautta (p = 0,002) (Fig. 2D). Ei ollut merkittävää vaikutusta

GLUL

mRNA: n ilmentymisen potilaan selviytymistä tässä potilasryhmässä.

Pitoisuus Development

Mahdollisuuksia GABA on prognostista merkitystä tunnistaa osajoukkoja syöpäpotilaiden alentuneen eloonjäämisen sai meidät kehittämään määritystä GABA joita voitaisiin laajasti ja riippumaton teknisesti haastavia instrumentointi kuten massaspektrometrillä ja NMR. Kaavamaisen kytketyn reaktion tarvittavat kvantitoimiseksi GABA annetaan kuvassa. 3. kaupallisesti saatavilla ”GABase” valmistaminen

Pseudomonas fluorescens

on yhdistelmä ABAT ja ALDH5A1 entsyymin toimintaa, joka hapettaa GABA läpi sarjan kahden reaktion osaksi sukkinaatti, mikä johtaa kofaktorina NADP NADPH: ksi. NADPH hapetetaan sitten NADP mitokondrioiden diaforaasi kytkien vähentäminen resatsuriinin osaksi fluoresoivan tuotteen resorufiini. Vaikka ALDH5A1 voidaan käyttää sekä NAD + ja NADP substraatteina, NADP on perinteisesti käytetty kofaktorina tämän entsyymivalmisteen [26].

GABase valmiste, yhdistelmä ABAT ja ALDH5A1 entsyymejä

P. fluorescens

muuntaa GABA sukkinaatti kautta muuntaminen alfa-ketoglutaraatti glutamaatin ja NADP NADPH: ksi. Vaikka NAD tai NADP voidaan mahdollisesti käyttää substraattien ALDH5A1, NADP tavanomaisesti käytetään kofaktorina tätä valmistetta. Sukkiinisemialdehydiksi (SSAL), välituote GABA aineenvaihdunta on myös metaboloi GABase valmistamiseksi. Diaforaasi hapettaa NADPH ja vähentää resatsuriinia fluoresoiviksi resorufiini. Soveltaminen 2-aminoetyyli vety sulfaatti (2-AEHS), estäjä ABAT voidaan käyttää määrittämään osuus SSAL kokonais- signaalin tuotetaan GABA ja SSAL solulysaateista.

Assay Optimization

klassinen NADPH fluoresenssin entsyymiaktiivisuuden määritys [26] käytettiin perustana optimointi yksittäisten komponenttien resatsuriinia perustuvan lukeman GABA. Kunkin komponentin titrattiin yli konsentraatioalueella, pitäen kaikkien muiden komponenttien vakio (Fig. 4). Kuten odotettua, määritys oli herkkä resatsuriini, mikä osoittaa 5,9-kertaista kasvua signaalin taustalla pitoisuutena 6,25 uM.