Krooninen sairaus

tiivistelmä

AZD6244 (ARRY-142886) on inhibiittori MEK1 /2 ja voi inhiboida solujen lisääntymistä tai indusoida apoptoosia solussa-tyypin riippuvaisella tavalla. Tarkka molekyylimekanismi AZD6244 indusoiman apoptoosin ei ole selvä. Tutkimaan mekanismeja AZD6244 indusoiman apoptoosin ihmisen keuhkosyöpä, päätimme molekyyli muutoksia kaksi alaryhmää ihmisen keuhkosyövän solulinjoja, jotka ovat joko herkkiä tai resistenttejä AZD6244 hoitoon. Olemme havainneet, että AZD6244 sai aikaan suuren, Bim proteiinien ja pienempi kasvu PUMA ja NOXA proteiineja, ja solukuolema herkillä keuhkosyövän solulinjoja, mutta ei vaikuttanut muiden Bcl-2-sukuiset proteiinit näissä solulinjoissa. Knockdovvn Bim siRNA lisäsi huomattavasti IC

50 ja vähentää apoptoosia varten AZD6244 käsiteltyihin soluihin. Olemme myös havainneet, että tasot endogeenisen p-Thr32-FOXO3a ja p-Ser253-FOXO3a olivat alhaisempia AZD6244-herkkien solujen kuin AZD6244-resistentit solut. Vuonna herkkien solujen, AZD6244 aiheuttama FOXO3a tumaansiirtymiseen tarvitaan Bim aktivointia. Lisäksi vaiennettaisi FOXO3a siRNA kumottu AZD6244 aiheuttamaa apoptoosia. Lisäksi olemme havainneet, että transfektointi konstitutiivisesti aktiivisen AKT sääteli p-Thr32-FOXO3a ja p-Ser253-FOXO3a ilmaisun ja esti AZD6244 aiheuttama Bim ilmentymistä herkkien solujen. Nämä tulokset osoittavat, että Bim on tärkeä rooli AZD6244 aiheuttaman apoptoosin keuhkosyövän soluille ja että PI3K /AKT /FOXO3a reitin on mukana Bim sääntelyn ja alttiutta keuhkosyöpään solujen AZD6244. Nämä tulokset vaikuttavat kehittämiseen strategioita vastustusta MEK estäjiä.

Citation: Meng J, Fang B, Liao Y, Chresta CM, Smith PD, Roth JA (2010) Apoptoosin induktio MEK esto in Human Lung Cancer Cells välittää Bim. PLoS ONE 5 (9): e13026. doi: 10,1371 /journal.pone.0013026

Editor: Gen Sheng Wu, Wayne State University, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 23, 2010; Hyväksytty: 31 elokuu 2010; Julkaistu: 27 syyskuu 2010

Copyright: © 2010 Meng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Cancer Institute erikoistunut tutkimus- Excellence (SPORE) Grant CA-70907 (J. Minna ja J. Roth), R01 Grant CA-092.487 (B. Fang), ja Cancer Center Support Grant CA-16672. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Tätä työtä tukivat myös Sponsored Research Grant AstraZeneca Lääkkeen teki on rooli tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tätä työtä tukivat jonka Sponsored Research Grant AstraZenecalta Lääkkeen. Rahoittajan AstraZeneca oli rooli joko tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Aktivointi Ras /Raf /MEK /MAP kinaasireitin on liitetty hallitsematon soluproliferaatiota ja kasvaimen kasvua. AZD6244 (ARRY-142886), on uusi, selektiivinen, ATP–kilpaileva estäjä mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin kinaasin 1/2 (MEK1 /2), on osoittanut aktiivisuutta nanomolaarisina pitoisuuksina vasten eristetty MEK-entsyymin ja lukuisia syöpäsolulinjoissa [1] . In vitro tutkimukset osoittivat, että AZD6244 alassäädetty tasot p-ERK tehokkaasti. AZD6244 on osoittanut aktiivisuutta useita -tuumoriksenografti mallit ihmisen syövän [2] – [4]. Kliinisissä tutkimuksissa, kun taas potilaita useista kasvaintyypeille ovat osoittaneet vastauksia MEK estäjä ei yksinään, muut potilaiden kasvaimia, erityisesti ei-pienisoluisen keuhkosyövän, ovat luontaisesti resistenttejä MEK esto. Siksi on tärkeää ymmärtää taustalla olevien mekanismien vastuussa vastustuskyky MEK esto, jos se on tärkeää hoitomuoto tässä hyvin yleisin syöpä.

edellinen tutkimus [5] osoittaa, että MEK estäjä AZD6244 esti voimakkaasti proliferaatiota nanomolaarisilla pitoisuuksina Calu-6, H2347 ja H3122 keuhkosyövän solulinjoja, mutta oli vähän vaikutusta H196, Calu-3, H522 tai HCC2450 solulinjoja. Lisäksi olemme havainneet, että seuraavat osa-G1 solusyklin pysähtymiseen, 20-40% AZD6244-herkkien solujen tehtiin apoptoosin, havaitsimme ei apoptoosin AZD6244-resistentit solut. Olemme aiemmin osoittaneet, että p-AKT ilme on alhainen AZD6244 herkkien keuhkosyövän solulinjoja mutta korkea resistentit solut, mikä viittaa siihen, että p-AKT on välittäjänä vastustuskyvyn AZD6244 hoitoon. Tässä tutkimuksessa tutkimme alavirran välittäjinä AZD6244 aiheuttaman apoptoosin ihmisen keuhkojen syöpäsoluja.

Apoptoosi voitaisiin säädellä kautta ulkoisen (kuoleman reseptori) tai sisäinen (mitokondrion) solukuoleman polkuja. Luonnostaan ​​apoptoosin välittyy Bcl-2-perheen proteiinit, jotka koostuvat kolmesta subfamilies: pro-selviytymisen jäsenet, kuten Bcl-2 tai Mcl-1, pro-apoptoottiset Bax /Bak alaryhmä, ja pro-apoptoottisten Bcl-2 homologia 3-only (BH3-only) proteiineja. Apoptotic ärsykkeet laukaisevat aktivoimalla tiettyjä BH3 vain proteiineja, jotka sitten tarttuvat pro-selviytymisen Bcl-2-perheen jäseniä ja vapauttaa loppupään -efektiboksejamme Bax ja Bak, herättämiseksi mitokondrion ulkokalvon läpäiseväksi, valjastamiseen kaspaasi kaskadin ja huipentui solukuolemaan. Bim, p53-säädelty modulaattorin apoptoosin (PUMA) ja NOXA on hiljattain todettu olevan tärkeä rooli kemoterapiaa ja täsmähoitoihin aiheuttaman apoptoosin rintasyövässä [6], leukemia [7], myelooma [8] ja NSCLC [ ,,,0],9] soluja.

FOXO transkriptiotekijä jäsenet edistävät tai inaktivoimaan useita kohdegeenien mukana tuumorisuppressiogeeneksi, kuten

Bim

,

FasL

, ja

TRAIL

geenit apoptoosin [10], [11],

p27kip1

,

sykliini D15

solusyklin asetuksen [12], ja

GADD45a

DNA vahinkosaneerauksen [13]. FOXO3a on yksi tärkeimmistä FOXO perheen transkriptiotekijöiden, jotka ovat erilaisia ​​solun toimintoja. FOXO3a fosforyloidaan ja inaktivoida AKT kautta fosforylaation Thr32, Ser253, ja Ser315 joka johtaa tumasta ja estämällä sen transkription toimintaa [14], [15]. FOXO3a on myös osoitettu säänneltävä onkoproteiinia ERK [16] kolmeksi ERK fosforylaatiopaikkaa, Ser 294, Ser 344 ja Ser 425. Kuten AKT, fosforylaatio näistä seriinijäännösten kanssa ERK lisääntynyt FOXO3a sytoplasminen jakautuminen ja tumasta.

Koska tasapaino antiapoptoottisten ja proapoptoottiset proteiinit on kriittinen lääkkeen aiheuttamalle apoptoosin, arvioimme muutosten Bcl-2-perheen proteiinien AZD6244 herkkä ja kestävä keuhkosyövän solulinjoja ja totesi, että MEK estäjä AZD6244 up-regulation proapoptoottiset BH3 vain proteiineja Bim, PUMA ja NOXA, prosessi liittyy johtaa solukuolemaan. Olemme myös havainneet, että hiljentäminen joko FOXO3a, transkriptionaalisen säätelijä Bim tai Bim pieniä häiritseviä RNA (siRNA) suuresti estyy apoptoosin. Lisäksi ilmaus konstitutiivisesti aktiivisen AKT (caAKT) herkkien solujen esti AZD6244 aiheuttama Bim yli-ilmentäminen ja johti AZD6244 vastarintaa. Sen sijaan vakaa transfektio määräävän-negatiivisten AKT osaksi resistenttien solujen parannettu AZD6244 aiheuttama Bim over-exrpession.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

AZD6244 tarjoama AstraZeneca Pharmaceuticals (Macclesfield, UK), liuotettiin 25 mM dimetyylisulfoksidissa (DMSO) ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Vasta-aine Bim hankittiin Calbiochem (San Diego, CA). Vasta-aineita p-ERK, FOXO3a, p-FOXO3a (Thr32), p-FOXO3a (Ser253), Bad, PARP, NOXA ja PUMA, ja AKT-kinaasin iinianalyysikitissä ostettiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Vasta-aineet Bak, Bcl-xl ja kaspaasi-9 ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Predesigned FOXO3a siRNA ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), ja Bim ja ohjaus siRNA olivat Qiagene (Valencia, CA). Täyspitkän ihmisen BimEL cDNA, joka kloonataan ekspressiovektoriin pCMV6-XL4, hankittiin Origene Technologies (Rockville, MD). Proteaasiestäjäseostabletit, β-aktiini-vasta-aine, ja sulforodamiini B (SRB), olivat Sigma Chemical Corporation (St. Louis, MO). Proteiinimääritys materiaalit ja SYBR Green Supermix ostettiin Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA), ja genetisiiniä oli Life Technologies Corporation (Carlsbad, CA). Lipofactamin 2000 ja Trizol-reagenssi hankittiin Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA), ja käänteistranskriptio reagenssit olivat Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA). DeadEnd ™ Flurometic TUNEL System hankittiin Promega (Madison, WI).

Soluviljely

Solulinjat H2347, H3122, H196, HCC2450, ja H522 toimitti Drs. A. Gazdar ja J. Minna, Hamon Center for Therapeutic Oncology Research, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX. Kaikki keuhkosyövän solulinjoja pidettiin korkean glukoosin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 100 ug /ml ampisilliinia ja 0,1 mg /ml streptomysiiniä; soluja viljeltiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2 ja 95% ilmaa.

solunelinkykyisyysmääritys

Solujen elinkyky määritettiin käyttämällä SRB-määritystä, ja kukin määritys suoritettiin neljänä kappaleena. Keuhkosyövän solut ympättiin noin 3000 kuoppaa kohti 96-kuoppalevyille ja inkuboitiin 24 tuntia DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Solut käsiteltiin sitten AZD6244 ilmoitettuina pitoisuuksina, jotka olivat vastaavat seerumissa saavutettiin potilailla, suun kautta antamisen jälkeen. Solut, jotka käsitelty DMSO käytettiin verrokkeina. Solut kiinnitettiin 96 tuntia käsittelyn jälkeen lisäämällä 50 ui 10% trikloorietikkahapolla 4 ° C: ssa 1 tunnin ajan. Ne värjättiin sitten 70 ui 0,4% SRB: ssa 60 minuuttia ja pestiin 1% etikkahappoa; 200 ui Tris-emästä (10 mmol /l, pH-arvo, 10,5) lisättiin. Absorbanssilukemia 570 nm: ssä määritettiin käyttämällä mikrolevyn analysaattorin. Suhteellinen eloonjäämisaste (%) laskettiin yhtälöllä OD

T /OD

C x 100% (OD

T edustaa absorbanssin hoitoryhmään, ja OD

C absorbanssista ohjaus ryhmiä). Inhiboivien pitoi- suuksien mediaanit (IC

50-arvot) määritettiin käyttämällä CurveExpert 1,3 ohjelmistoja ja piirrettiin annos-vaste-käyrät. Kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa.

Western blot-analyysi

Koko-solu-lysaatit valmistettiin pesemällä solut fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja saattamalla ne lyysi Laemmlin näytepuskuria täydennetty proteaasiestäjäseostabletit. Sen jälkeen kun lysaatit sonikoitiin 15 sekunnin ajan, proteiini konsentraatiot kvantitoitiin käyttäen Bio-Rad proteiinimäärityksellä kit. Vastaavat proteiinit ladattiin, erotettiin 10% tai 12% natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidia (SDS-PAGE) geelielektroforeesi ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille 80 V: ssa 2 tuntia. Membraanit blokattiin 1 tunnin ajan 5% rasvaton maitojauhe Tris-puskurissa, joka sisälsi 0,1% Tween (TBST), ja tutkittiin laimealla ensisijaisen vasta-aineen kanssa 4 ° C: ssa yön yli. Kalvot pestiin sitten kolme kertaa TBST-puskurissa ja tutkittiin infrapunaväri-leimatut sekundääriset vasta-aineet; Immunoreaktiivisia bändit tehtiin näkyviksi käyttämällä Odyssey® Imager (Li-COR Biosciences, Lincoln, NE).

Solusykli ja apoptoosimäärityksessä

Solut kerättiin trypsinisaatiolla, pestiin kahdesti kylmällä PBS, kiinnitettiin jääkylmällä 70% metanolia, ja inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli. Sitten solut pestiin PBS: llä ja inkuboitiin 25 ug /ml propidiumjodidia, joka sisälsi 30 ug /ml ribonukleaasi 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Solut analysoitiin EPICS Profile II virtaussytometrillä (Coulter Corp., Hialeah, FL) kanssa Multicycle Phoenix Flow Systems ohjelma (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA). Kokeet toistettiin ainakin kolme kertaa.

Measurement apoptoosin TUNEL (pääte deoksinukleotidyylitransferaasilla välittämää nick-end merkinnät) määritys

TUNEL Testi suoritettiin seuraavien ohjeiden mukaan valmistajan on kaupallisesti saatavilla kit (DeadEnd ™ fluorometrinen TUNEL System) Promegan. Apoptoottiset solut osoittavat voimakasta ydin- vihreän fluoresenssin että voitaisiin havaita tavallisella fluoreseiini suodatin. Kaikki solut värjättiin DAPI osoittavat vahvan sininen ydin- fluoresenssi. Levyjä tarkasteltiin fluoresenssimikroskopian suhteellisen apoptoottiset solut määritettiin laskemalla TUNEL-positiivisten solujen viidellä satunnaisesti aloilla (at x 100 suurennus) jokaisesta näytteestä.

Reaaliaikainen PCR

Yhteensä-RNA eristettiin käyttämällä Trizol-reagenssia ja käänteistranskriptio cDNA: ksi. Kuten aiemmin on kuvattu, käytimme Bim alukkeita [6] tutkimuksessamme. Kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (PCR) suoritettiin 25 ul: n seos, jossa on 12,5 ui 2 x SYBR Green Supermix, 1 uM kutakin eteenpäin ja taaksepäin-aluketta, ja 4-12 ng templaatti käyttäen CFX96 reaaliaikainen PCR-tunnistus järjestelmä (Bio-Rad). PCR suoritettiin aluksi denaturointi 10 minuuttia 95 ° C: ssa, jota seuraa 39 sykliä 15 sekuntia 95 ° C: ssa, 30 sekuntia 58 ° C: ssa, ja 30 sekuntia 72 ° C: ssa. Kaikki näytteet analysoitiin kolmena rinnakkaisena, ja ihmisen glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) käytettiin endogeenista ohjaus. Suhteellinen ekspressio laskettiin käyttämällä 2-δδCt menetelmällä.

siRNA ja Bim cDNA transfektio

Soluja viljeltiin 6-kuoppalevyillä, kunnes 70% konfluentteja ja transfektoitiin 200 nmol /l ohjaus epäspesifinen siRNA, Bim kohdistettuja siRNA, tai FOXO3a kohdistettuja siRNA käyttämällä Lipofectamine ™ 2000 mukaan valmistajan ohjeiden. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen solut käsiteltiin DMSO (kontrolli) tai AZD6244 ilmoitetuilla annoksilla ja ajankohtina. Sitten solut kerätään ja käsitellään immunoblottauksella tai propidiumjodidivärjäys että solusyklin määrityksessä.

Bim cDNA transfektiota soluja viljeltiin myös 6-kuoppalevyillä, kunnes 70% konfluentteja ja transfektoitu kontrollivektorilla tai BimEL ekspressiovektori, jonka pitoisuus on 4 ug 250 ul: ssa väliaineessa, käyttäen Lipofectamine 2000 Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen solut kerättiin immunoblottauksella tai kiinnitettiin 4% formaldehydiä TUNEL-määrityksessä.

AKT-kinaasiaktiivisuutta määritys

Cell pestiin kahdesti PBS: llä, altistettiin lyysi soluhajotuspuskurin, ja sonikoitiin 15 sekunnin ajan. Uutteet sentrifugoitiin solujätteiden poistamiseksi, ja proteiinin pitoisuudet supernatanteissa määritettiin käyttämällä Bio-Rad proteiinimäärityksellä reagenssia. 200 ui solu- lysaattia näytettä inkuboitiin 20 ui immobilisoidun anti-AKT-vasta-ainetta 4 ° C: ssa yön yli kevyesti keinutuoli. Saatu immunosaostumat pestiin kolme kertaa hajotuspuskurilla ja kahdesti AKT kinaasipuskuria. Kinaasimääritykset suoritettiin 30 minuutin ajan 30 ° C: ssa jatkuvasti sekoittaen kinaasipuskurissa, joka sisälsi 200 uM ATP: tä ja 1 ug GSK-3-fuusioproteiinia. Reaktiotuotteet erotettiin 10% SDS-PGAE, jota seurasi Western-blottauksella anti-fosfo-GSK-3α /β mukaisen vasta-aineen valmistajan ohjeita ei-radioaktiivista AKT kinaasimääritys. Kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa.

immunofluoresenssi

Soluja viljeltiin CultureSlides (BD Biosciences, CA). Elatusaine imettiin pois, ja solut pestiin kolme kertaa PBS: llä ja kiinnitettiin sitten juuri valmistettu 4% paraformaldehydillä 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Kun toinen pesuvaihe PBS, solut tehtiin läpäiseviksi 20 minuuttia huoneenlämpötilassa käyttäen PBS-puskuria, joka sisälsi 0,2% Triton X-100 ja 0,1% natriumsitraattia. Sitten soluja inkuboitiin PBS: ssä, joka sisälsi 5% rasvatonta kuivamaitoa huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan. Primaarinen vasta-inkubaatio suoritettiin anti-FOXO3a (1:100 laimennokset) 4 ° C: ssa yön yli. Kun toinen pesuvaihe PBS, soluja inkuboitiin sekundäärisen vasta-aineen, FITC-konjugoitu anti-kani-vasta-aine (1:100; Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Kaikki vasta-aineet laimennettiin PBS: ään + 5% rasvatonta kuivamaitoa. Objektilasit värjättiin sitten Prolong mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää liuosta (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen pestään kolme kertaa PBS: ssä. Kuvat otettiin fluoresenssimikroskopialla kanssa ylösalaisin Zeiss laser-skannaus mikroskooppia. Yksittäiset tumat kuvattu käyttämällä DAPI fluoresenssi, ja ydin- fluoresenssi Cy3 kvantifioitiin käyttämällä Zeiss KS400 kuva-analyysi-ohjelmisto (Carl Zeiss, Inc., Oberkochen, Saksa). Kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa.

Tilastollinen analyysi

Data ilmaistiin keskiarvona ± SD ja lasketaan keskiarvot 95%: n luottamusväli. Tilastollinen vertailu koeryhmien suoritettiin kaksisuuntainen ANOVA testi käyttämällä Microsoft Excel-ohjelmisto. Arvot

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

AZD6244 lisää Bim ilmentymistä keuhkosyövässä solulinjoissa

edellisen tutkimuksen [5 ] osoitti, että AZD6244 esti proliferaatiota Calu-6, H2347 ja H3122 keuhkosyövän solulinjoja, mutta oli vähän vaikutusta H196, Calu-3, H522 tai HCC2450 solulinjoja. Lisäksi olemme havainneet, että seuraavat osa-G

1 solusyklin pysähtymiseen, 20-40% AZD6244-herkkien solujen tehtiin apoptoosin, mutta emme havainneet apoptoosin AZD6244-resistentit solut. Tässä tutkimuksessa käytimme näitä samoja solulinjoja edelleen määrittää mekanismeja AZD6244: n indusoiman apoptoosin.

mitokondrion apoptoottinen reitti tiedetään olevan keskeinen rooli tyrosiinikinaasin estäjä indusoiman apoptoosin [6] – [ ,,,0],9]. Arvioidaan joka Bcl-2-perheen jäseniä kriittisesti vaikuttavat AZD6244 hoito, päätimme heidän proteiinin tasot kolmessa herkkä keuhkosyövän solulinjat hoidon jälkeen 3 uM AZD6244 pitoisuus saavutti seerumissa saavien potilaiden suun AZD6244. Calu-6 on KRAS ja villityyppisen BRAF taas H2347 mutantissa sääntelyviranomaisten ja H3122 [17] on sekä villityypin KRAS ja BRAF. Western blot-analyysi osoitti, että hoito AZD6244 aiheuttama nopea ja jatkuvasti kasvanut tasoilla BimEL ja vähemmässä määrin myös BimL ja Tietomallien kaikissa herkkä solulinjoissa (Fig. 1A). Lisäksi hoito sub-mikromolaarinen pitoisuuksien (0,03, 0,1, 0,3, 1, ja 3 uM) AZD6244 24 tuntia indusoi selvästi kohonneita tasoja Bim (Fig. 1 C). Nämä havainnot osoittivat, että AZD6244 indusoi sen vaikutukset Bim ilmentymistä pitoisuudesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. Kuitenkin näissä soluissa, tasot muiden Bcl-2-perheen jäsenten (Bax, Bak, ja Bcl-x L) ei muutu havaittavasti missään konsentraatiossa AZD6244 tai milloin tahansa vaiheessa (Fig. 1A). Sen sijaan, AZD6244 ei aiheuttanut ilmeisiä muutoksia Bim ilmentymistä resistenttejä solulinjoja (Fig. 1 B). Resistentti solulinjat ovat villin tyypin BRAF ja KRAS. Olemme myös havainneet tukahduttaminen p-ERK-ilmentymisen AZD6244 sekä herkkä ja resistentit solut (Fig. 1A ja 1B). Tutkimme myös ilmentymisen BH3 vain proteiinien PUMA ja NOXA seuraavat 3 uM AZD6244 hoitoon. PUMA ja NOXA ilmaisuja lisättiin heti AZD6244 hoitoon, mutta tasojen nousu oli paljon vähemmän kuin mitä havaittiin Bim (Fig. 1A). Koska säätelyä Bim on paljon dramaattisempi kuin PUMA ja NOXA in AZD6244 käsiteltyjä soluja, olemme keskittyneet roolista Bim myöhemmissä tutkimuksissa.

Western blotit Bcl-2-perheen jäsentä hoidon jälkeen AZD6244. (A) Ihmisen keuhkosyövän solulinjat (Calu-6, H2347 ja H3122) käsiteltiin 3 uM AZD6244 4, 8, 24, 48, ja 72 tuntia. (B) Ihmisen keuhkosyövän solulinjat (Calu-3, H196, H522, ja HCC2450) käsiteltiin 3 uM AZD6244 4, 24, ja 72 tuntia. (C) Calu-6, H2347, H196 ja H522-soluja käsiteltiin 0,03, 0,1, 0,3, 1 ja 3 uM AZD6244 24 tuntia. Tiedot ovat yksi kolmen erillisen kokeen samanlaisin tuloksin.

AZD6244 aiheuttama Bim yliekspressio aiheuttaa sekä lisääntynyt transkriptio ja lisääntynyt proteiinin vakautta

tutkimiseksi mekanismeja AZD6244 aiheuttaman Bim ilmaisu, olemme analysoineet tasot Bim mRNA-hoidon jälkeen AZD6244. Herkkiä ja resistenttejä soluja käsiteltiin 3 uM AZD6244 4 ja 24 tunnin ajan, ja solut kerättiin reaaliaikainen PCR-analyysi. MRNA tasot GAPDH käytettiin sisäisen valvonnan. Tulos osoitti, että kun normalisoinnin sisäisen valvonnan, käsittely AZD6244 johti huomattavaan kasvuun mRNA tasojen Bim on ajasta riippuva tavalla herkällä Calu-6, H2347 ja H3122 soluja. AZD6244, pitoisuutena 3 uM, lisääntynyt Bim mRNA välillä 2,2- 2,5-kertainen, kun 4 tuntia, ja 2.9- 3,8-kertaiseksi 24 tunnin kuluttua inkuboinnin näissä kolmessa solulinjoissa (Fig. 2A). On huomattava ero Bim mRNA ilmaisun välillä hoidon ja kontrolliryhmien välillä tai 4 tuntia ja 24 tuntia hoitoryhmissä (

P

0,05 kaikkien pairwise vertailun). Sen sijaan, AZD6244 ei indusoi Bim mRNA: n ekspression neljässä resistenttejä solulinjoja H196, HCC2450, Calu-3 ja H522.

(A) Totaali-RNA eristettiin rinnakkain. Expression of

Bim

mitattiin reaaliaikaisella PCR: llä, ja normalisoitu tasolle

GAPDH

. Esitetyt tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen samanlaisin tuloksin.

Sarakkeet

, keskiarvo;

baari

, SD. *,

P

0,05, verrattuna käsittelemättömiin soluihin. (B) Calu-6, H2347, H3122 ja H196-soluja käsiteltiin 30 uM MG132 2, 4, 6, ja 8 tuntia, ja Western blot -analyysi Bim ekspressio suoritettiin. (C) Calu-6, H2347, H3122 ja H196-soluja käsiteltiin DMSO: ssa, 3 uM AZD6244, tai 30 uM MG132 6 tuntia, ja sitten 25 ug /ml sykloheksimidiä estää proteiinisynteesiä. Western blot analyysi Bim ilme suoritettiin. Tulokset edustavat yksi kolmesta itsenäisestä kokeesta samanlaisin tuloksin.

Koska ERK1 /2-signalointireitin aktivaatio fosforyloi Bim ja edistää proteasomin riippuva hajoaminen Bim [18], testasimme onko Bim proteiinin stabiloitiin AZD6244 hoitoon. Tätä varten ensin käsitelty herkkiä (Calu-6, H2347 ja H3122) ja resistenttejä (H196) soluja proteosomin estäjä MG132 30 uM 2, 4, 6 ja 8 tuntia, otettiin talteen solut ja havaitaan Bim ilmentymisen Western blot ( kuva 2B). Bim proteiini nousivat 2 tuntia altistuksen jälkeen MG132 ja kasvoi edelleen 6-8 tuntia. Sitten käsitelty näiden solujen kanssa DMSO: ssa, 3 uM AZD6244, tai 30 uM MG132: ssa 4 tuntia ja sitten lisättiin 25 ug /ml sykloheksimidiä estää proteiinisynteesiä soluissa. Sitten solut otettiin talteen ajan ja Bim ilmentymistä havaittiin Western blot -analyysillä (kuvio. 2C). Olemme havainneet, että Bim proteiini oli hajoaa nopeasti käsitellyissä soluissa DMSO kaikki neljä testattiin solulinjoissa. Sitä vastoin soluissa, joita käsiteltiin AZD6244 tai MG132, BIM-proteiinin tasot stabiloitu jopa 6 tuntia sen jälkeen sykloheksimidikäsittelylle, mikä osoittaa, että hajoamista Bim proteiinin estettiin käsittelemällä AZD6244. Yhdessä tuloksemme osoittavat, että lisääntynyt BimEL ilmaisun aiheuttama AZD6244 hoito voi johtua kahdesta mekanismista: lisäys

Bim

geenin transkription ja eston Bim proteiinien hajoamista. Kuten AZD6244 voi estää Bim proteiinien hajoaminen sekä herkkiä tai resistenttejä solulinjoja, kasvu

Bim

geenin transkriptio voi olla suurempi merkitys indusoimaan AZD6244: n indusoiman apoptoosin.

Bim tarvitaan AZD6244- aiheuttama apoptoosin keuhkosyöpäsoluissa

Jotta voidaan tutkia roolia Bim in AZD6244 aiheuttaman apoptoosin, me luotu erityinen siRNA konstruktioita varten Bim in Calu-6 ja H3122 solulinjoissa. Kuten on esitetty kuviossa. 3A, siRNA knockdovvn Bim inhiboi oleellisesti ilmentymistä Bim-hoidon jälkeen 3 uM AZD6244 48 tuntia. PARP lohkominen ja kaspaasi-9 pilkkoutumisen /aktivaation inhiboi.

(A) Calu-6 ja H3122-solut transfektoitiin Bim-spesifinen tai ohjata siRNA, ja käsiteltiin sitten 3 uM AZD6244 48 tuntia. Expression of Bim, PARP ja kaspaasi-9 analysoitiin Western blottauksella. (B) Soluja viljeltiin väliaineessa, joka sisälsi erilaisia ​​pitoisuuksia AZD6244 96 tuntia. Solujen elinkelpoisuus määritettiin sulforodamiini B, ja suhteellinen solujen elinkykyisyys piirrettiin kuvattu Materiaalit ja menetelmät osassa. Arvot edustavat keskiarvoa ± SD kolmen itsenäisen kolmena kappaleena määrityksissä. (C) Parallel solut kiinnitettiin etanolilla ja värjättiin propidiumjodidilla; DNA-pitoisuus analysoitiin virtaussytometrialla. Luvut esittävät prosenttiosuuksia apoptoottisten Saharan G

1-vaihe soluissa. Tulokset edustavat yksi kolmesta itsenäisestä kokeesta samanlaisin tuloksin.

Sarakkeet

, keskiarvo;

baari

, SD. *,

P

0,05, verrattuna kontrolliryhmään siRNA transfektoiduista soluista. (D) Parallel soluja myös vahvistettu TUNEL ja DAPI värjäystä. Apoptotic soluytimet Tunelin värjäystä leimattiin FITC ja näkyviksi fluoresenssimikroskopiaan. Suhteellinen apoptoottiset solut määritettiin laskemalla TUNEL positiivisten solujen viidellä satunnaisesti aloilla (100-kertainen suurennus) kullekin näytteelle.

Sarakkeet

, keskiarvo;

baari

, SD. *,

P

0,05, verrattuna kontrolliryhmään siRNA transfektoiduista soluista. Edustaja valokuvat Calu-6 näytettiin yläpaneelin ja prosenttiosuus apoptoottisten solujen sekä Calu-6 ja H3122 olivat osoitti alemmassa paneelissa. (E) Calu-6-solut transfektoitiin BimEL ekspressiovektoriin ja kontrollivektori 48 tuntia. Expression of Bim analysoitiin Western blottauksella ja apoptoottisia soluja havaittiin TUNEL määrityksessä.

Testasimme myös antiproliferatiivinen vaikutus AZD6244 valvonta- ja Bim siRNA-transfektoiduissa soluissa SRB määrityksen ja määrittää IC

50-arvot. Olemme havainneet, että IC

50 AZD6244 kasvoi +0,7-+76,3 uM Calu-6-solut, ja 1,4-89,3 uM H3122-soluissa (kuvio. 3B). Ohjaus- ja Bim siRNA-transfektoituja soluja käsiteltiin 3 uM AZD6244 72 tunnin ajan, ja solut kerättiin solusyklin analyysi. Tulokset osoittivat, että hoidon jälkeen AZD6244, prosenttiosuus apoptoottisten (sub-G

1) solujen laski 38,6%: sta 8,4%: in Bim siRNA-transfektoiduissa Calu-6-solut, ja 29,8%: sta 7,5%: in Bim siRNA-transfektoiduissa H3122-solut (Fig. 3C). TUNEL määritys osoitti myös Bim siRNA transfektio esti AZD6244 indusoiman apoptoosin, mistä 56,6%: sta 12,1%: in Calu-6 ja 65,3%: sta 18,5% H3122-soluissa (kuvio. 3D).

edelleen testata onko lisääntynyt Bim ilmentyminen on riittävä indusoimaan apoptoosin. Plasmidi, joka koodaa täyspitkää BimEL transfektoitiin ja Calu-6 ja apoptoosin transfektoitujen solujen määritettiin TUNEL-määrityksellä. Olemme havainneet, että lähes kaikki solut, jotka oli transfektoitu kontrollivektorilla ovat TUNEL-negatiivisia jälkeen 48 tuntia, kun taas, BimEL ekspressiovektori transfektoiduista soluista osoitti, kasvoi merkittävästi TUNEL-positiivisia apoptoosin (Fig. 3E).

rooli FOXO3a in AZD6244 indusoituun Bim ilme

on raportoitu, että aktivoituminen FOXO transkriptiotekijöiden indusoi Bim mRNA ilmaisun ja edistää solujen apoptoosin Bim riippuvaisella tavalla [19], [20]. FOXO transkriptiotekijät fosforyloivatko AKT kolmella hyvin säilyneitä sivustoja, Thr32, Ser253, ja Ser315, mikä johtaa soluliman säilyttäminen ja heikentyvän FOXO ydin- transkriptionaalisen aktiivisuuden. ERK: n on myös osoitettu fosfory- FOXO3a ja lisätä sen tumasta. Edellisessä tutkimuksessa [5], huomasimme, että p-AKT ilmentyminen oli huomattavasti korkeampi resistenttien solujen kuin herkkien solujen. Kuten odotettua, endogeenisten tasojen p-Thr32-FOXO3a ja p-Ser253-FOXO3a olivat korkeampia resistenttejä soluja kuin herkkien solujen (Fig. 4A). Mitään johdonmukaista eroja ei todettu näiden kahden ryhmän välillä on yhteensä FOXO3a.

(A) Endogeenisen ilmentymisen p-Thr32-FOXO3a, p-Ser253-FOXO3a, ja yhteensä FOXO3a havaittiin 8 solulinjoissa. (B) solunosasijaintia FOXO3a in Calu-6 ja H522-solujen havaittiin immunofluoresenssivärjäyksen jälkeen AZD6244 hoidon. (C) Calu-6-solut olivat joko mock-transfektoituja tai transfektoitu FOXO3a-spesifinen pieni häiritsevä RNA (siRNA), ja käsiteltiin sitten 3 uM AZD6244 4 tuntia. Expression of FOXO3a, Bim, PARP ja kaspaasi-9 analysoitiin Western blottauksella. (D) Samanaikaisesti Calu-6 solut kiinnitettiin etanolilla ja värjättiin propidiumjodidilla; DNA-pitoisuus analysoitiin virtaussytometrialla. Luvut esittävät prosenttiosuuksia apoptoottisten Saharan G

1-vaihe soluissa. Tulokset edustavat yksi kolmesta itsenäisestä kokeesta samanlaisin tuloksin.

Sarakkeet

, keskiarvo;

baari

, SD. *,

P

0,05, verrattuna kontrolliryhmään siRNA transfektoiduista soluista. (E) TUNEL määritykset suoritettiin, kuten on kuvattu kuviossa. 3D. Edustaja valokuvat Calu-6 esitetään.

transkription aktivaatio FOXO3a vaikuttaa suuresti sen solunosasijaintia prosessissa tiukasti säännelty AKT ja ERK. Olemme tutkineet, onko AZD6244 hoito aiheutti FOXO3a muuttamaan tumaan, jossa se on aktivoitu. Immunofluoresenssilla värjäys osoitti, että herkillä Calu-6-solut, käsittelemällä 3 uM AZD6244 indusoi huomattavaa solunosasijaintia FOXO3a sytoplasmasta tumaan. Kuitenkin kestävä H522-soluissa, havaitsimme mitään selvää muutosta solunosasijaintia FOXO3a jälkeen AZD6244 hoidon. Lisäksi olemme huomanneet, että hoitamattomilla Calu-6 solua, FOXO3a asunut sekä sytoplasmassa ja tumassa; käsittelemättömästä H522-soluissa, useimmat FOXO3a asui sytoplasmassa, ja tumavärjäystä oli suhteellisen vähäinen (Fig. 4B). Nämä havainnot ovat yhdenmukaisia ​​havaitaan Western blottauksella p-FOXO3a ilmentymisen (Fig. 4A).

Jotta voidaan tutkia roolia FOXO3a in AZD6244 aiheuttama Bim, arvioimme vaikutus erityisten siRNA konstruktioita varten FOXO3a vuonna Calu-6 ja H3122-soluissa. Kuten on esitetty kuviossa. 4C, siRNA knockdovvn FOXO3a inhiboi ilmentymisen FOXO3a, mikä johti voimakkaaseen suppressioon AZD6244 aiheuttama Bim, PARP lohkominen ja kaspaasi-9 pilkkoutumisen /aktivaation hoidon jälkeen 24 tuntia. Apoptoosin analysointi seuraavien FOXO3a siRNA transfektion herkkien solujen jälkeen AZD6244 hoidon osoitti prosenttiosuus Saharan G

1 apoptoottisten solujen laski 32,5%: sta 10,9% hoidon jälkeen AZD6244 72 tuntia (Fig. 4D). TUNEL määritys osoitti myös, että FOXO3a siRNA transfektion estivät merkittävästi AZD6244 indusoiman apoptoosin 56,7%: sta 18,4%: in Calu-6 (

P

0,05, Fig. 4E). Tuloksemme ehdotti, että FOXO3a aktivoitumista tarvitaan AZD6244 aiheuttama Bim ilme.

caAKT transfektion ajan säätelee ilmentymistä p-FOXO3a ja esti AZD6244 aiheuttaman apoptoosin

edellinen tutkimus osoitti, että korkeat Kuten on esitetty kuviossa.