Krooninen sairaus

tiivistelmä

syöpälääkkeen Ruxolitinib on voimakas Janus estäjäksi hyväksytty hoitoon on myeloproliferatiivinen kasvaimet. Lisäksi Ruxolitinib on heikko estävä vaikutus paneeli muiden kinaasien, mukaan lukien Src. Ei ole rakenteellista tietoa Ruxolitinib sitoutumisen minkä tahansa kinaasin. Tässä artikkelissa, me määrittää kiderakenteen c-Src verkkotunnus kompleksi Ruxolitinib resoluutiolla 2,26 Å. C-Src domain hyväksyy DFG-aktiivisessa konformaatiossa upon Ruxolitinib sitova, mikä osoittaa Ruxolitinib on tyypin I -estäjä c-Src. Ruxolitinib muodostaa kaksi vetysidoksia Met341, vesi-välitteisen vetysidoksen, jossa Thr338, ja useita van der Waalsin kontaktien c-Src. Ruxolitinib sitten telakoituna osaksi ligandia sitova taskussa aiemmin ratkaistu JAK1 rakenne. Vuodesta telakointi seurauksena Ruxolitinib sitoo myös JAK1 kuin tyypin I -estäjä, enemmän vuorovaikutusta ja korkeampi muoto täydentää ligandin sitovaan taskuun JAK1 verrattuna c-Src. Koska Ruxolitinib on suhteellisen pieni estäjä ja on huomattava välinen onkalo Ruxolitinib ja c-Src ligandia sitovasta taskusta, ehdotamme muuttaa Ruxolitinib kehittämään voimakkaita inhibiittoreita c-Src.

Citation: Duan Y, Chen L, Chen Y, Fan Xg (2014) c-Src sitoutuu Cancer Drug Ruxolitinib kanssa aktiivisen konformaation. PLoS ONE 9 (9): e106225. doi: 10,1371 /journal.pone.0106225

Editor: Wenqing Xu, University of Washington, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 11, 2014; Hyväksytty: 28 heinäkuu 2014; Julkaistu: 08 syyskuu 2014

Copyright: © 2014 Duan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Atomic koordinaatit ja rakenne tekijät on talletettu Protein Data Bank www.rcsb.org liittymisen numerot 4U5J.

Rahoitus: Tätä työtä tukee avustuksilla National Natural Science Foundation of China (YC, projekti numerot 81272971 ja 81372904) ja National Institutes of Health (NIH) (LC, 5R01GM064642). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Proteiinikinaasit katalysoivat siirto fosforyyliryhmä adenosiinitrifosfaatista (ATP) seriini, treoniini tai tyrosiinitähteiden sen substraatin proteiinien [1]. Tällaiset posttranslational muutokset toimia mekanismina moduloimiseksi entsymaattisen aktiivisuuden tai molekyylitason interaktioiden alustan proteiinien vastauksena endogeenisen ja eksogeenisen signaaleja [1]. Fosforylaatio on tärkeä merkitys signaalinsiirtomekanismeissa ja säätelee lukuisten soluprosessien lukien soluadheesion, invaasio, lisääntymistä, eloonjääntiä ja angiogeneesissä [2]. Yli-ilmentymisen tai mutaation proteiinikinaasien voi aiheuttaa erilaisia ​​ihmisen sairauksia, kuten syöpää ja autoimmuniteetti. Proteiinikinaasit ovat terapeuttisina kohteina ihmisten sairauksien hoidossa [3]. Prototyyppinä, Imatinibiin, tavoitteet BCR-Abl, konstitutiivisesti aktiivinen muoto Abl kinaasi, joka johtaa krooninen myelooinen leukemia (KML), ja on erittäin onnistunut hoidossa tämän taudin [4].

Koska on korkea sekvenssin säilyttäminen sisällä kinaasidomeenin, ei ole yllättävää, että useimmat estäjät on yleensä rajoitettu kohdespesifisyyden. Off-tavoite vaikutukset voivat olla hyödyllisiä joissakin tapauksissa, mutta voi johtaa sivuvaikutuksia muissa tapauksissa. Jokaisella estäjä on ainutlaatuinen ja erittäin arvaamaton tavoitespektri [5]. Ymmärtäminen mekanismia kohdespesifisyyttä on tärkeä tavoite, joka lisäisi olemassa olevien estäjät ja edistävän prosessia muodostunut inhibiittoreita. Esimerkiksi rakenneinformaatioon Imatinibin sitova kinaasi paitsi tutkittu monimutkainen aiottuun tavoite kinaasi Abl [6], mutta myös tutkittu monimutkainen muiden kinaasien, mukaan lukien c-Src, Lck, p38 [7] – [9] . Nämä tutkimukset suuresti auttaa meitä ymmärtämään perusteella kinaasin eston, valikoivuus ja mahdolliset off-tavoite vaikutuksia. Lisäksi nämä tutkimukset antavat rakenteellista tukirakenteen uusien estäjien eri kinaasien.

proteiinikinaasin estäjät jaetaan tyypillisesti kolmeen alatyyppiin: tyyppi I, tyyppi II ja tyypin III-inhibiittorit. Tyypin I inhibiittorit miehittää taskun ensisijaisesti täyttää ATP, ja katalyyttisesti tärkeä Asp-Phe-Gly (DFG) motiivi pidetään aktiivisessa konformaatiossa (kutsutaan DFG-konformaatiossa). Tyypillinen esimerkki tyypin I estäjä on toisen sukupolven BCR-Abl-estäjä, Dasatinibia. Tyyppi II-inhibiittorit, kuten Imatinibiin, miehittää ATP-sitova tasku ja lisäksi alue, ja DFG motiivi pyöritetään ~180 ° suhteessa aktiivisen konformaation (kutsutaan DFG-out konformaatiosta) [10] – [12 ]. Tyyppi III-inhibiittorit sitoutuvat säätelydomeenit ulkopuolella ATP-sitova tasku, sekä porrastaa kinaasiaktiivisuutta allosteerisessa tavalla. Koska aminohapot ulkopuolella ATP-sitova tasku ovat vähemmän konservoituneita suhteessa ne taskussa, on ehdotettu, että se voisi olla helpompi saavuttaa kinaasin selektiivinen tyyppi II tai III estäjiä.

yhden jäämän sisällä ATP-sivuston proteiinikinaasien, kutsutaan portinvartija, on tärkeä rooli muodostettaessa spesifisyys tasku, ja ohjaa herkkyys erilaisia ​​pienimolekyylisiä estäjiä. Portinvartija Jäännös vaihtelee eri proteiinikinaasien. Jotkut kinaasit on pieni jäännös (esim. Thr, Ala tai Gly) tässä asemassa, ja ne ovat helposti kohteena rakenteellisesti erilaisten luokkien estäjiä. Muut kinaasit hallussaan suurempi jäännöksen (esim Phe) tässä asemassa, ja ovat vastustuskykyisiä [13]. Mutaatio portinvartija jäännös on yhteinen resistenssimekanismi kinaasi-inhibiittorit. Esimerkiksi substituutio BCR-Abl gatekeeper Thr-315 Ile on johtanut Imatinibiresistenteiksi [14] – [16].

Ruxolitinib on voimakas Janus-kinaasi-inhibiittoria hoidettaessa myeloproliferatiivista kasvaimien (MPNs ) [17]. Se on voimakas estävä vaikutus JAK1 (IC

50 = 3,3 nM) ja JAK2 (IC

50 = 2,8 nM), kohtalainen aktiivisuus Tyk2 (IC

50 = 19 nM) ja heikko tehoaa JAK3 ( IC

50 = 428 nM), ja paneelin muiden kinaasien, mukaan lukien Src [18], [19]. JAK2 mutaatioita ja aktivointi on keskeinen asema etiologiassa ihmisen MPNs. Esimerkiksi noin puolet potilaista, joilla MPNs kuljettaa voitto-of-function mutaation JAK2-geenin (JAK2 V617F) [17], [18]. Ruxolitinib estää säädeltyyn JAK2 signalointireitin, ja osoitti merkittävää hyötyä kliinisissä tutkimuksissa. Vuonna 2011 Ruxolitinib hyväksyttiin hoitoon väli- tai korkean riskin myelofibrosis [20].

Ei ole rakenteellista tietoa Ruxolitinib sitoutumisen mitään kinaasi. Tässä artikkelissa, me tutkimme rakenteellinen perusta Ruxolitinib sitoutumisesta kinaasi käyttäen c-Src domain kuin prototyyppisiä järjestelmä. Määrittämällä rakennetta Ruxolitinib kompleksin 2,26 päätöslauselman, osoitimme, että c-Src domain hyväksyy DFG-aktiivisessa konformaatiossa. Ruxolitinib muodostaa kaksi vetysidoksia Met341, vesi-välitteisen vetysidoksen, jossa Thr338, ja useita van der Waalsin kontaktien c-Src. Sitten telakoituna Ruxolitinib osaksi ligandia sitova taskussa aiemmin ratkaistu JAK1 rakenne. Meidän telakka seurauksena Ruxolitinib sitoo myös JAK1 kuin tyypin I -estäjä, enemmän vuorovaikutusta ja korkeampi muoto täydentää ligandin sitovaan taskuun JAK1 kuin c-Src. Koska on olemassa huomattavaa välinen onkalo Ruxolitinib ja c-Src-ligandi-sitova tasku, on erittäin mahdollista muuttaa Ruxolitinib kehittämään voimakkaita inhibiittoreita c-Src.

Methods

Protein Expression and puhdistus

kana c-Src (tähteet 251-533), valmistettiin, kuten on aiemmin kuvattu [21]. Lyhyesti, proteiini ilmennettiin 6 x His-merkitty Escherichia coli BL21DE3 soluihin, kun läsnä on YopH fosfataasilla. Proteiini puhdistettiin ensin Ni-NTA-helmiä. 6 × His-tag poistettiin sitten TEV pilkkominen. Katkaisun jälkeen, anioninvaihtokromatografialla ja kokoekskluusiokromatografialla käytettiin edelleen proteiinin puhdistamiseksi. Proteiini 50 mM Tris (pH 8,0), 100 mM NaCl, 5% glyseroli, 1 mM DTT konsentroitiin 10 mg /ml ja flash-jäädytettiin varastointia varten -80 ° C: ssa.

kiteytys

c-Src /ruxolitinib kiteitä saatiin 18 ° C: ssa käyttäen hanging drop–hyörydiffusiomenetelmää. C-Src /ruxolitinib kompleksi sekoitettiin liuokseen, joka sisälsi 170 uM c-SRC, 2000 uM ruxolitinib, 10% DMSO, 50 mM Tris (pH 8,0), 100 mM NaCl, 5% glyserolia, 1 mM DTT: tä. Säiliö sisälsi 0,1 M MES (pH 6,4), 2% glyserolia, 8% PEG 4000, 50 mM natriumasetaattia, 10 mM MgCI 2: ta. Kiteet kylmäsuojattiin säiliössä liuosta sekä 20% glyserolia ja 2000 uM ruxolitinib. Crystal kuuluu avaruusryhmää P1 solun mitat ovat

= 42,107 Ä,

b

= 63,228 Ä,

c

= 73,989 Ä, α = 79,27 °, β = 89,27 °, γ = 90,29 °.

Tiedonkeruu ja Structure Determination

tietoja kerättiin Shanghain Synkrotronisäteily Facility (SSRF), beamline BL17U, ja Advanced Light Source (Lawrence Berkeley National Laboratory) beamlines 5.0.2 ja 8.2.1. Data pelkistettiin käyttäen HKL2000 [22]. Rakenne määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [23], [24]. Alkuvaihe määritys suoritettiin molekyyli- korvaaminen Phaser päässä CCP4 paketin [25], käyttämällä ketju A aiemmin ratkaistu c-Src rakenne (PDB-koodi 2SRC) [26], kun haku mallia. Rakenne puhdistettu käyttäen Phenix.refine ja Coot päässä Phenix paketti [27]. Tilastoihin kristallografiamalli analyysi on esitetty taulukossa 1. graafiset esitykset rakenne valmistettiin käyttämällä PyMol (Delano Scientific, San Francisco, CA). Koordinaatit ja rakenteelliset tekijät on talletettu Protein Data Bank liittymisen koodi 4U5J.

Molecular Docking ja rakenteellinen analyysi

Molecular telakointi suoritettiin käyttäen Molsoft ICM-Pro [28 ]. Ruxolitinib telakoitiin osaksi ligandia sitova taskussa JAK1 (ATE koodi: 3EYG) [29]. Tilavuus ligandia sitovan taskun laskettiin käyttämällä POCASA [30]. Kaaviot proteiini-ligandi-vuorovaikutusten luotiin käyttäen LIGPLOT [31].

Kinaasimääritykset

c-Src (laimennettu 50 mM Tris, pH 7,5, 0,1 mM EGTA, 0,1% β-merkaptoetanolia, 1 mg /ml BSA: ta) määritettiin vastaan ​​KVEKIGEGTYGVVYK lopputilavuudessa 25,5 ui, joka sisälsi 50 mM Tris, pH 7,5, 0,1 mM EGTA, 0,3 mM KVEKIGEGTYGVVYK, 10 mM magnesiumasetaattia ja 0,05 mM [33P-γ-ATP: tä] (50-1000 cpm /pmol) ja inkuboitiin 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Kokeet pysäytettiin lisäämällä 5 ui 0,5 M (3%) ortofosforihappoa, korjattu P81 Unifilter levyille pesupuskurilla 50 mM ortofosforihappoa, ja kuivattiin ilmassa. Kuivat Uni- jälkeen levyt suljettiin lisättäessä MicroScint O ja laskettiin Packard Top- count NXT: tuikeilmaisin.

Tulokset ja keskustelu

Ruxolitinib sitoutumaan ATP-sitova tasku c-Src

Jos haluat nähdä, miten syöpälääkkeen Ruxolitinib vuorovaikutuksessa kinaasi, päätimme röntgen rakenne c-Src in monimutkainen Ruxolitinib tarkkuudeksi 2,26 Å. Tilastossa tiedonkeruun ja malli hienosäätö on lueteltu taulukossa 1. Kukin epäsymmetrinen yksikkö sisältää kaksi molekyyliä c-Src. On hyvin määritelty elektroni tiheys Ruxolitinib sekä c-Src-molekyylejä, joka näyttää sitoa täysi miehitys (kuva S1). Rakenne c-Src koostuu bi-lohko arkkitehtuuri (N-lohko ja C-lohko), joka on tyypillinen proteiinityrosiinikinaaseja. ATP sitoutumiskohta c-Src sijaitsee taittuvat halkeama välillä N- ja C-terminaaliset lohkoa, jota ympäröi sarana-alueen, P-silmukka, Helix AC, ja aktivointi silmukka (kuvio 1A). Osa aktivointi silmukan (aminohapot 412-423) osoittaa ei elektronitiheys, mikä osoittaa, tämä alue on joustava. Siksi tämä alue ei sisälly ATE.

(A) Yleinen rakenne c-Src /Ruxolitinib monimutkainen. (B) toinen pyrrolopyrimidiini renkaat muodostavat kaksi vetysidoksia pääketjuatomit Met341. (C) Ruxolitinib muodostaa vesivälitteisiä vuorovaikutus Src gatekeeper jäännöksen Thr338.

Ruxolitinib sitoo ATP-sitova ontelo c-Src, jossa yksiselitteinen elektronitiheys havaittiin estäjän (kuva S1) . Se on suunnattu siten, että pyrrolopyrimidiini soi kohta kohti sarana-alueen, syklopentaani rengas pistettä kohti C-lohko, kun taas propaaninitriiliä yhtymä kohti P-silmukka (Kuva 1A). Pyrrolopyrimidiini renkaat muodostavat kaksi vetysidoksia pääketjun atomien Met341 (kuvio 1 B), samoin kuin vesi-välitteisen vuorovaikutus Src gatekeeper jäännös Thr338 (kuvio 1C). Lisäksi vetysidoksia, Ruxolitinib muodostaa myös useita van der Waalsin kontaktien c-Src (kuvio S2).

DFG motiivi etsii N-pään aktivointi silmukan, ja sen konformaatio on keskeinen rooli kinaasiaktiivisuuden [32]. DFG-in ja DFG-out konformaatioita edustavat kahta äärimmäistä valtioiden jatkumoa mahdollisuuksia [32]. Välitiloja havaitaan joissakin tapauksissa [26]. Kolme erillistä konformaatioita kinaasin domeenien Src-ryhmän kinaasien a DFG-aktiivisessa konformaatiossa, joka on DFG keskitaso aktiivinen konformaatio, ja DFG-out aktiivinen konformaatio [32]. Vuonna DFG-konformaation (kuvio 2A ja 2B, pdbs 3LCK ja 3DQW), aspartaatti- sivuketjun kasvoja suoraan ATP-sitoutumiskohta, ja fenyylialaniinin sivuketju kasvoja proteiiniin. Vuonna DFG-out konformaation (kuvio 2E, ATE 2OIQ), selkäranka DFG motiivin käännetään, aspartaatti- sdie ketjun poispäin ATP-sitoutumiskohtaan, kun taas fenyylialaniinin sivuketju sijaitsee ATP-sitoutumiskohtaan. Esimerkiksi kinaasidomeeni c-Src hyväksyy DFG-out konformaatio sitoutumisen Imatinib [33]. Vuonna DFG-väli- konformaation (kuvio 2D, ATE 2SRC), DFG-motiivi omaksuu konformaation välillä edellä kaksi konformaation. Vertasimme DFG-motiivi konformaation Src /Ruxolitinib monimutkainen näiden kolmen konformaatioita. Ilmeisesti kun Ruxolitinib sitova, c-Src domain pidetään DFG-konformaation (kuvio 2C).

(A) aktiivinen Lck DFG-konformaation (ATE: 3LCK); (B) aktiivinen c-Src T338I DFG-konformaation (ATE: 3DQW); (C) aktiivinen c-Src DFG-konformaatiossa Src /Ruxolitinib kompleksin (tämä työ); (D) aktiivinen c-Src in Src /CDK konformaation, DFG-väli (ATE: 2SRC); (E) aktiivinen c-Src DFG-out konformaation Src /Imatinibiin kompleksin (ATE: 2OIQ).

Kinaasidomeeni c-Src se käyttää erilaisia ​​konformaatioita sitoutuessaan eri estäjiä. C-Src /Imatinibiin monimutkainen, Imatinibin vie paitsi ATP-sitoutumiskohtaan, mutta myös ulottuu DFG motiivi ja miehittää ylimääräistä aluetta. DFG motiivi on DFG-out konformaation (kuvio 3A). C-Src /Ruxolitinib monimutkainen, Ruxolitinib vain vie ATP-sitoutumiskohta, ja c-Src tekee DFG-konformaatiossa. P-silmukka siirtyy lähemmäs C-lohko, joka johtaa tiukempi ATP-sitoutumiskohdan. Tämä voi johtua indusoidun-sovituksen mekanismilla (kuvio 3B). Näiden havaintojen perusteella, Imatinibi on tyypin II estäjä c-Src kun Ruxolitinib on tyypin I -estäjä c-Src.

(A) Pocket täyttöaste imatinibin c-Src /Imatinibi kompleksin (ATE : 2OIQ). C-Src rakenne on esitetty piirretty, värillinen magenta. Imatinibi esitetään alalla. (B) Pocket täyttöaste Ruxolitinib in c-Src /Ruxolitinib monimutkainen (tämä työ). C-Src rakenne on esitetty piirretty, värillinen keltaisella. Ruxolitinib esitetään alalla.

Useimmat estäjät ovat ATP-kilpailukykyisiä ja kuuluvat tyypin I estäjät. ATP-sitova tasku on konservoitunut jäsenten kinaasiperheen. Sen lisäksi, että ATP-sitova tasku, tyypin II estäjä sitoutuu vähemmän konservoitunut lisäksi tasku. Tyyppi II: n estäjä vaikuttaa indusoimalla konformaatiomuutoksen siten, että kinaasi ei enää pysty toimimaan. On ehdotettu, että tyypin II estäjä voisi paremmin selektiivisyys. Kuitenkin biologinen teho, erityisesti kliinistä tehoa, on lopullinen sovittelija.

vertailu sitovia taskuista Src ja JAK

Ruxolitinib on Janus estäjä, jolla on raportoitu IC

50-arvot 2,8 nM JAK2, 3.3 nM JAK1, 19 nM Tyk2, ja 428 nM JAK3 [18]. Lck, Src-perheen kinaasin, estyy Ruxolitinib kanssa raportoitiin IC

50-arvo 3,6 uM [19]. Käyttämällä kinaasimäärityksiä, huomasimme, että Ruxolitinib esti c-Src kanssa IC

50 2,92 uM (taulukko S1). Näin ollen, Src-kinaasien estyvät Ruxolitinib paljon vähäisemmässä määrin kuin JAK-kinaasien. Sekvenssi-identtisyys välillä Src ja JAK-perheen kinaasien on ~34% kinaasidomeenissa (kuvio 4A 4B). Sen lisäksi, että JAK-kinaasien on useita ylimääräisiä aminohappopätkiä (kuvio 4A, merkitty vihreällä laatikko), tunnistivat useita muita merkittäviä eroja Src perheen ja JAK kinaasiperheen. Thr338, portinvartija jäännös c-Src, korvataan Met JAK perhe; Met 341 c-Src, jäännös muodostaen kaksi vetysidoksia Ruxolitinib, korvataan Leusiini in JAK perhe (kuva 4A).

konservoitunut DFG motiivi on korostettu sinisellä box; portinvartija jäännös korostettu punaisella box; Jäännös vastaa Met341 c-Src on korostettu violetti box; useita ylimääräisiä aminohappopätkiä on korostettu vihreällä laatikkoon.

sitten päällekkäin meidän rakenteesta, jossa on JAK1 rakenne (ATE: 3EYG) [29]. Molemmat kinaasi verkkotunnuksia jakavat samanlaisen kokonaisrakenne kanssa RMSD 2,92 Å. P-silmukka JAK1 on lähempänä C-lohko, joka johtaa tiukempi tasku, verrattuna C-Src (kuvio 5A). Sitten käytimme POCASA [30] analysoida ligandia sitova taskut c-Src (rakennettamme) ja JAK1 (ATE koodi: 3EYG). JAK1 on pienempi tasku, jonka tilavuus on 311 Å

3, kun taas c-Src on isompi tasku, jonka ennustettu tilavuuteen 450 Å

3 (kuva 5B 5C).

( A) c-Src domain (tämä työ) on päällekkäin JAK1 kinaasidomeenissa (ATE: 3EYG) käyttäen Ca atomit kinaasidomeenin ohjearvon. c-Src näkyy keltaisena, kun JAK1 näkyy magenta. (B) Ennustettu c-Src ligandia sitova tasku näytetään harmaana pisteillä. (C) Ennustettu JAK1 ligandia sitova tasku näytetään harmaana pisteillä. Ligandia sitova tasku ennustetaan käyttämällä POCASA [30].

ymmärtämään paremmin, miten Ruxolitinib erottaa nämä kinaasi perheet, me typistetty Ruxolitinib osaksi aiemmin ratkaistu JAK1 rakenne (ATE: 3EYG) [29]. Telakka tulos osoittaa, että Ruxolitinib vain vie ATP-sitoutumiskohta, ja DFG motiivi pidetään DFG-aktiivisen konformaation (kuvio 6A), mikä viittaa siihen, että Ruxolitinib on myös tyypin I inhibiittori JAK1. Tämä on yhdenmukaista aikaisempien havainnon käyttämällä kilpailevan sitoutumisen määritykset [5]. Ruxolitinib on suunnattu siten, että pyrrolopyrimidiini soi kohta kohti sarana-alueen. Sen sijaan, että muodostuu kaksi vetysidoksia Met341 c-src pyrrolopyrimidiini renkaat muodostavat kaksi vetysidoksia pääketjun Glu957 ja Leu959 (kuvio 6B). Merkittävä ero Ruxolitinib sitoutumisesta c-Src ja JAK1 sijaitsee suunta syklopentaanirenkaassa. Se muistuttaa kohti C-lohko C-Src /Ruxolitinib kompleksin, kun taas pistettä kohti N-lohko sitoutuneena JAK1 (kuvio 6B). Toinen merkittävä ero on, että propaaninitriiliä ryhmä Ruxolitinib tekee yhteyksiä JAK1, vaikka se ei ole vuorovaikutuksessa c-Src (kuva S3).

(A) Ruxolitinib telakoitiin osaksi ligandia sitova taskussa JAK1 ( ATE: 3EYG). JAK1 kinaasidomeeni näytetään sarjakuva, ja värillinen magenta. Ruxilitinib esitetään alalla. (B) Ennustettu välisten vetysidosten Ruxolitinib ja JAK1 sarana-alue. Perustuen telakointi seurauksena pyrrolopyrimidiini renkaat Ruxolitinib muodostavat kaksi vetysidoksia JAK1 Glu957 ja Leu959. (C) Muoto täydentävät toisiaan Ruxolitinib ja JAK1 ligandia sitova tasku. (D) Muoto täydentävät toisiaan Ruxolitinib ja c-Src ligandia sitova tasku. Ennustettu ligandia sitova tasku näytetään harmaalla mesh.

On korkea muoto täydentävät toisiaan Ruxolitinib ja JAK1 ATP-sitova tasku (kuvio 6C), mikä aiheuttaa lisää yhteyksiä jäämiä ympäröivä tasku kuin c-Src (kuva S3). C-Src /Ruxolitinib monimutkainen, on huomattava ontelon vieressä Ruxolitinib ligandin sitova tasku, erityisesti välillä Ruxolitinib ja Helix aC c-Src (kuvio 6D). Enemmän vuorovaikutusta ja korkeampi muoto täydentää voisi olla syy, miksi Ruxolitinib on voimakkaampi inhibiittorin JAK-kinaasien kuin Src-kinaasien.

Ruxolitiib on suhteellisen pieni inhibiittori, jonka molekyylipaino on 306,37 g /mol. Lisäämällä ylimääräistä ryhmät Ruxolitinib voisi johtaa löytämään uusia yhdisteitä, jotka ovat tehokkaita estäjiä c-Src. Esimerkiksi lisäämällä joitakin kemialliset ryhmät täyttämään ontelon välistä Ruxolitinib ja Helix aC c-Src voisi parantaa uuden yhdisteen affiniteetin kanssa Src kinaasien. Kuitenkin, koska kasvu ligandin määrän, uusi yhdiste olisi todennäköisesti liian suuri täyttämään JAK ligandia sitova tasku, siis voisi olla huono estäjän JAK-kinaasien.

Johtopäätökset

tässä artikkelissa esitämme kiderakenne Ruxolitinib sidottu kinaasidomeeni c-Src. Vaikka Ruxolitinib ei ole tehokas inhibiittori c-Src, kiderakenne osoittaa, että c-Src-kinaasin domeeni pidetään DFG-aktiivisessa konformaatiossa, mikä on ominaista tyypin I: n estäjä. Lisäksi olemme telakoituna Ruxolitinib osaksi ligandia sitova taskussa aiemmin ratkaistu JAK1 rakenne. Meidän telakka seurauksena Ruxolitinib sitoo myös JAK1 tyypiksi I: n estäjä. Verrattuna sen sitoutumisesta c-Src, Ruxolitinib on enemmän vuorovaikutusta ja korkeampi muoto täydentää JAK1 ligandia sitova tasku, joka voi olla tärkein syy, miksi Ruxolitinib on paljon voimakas estäjä vastaan ​​JAK-kinaasien kuin Src kinaasien. Meidän rakenneanalyysi, huomasimme, että on olemassa huomattava onkalo välillä Ruxolitinib ja c-Src ligandia sitova tasku, mikä viittaa siihen, että muuttamalla Ruxolitinib voisi johtaa kehitystä voimakas c-Src-inhibiittorit.

tukeminen Information

Kuva S1.

Fo-Fc jättää kartan Ruxolitinib c-Src /Ruxolitinib monimutkainen. Elektroni tiheys on muotoiltu klo 2σ ja on päällekkäin lopulliseen malliin.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0106225.s001

(TIFF) B Kuva S2.

Kaavakuva ptotein ligandivuorovaikutuksien c-Src /Ruxolitinib monimutkainen. Vetysidoksia katkoviivoin atomien välillä mukana, kun taas hydrofobiset kontaktit edustaa kaari pinnoja. Kaaviossa kertyi LIGPLOT [31] (Täydentävä viite).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0106225.s002

(TIFF) B Kuva S3.

Kaavakuva ptotein ligandivuorovaikutuksien in JAK1 /Ruxolitinib telakointi tuloksen. Vetysidoksia katkoviivoin atomien välillä mukana, kun taas hydrofobiset kontaktit edustaa kaari pinnoja. Kaaviossa kertyi LIGPLOT [31] (Täydentävä viite).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0106225.s003

(TIFF) B Taulukko S1.

Kinaasimääritykset osoittavat, että Ruxolitinib esti c-Src, jonka IC50 on 2,93 uM.

doi: 10,1371 /journal.pone.0106225.s004

(DOCX) B

Tiedoksi

Kiitämme Xiao Lei, Kaori Noridomi, ja Shuxing Li kokeellisiin apua ja keskustelua. Kiitämme Chao Zhang tarjoamiseksi c-Src ekspressiovektoriin. Kiitämme Meng Xia ja Stephanie Chu apua muokkausta. Kiitämme ALS BCSB henkilökunnan Corie Ralston ja Kevin Royal apua tiedonkeruuta. Kiitämme SSRF BL17U henkilökunnalle apua tiedonkeruuta. Kiitämme kansainvälinen keskus Kinase Profilointi apua kinaasianalyysiä.