Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

On kaksi tapaa, että tilastolliset menetelmät voivat oppia biolääketieteen tiedot. Yksi tapa on oppia luokittelijoiden tunnistamaan sairauksiin ja ennustaa tuloksia käyttäen koulutus aineisto vakiintuneiden diagnoosi jokaisesta näytteestä. Kun koulutus aineisto ei ole käytettävissä tehtävä voi olla kaivoksen läsnäolon mielekkäitä ryhmien (klusterit) näytteiden ja tutkia taustalla tietorakenne (ohjaamaton oppiminen).

Tulokset

tutkineet proteomic profiilit sytosolifraktion ihmisen maksan näytteitä kaksiulotteinen elektroforeesi (2DE). Näytteet resektoitiin kun kirurginen hoito maksametastaaseja kolorektaalisyövässä. Ilman valvontaa hierarkkinen ryhmittely 2DE geelin kuvia (n = 18) paljasti kaksi klustereita, jotka sisältävät 11 ja 7 näytettä. Aiemmin käytimme samoja yksilöitä mitata biokemiallisia profiilit perustuvat sytokromi P450-riippuvainen entsymaattisia toimintoja ja totesi myös, että näytteet selvästi kahteen hyvin erillään ryhmien klusterianalyysillä. Kävi ilmi, että ryhmien entsyymin aktiivisuutta lähes täydellisesti yhteen ryhmiin tunnistettiin proteomic tiedot. Niistä 271 toistettavissa läiskät meidän 2DE geelit, valitsimme 15 erottamaan ihmisen maksan sytosolin klustereita. Käyttämällä MALDI-TOF peptidi massa sormenjälkien tunnistimme 12 proteiineja valitun paikkoja, kuten tunnettua syöpään liittyvä lajeja.

Johtopäätökset /merkitys

tulokset korostavat hierarkkisen klusterin analyysi proteomic data, ja osoittivat välistä yhdenmukaisuutta tulosten biokemiallisten ja proteomiikka lähestymistapoja. Ryhmittely ihmisen maksan näytteet ja /tai potilaita eri klusterit voivat tarjota oivalluksia mahdollisia molekyylimekanismin lääkeainemetaboliaa ja luo perustelut yksilöllisten.

Citation: Petushkova NA, Pyatnitskiy MA, Rudenko VA, Larina OV , Trifonova OP, Kisrieva JS, et ai. (2014) soveltaminen on Hierarkkinen klusterointi ja analyysi proteiini Patterns in Human Cancer-Associated Maksa. PLoS ONE 9 (8): e103950. doi: 10,1371 /journal.pone.0103950

Editor: Silvia Mazzuca, Università della Calabria, Italia

vastaanotettu: 26 helmikuu 2014; Hyväksytty: 04 heinäkuu 2014; Julkaistu: 01 elokuu 2014

Copyright: © 2014 Petushkova et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukivat opetus- ja tiedeministeri Venäjän federaation State Sopimus nro 16.522.12.2002. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kaksi tekijää työskentelee myös kaupallinen yritys Postgen Tech LLC, mutta he eivät vastaanottaa maksun tai palveluita yhtiölle kaikista näkökohta toimitti työtä (mukaan lukien mutta ei rajoittuen avustuksia, tarkkailuun board, tutkimuksen suunnittelu, käsikirjoitus valmisteilla, tilastollinen analyysi, jne.). Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Maksan etäpesäkkeitä yleensä asteittain vahingoittaa maksan toimintaa ja ovat erittäin pahanlaatuisten ja tulenkestävät perinteisiin hoitoihin [1] . Ymmärtäminen molekyyli- ja biologiset mekanismit paksusuolisyövän voivat sallia kehittämiselle edelleen terapeuttisia strategioita niiden ehkäisemiseksi ja hoitamiseksi maksametastaaseista [2], [3]. Lisäksi molekyyli-pohjainen hoitoja voi pidentää aikaa maksan uusiutumisen jälkeen parantava resektion ja voi pidentää potilaiden eloonjäämistä. Kehittäminen tehokkaampaa ja vähemmän myrkyllisiä syövänvastainen strategioita myös mahdollistaa personointi hoito-mukaisen molekyyli- piirteitä yksittäisten potilaiden [4].

proteomiikan tutkimukset maksan näytteitä voidaan auttaa tunnistamaan tiettyyn proteiiniin merkkiaineita etäpesäkkeitä [5]. Yksi useimmin käytetyt menettelyt luonnehdinta proteiinin osien biologisten järjestelmien on kaksiulotteinen polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (2DE) yhdessä massaspektrometrialla. Tyypillisesti 2DE vertaillaan muutoksia proteiinien tasolla, muutos, ja hajoaminen välillä käsiteltyjen ja käsittelemättömien näytteiden [6]. Proteomic muutokset voidaan paljastaa geeli kuva-analyysin jälkeen visualisointi värjäämällä ja tunnistaminen proteiinien lajien muuttunut ilme tai translaation jälkeisessä todetaan [7].

Useimmat tutkimukset perustuvat 2DE analyysiin proteiiniprofiileja kolorektaalisyövässä ovat suoritettiin kudoksen lysaatin peräsuolen adenokarsinooma, viereisen normaalin paksusuolen limakalvo, ja metastaaseja [8] – [10]. Tällainen strategia rajoittuu lähinnä runsas proteiineja (esim rakenteellisia proteiineja, glykolyyttiset entsyymit, annexins, katepsiinit, ja lämpösokkiproteiinit), jotka yli-ilmentyy useissa syövissä [8]. Nämä proteiinit voivat vaikeuttaa tunnistamista matalan runsaus proteiineja, kuten kalvo proteiineja, joka on keskeinen rooli solun signalointi, solu-vuorovaikutuksiin, viestintä, ja liikenne mekanismit, ja ovat huumeiden tavoitteita [11]. Lähestymistapojen liittyvät erillään kliinisestä materiaalista subproteomes, kuten secretome, proteasomin, solukalvoon osa, ydin- matriisin, jne., On syntynyt viime aikoina. Subsellulaariset yhdistettynä massaspektrometria tekniikoita on tehokas lähestymistapa paljastaa uusia, alhainen runsas erityisiä peräsuolen liittyvien proteiinien ja ehdokas biomarkkerit [8]. Esimerkiksi 1687-proteiinia täplät havaittiin suuri muodossa geeleissä (24 x 33 cm), liukoista proteiinia osa syöpä- ja normaalin limakalvon kudosten ja se osoittaa, että intensiteetti ≥96% proteiinia täplien hajallaan alueella 2-kertaiseksi eroja ja 90,5% 1,5-kertainen eroja [12]. Jotta ihmisen maksan sytosolifraktion 17 × 24 cm geelit, 2-kertainen vähemmän proteiinitäplien (911 täplät) on sovitettu [13]. 2DE kuva analyysit osoittivat, että määrä proteiinitäplien merkittävästi muuttuneet ensisijainen syövän ja maksan etäpesäkeleesioita. Sanotaan, kalvon osa primaarisen syövän hoidossa ja maksan metastaaseja osoittaneet proteiinipitoisuuden (eli määrä Hyväksytty proteiinin läiskät 2DE geelit), verrattuna kalvon osa normaalin paksusuolen ja peräsuolen limakalvon [10]. Muto et ai. [12] yleisesti raportoitu, että proteomiin normaalia kudosta voi olla yhtenäisempi kuin kasvaimen kudokset.

Aiemmin meillä kuvattu lähestymistapa syrjiä mikrosomaalisia näytteet tietynlaiset perustuvat biokemialliset profiilit [14]. Tässä raportissa koejärjestely verrata biokemiallisten ja proteomiikka profiilit on esitetty (kuvio 1). Ensimmäisessä vaiheessa tämä lähestymistapa biokemiallinen profiili saatiin. Se oli 12 parametrit, eli aktiivisuus NADPH-sytokromi P450 -reduktaasin, P450 sisältöä ja 10 sytokromi P450-riippuvainen mono-oksigenaasin toimintaa merkki alustoille. Puhtaasti ilman valvontaa tilastollinen analyysi biokemiallisten profiilit ihmisen maksan mikrosomeissa meidän päätellä, että kuviot maksan mono-oksygenaasi järjestelmän muodostettu kaksi hyvin toisistaan ​​ryhmät (kuvio 1, A). Kävi ilmi, että ainakin 6 muuttujat olivat merkittävästi erilaisia ​​kahden suuren klustereita ihmisen mikrosomaalisia näytteitä, joilla

p

-arvo 0,05 kanssa Bonferroni korjaus. Lisäksi todettiin, että muutokset NADPH-sytokromi P450-reduktaasin aktiivisuus käsittää tärkein tekijä, joka vastaa erottaminen biokemiallisten profiilit kahden ryhmän välillä potilaista [14].

(A) profiili oli 12 parametrit, eli aktiivisuutta NADPH-sytokromi P450-reduktaasi, sytokromi P450 sisältöä ja sytokromi P450-riippuvainen mono-oksygenaasi toimintaa merkki substraattien (Petushkova et al., 2010). (B) profiili mukana 2DE kuvia.

korreloida HLC proteiiniprofiili määrittelemän 2DE, biokemiallisten toimintaan mikrosomaalisten järjestelmän käytimme aikaisemmin kerättiin morfologisesti normaali maksan näytteet ympäröivän maksametastaaseja paksusuolen syöpä. Ultrasentrifugointimenetelmätavan käytettiin, jolloin saatiin ihmisen maksan sytosoliin ja mikrosomaalifraktioilla samasta maksan näyte. Nykyinen tutkimus tehtiin vertailla näyte klusterien mukaisesti saatu mikrosomaalisten biokemiallinen aktiivisuus (kuvio 1, A) vastaavien sytosolin proteomic profiileja (kuvio 1, B). Lisäksi olimme kiinnostuneita tunnistamisessa liukoiset proteiinit, jotka voidaan jotenkin liittyvät aktiivisuuteen kalvoon sitoutuneen sytokromi P450.

Materiaalit ja menetelmät

Eettinen menettelyjä

kaikki näytteet jäljellä maksasta jälkeen histologinen analyysi oli hyväksynyt osasto patologinen anatomia National Research Center of Surgery, Russian Academy of Medical Sciences (Moskova, Venäjä). Tietoinen suostumus saatiin kaikilta potilailta. Yksilöt suostunut osallistumaan tutkimukseen mukaan paikallisen laitoksen eettinen komitea National Research Centre of Surgery. Näytteet on kuvattu edellisissä julkaisuissa [14], [15].

Chemicals

2- [4- (2-hydroksietyyli) piperatsin-1-yyli] etaanisulfonihappo, phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF ), 2,5-dihydroksibentsoehappo, etyleenidiamiinitetraetikkahappo (EDTA), nikotiiniamidiadeniinidinukleotidifosfaatin, natriumditioniitti, trypsiiniä, ja natriumdeoksikolaattia ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA); asetonitriili ja trifluorietikkahappo ostettiin ICN Pharmaceuticals Inc. (Costa Mesa, CA, USA); Coomassie Brilliant Blue R-250 ostettiin Fluka (Seelze, Saksa). Modifioitu trypsiini (luettelonro. V511C) saatiin Promegalta (Madison, WI, USA). Muut kemikaalit hankittiin Reakhim-Penza, LLC (Penza, Venäjä).

2.3 kudosnäytteitä ja valmistelu

Ihmisen liukoisen maksan proteiinifraktioiksi valmistettiin edellisessä tutkimuksessa (säilytetään -80 ° C: ssa ennen käyttöä) peräisin toistoleikattiin ja hävittää massat ympäröivä maksan kudoksiin, jotka otettiin potilailta (n = 23), joille maksan leikkaus [14]. Näytteet morfologisesti normaali maksan (3-10 g,) saatiin distaalisen reunan resektio, vähintään 5 cm pois kasvain. Näytteet diagnosoitiin histopatologisesti.

Kuten koostui edellytyksiin kokeen, emme ottaneet huomioon kaikki henkilökohtaisia ​​tietoja potilaiden tai koskevat potilaan hoitoa. Kuitenkin näytteitä suoritettiin seuraavien ohjeiden: (1) kaikki potilaat olivat ankarissa syöpäsairaus, joka johti leikkaus maksan ehkä jälkeen ennen kemoterapiaa; (2) ei sädehoito suoritettiin ennen leikkausta; (3) ei ole näyttöä hormonitoiminnan tai aineenvaihduntasairaus; (4) ei vakava tartunta löydettiin; (4) potilaiden ravinnon vaatimuksia hallinnoi National Research Center of Surgery suhteellisen yhtenäinen standardi; seurauksena, eksogeeninen ruokavalion vaikutusta metabolisen profilointia rajoittui alimmalle tasolle. Resektoitua Näytteet laitettiin välittömästi jäihin ennen saamiseksi ihmisen maksan mikrosomaalisten osa [14] ja HLC. Kaikki valmistelu menettelyt suoritettiin 0-4 ° C: ssa. Maksa homogenisoitiin kaksi osaa homogenointipuskuria, joka sisältää 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitoli (DTT), 0,1 mM PMSF, ja 150 mM KCl: a käyttäen lasista Potter Elvehjem-homogenisaattoria, jossa on teflon survin (Sartorius STEDIM Biotech GmbH, Göttingen, Saksa). Maksa Homogenaattia peräkkäin sentrifugoitiin 10000 x

g

20 minuuttia ja 105.000 ×

g

70 min. Pelletti (mikrosomaalinen fraktio) analysoitiin kuten kuvattu edellisessä tutkimuksessa [14]. Esillä olevassa tutkimuksessa, supernatanttia käytettiin HLC osa. Proteiinin pitoisuus HLC näytteiden arvioitiin käyttämällä Bradfordin määritystä [16] kanssa, naudan seerumin albumiinia standardina.

Esifraktiointi ja HLC näytteitä ennen kaksiulotteinen polyakryyliamidigeelielektroforeesilla

alikvootti HLC (200 ui, 13,2 ± 5,6 mg proteiinia) sekoitettiin 1 ml: lla kylmää 10% trikloorietikkahappoa (TCA) asetonissa (v /v), joka sisälsi 0,07% merkaptoetanolia. Sen jälkeen, kun 3-h inkuboinnin -18 ° C: ssa, seosta sentrifugoitiin 20000 x

g

10 min (4 ° C). Supernatantti poistettiin ja pelletti liuotettiin 5 ml: lla kylmää asetonia, joka sisälsi 0,07% merkaptoetanolia, ja sentrifugoitiin kuten edellä on kuvattu. Supernatantti heitettiin pois ja saatu pelletti on käytetty proteiinien erottaminen 2DE.

Kaksiulotteinen polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (2DE) B

2DE on HLC proteiinien suoritettiin, kuten valmistaja on kuvannut (Bio -Rad, Hercules, CA, USA). Kunkin HLC näyte, saatu pelletti liuotettiin 200 ul: aan nesteytys-puskuria (4 M urea, 2 M tioureaa, 4% 3 – [(3-kolamidopropyyli) -dimetyyliammonio] -1-propaanisulfonaatti, 50 mM DTT: tä, ja 0,5 % Ampholinea). Proteiinit ladattiin passiivisella nesteytys päälle 11-cm, epälineaarinen, immobilisoidut, pH-gradientin (IPG, pH 3-10) riisuu yön yli (14 h) 50 V ja vielä 30 minuutin ajan 250 V: Isoelektrinen fokusointi (IEF) oli suoritettiin käyttäen Protean IEF Cell (Bio-Rad), jossa on sovellettu gradientti 250-5500 V yhteensä 35000 V · h. Kaikki IEF vaiheet suoritettiin 20 ° C: ssa. Seuraavat IEF, IPG geeli liuskoja tasapainotettiin tasapainotuspuskurilla (50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 6 M ureaa, 2% natriumdodekyylisulfaattia (SDS), 20% glyserolia), joka sisälsi 1% DTT: tä ja ravisteltiin 30 minuutin ajan 50 rpm kiertoravistimella [17]. IPG nauhat siirrettiin sitten tasapainotuspuskurilla, joka sisälsi 2,5% akryyliamidia, ja ravisteltiin vielä 30 minuutin ajan ennen erottamista polyakryyliamidigeelillä (135 x 80 x 1,0 mm, 4% sileää geeliä, ja 12% ratkaisemiseksi geeli). Erottaminen toisessa ulottuvuudessa suoritettiin käyttäen Mini-Protean Dodeca Cell (Bio-Rad) ja Tris-glysiini-puskuria (25 mM Tris-emästä ja 192 mM glysiiniä), joka sisälsi 0,1% SDS: ää, 150 V Run aika oli noin 60 min ja kun poistuminen bromifenolisinistä puskuriin, elektroforeettisen erotuksen katsottiin täydellinen.

Protein visualisointi ja kuva-analyysi

Geelit altistettiin hopeavärjäyksellä [18], geeli kuvat hankittiin käyttämällä GS-800 Calibrated densitometri (Bio-Rad) ja ladataan osaksi yleisten digitaalisten kuva-analyysi-ohjelmisto GelEditor. Se on kirjoitettu Java ja supportsl työkaluja lataa kuvia, automatisoitu paikalla havaitseminen perustuu Laplacian Gaussin Filter, manuaalinen paikalla havaitseminen, sovitus proteiiniprofiileja, sekä mahdollisuus tallentaa raportteja (kuva S1). Paikalla intensiteetti geelillä laskettiin summana pikseleiden manuaalisesti havaittu paikalla. GelEditor ohjelmiston voi vapaasti ladattavissa www.bioinformatics.ru/geleditor.zip.

In-geeliä ruuansulatuksen

Proteiini täplät (~ 3 mm

3) irrotettiin geeli käyttämällä muunnettua 250 ui vihjeitä ja väri poistettiin 50 ui 100 mM K

3 [Fe (CN)

6] ja 100 mM natriumtiosulfaattia suhteessa 01:01 (v /v) per geeli pala huoneen lämpötilassa 30 min. Sen jälkeen geelipalat pestään vedellä huoneen lämpötilassa, ja ravisteltiin 15 minuutin ajan 50 rpm tasoravistelijalla. Menettely toistettiin kolme kertaa. Sitten geeli palaset pestiin kahdesti 150 ui 50 mM NH

4HCO

3 50% asetonitriili, 37 ° C: ssa, ravisteltiin 15 minuutin ajan 50 rpm: llä pyörivässä ravistelijassa, ja inkuboitiin 15 min nestehukka (100% asetonitriiliä). Sen jälkeen kun asetonitriili poistettiin ja geeli palat kuivataan, 8 ± 2,0 ui trypsiiniliuosta (25 ng /ul modifioitu trypsiini 50 mM bikarbonaatti ammonium) lisättiin ja seosta inkuboitiin 37 ° C: ssa yön yli. Sitten, 15 pl 0,7% trifluorietikkahappoa, lisättiin kuhunkin geelin pala, ja näytteitä inkuboitiin 2 h huoneen lämpötilassa. Uutettu trypsiinipeptidit käytettiin massaspektrometrianalyysi.

Matrix laserdesorptio-ionisaatio-lentoaika-massaspektrometrialla (MALDI-TOF MS) B

Jokainen seos proteolyyttisten peptidien (1 ui) täpliksi MALDI kohde (600/384 Anchor siru; Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Saksa) vuonna kolme toistoa ja ilmakuivattua. Sillä ionisaatio, liuos, jossa oli 2,5-dihydrobentsoehapon (3 mg /ml) asetonitriilissä ja 0,7% trifluorietikkahappoa (1:01 v /v) käytettiin. Massaspektrit

m /z

valikoima 600-4000 manuaalisesti hankitut FlexControl ohjelmistoa (Bruker Daltonik GmbH) heijastus /myöhässä uuttamalla tilassa kiihdytysjännitteellä 25 kV ja 135-ns viive käyttämällä Ultraflex II MALDI-TOF MS-analysaattori (Bruker Daltonik GmbH). Kaikki massaspektrit edustaa signaalien keskimäärin 100 laser laukausta paikasta otoksen paikalla. Kustakin näytteestä paikalla, 4-6 massaspektrit hankittiin. Laser sujuvuus säädettiin yläpuolella desorptio kynnyksen matriisin saada paras resoluutio ja suurimman massan mittaustarkkuuden. Signaalit S /N-suhde 6 ja enintään 100 huippujen kohti spektrin käytettiin rakentamaan huippu luetteloita SNAP algoritmin (FlexAnalysis ohjelmisto ver. 2.0; Bruker Daltonik GmbH) ja sisäisesti kalibroitu trypsiinillä Autolyysin tuotteet (

m /z

842.5094 ja 2211.1046 Da, vastaavasti). Tuloksena huippu luetteloita käytettiin hakemaan vastaan ​​UniProtKB /Swiss-Prot-tietokannasta (UniProt release 2012_09 – 11 syyskuu 2012). Tunnistaminen peptidi massa sormenjälkien ottaminen (PMF) suoritettiin käyttäen Mascot ohjelmistoa (Matrix Science, Inc., Boston, MA, USA). Aikana tietokannan haku, enintään yksi jäi katkaisun sallittiin, massa toleranssi 80 ppm käytettiin, ja vaihteleva muutoksia, kuten metioniini hapettuminen ja kysteiinin muutos akryyliamidin, otettiin huomioon. Käytettävissä olevan m /z toleranssi (80 ppm) arvioitiin suurin massa poikkeama perustuvat tilastollisiin jakautuminen massa- virheitä kaikissa spektrit ja sen keskihajonta.

Tilastollinen

Alkuperäinen aineisto koostui 19 näytettä (2DE geelit), kukin tunnettu keskimäärin 271 ± 99 proteiinitäplien /ominaisuudet (taulukko S1). Geeli no. 6 käytettiin master geelin käsin spot-to-paikalla linjaus. Koska olimme kiinnostuneita vertaamalla tuloksia etukäteen tietoa biokemialliset profiilit mitattiin samat näytteet [14], myös ulkopuolelle geeli no.4 koska edellisessä tutkimuksessa sitä pidettiin Peränpitäjänä; joten meillä oli kokoelma 18 geelin kuvia. Varmistaakseen tutkimus toistettavuus ja vähentää melua herkkyyttä, analysoimme ainoastaan ​​laadullisia eroja geelejä suhteen läsnäolo /poissaolo tietyn proteiinin paikkoja. Kukin geeli oli toistettu kolme kertaa, ja paras replica valittiin silmämääräisesti erottaminen laatua. Lopullinen aineisto esitettiin binary matriisi D koostuu 18 riviä (geelit kuvat) ja 389 saraketta (paikkoja), jossa

d

ij

= 1 jos

j

nnen paikalla oli läsnä on

i

nnen geeliä, toisin

d

ij

= 0. geeli klusterointia, käytimme Wardin menetelmällä. Etäisyys metrinen kahden binaarisen vektorien määriteltiin bittien määrä, jos nämä vektorit eroavat (tunnetaan myös nimellä Hamming-etäisyys). Kaikki laskelmat ja grafiikka tehtiin R tilastokieltä (www.r-project.org). Lähdekoodi tietojen analysoinnin kirjoitus löytyy Data Analysis Script S1. Mitata samankaltaisuuteen kahden datan clusterings, laskimme mukautetaan Rand indeksin, jonka arvo on alueella -1 ja +1 välillä, missä +1 vastaa täydellistä välisen osioita.

Tulokset ja keskustelu

meidän kokeissa kaikki näytteet on otettu jonkin luokan potilaat: kirurgisesti hoitoa maksametastaaseista johtuvat paksusuolen syöpä (kuva 1). Siksi tavoitteenamme ei ollut löytää eroja normi ja syöpä, vaan pikemminkin tutkia rakenteen sisällä yksi-ryhmä aineisto, joka kuvaa ihmisen maksan huumeiden metaboloivien järjestelmä ja sytosolin osa (tässä tutkimuksessa). Aiemmissa tutkimuksessa koskien lääkeainemetaboliaan [14] huolimatta suhteellisen pieni otoskoko (n = 22) tuloksemme kiistatta todistettu esiintyminen kaksi klustereiden tietoja. Me lasketaan siluetti leveys kriteerit klusterin pätevyyttä, joka osoitti, että läsnä oli kaksi klustereiden on vahvistettu erittäin suuri luottamus (p 0,0001). Siksi paljastui heterogeenisyys kuluessa yhtä hoidetussa ryhmässä potilaita oli taustana hetkellä raportoitu proteomic tutkimuksessa.

2DE analyysi HLC

Tutkimukset ihmisen maksan kudoksissa on tehty tunnistamaan, onko ryhmiä näytteiden erottuva niiden proteomeja. HLC Proteomi leimasi edustava kokoelma 19 oli eroteltu 2DE keskiosalla muodossa geelejä kolme toistoa, siten yhteensä 58 2DE kuvien tutkittiin. Paras 2DE rinnakkaista valittiin teknisten kulkee mukainen erottaminen laatu (kuva S2). Valitut edustavat kuvat muutettiin päällä luetteloihin ja edelleen ryhmittyneet käyttäen valvomatta menetelmällä. Johdonmukaisesti edellisessä työtä maksan mikrosomeilla täällä käytimme valvomatta lähestymistapaa, koska kliiniset tiedot resektoitua maksa näytteitä oli poissa.

hylännyt joitakin näytteitä johtuu heikkolaatuisia 2DE erottaminen takia erikoispiirteitä näytteen valmistusta (kuva 2). Tyypillinen 2DE kuvia Ag-värjätyn geelin ja näytteen no. 6 ennen ja jälkeen Esifraktiointi kanssa TCA asetonissa (katso materiaalit ja menetelmät) on esitetty kuviossa 2,

ja

b

. Ilman Esifraktiointi, 2DE sytosolia murto vaikeuttaa erottamista proteiinitäplien (kuvio 2

). Kuva 2

b

on edustava mestari geeli kuva osoittaa proteiinien erottelu ihmisen maksakudosta jälkeen TCA /asetonilla saostumisen. Tämä käytäntö on usein käytetään poistamaan epäpuhtauksia, koska se minimoi proteiinien hajoaminen [19], mutta TCA /asetonilla sademäärä oli riittämätön saada asianmukaista geeli kuvia HLC näytteen nos. 20-23, joten ulkopuolelle näitä näytteitä muihin analyyseihin. Kaikkiaan 687 proteiinitäplien eroteltiin hopeavärjätyssä 2DE geeli HLC näytteestä no.6, tekninen ajaa # 1, spot-tunnistus työkalu GelEditor ohjelmistoja. Lisäksi hopeavärjäysmenetelmää perustuva protokolla Shevchenko et al. [18] Coomassie blue-värjäys koetettiin myös tässä tutkimuksessa, ja vain noin 100 proteiinia kohdetta havaittiin samalla geelillä no.6 (kuvio 2

c

).

30 ug ihmisen liukoinen maksan proteiinifraktiota (HLC) erotettiin 2DE ja visualisoitiin hopeavärjäyksellä (

ja

b

) tai Coomassie Brilliant Blue-värjäys (

c

):

– HLC ennen esikäsittelyä trikloorietikkahapolla asetonissa;

b

ja

c –

HLC esikäsittelyn jälkeen. Käyttämällä Coomassie-värjäys lähes 100 proteiinitäplien voisi paljastua, mutta hopeavärjäyksen merkintöjä jopa 687 proteiinia täplät tunnistetaan automaattisesti. Paikkoja nos. 14, 25, 34, 36, 48, 56, 62, 63, 66, 210, 214, 219, 247, 252, 275, 276, 279, 301, 321, 322, ja 408 ovat yhteisiä kaikille 2DE geelit 19 ihmisen maksan sytosolin näytteitä.

saadut geelikuvien tutkittiin luonnehtia spot toistettavuutta ja vaihtelevuutta. Havaitsimme, että 96% proteiinista paikkoja olivat alaraja toteamisrajan Hopeatiosulfaatin kanssa normalisoitu intensiteetti 0.02 suhteellinen yksikköä. Keskipitkällä intensiteetti 0,02-0,04 yksikköä havaittiin 2% paikkoja, kun taas 1% pilkkuja oli korkea runsaasti suhteellisen intensiteetin 0,1 yksikköä.

Lisäksi valitsimme päällikön geeli parhaana geeli eniten paikkoja ja minimaalinen joukko hajonta keskimääräisen intensiteetin kunkin täplän. Master geeli vastasi näyte no 6. arvioida tekninen muunnelma meidän koejärjestely, teimme neljä itsenäistä Replikoitumattoman ajojen HLC näyte no. 6 eri aikoina. Aluksi vaiheessa analyysin käytimme useita paikkoja karkeana mittana geeliä toistettavuus. Yhteensä 449, 420, 444, ja 406 proteiinitäplien havaittiin näissä ajoissa valikoimia pl 3,5-10,0 ja MW 10-250 kDa. Havaittu keskimääräinen lukumäärä paikkoja oli 430 ± 20, joka oli verrattavissa aikaisemmin saatuja tietoja sytoplasminen osa primaaristen ihmisen hepatosyyttien HepG2 ja Hep2B solulinjat [20]. Loput geelit sisälsivät riittävästi vähemmän paikkoja, kuten kuvassa 3 19 HLC näytteitä. Koko sarja, keskimäärin käsin havaittujen proteiinitäplien oli 271 ± 99 (keskiarvo ± SD, n = 58). Paikalla määrät olivat kolme kertaa pienempi verrattuna aiemmin raportoituun tulokset sytosolifraktion analyysin ihmisen maksan kudosnäytteiden [13], [21], [22]. Ero paikalla numero oli johtunee 2DE setup, kun käytimme 11-cm IPG nauhojen sijasta 17 cm, jota Wimmer et al. [13], ja Kim et ai. [23], ja niin gradienttien isoelektristä fokusointia varten olivat lyhyempiä. Kim et ai. [23] analysoidaan kasvain- ja ei alueilla resektoitiin maksasyövän kudosten tunnistaminen sytosolin proteiinien avulla 2DE ja MALDI-TOF-MS. He käyttivät hopeavärjäyksellä proteiinin havaitsemisen geelien ja tarkkailtava enintään 1060 täplät ja tunnistaa 127 proteiinit; he myös, että ongelma vaihtelevuutta spot intensiteetin päätettiin käyttäen normalisoitua intensiteettiä.

geelit kuuluvat klusterin 1 esitetään valkoiset pylväät. Geelit kuuluvat klusterin 2 esitetään harmaalla sarakkeita. Geeli, joka poistaa kaikki myöhemmät tietojenkäsittely esitetään varjostetulla sarakkeeseen.

Arvioidaan geeli-to-geeli vaihtelua, vertasimme paikkoja neljästä Replikoidun geelikuvien saatu näytteestä ei. 6 käyttämällä manuaalista spot sovitus piirre oma GelEditor ohjelmistoa (kuva S1). Kukin rinnakkaista manuaalisesti tasataan päänäköistiedosto, joka sisälsi enimmäismäärä paikkoja. Olemme havainneet, että 102 paikkoja oli läsnä vähintään kolme toistoa, 80 täplät Hyväksytty puolet geelien, kun taas 58 läiskät olivat läsnä master geelillä vain. Lopuksi, 47% paikoista (209 täplät) sovitettu kaikki neljä jäljitellä 2DE kuvia.

määrittämiseksi toistettavuus 2DE, tutkimme tekninen ajojen HLC näytteen 6, analysoi normalisoitu intensiteetit kunkin paikan, ja piirretty ne toisiaan vastaan ​​X-Y ja kvantiili – kvantiili (Q-Q) tontteja [24]. X-Y tontteja näytteen no.6, tekninen run # 1 (master geeli) verrattuna samasta näytteestä, tekninen run # 2 esittävät Pearsonin korrelaatiokertoimen r = 0,797 (kuva 4

). Me tehdään tällainen analyysi kaikkien neljän tekniset kulkee geelin 6 ja määritettiin keskimääräinen Pearsonin korrelaatiokerrointa, joka oli yhtä suuri kuin 0,72 ± 0,06 (keskiarvo ± 95%: n luottamusväli). Suuruus korrelaatiokertoimen r 0,7 viittaa vahva korrelaatio, kun taas Q-Q tonttien käytettiin graafinen työkalu vertailuun kahden jakauman toisiinsa. Kaksi aineistoja voitaisiin pitää samanlaisina, jos pistettä Q-Q tonttien sijaitsevat lähellä regressiosuora

y = x

. Kuten kuviossa 4b tämä kriteeri täysin täytettävä HLC proteiineja.

Normalized paikalla intensiteetit kaksi teknistä ajojen geelin no.- Y juoni ja quantile-kvantiili (Q – Q) juoni. X – Y tontti osoittaa vahvaa korrelaatiota paikalla intensiteettien joiden Pearsonin korrelaatiokerroin r = 0,797 (a). Q – Q tontti näyttää korkea samankaltaisuus spot intensiteetin jakauma (b). Intensiteetti sillä jokaiselle täplä geelillä normalisoitiin kohden kokonaisvoimakkuutta sovitetun täplät tästä geelistä.

hyvin toistettavissa täplät (209) käytettiin arvioitaessa paikalla intensiteettimuutosta neljällä rinnakkaisnäytteiden HLC näytteen no 6. variaatiokerroin (CV) jakelu histogrammi (katso kuva 5), ​​65% täplät ominaista CV 0,6. Tämä aste vaihtelusta monistaa geelien oli verrattavissa CV havaittu normaalia kudosta vastaan ​​eri syövän vaiheissa [9], [25]. Esimerkiksi, Shi et ai. [9] havaittiin keskimäärin CV 62-69% vuonna 1223 paikalla piirteitä 18 2D-DIGE paikalla profiilien kesken eri näytteen ryhmien (normaali paksusuoli limakalvo, ensisijainen peräsuolen syöpä, ja maksametastaaseja). Tutkijat havaitsivat, että sekä ensimmäisen että toisen kasvaimia näytetään huomattavasti korkeampi spot tilavuuden vaihtelut kuin normaali paksusuoli.

intensiteetti sillä jokaiselle täplä geelillä normalisoitiin kohti yleistä intensiteetti Hyväksytty täplät tästä geelistä.

yleensä CV riippuu biologista materiaalia, sekä näytteen valmistus ja paikalla havaitseminen lähestymistapoja [26], [27]. Hopea värjäystä, vastaavat täplät valmisteltu ja ajaa identtisissä olosuhteissa vaihdella intensiteettiä; siksi on vaikea saavuttaa toistettavuutta edes rinnakkain rinnakkaista [26]. Siksi, koska meidän geelit olivat huonosti toistettavissa intensiteetit vastaavat paikkoja, emme käyttäneet intensiteettiä arvoja tarkempaa analysointia, mutta muunnetaan täplät osaksi binäärimuodossa: joko on paikalla, tai ei.

3.2 valvomaton klusterointi geelien ja mikrosomaalisten näytteet

käyttää klusterianalyysillä erottamaan geelit ja selventää ryhmien mallistomme maksan näytteitä. Aluksi läiskät kukin 2DE geelillä koottiin sen läiskät master geelillä (no. 6 # 1) käyttäen Perl-skripti (Data Analysis Script S2). Tuloksemme olivat muotoiltuja taulukko, jossa rivit osoitti proteiinin täplät ja sarakkeet edustettuina HLC näytteitä. Jos proteiini paikalla oli läsnä HLC geelillä ja master geeli, solun arvo olisi asetettu ”1”, toisin, jos paikalla oli poissa seuraavalla HLC geeli, se asetettiin ”0”. Me tehdään hierarkkinen klusterin analyysi tiedoista matriisi Wardin menetelmää yhdistettynä Hamming-etäisyys metristä. Klusterointi 2DE geelejä HLC Näytteiden visualisoidaan dendrogrammimuodossa (kuva 6

). Kaksi tärkeää klusterit olivat selvästi erotettavissa: ensimmäinen (klusteria ei. 1) muodostettiin geelit nos. 1-3, 5, ja 7-13, kun taas toinen (klusteria ei. 2) sisältyvät geelit nos. 6 tekninen run # 3, ja 14-19. Joten, Wardin menetelmällä saatiin kaksi ryhmää maksan näytteitä. Mielenkiintoista, histogrammi kuviossa 3 alustavasti todennut, että on olemassa kaksi klustereita varten HLC näytteitä. Keskimäärin käsin havaittujen proteiinin läiskät geelit klusterimalleja nos. 1 ja 2 olivat 219 ± 72 ja 342 ± 91 (keskiarvo ± SD), tässä järjestyksessä; kuitenkin ero määrä paikkoja oli tilastollisesti merkityksetön (

p

0,05, n = 18).

Kaksi suurta klustereita voidaan nähdä.

mukaan meidän aiemmin ilmoittanut ihmisen maksan mikrosomeja myös jaotella kahteen ryhmään [14]: ensimmäinen sisälsi näytteitä nos. 1-3, 5-12, ja 23, kun taas toinen sisälsi näytteitä nos. 13-22 (kuvio 1A). Siten oli olemassa korrelaatio näytteen klustereiden ilmi kaksi aivan eri kokeellisia lähestymistapoja.

Rand-indeksi oli 0,58, mikä osoittaa merkittävää ottelu [27] välillä biokemiallisten ja proteomiikka tiedot. Hieman eroa ryhmän koostumus HLC näytteiden ja ihmisen maksan mikrosomaalisten (huume-metaboloivien) on todettu. Nämä muutokset olivat erityisesti HLC näytteitä nos. 6 ja 13, osoitettu klusterin nos.