Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

mesenkyymikasvaimia stromasoluja voi edustaa ihanteellinen ehdokas toimittaa syöpälääkkeet. Aikaisemmassa tutkimuksessa olemme osoittaneet, että altistuminen hiiren luuytimestä peräisin stroomasolujen doksorubisiinille johti ne voivat hankkia anti-proliferatiivista potentiaalia kohti viljeltiin yh- hematopoieettisten kantasolujen (HSC: iden). Meillä on siis hypoteesin onko vasta eristettyä ihmisen luuytimen mesenkymaaliset kantasolut (hMSC) ja kypsä hiiren stroomasolut (SR4987 viiva) pohjustettu

in vitro

kanssa syöpälääkkeiden ja sitten paikallinen lähellä syöpäsoluja, voi estää leviämisen.

menetelmät ja tärkeimmät havainnot

Paklitakseli (PTX) käytettiin ensisijaisena hMSC: eiden viljelyn ja SR4987. Sisällyttäminen PTX osaksi hMSC tutkittiin käyttämällä FICT-leimattua-PTX ja analysoitiin FACS: llä ja konfokaalimikroskopialla. Vapautuminen PTX in viljelyalustasta PTX pohjustetaan hMSC (hMSCsPTX) tutkittiin HPLC: llä. Culture endoteelisolujen (EC) ja aortta rengas määritystä käytettiin testaamaan antiangiogeenisen aktiivisuuden hMSCsPTX ja PTX pohjustetaan SR4987 (SR4987PTX), kun taas antituumorivaikutuksen testattiin

in vitro

useat erilaiset kasvainsolulinjoja ja in vivo yhteistyössä siirtämällä hMSCsPTX ja SR4987PTX syöpäsolujen hiirillä. Kuitenkin, vaikka solut häviävät, koska kemoterapian indusoiman apoptoosin, sekä hMSC: eitä ja SR4987 pystyivät nopeasti sisällyttää PTX ja voi vapauttaa hitaasti PTX viljelyalustassa ajassa riippuvaisella tavalla. PTX pohjustettu solut hankkinut voimakas anti-kasvain ja antiangiogeenisen

in vitro

että riippui annoksesta, ja osoitettavissa käyttämällä niiden kasvualusta tai rinnakkaisviljelemällä määrityksessä. Lopuksi hMSCsPTX ja SR4987PTX yhteistyössä ruiskutettiin ihmisen syöpäsoluja (DU145 ja U87MG) ja hiiren melanoomasoluja (B16) immuunivajaissa ja syngcenisiä hiirillä merkittävästi viivästynyt kasvaimen vie ja vähensi kasvainten kasvua.

Johtopäätökset

Nämä tiedot osoittavat ensimmäistä kertaa, että ilman geenimanipulaation, mesenkymaaliset stroomasoluista voi omaksumisen ja myöhemmin vapauttaa hitaasti PTX. Tämä voi johtaa mahdollisiin uusia työkaluja lisätä tehoa syövän hoidossa.

Citation: Pessina A, Bonomi A Cocce V Invernici G, Navone S, Cavicchini L, et al. (2011) Mesenkymaaliset stroomassoluihin pohjustettu Paklitakseli Antaa New Approach Cancer Therapy. PLoS ONE 6 (12): e28321. doi: 10,1371 /journal.pone.0028321

Editor: Marc Tjwa, University of Frankfurt – University Hospital Frankfurt, Saksa

vastaanotettu: 15 huhtikuu 2011; Hyväksytty: 5. marraskuuta 2011; Julkaistu: 20 joulukuu 2011

Copyright: © 2011 Pessina et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus oli osittain tuettu AIRC (Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro) Project AIRC IG-9062, National Italian Grant PUR 2008 ja Fondazione Banca del Monte di Lombardia. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

päätavoitteena syöpähoidon on paikallistaa lääkkeen vaikutusta kasvaimen mikroympäristön jotta tappaa niin monta syöpäsoluja kuin mahdollista samalla tuottaa alhaisin vakuuden myrkyllisyyttä. Voit tehdä tämän, merkittävä määrä teknisiä lähestymistapoja, käytöstä myrkyllisten immunokonjugaattien kohdistamiseen kasvaimen antigeenejä [1] hienostunut nanohiukkasten käyttöön [2] tai manipuloida kantasolujen [3] huumeiden toimitus, on tutkittu ja julkaistu viimeisten 20 vuoden aikana. Koska mesenkymaaliset kantasolut (MSC: t) helposti sopeutumaan viljelyolosuhteet tarpeen

in vitro

manipulointia ja kotiin sairaan kudoksen kun pistetään

in vivo

, nämä solut näyttävät edustavan paras valinta tuottaa anti -tumor aineet [4], [5]. Siirtogeenisiä menettelyjä on käytetty indusoimaan MSC-erittävän terapeuttista sytokiinejä tai kasvua ja estävän tekijät [6], [7]. Viimeaikaiset tiedot ovat osoittaneet, että suunnitellut MSC: tuottaa anti-kasvain tekijöitä, joilla on kyky tappaa syöpäsoluja sekä

in vitro

ja

in vivo

[3], [8] – [12]. Vaikka lupaavia tuloksia eläimillä, geneettistä manipulointia MSC: kliinisen sovelluksen ihmisissä on joitakin riskejä [13].

Aikaisemmassa tutkimuksessa osoitimme, että hiiren luuytimen (BM) peräisin stroomasolulinja (SR4987 solulinja) viljeltiin doksorubisiinin (DXR), joka on voimakas anti-syöpä yhdiste, pystyivät ottoa merkittäviä määriä lääkettä osoittamatta merkittävää toksisuusoireiden. Sen sijaan, hematopoieettiset kantasolut (HSC: t) BM olivat hyvin herkkiä DXR. Mielenkiintoista on, havaitsimme merkittävää inhibitiota HSC: iden aiheuttama pesäkkeiden muodostumisen yksiköt (CFU) kun viljeltiin yhdessä SR4987 pohjustetaan ensin DXR. Olemme päätellä, että hiiren stromasoluja voi toimia varastona DXR että tämän jälkeen voi vapauttaa joitakin DXR aineenvaihduntatuotteita tai jopa DXR alkuperäisessä muodossaan, joka johtaa HSC: ihin aiheuttamaa CFU esto [14]. Niinpä me arveltu, että myös

in vivo

, BM stroomasolut voi olla kaksoisrooli säätelyssä huumeiden myrkyllisyys, riippuen niiden kyvystä omaksumisen ja vapauttamaan kemoterapeuttiset lääkkeet [14]. Ottaen huomioon nämä ominaisuudet, me täällä tutkia, ihmisen MSC: (hMSC) juuri valmistettu BM ja hiiri SR4987, kun pohjustus kanssa syövän vastaisen ja antiangiogeeninen huumeiden paklitakseli (PTX), voi hankkia kyky tappaa kasvainsoluja (TCS) niiden läheisyydessä .

Paklitakseli on erittäin lipofiilinen lääke (johdettu

Taxus brevifoliasta

), erittäin aktiivinen monissa kiinteitä kasvaimia ja myös voitava estää endoteelisolujen proliferaation. Paklitakseli vaikuttaa solun tukirangan edistämällä mikrotubulusten polymeroitumisen indusoi mitoosi pidätyksen solun [15], [16].

Me osoittaa, ensimmäistä kertaa, että on aikariippuvainen kinetiikka, hMSC ja hiiri SR4987 pohjamaalattu kanssa PTX (MSCsPTX, SR4987PTX) vapauttavat lääkeaineen määränä riittää vaikuttamaan kasvainten leviämisen, tappaa endoteelisolujen (EC)

in vitro

ja, mikä tärkeintä, vähentää kasvaimen kasvua

in vivo

. Tuloksemme ovat ensimmäinen osoitus siitä, yksinkertaisen

in vitro

menettelyssä hMSC ja hiiren stroomasolujen voidaan kuormittaa syöpälääkkeitä ja käyttää

in vivo

päästää niitä kasvain microenvironment.

tulokset

karakterisointi MSC P-glykoproteiinin (P-gp) ilmentyminen ja herkkyys PTX

solut tässä tutkimuksessa käytetyt kolme erilaista tuoretta valmisteet hMSC ja hiiren stroomasolulinja SR4987 [17]. Viljellyt hMSC: t analysoitiin vahvistaa ilmentymisen MSC markkereita sekä niiden multipotentti erilaistumista kapasiteettia. He olivat positiivisia CD44 +, CD73 +, CD90 +, CD105 +, ja HLA-I ja negatiivinen CD14-, CD31-, CD34-, CD45-, CD80- ja HLA-II. Kun viljellään erottaa olosuhteissa, ne osti osteo-adipo ja kondroblasteiksi markkereita (Fig. S1). Me seuraavaksi arvioidaan herkkyys hMSC: eiden ja SR4987 PTX, on 24 h sytotoksisuuden testi ja anti-lisääntymisen määrityksessä on 7 päivää (Fig. 1A, B). SR4987 ja hMSC: t olivat herkkiä anti-proliferatiivista aktiivisuutta PTX, mukaan annoksesta riippuvan kinetiikan, jolla on IC

50-arvo oli 25,6 ± 11,08 ng /ml ja 4,07 ± 1,75 ng /ml vastaavasti. Sitä vastoin, sekä SR4987 ja hMSC: t olivat vahvasti resistenttejä PTX suoraan sytotoksisuuteen, joilla on hyvin vähän solujen kuolemaa jopa suurempina pitoisuuksina 10,000 ng /ml (kuvio. 1A, B). Estyminen hMSC ja SR4987 lisääntymistä PTX varmistettiin suorittamalla solusyklin analyysi, osoittaa merkittävää kerääntymistä solujen S ja vähäisessä määrin, G2 /M vaiheessa. Elinkelpoisuus Sekä hMSC ja SR4987 soluja ei vaikuttanut merkittävästi ja solut irrotetaan, pestään, ja niitä siirrostetaan puuttuessa lääkkeen antoi yksisolukerros solun elinkelpoisuus on välillä valvonnan ja solusykliä kuvio palautunut 72 h (Fig. S2 ). Nämä tiedot on vahvistettu prosenttiosuudet apoptoottisten /nekroottisten solujen laskettiin eri koeolosuhteissa anneksiini määrityksessä (taulukko S1). Hoito ei tuota jotkut menetys solujen johtuu kemoterapian indusoiman apoptoosin, vaikka ainoa merkittävä apoptoosin lisääntyminen (P 0,05) oli osoituksena SR4987 soluissa (24 tuntia hoidon PTX), joka otetaan talteen, kun lääkkeen vaihto (24 + 24 h). Nämä tiedot ovat yhtä mieltä koskevia muiden kirjoittajien herkkyydestä stroomasoluissa paklitakseliin [18], [19].

Eri pitoisuuksia PTX (0,1-10,000 ng /ml) lisättiin kulttuuriin hMSC: eiden (Fig. 1A) ja hiiren SR4987 (Fig. 1 B). Sytotoksinen aktiivisuus arvioitiin 24 tunnin hoidon; vaikutus proliferaatioon 7 päivänä kulttuurin jonka MTT-määrityksellä. Optinen tiheys mitataan kulttuureissa MSC, jotka eivät saaneet PTX katsottiin 100% lisääntymistä. Huomaa, että pitoisuus PTX jopa 10.000 ng /ml ei vaikuttanut myöskään hMSC tai SR4987 solujen elinkykyä. Pieni taulukot aseta A- ja B osoittavat IC

50 ja IC

90 aiheuttama PTX on hMSC ja SR4987 vastaavasti. Sekä medium (CM) alkaen PTX pohjustetaan soluista (hMSCsPTX-CM ja SR4987PTX-CM) tuotti annoksesta riippuvaisen kasvun inhibition MOLT-4 raportoitu (Fig. 1 C) kuin prosenttia tuottaman CM käsittelemättömästä soluista (hMSC-CM ja SR4987-CM). Huomaa, että on 1:16 laimentaminen sekä hMSCsPTX-CM ja SR4987PTX-CM tuotettu 100% kasvun inhibitio yhtä suuri kuin niihin, jotka saatiin 3,13 ng /ml PTX. Tämä biologinen määritystä käytettiin arvioimaan PEC vapauttaa yhden PTX käsitelty hMSC ja sen kerääntyminen viljelyalustassa aikana (D). Histogrammi osoittaa PEC vapauttaa hMSCPTX eri aikoina kulttuurin. Käyrä osoittaa PEC kerääntymistä hMSCsPTX-CM. Huomaa, että jokainen hMSCPTX vapauttaa noin 1 pg PEC 24 h, saavuttaen maksimaalisen kertymistä noin 1,7 pg kuluttua 144 h. Arvo ovat keskiarvo ± keskihajonta (SD) viiden itsenäisen kokeen.

Sekä hMSC ja SR4987 solut ilmensivät P-gp joka alas-moduloitu käsittelemällä PTX ja verapamiilin (VP). Läsnäolo VP lisääntynyt SR4987 herkkyys anti-leviämisen aktiivisuus PTX, kun se ei ollut tehokas hMSC (Fig. S3).

PTX-otto ja vapautumista hMSC

Perustuen aikaisemmat tutkimukset [14], subkonfluenteista kulttuuri (3 x 10

5) kiinni olevista hMSC altistettiin 24 h 2,000 ng /ml PTX (tarpeeksi täysin estää soluproliferaatiota, mutta ei pysty vaikuttaa solujen elinkykyyn). Usean pesun jälkeen ja trypsinoimalla, hMSCsPTX viljeltiin edelleen 24 tuntia ja kunnostetun alustan (CM) testattiin Molt-4, joka on leukemiasolulinja hyvin herkkä PTX (IC

50 1,48 ± 1,06 ng /ml) [ ,,,0],20]. CM sekä viljelmistä hMSCPTX (hMSCsPTX-CM) tuotti voimakkaan annoksesta riippuvan anti-proliferatiivinen vaikutus MOLT-4, jotka vastaavat saatiin puhdasta PTX annoksilla 0,39-50 ng /ml (kuvio. 1C). Sitä vastoin CM valvonnan soluja (hMSC: t-CM) eivät olleet tehokkaita. Vertaamalla estävä aktiivisuus puhtaan PTX ja CM on Molt-4, laskimme PTX vastaava pitoisuus (PEC) on CM käytetty arvioitaessa PEC vapauttaa yhden solun (PEC pg /solu). Yhteenlaskettu PEC sisäistää hMSCsPTX 24 h, arvioi testaamalla hMSCsPTX solulysaateissa, oli 2,67 ± 0,8 pg /solu, mikä viittaa siihen, että hMSC 24 h voisi sisällyttää noin 8%: n PTX perin käytettävissä (33,3 pg /solu). Tuloksia lysaatit hMSC: eiden vahvistettu formaliinilla ennen PTX pohjustusta havaitsi muutamia epäspesifistä sitoutumista PTX, vastaten 0,11 ± 0,01 PEC pg /solu (noin 4% kaikista PEC läsnä lysaatti eläviä soluja).

sen jälkeen laskimme ajasta riippuva vapautuminen PEC mukaan hMSCsPTX korvaamalla ja keräämällä niiden CM eri aikavälein. Havaittavissa aktiivisuus PEC oli läsnä kuluttua 2 h inkuboinnin hMSCsPTX saavuttaa PEC 1 pg /solu ensimmäisten 24 tunnin viljelyn, ja sen pitoisuus on enintään noin 1,7-2,0 pg /solu 144 h (Fig. 1 D). Koska nämä arvot eivät lisääntyneet enää Inkuboinnin arvioimme, että noin 25-30% koko PEC löytyy solu- lysaatti säilytettävä solut ja koskaan julkaistu. Sisäistämisen PTX osaksi hMSC tutkittiin konfokaalimikroskopiaa käyttäen Fluorescent PTX (PTX-F) (Fig. 2A). PTX-F lokalisointi hMSC analysoitiin ajan kuluessa. 1 tunnin kuluttua ja pohjustus, sisäistämisen PTX-F by hMSC oli tuntuva. Värjäytyminen oli voimakas ja rikastettu sisällä rakkuloiden lopussa pohjustus (24 h). 24 tunnin kuluttua, havaitsimme, että jakelu PTX-F jäi ainoastaan ​​vesikkelit, joista monet olivat lähellä solukalvon, mikä viittaa mahdolliseen eritystä. Arvioida, PTX-F rikastui rakkulat peräisin Golgin laite, kolokalisaation analyysi suoritettiin vuonna hMSC värjätään markkeri Bodipy® TR seramidiksi. Kuten nähdään valkoiset täplät kuviossa 2A naamio, havaitsimme korkeatasoinen rinnakkaispaikantumisen välillä PTX-F ja Bodipy® TR seramidiksi, mikä tarkoittaa, että PTX-F on sisäistänyt sisällä Golgi-johdettu rakkulat. Siten PTX-F kerääntyy rakkulat sijasta kertyvän mikrotubulusten [15] monien muiden vierasaineiden tehdä [21], ja sen tasot vähenee hMSC jälkeen kinetiikka esitetään FACS-analyysi (kuvio. 2A ja Fig. S4).

sisäistämisen PTX-F analysoitiin konfokaalimikroskopiaa (A) elävillä hMSC pohjustetaan 1 (1) tai 24 (24) h PTX-F (vihreä) ja täynnä Golgin markkeri BOPIPY®TR keramidiin (punainen). Solut havaittiin myös 24 h kuluttua pesuvaiheen (24 + 24). PTX-F kerääntyy soluihin ja lokalisoituu Golgin laitteeseen tai Golgin johdettu rakkulat. Mask paneeli korostaa kolokalisaation välillä PTX-F ja BODIPY®TR seramidiksi osoittaa valkoiset täplät, jotka osoittavat ne pikselit, jossa sekä fluoresoivat signaalit ovat havaittavissa .. valkoiset viivat edustavat solun rajan ja nuolet osoittavat rakkulat lähelle solukalvon. Mitta-asteikko: 20 um. Vapauttamista PTX on hMSCsPTX-CM 24 tunnin analysoitiin HPLC: llä. Eluutioprofiili (B) verrattiin puhtaiden PTX on 1,000 ng /ml (C). Luku kertoo kromatogrammi profiilia yhdestä tyypillisestä kokeesta, jossa hMSCsPTX-CM osoittaa oikeutta huippu, joka selkeästi PTX ja kvantifioitiin PTX standardikäyrä kuin 68,1 ng /ml. Kuvio 2D raportoi profiilin hMSC-CM viljelty ilman PTX. Huippu merkitty I.S. on sisäisen standardin kefalomanniinin lisättiin kaikkiin näytteisiin oikean kvantifiointiin PTX.

Läsnäolo PTX in hMSCsPTX-CM vahvistettiin HPLC-analyysillä. HPLC-kromatogrammit saatu hMSCsPTX-CM ja standardi näyte PTX PBS: ssä (1,000 ng /ml) (Fig. 2B, C) osoittavat, että huippu identtinen retentioajan PTX eluoitiin hMSCsPTX-CM. HPLC-analyysi paljasti, että läsnä on muita ei-spesifinen huiput (2,5-4 minuuttia) johtuvat todennäköisesti yhdisteiden solujen tuottama ja ei korreloi läsnä PTX, koska läsnä myös kromatogrammissa ohjaus keskipitkän hMSC: eiden-CM (Fig. 2D). Läsnäolo tärkeimmät PTX metaboliitin, 6-alfa-hydroksi-paklitakseli, yleensä eluoitui 5,5 minuutissa ja muiden PTX aineenvaihduntatuotteiden voidaan sulkea pois. [22]

Samanlainen PTX pohjustus tekniikkaa on sovellettu hiiren SR4987 joka osoitti samanlaista kinetiikkaa sisällyttämistä ja vapautumista PTX, joilla on suurempi suuntaus lääkeaineen vapautumisen ensimmäisten 24 tunnin inkuboinnin (tietoja ei esitetty).

HMSCsPTX ja SR4987PTX inhiboivat erilaisten TCs

in vitro

arvioimiseksi

in vitro

anti-kasvain potentiaali hMSCsPTX ja hiiri SR4987PTX, me sitten tutkittiin vaikutusta hMSCsPTX-CM kahdella ihmisen solulinjoissa (DU145, T98G ) ja SR4987PTX-CM hiiren B16 melanoomasolulinjalla. Kuten on esitetty kuviossa. 3, lisäksi hMSCsPTX-CM on 1:04-1:08 laimennus indusoi jopa 80% kasvun inhibitio kaikilla kasvainsolulinjoja (Fig. 3A). Tällä 1:02 laimennus, mikä vastaa lisäämällä noin 25 ng /ml puhdasta PTX, 100% kasvaimen kasvun inhibitio saatiin (Fig. 3B). Yhdistämällä nämä tiedot niillä, kinetiikka julkaisu (Fig. 1 D), voisimme arvioida, että 24 tuntia, 3 x 10

5 hMSCsPTX voi vapauttaa noin 50-60 ng /ml PEC jotka ovat pitoisuudet 3-5 kertaiseksi IC

90 arvot PTX varten syöpäsoluja tutkittu. Lisäämällä ohjaus hMSC: eiden-CM ei vaikuttanut TCs proliferaatiota (tuloksia ei ole esitetty). Kapasiteetti hMSCsPTX estää eri TCs lisääntymistä vahvistettiin yhdessä viljelemisen määritys, jossa hMSCsPTX ja TCs sekoitettiin eri suhteilla (välillä 01:01 ja 1:100). Läsnäolo hMSCsPTX inhiboi proliferaatiota kaikissa kasvaintyypeissä testatuissa solulinjoissa, mukaan niiden suhteellinen esiintyminen (Fig. 3C, D, E). Tämä antoi meille mahdollisuuden laskea mielivaltaisen arvo ilmaistuna suhde hMSCsPTX ja TCs jotka tuottivat IC

50. IC

50-arvot olivat 01:47 ja MOLT-4, 01:05 sillä T98G ja DU145 ja vain 1:2-3 varten B16 syöpäsoluja. Lisäämällä ohjaus hMSC: eiden ei olennaisesti vaikuta Ahkerien proliferaatiota, vaikka pieni merkittävän kasvun inhibitiota (p 0,02) havaittiin 1:01 suhde kaikkien kasvaimen testatuissa solulinjoissa.

(A) on esitetty kinetiikan kasvun inhibition aiheuttamaa sarjalaimennoksia hMSCsPTX-CM on T98G, DU145 ja SR4987PTX-CM on B16, joka verrattiin aktiivisuuteen eri pitoisuuksia PTX samalla TCs (B). CM lisäys tuotti vahvan antiproliferatiivinen vaikutus kaikkiin TCs testattiin annosriippuvaisesti: 01:16 ja 01:04 laimennokset IC

50 ja IC

90 kasvun estäminen kaikilla TC linjat vastaavasti vastaavat PTX pitoisuudet tarpeen saada IC

50 ja IC

90 erilaisista kasvainsoluihin raportoitu pieni pöytä insertin (B). Esto TCs leviämisen saatiin myös suoraan yhdessä dosviljelmämäärityksessä. Pohjamaalattu hMSCsPTX sekoitettu, eri suhteissa (1:100-1:10-1:1 MSC: t /TCS), jossa MOLT-4 (C), T98G (D), DU145 (E) osoitti annosriippuvaisen kyky estää TCs leviämisen arvioidaan joka MTT testissä 7 vuorokauden ilmaistuna prosenttia OD mitattiin TCs viljellä ohjaus pelkästään väliainetta (CTR) tai läsnäollessa ole esitäytetty hMSC: eitä. SR4987PTX käyttäytyi kuin hMSCsPTX. Kuitenkin, vaikka ei esikäsitelty SR4987 sinänsä osoitti jonkin verran anti-proliferatiivista kapasiteettia B16 klo 01:01 suhde (F). Histogrammit raportoi keskiarvo ± SD kolmesta kokeesta, jossa tilastollisen merkittävyyden seuraavasti:

* (p 0,05) B,

** (p 0,01) vs

kasvainsolujen kasvua (CTRL) .

hiiri SR4987PTX toimi kuin hMSCsPTX kertymä ja lääkeaineen vapautumista testattuna MTT: llä on CM (Fig. 1A). Kuitenkin yhdessä dosviljelmämäärityksessä, SR4987 solut ”sinänsä” tuotti esto B16-melanoomasoluja (p 0,05), joka ei poikkea tuottama SR4987PTX (Fig. 3F).

hMSCSPTX ja hiiren SR4987PTX näyttää voimakkaita

in vitro

anti-angiogeeninen aktiivisuus

Koska PTX pidetään angiogeneesin inhibiittori [16], [23], me siis tutkitaan, onko hMSCsPTX ja SR4987PTX voi vaikuttaa angiogeneesiin

in vitro

(Fig. 4). Antiangiogeenisiä aktiivisuus puhdasta PTX alun perin testattiin HUVEC ja mikrovaskulaarista EC (HMECs) lisääntymistä. PTX annoksina jopa 10 ng /ml oli erittäin sytotoksinen sekä HUVEC ja HMECs. PTX tuotti noin 50% hankittua kasvun esto (IC

50) 4,6 ng /ml (Fig. 4A). Vaikutus hMSCsPTX-CM on HUVEC ja HMECs oli erittäin sytotoksinen 1:02 ja 1:04 laimennukset (Fig. 4B, C). Klo 01:08 hMSCsPTX-CM esti sekä HUVEC ja HMECs proliferaatiota mutta vähemmän kuin 5 ng /ml puhdasta PTX. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin yhdessä viljelemisen määrityksessä (Fig. 4D, E, F). Suhde 1:01 ja 1:05 on hMSCsPTX /EC tuotetaan voimakas sytotoksinen vaikutus sekä HUVEC ja HMECs, kun taas suhde 01:10, sytotoksisuutta, mutta merkittävä hankittua kasvun esto havaittiin (Fig. 4D, E). Mielenkiintoista on, on suhde 1:05, hMSCsPTX aloitettiin tappaa HMECs ensimmäisen 24 h co-kulttuuri; 72 tunnin kuluttua inkubaation harvoja HMECs selvisivät (Fig. 4F). Ohjaus hMSC-CM ei vaikuttanut hankittua lisääntymistä.

PTX estää hankittua lisääntymistä (A). HUVEC-soluja ja HMECs (2 x 10

5) viljeltiin 72 tuntia kun läsnä oli eri pitoisuus PTX. IC

50 oli noin 4,69 ng /ml PTX ja 10 ng /ml PTX merkittävästi tukossa sekä HUVEC ja HMECs lisääntymistä, mikä suuremmilla annoksilla oli sytotoksinen. Vastaavasti, lisäksi hMSCsPTX-CM suuresti estää HUVEC (B) ja HMECs (C) proliferaatiota. Klo 01:02 laimennus, hMSCsPTX-CM oli sytotoksinen, kun taas suuremmilla 1:04 ja 1:08 laimennukset estävän merkitsevästi hankittua lisääntymistä. Inhibitio hankittua leviämisen saatiin rinnakkaisviljelemällä määrityksessä. HMSCsPTX co-viljeltiin 1:01 ja 1:05 suhde (MSC /EC) oli sytotoksinen sekä HUVEC (D) ja HMECs (E). Klo 01:10 suhde hMSCsPTX edelleen estää hankittua lisääntymistä. Hoitamaton kontrolli hMSC ei vaikuttanut hankittua. In (F) valokuvia kulttuurin hMSCsPTX sekoitettuna 01:05 kanssa HMECs. Solut kiinnitettiin ja värjättiin eri aikaan näkyvät. hMSCsPTX tappaa HMECs jo 24 tuntia ymppäyksen jälkeen. Valkoinen nuolet osoittavat saarten HMECs edelleen läsnä viljelmän. Huomaa, että 72 tunnin jälkeen suurin osa HMECs kylvetään tapettiin ja vasta hMSCsPTX jäädä kulttuuri (20-kertainen suurennus). Bars kuvioissa ovat keskiarvoja ± SD kolmesta erillisestä kokeesta tehdään kolmena kappaleena.

* p 0,05

,

** p 0,01 vs

hoitamatta hMSC.

Antiangiogeeninen potentiaalia hMSCsPTX tutkittiin myös käyttämällä rotan aortan rengas määritys [24]. Kuten on esitetty kuviossa. 5A, lisäämällä 1:02 ja 1:04 laimennus hMSCsPTX-CM voimakkaasti alentunut joko spontaania tai VEGFa aiheuttama versomistilanteen neocapillaries peräisin aortan renkaita. Laimennus 1:08 of hMSCsPTX-CM jotka estävät hankittua lisääntymistä ei vaikuttanut aortan rengas hiussuonia muodostumista (Kuva. 5A). HMSCsPTX-CM kykeni myös indusoimaan hiussuonten regressio jos lisätään aortan renkaat 7 vuorokauden viljelyn. Alle mikroskooppinen tutkimus, useita vyöhykkeitä aluksen kuolion havaittiin (kuvio. 5B). Lisääminen hMSC-CM ei olennaisesti vaikuta kapillaarinen muodostumiseen (Fig. 5A). Samanlaisia ​​tuloksia SR4987PTX saatiin (Fig. S5).

(A) ja (B) rotan aortan rengas määritystä käytettiin testaamaan hMSCsPTX-CM pienten suonten kasvun estäminen. (A) hMSCsPTX-CM eri laimennoksilla lisätään rotan aortan renkaita läsnä ollessa tai puuttuessa VEGFa indusoi suuri vähennys kapillaarin seuraus kuin CTRL keskipitkän ja hMSC: eitä-CM. VEGFa 20 ng /ml käytettiin positiivisina verrokkeina (

** p 0,01 vs

hMSC-CM). (B) kuva osoittaa hMSCsPTX-CM (at 1:02 laimennus), joka indusoi kapillaari regression osoituksena läsnäolo aluksen repeämä ja nekroottinen alueet (nuolet) (suurennuksilla 20 x). In (C), (D) ja (E) vaikutukset hMSCsPTX

in vivo

kasvaimen kestää (C), on DU145 (D) ja B16 (E) kasvu on esitetty. Noin 0,4 × 10

6 hMSCsPTX ja hallita käsittelemättömiä hMSC sekoitettiin (at suhde 1:05 hMSC /TCs /) 2 x 10

6 DU145 tai B16 ja sitten pistetään ihon alle (s.c.) hiiriin. Kasvaintilavuudet lasketaan mittaamalla kasvaimen halkaisijat otetaan kahden päivän välein, joiden kaliiperi. Yhteistyössä injektion hMSCsPTX kanssa DU145 tai B16, tuotti merkittävää viivettä kasvaimen ulkonäkö (C) sekä suuri vähennys DU145 (D) ja B16 (E) kasvaimen tilavuus, kun taas yhteistyössä injektio hoitamatonta hMSC ei vaikuttaa joko DU145 tai B16 määriä, eivätkä injektio TCs sekoitetaan 5 minuuttia ennen injektion 2,000 ng /ml PTX (katso taulukko 1). Insertti (D) ja (E) on kuva kasvainten valvonta-, hMSCsPTX ja hMSC käsiteltyihin hiiriin ajankohtana uhrauksia.

* p 0,05 ** p 0,01 vs

TCs yksin tai

vs

hMSC hoidetuissa hiirissä.

hMSCsPTX ja hiiri SR4987PTX estää kasvaimen kasvua

in vivo

in vitro

tiedot osoittivat, että sekä hMSCsPTX ja SR4987PTX olivat vahvasti inhibitorisia Ahkerien ja jopa sytotoksisia hankittua. Nähdä, ovatko ne voivat vaikuttaa kasvaimen kasvua

in vivo

, hMSCsPTX ja ohjaus hMSC yhteistyössä injektoitiin suhteessa 1:05 joko ihmisen DU145 tai hiiren B16 syöpäsoluja immuunipuutteisilla hiirillä. Kontrolliryhmiä injektoitiin myös TCs yksin tai Ahkerien sekoitettuna, 1-2 minuuttia ennen injektiota, jossa 2,000 ng /ml vapaata PTX. Taulukossa 1 ja kuviossa 5 tulokset on koottu. HMSCsPTX sekoittaa joko DU145 tai B16 tuotti merkittävästi viivästyttää kasvaimen kestää (Fig. 5C) ja vähensi sekä DU145 (Fig. 5D) ja B16 kasvaimen kasvua (Fig. 5E). Kasvaimenvastainen vaikutus DU145 aiheuttama hMSCsPTX oli voimakkaampi kuin että B16. Kuitenkin kasvain painot DU145 ja B16 merkittävästi vähentää hMSCsPTX hoito; 25% hiiristä hoidettiin DU145 ja hMSCsPTX olivat myös kasvainta (taulukko 1). On mielenkiintoista, että co-injektion DU145 ja B16-solut, joilla on korkea pitoisuus vapaan PTX ei viive kasvain vie tai vaikuttaa kasvuun (taulukko 1), joka viittaa siihen, että ajasta riippuvainen vapautumisen PTX mukaan hMSCsPTX on tarpeen vaikuttaa syöpäsolujen lisääntymistä. Tämä voi tapahtua myös

in vivo

.

Samanlaisia ​​tuloksia saatiin käyttämällä hiirtä SR4987 on B16 (taulukko 1). SR4987PTX yhteistyössä ruiskutettiin B16 (at suhde 1:05) osaksi C57B16 hiiriin, jotka ovat syngeenisen varten SR4987 [14], viivästynyt merkittävästi kasvaimen vie ja vähentää B16 kasvua, vaikka yhteistyössä injektion ohjaus SR4987 ”sinänsä” tuottanut joitakin estävä aktiivisuus B16 kasvuun (kuvio. S6).

Effects of mouse SR4987PTX ihonalaisen ksenografteja glioblastooma U87MG solujen

Kokeet käyttäen RFP + U87MG glioblastoomasolut ja GFP + SR4987 suunniteltiin, jotta jäljittää kaksi solufraktiois- ja tutkia niiden vuorovaikutusta

in vivo

. Ohjaus hiiret, oksastettu joko U87MG soluja tai U87MG solujen ja SR4987, osoittivat, että ilmaus RFP ja GFP ei muuttanut tuumorigeenisyyteen ja selviytymistä näiden solujen

in vivo

kunnossa. Kaiken SR4987PTX soluilla oli estävä vaikutus kasvuun glioblastooma ksenograftien (Fig. S7A-B). Tällä 2, 4 ja 6 viikon ajankohtina, RFP + U87MG /GFP + SR4987PTX ksenografteissa olivat huomattavasti pienempiä kuin RFP + U87MG ksenografteja (

p

0,01,

p

0,05 ja

p

0,001, tässä järjestyksessä; Opiskelijan

t

-testi). Samalla pistettä, RFP + U87MG /GFP + SR4987-PTX ksenografteissa olivat huomattavasti pienempiä kuin RFP + U87MG /GFP + SR4987 ksenograftien sekä (

p

0,02,

p

0,05, ja

p

0,001, tässä järjestyksessä; Opiskelijan

t

-testi). Fluoresenssimikroskopian osoitti, yhteydessä kasvain, GFP + SR4987PTX solujen järjestetty itsensä säikeiden ja sarakkeisiin muodostamaan verkkoja, loukkuun RFP + U87MG soluja (Kuva. S7C). Sitä vastoin GFP + SR4987, joita ei ole esikäsitelty PTX oli sekoittunut U87MG-solujen ilman taipumusta järjestää osaksi sekundaarirakenteita (Fig. S7C). Histologinen tutkimus paljasti, että ksenografteista sisältävä SR4987 soluja, riippumatta niiden PTX pohjustus, ei kehittynyt pesäkkeitä nekroosi, jotka tyypillisesti nähdään U87MG ksenografteissa klo 4 ja 6 viikkoa elinaika (Fig. S7D). Sekä koko ja histologinen ulkonäkö U87MG ja U87MG /SR4987 ksenografteissa eivät eroa merkittävästi siitä, ksenografteista syntyvät ruiskuttamalla viruksen transdusoitujen RFP + U87MG solujen ja RFP + U87MG /GFP + SR4987, vastaavasti (tuloksia ei ole esitetty).

keskustelu

hiiri stroomasolulinja SR4987 pohjustetaan ensin

in vitro

kanssa DXR ja sitten viljeltiin yhdessä HS-solut syntyy vahva esto pmy kokoonpanojen [14]. Panevat merkille tätä ominaisuutta, mietimme jos hMSC ja SR4987 pohjustetaan syövänvastainen lääke voisi hankkia antituumorivaikutuksen ja näin ollen voidaan käyttää syövän hoidossa.

Voidakseen vahvistaa tämän hypoteesin, sekä hiiren SR4987 ja hMSC esikäsiteltiin PTX, koska se osoittanut sekä voimakas anti-kasvain [15], [25] ja antiangiogeenisestä toimintaa [16], [23]. Vapauttaman pohjustettu soluja, PTX voi vaikuttaa sekä kasvaimen ja hankittua leviämisen.

Alustavat kokeet osoittivat, että PTX kykeni estämään hMSC ja SR4987 leviämisen, mutta ei ollut sytotoksinen; jopa 10.000 ng /ml ei vaikuttanut solujen elävyyden. Tämä PTX pitoisuus oli noin 500 kertaa suurempi kuin on tarpeen tuottaa IC

50 MOLT-4, ihmisen leukemia solulinjassa hyvin herkkä PTX toimintaa [20], että käytimme seurantaan hMSCsPTX-CM ja SR4987PTX-CM aktiivisuutta. Perustuen aikaisemmassa tutkimuksessa [14], me luotiin siis -protokollaa prime hMSC ja SR4987 kanssa PTX, joka koostuu hoitoon 3 x 10

5 kiinnittyneet solut 2,000 ng /ml PTX 24 tuntia viljelmässä. Yhteenvetona, olemme huomanneet, että: a) hMSC pystyivät nopeasti sisällyttää PTX vahvistanut käyttämällä PTX-F; b) hMSCsPTX voi vapauttaa hitaasti PTX, ainakin osittain, kasvualustaan ​​ajassa riippuvaisella tavalla, mikä vahvistettiin HPLC-analyysissä; c) formaliinilla hMSC ja eivät olleet tehokkaita ottoa PTX; d) sekä hMSCsPTX ja SR4987PTX hankkinut voimakas anti-kasvain ja antiangiogeenisen

in vitro

että riippui annoksesta, ja osoitettavissa käyttämällä niiden CM tai rinnakkaisviljelemällä määritys; e) hMSCsPTX yhteistyössä ruiskutetaan immuunivajaissa hiirissä ihmisen DU145 ja SR4987PTX yhteistyössä ruiskutetaan U87MG tai hiiren B16 merkittävästi viivästynyt kasvaimen vie ja vähensi kasvainten kasvua. Vuonna B16 mallia havaitsimme, että hiiren peruskudossolujen SR4987 solut kykenevät ”sinänsä” estää kasvainsolujen proliferaatiota tasolle samanlainen SR4987PTX. Tämä havainto näyttää olevan kanssa ristiriitaisia ​​tietoja raportoitu kirjallisuudessa, jotka viittaavat sekä kapasiteetin mesenkymaalisten solujen ja stroomasolujen suosia tai estämään kasvaimen etenemistä [26]. Erityisesti B16 tuumorin malli edustaa tilaa, jossa hiiren stroomasoluissa anti-kasvain aktiivisuus on osoitettu [27]. Tässä kunnossa se voi olla, että PTX ladattu SR4987 solujen lisätä perusinsuliininsa tuumorin vastaista tehokkuutta ilman merkittävää mitattavissa vaikutus.

riippumatta tämän löydöksen, voimme päätellä, että tuloksemme, yhdessä tuettava voimakkaasti alkuperäistä hypoteesia ehdottaa vielä hMSC kantajana kemoterapeuttisten ihmisen. Mielestämme tuloksemme paljastaa tärkeitä uusia oivalluksia toiminnallisia ominaisuuksia nisäkkäiden MSC:. Toksikologiselta näkökulmasta, meidän tulokset tukevat ajatusta, että nisäkkäät, ainakin sisällä BM strooman osastoon, sisältävät soluja, jotka voivat olla kahtalainen rooli säätelyssä haittavaikutusten varalta. Nämä solut voivat vähentää tai parantaa lääkeaineen myrkyllisyyttä, riippuen niiden kyky ”adsorboida” ja sen jälkeen vapauttaa lääkeaineen tasainen, kuten kuvassa varten PTX, sen alkuperäisessä muodossa. Tämä esiintyminen

in vivo

on vielä selvittämättä. Kuitenkin tiedot saavilla syöpäpotilailla erittäin suuria annoksia kemoterapiaa näyttävät tukevan tätä olettamusta [28].