Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Altered ilmentymistä Mcl-1, antiapoptoottisena jäsen Bcl-2-perheen, on yhdistetty etenemistä ja lopputulosta erilaisia ​​syöpäsairauksia. Olemme aiemmin raportoitu yli-ilmentyminen Mcl-1-proteiinia ihmisen suusyöpä. Tässä tutkimuksessa pyrittiin arvioimaan kliinis merkitystä ilmaisun kolme tunnettua Mcl-1 isoformien suullinen kasvaimia ja vaikutuksen kohdistaminen Mcl-1L isoformi on kemosensitiivisyys suun syöpäsoluja.

Methods

ilmaisu MCL-1 isoforms- Mcl-1L, Mcl-1 S MCL-1ES analysoitiin 130 pariksi suun kasvaimia ja 9 suun solulinjoja käyttämällä kvantitatiivista tosiaikaista PCR proteiini Western blottauksella. MCL-1-mRNA-tasot korreloivat kliinis parametrit ja tulos suun syöpäpotilailla. Vaikutus Mcl-1L shRNA tai Obatoclax (pienimolekyylinen Mcl-1-estäjä), yhdessä sisplatiinin kanssa on kemosensitiivisyys suun syöpäsolujen arvioitiin myös.

Tulokset

Anti-apoptoottisia Mcl -1L oli pääasiallisesti ilmaisi, miedolla tai havaitsemattomia proapoptoottisten Mcl-1S ja Mcl-1ES isoformit. MCL-1L transkriptit yliekspressoituvat merkittävästi kaikissa syöpäsolulinjoissa ja 64% suun kasvaimista versus viereisen normaalit (

P

0,02). Suun syöpäpotilailla, korkea Mcl-1L ilmentyminen oli merkitsevästi yhteydessä solmuun positiivisuus (

P

= 0,021), kehittynyt kasvaimen koko (

P

= 0,013) ja huono kokonaiseloonjääminen (

P

= 0,002). Monimuuttuja-analyysi osoitti Mcl-1L olevan itsenäistä ennustetekijä suun syöpien (

P

= 0,037). MCL-1L shRNA Knockdown tai sen inhibitiolle Obatoclax yhdistelmänä sisplatiinin synergistisesti vähensi kannattavuutta ja kasvua suun syöpäsolujen kuin jompikumpi hoito yksinään.

Johtopäätös

tutkimukset viittaavat siihen, että yli-ilmentyminen MCL-1L liittyy huonoon ennusteeseen ja chemoresistance suun syöpiä. MCL-1L on itsenäinen ennustetekijä ja potentiaalinen terapeuttinen tavoite suusyöpä.

Citation: Palve V, Mallick S, Ghaisas G Kannan S, Teni T (2014) yli-ilmentyminen pl-1L Splice Variant Is liittyy huonoon ennusteeseen ja Chemoresistance suun Syövät. PLoS ONE 9 (11): e111927. doi: 10,1371 /journal.pone.0111927

Editor: Kithiganahalli N. Balaji, Indian Institute of Science, Bangalore, Intia

vastaanotettu: 9. kesäkuuta, 2014; Hyväksytty: 09 lokakuu 2014; Julkaistu: 19 marraskuu 2014

Copyright: © 2014 Palve et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Suun syöpä on yleisin syöpä Intian miehillä ja on pääosin liittyy tupakan pureskelu tapa vallalla maassa [1]. Huolimatta viimeaikaisista edistysaskeleet hoitomuotoja kuten leikkaus, sädehoito /kemoterapia, pitkän aikavälin selviytyminen suun syöpäpotilaiden ei ole muuttunut merkittävästi. Liittyvien tekijöiden huonoon ennusteeseen suun syöpä ovat, esitelmä kehittynyt kliinisessä vaiheessa hallitsematon paikallista alueellista toistumisen [2]. Siksi on tärkeää valottaa mekanismeja kehittymistä ja etenemistä suusyövästä ja tunnistaa molekyylikohteista parempaan sairauksien hoidossa.

Suun syöpiä ovat toistuvasti liitetty apoptoottinen säätelyhäiriötä [3]. Pro ja antiapoptoottisia jäseniä Bcl-2-perheen ovat keskeisiä säätelijöitä solujen apoptoosin ja on kriittinen rooli säätelyssä solujen eloonjäämistä [4]. MCL-1 (myeloidisolun leukemia-1) on tärkeä anti-apoptoottisen jäsen Bcl-2 geeniperheen, olennaista kehitystä, erilaistumista ja lisääntymistä [5]. Cellular ilmentyminen Mcl-1 on tarkoin säädeltyä läpi useita transkription ja transkription jälkeisen mekanismien [6]. Lisääntynyt Mcl-1 ilmentymisen voi tuottaa kohtalainen lyhyen aikavälin kannattavuuden parantamiseksi monenlaisiin solutyyppejä. Mcl-1 voi edistää solujen eloonjäämistä tukahduttamalla vapautumista sytokromi-c mitokondrioista kautta heterodimerisation ja neutralointi efektori pro-apoptoottisten BH3 vain proteiineja, kuten Bak ja Noxa [7]. Yli-ilmentyminen Mcl-1 on raportoitu erilaisia ​​maligniteetteja, mukaan lukien hematopoieettisten, imukudoksen ja kiinteitä kasvaimia [8], [9]. Yliekspressio Mcl-1 on liittynyt aggressiivinen kasvain ominaisuuksia, kestävyys käsittelyä ja huonoon ennusteeseen rinta-, maha-, munasarja- kohdunkaulan syövistä [10] – [13].

Vaikka Mcl-1-geeni on tutkittu laajasti multippelimyelooma ja leukemia, on olemassa harvinaisia ​​raportteja Mcl-1 analyysi pään ja kaulan alueen syöpä. Viimeaikaiset tutkimukset laboratoriossamme ovat osoittaneet merkittävää yli-ilmentymisen Mcl-1 proteiinia suusyövän solulinjoissa, esipahanlaatuinen leesioita (SVT) ja suullinen kasvaimia immunohistokemiallisesti [14]. Olemme myös osoittaneet korkeita PCNA ja Mcl-1-proteiinin ilmentymisen liittyvän huonoon ennusteeseen suun syöpäpotilailla hoidettu lopullinen sädehoidon [15]. Tilanne on monimutkainen johtuen olemassaolosta kolmen erillisen Mcl-1-isoformien vastakkaisia ​​toimintoja nimittäin antiapoptooppinen Mcl-1L ja proapoptoottisten Mcl-1 S MCL-1ES [16]. Mielenkiintoista, meidän lab on viime aikoina raportoitu yhdistyksen Antiapoptoottisten Mcl-1L isoformin selviytymisen ja radioresistance suun squamous kohdunkaulan soluissa [17].

Mcl-1 on myös osoitettu rooli chemoresistance of erilaisia ​​syöpiä, mutta rooli sen isomuotojen chemoresistance ei ole tutkittu syöpiä, kuten suun syöpiä. Säteily jälkeen kemoterapiaa on yhteinen hoitomuoto suun syövän ja Mcl-1 yli-ilmentymisen on osoitettu antamaan resistenssin tavanomaisia ​​kemoterapeuttisia lääkkeitä, kuten sisplatiini [18]. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että Mcl-1 edistää solujen eloonjäämistä ja kohdistaminen Mcl-1 kautta BH3 jäljittelevä molekyylit voivat indusoida solukuoleman Sisplatiini resistenttien syöpäsolujen [19], [20]. Äskettäin Obatoclax, BH3: a jäljittelevää pienmolekyylisalpaaja- on osoitettu antagonisoida Mcl-1-proteiini ja voittaa Mcl-1 välitteistä resistenssin apoptoosia [21], [22]. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, Mcl-1 olevan tärkeitä selviytymisen suun syöpäsolujen ja siten kohdistaminen Mcl-1 voisi olla käyttökelpoinen hoidettaessa suun syöpäpotilailla. Kuitenkin parhaan tietomme mukaan tällaiset tutkimukset eivät ole käytettävissä suusyöpä. Tämä tutkimus oli siten sitoutunut arvioimaan kliinistä merkitystä Mcl-1 isoformien suusyövän ja tehoa kohdistaminen Mcl-1 chemosensitize suullinen syöpäsoluja

in vitro

.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljelmät

Seven suun syöpäsolun lines- SCC25, QLL1 (Dr. Park, Yonsei University College of Medicine, Koreassa [23] Dr Rheinwald, Harvard Medical School, Boston [ ,,,0],24]); UPCI: SCC029B, UPCI: SCC040 UPCI: SCC074 (tri S Gollin, University of Pittsburgh, PA) [25]; AW8507 AW13516 [26], käytettiin tutkimukseen. Lisäksi kuolemattomaksi Sikiön suun limakalvolta (FBM) [27] ja Dysplastisilla Oral Keratinosyyttien (DOK) (Dr. Ken Parkinson, Queen Maryn School of Medicine Dentistry, UK) [28] solulinjoja käytettiin myös tutkimuksessa. Soluja ylläpidettiin MEM tai IMDM täydennetty 10% FBS: ää 1% standardin antibioottia seoksella 5% CO

2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa kuten aiemmin on kuvattu [17], [23], [29].

Suun kudosten

Tutkimus oli hyväksymä Institutional Review Board of Tata Memorial Centre ja Sharad Pawar Dental College, Intia. Kirjallinen suostumukset on saatu kaikista tutkimukseen osallistuneista. Hoitamatonta ensisijainen suun kasvain näytteet ja niiden viereisten normaaleissa kudoksissa saatiin 130 leikkauspotilaiden klo pään ja kaulan yksikön ja ICMR National Tuumorikudoksen Repository, Tata Memorial Centre, Mumbai, Intia. Tulehtunut suun kudoksiin (n = 20) kerättiin terve normaaleissa kudoksissa potilailta, joille suoritetaan vähäinen hampaiden kirurgisen laitoksella Oral Pathology, Sharad Pawar Dental College, Wardha, Intia. Kaikki kudokset jäädytettiin välittömästi nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa analyysiin asti. Kliinis ominaisuudet kohortti on kuvattu taulukossa 1.

RNA: n eristys ja Reaaliaikainen PCR

RNA solukasaumista ja kudokset uutettiin käyttäen TRI-reagenssia (Sigma, USA) mukaan valmistajan protokollaa. RNA liuotettiin DEPC-käsiteltyä vettä, ja kontaminoivan DNA poistettiin DNaseI hoito (Sigma, USA). RNA: n eheys analysoitiin elektroforeesilla ja näytteet säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes analyysi, kuten aiemmin on kuvattu [17]. cDNA syntetisoitiin 500 ng: kokonais-RNA käyttämällä First Strand cDNA-synteesi kit (MBI Fermentas, Kanada) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. CDNA tehtiin sitten kvantitatiivista tosiaikaista PCR: llä käyttäen Taqman Universal PCR Master Mix (ABI, 4304437) ja Mcl-1 isoformispesifisiä geeniekspression koettimia (ABI,

Mcl-1L

: Hs00172036_m1;

Mcl -1S

: Hs00766187_m1

Mcl-1ES

: 4331348). Monistamiseksi tehtiin ABI-7900HT reaaliaikainen PCR-järjestelmää (Applied Biosystems, USA). GAPDH (ABI, Hs99999905_m1) käytettiin sisäisenä kontrollina normalisoida muun näytteen vaihtelu RNA input monistuksen tehokkuus. Kaikki monistusreaktiot tehtiin kolmena rinnakkaisena, käyttäen DEPC käsitelty vesi negatiivisina kontrolleina. Analyysi geenien ilmentyminen tietojen tehtiin käyttämällä vertailuesimerkin C

T menetelmä suhteellisen kvantifioinnin [30].

Western blotting

Proteiinit uutettiin solupelleteistä ja kasvainkudoksissa, kuten on kuvattu aiemmin [14]. Lyhyesti, 30 mg jäädytettyä kudosta jauhettiin kuolevainen survin käytetään nestemäistä typpeä, liuotettuna jäähdytettyyn ProteoJET Mammalian Cell Lysis Reagent, joka sisältää ProteoBlock Protease Inhibitor Cocktail (Fermentas, USA) ja sonikoitiin jäillä. Kudoksen tai solujen lysaatit kirkastettiin sentrifugoimalla 14000 rpm: ssä 4 ° C: ssa. Proteiini arviointi suoritettiin Bradfordin menetelmällä. Kudos /solulysaateista (30-50 ug) erotettiin 12% SDS-PAGE-geeleissä ja siirrettiin PVDF-membraaneille (Millipore, USA). Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitoa TBS: ssä 2 tunnin ajan. ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa hiiren monoklonaalisella vasta-aineella Mcl-1L (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology, USA). Kalvot riisuttu ja uudelleenseulottiin kanin polyklonaalista vasta vastaan ​​ß-aktiini (1:2000) (Santa Cruz Biotechnology, USA) latauskontrollina. Toissijaiset vasta käytettiin piparjuuren peroksidaasiin konjugoidulla IgG (1:5000) (Santa Cruz Biotechnology, USA). Proteiinit visualisoitiin parannetun kemiluminesenssi Kit (GE Healthcare, USA). Densitometria analyysi kehitetty röntgenfilmeissä suoritettiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa (NIH, Bethesda, MD).

Mcl-1L Knockdown

ilmentyminen Mcl-1L säädeltiin vähentävästi kloonaamalla Mcl-1L shRNA kasetti pTRIPZ lentiviraalinen järjestelmän valmistajan ohjeiden (Applied Biosystems, USA). Ei-kohdistaminen oligonukleotidi sekvenssi kloonattiin kontrollina. Viruspartikkelit luotiin kotransfektoimalla rekombinantti Mcl-1LshRNA-pTRIPZ konstruktit ja pakkaus plasmidien HEK293FT soluissa. Lisäksi kolme suullista syöpäsolulinjoilla nimittäin AW8507, UPCI: SCC029B UPCI: SCC040 transdusoitiin ja vakaa valinta tehtiin käyttäen puromysiiniselektion merkki. Lauseke shRNA aiheutettiin doksisykliini ja lähettää 72 tuntia. Hoidon tasot Mcl-1L arvioitiin qRT-PCR ja western-blottauksella. Erityinen vaiennettu Mcl-1L vahvistettiin kolmen erillisen kokeen.

Solukuolemaan PI värjäys

PI (propidiumjodidia, Santa Cruz Biotechnology, CA) värjäys tehtiin havaitsemiseksi solun kuoleman kolme suullista syöpäsolulinjoissa (AW8507, UPCI: SCC029B UPCI: SCC040) jälkeen eri tavalla yhdistelmiä. Lyhyesti, solut kerättiin trypsinoimalla, lähettää erilaisia ​​hoitoja, kuten aiemmin on kuvattu. Solut pestiin PBS: llä ja 10 ui PI lisättiin. Sitten soluja inkuboitiin 2 minuutin ajan pimeässä ja analysoitiin 488 nm: ssä, virtaussytometrillä (FACS Caliber, BD, USA).

MTT-määritystä

Solut ympättiin 2000 solua kuoppa 96-kuoppaisille levyille, jotka sisälsivät DMEM, jossa 10% FBS: ää. 24 tunnin kuluttua solut olivat joko jätettiin käsittelemättä tai käsiteltiin eri pitoisuuksilla Sisplatiini (+0,025-+10,0 ug /ml) (MP Biomedicals, Intia) tai Obatoclax (0, 1,0-10,0 nM) (Selleck chem USA). 50% estävät konsentraatiot (IC50) ja sisplatiinia ja Obatoclax laskettiin eloonjäämiskäyriä kaikki solulinjat. DMSO sisältävät väliaine toimi vastaaviin kontrolli. Inkubaation jälkeen solujen Obatoclax ja /tai sisplatiini 72 tuntia, solun kasvu arvioitiin MTT-määrityksellä, kuten valmistajan ohjeiden mukaisesti (Sigma, USA). Lyhyesti, käytetty elatusaine poistettiin ja 50 ui MTT-liuosta (1 mg /ml) lisättiin kuhunkin kuoppaan. Levyjä inkuboitiin 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa CO

2-inkubaattorissa ja formatsaanikitei- kiteet elävät solut liuotettiin käyttäen dimetyylisulfoksidia (DMSO, 100 ui kuoppaa kohti). Levyä sekoitettiin kiertoravistimella 10 minuutin ajan ja absorbanssi mitattiin 540 nm: ssä viitataan aallonpituudella 690 nm mikro- levylukijaa (Spectramax, USA). Viisi kaivoja käytettiin kunkin lääkeaineen pitoisuus, ja koe toistettiin kolme kertaa. Toisessa kokeessa, sen arvioimiseksi, onko yhdistelmä hoitojen saavutettaisiin kasvun estäminen kuin yksilöllistä, suusyövästä soluja käsiteltiin doksisykliinihoidon että pudotus Mcl-1 ilmentymisen tai Obatoclax (5 nM) estää Mcl-1 aktiivisuutta, minkä jälkeen annetaan sisplatiinia pitoisuus pienempi kuin IC 50 annosta. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

trypaanisini määritys Konfokaalimikroskopia

Solut ympättiin 24-kuoppaisille levyille tiheydellä 5 x 10

4 kuoppaa kohti. MCL-1 ilmentyminen oli suunnattu joko Doksisykliini tai Obatoclax hoitoihin tai yhdessä sisplatiinin kanssa edellä kuvatulla tavalla. Solut trypsinzed jälkeen 48 tuntia. hoidon ja trypaanisininen (0,4%) värjäys suoritettiin. Määrä elävät solut laskettiin käyttäen hemosytometria ja käsittelemättömään kontrolliin verrattuna. Tiedot esitetään kolmen toisistaan ​​riippumattoman kokeen. Kuvantamisen solujen erilaisten käsittelyjen jälkeen suoritettiin käyttämällä käännettyä mikroskooppia LSM Image Browser 4.2 ohjelmisto (Carl Zeiss, USA).

Tilastollinen

Tilastollinen analyysi tehtiin käyttämällä lisensoitu versio SPSS ohjelmistopaketti 15.0. Tilastollisesti korreloi ilmentymisen Mcl-1 isoformien kliinis parametrit, data oli kaksijakoinen kahteen ryhmään eli: Mcl-1 isoformi Voimakkaasti ekspressoivat ja alhainen ekspressoivat. Vertailun vuoksi keskimääräinen ilmentymistä Mcl-1 isoformit terveillä normaalit ja histologisesti normaaleissa viereisten kudosten käytettiin. Korrelaatio kliinis parametrien (sukupuoli, ikä, sivusto, tavat, koko, solmu, etäpesäkkeitä, toistuminen) tehtiin käyttäen Chi Square koe (χ

2). Kaplan Meier käyrät käytettiin arvioitaessa eloonjäämisaste ja ero ryhmien sisällä laskettiin Log Rank testi merkitystä. Ennustavan parametrit yhden muuttujan analyysiin sisällytettiin monimuuttujamenetelmin käyttäen Coxin suhteellista vaaraa testi tunnistaa tekijät, jotka olivat riippumattomia ennustajia selviytymisen. GraphPad Prism5 ohjelmistoa käytettiin piirtää kaavioita ja tietojen kahden samanlaisen erilaisia ​​ryhmiä analysoitiin tilastollisesti Student-t-testillä Mann Whitney testi. Vaihtelu joukossa ryhmä avulla analysoitiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA). Tiedot ilmoitetaan keskiarvona ± SD. P-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Expression of Mcl-1 isoformit suun solulinjoissa

qRT-PCR-analyysi paljasti, hallitseva korkea ilmentyminen antiapoptooppinen Mcl-1L isoformi miedolla tai havaitsemattomia proapoptoottisten Mcl-1S ja Mcl-1ES ilmentymistä kaikissa suun kautta solulinjoissa (Figure1a). MCL-1L todettiin merkittävästi yliekspressoituvan sekä mRNA proteiinin taso kaikissa seitsemässä suun syöpäsolulinjoissa (SCC25, UPCI: SCC029B, UPCI: SCC040, UPCI: SCC074, QLL1, AW8507 ja AW13516) verrattuna immortalisoituja normaaliin FBM dysplastic DOK solulinja (kuvio 1).

(a) Expression of Mcl-1L MCL-1S mRNA suullinen solulinjoissa; MCL-1 ES taso oli havaittavissa (* P≤0.03) (b) pl-1L proteiinin ilmentymistä suun solulinjoissa.

Expression MCL-1 isoformien suukudosten

qRT-PCR-analyysi paljasti merkittävän (p≤0.02) korkea ilmentyminen Mcl-1L-mRNA: n 64% (84/130) suun kautta kasvaimia eri alisivustoja verrattuna normaaliin kudokseen (kuvio 2a). Lisäksi mitään merkittävää eroa ei havaittu Mcl-1L ilmentyminen kasvaimia eri alisivustoja. Suhteellinen ilmentyminen Mcl-1L-isoformi on -5 kertaa suurempi kuin Mcl-1S ja -10 kertainen, jotta Mcl-1ES isoformi suun kasvaimia (tuloksia ei ole esitetty). Vastaavasti, Western blot-analyysi osoitti korkean Mcl-1L-proteiinin ilmentyminen suun kasvaimissa versus vieressä normaaleissa kudoksissa (kuvio 2b).

(a) Expression of Mcl-1L-mRNA: n normaalissa vs. suun kasvaimista eri osioihin (* P≤0.02); (B) Mcl-1L proteiinin ilmentymistä viereiseen normaaliin verrattuna kasvaimiin.

Korrelaatio Mcl-1-ilmentymisen kliinis parametrien tulos

Univariate analyysi paljasti merkittävän iskuäänten Mcl-1L ilmaisutapoja solmuun positiivisuus (p = 0,021) ja kehittyneiden kasvaimia (p = 0,013). Kuitenkaan mitään merkittävää korrelaatiota ei havaittu ilmentyminen Mcl-1 isoformit ja sukupuoli, ikä, tupakka /alkoholi tottumukset, ensisijaisesta erilaistumista suun syöpäpotilailla (taulukko 2). Erityisesti alhainen ilmentyminen proapoptoottisten Mcl-1 S-isoformi osoittivat suuntauksen positiivinen merkitys huonosti eriytetty kasvaimet (p = 0,053).

Korrelaatio Mcl-1-ilmentymisen kokonaiselinaikaa

Kaplan-Meier eloonjäämiskäyristä matalan ja korkean ekspressoivat MCL-1L havaittiin tilastollisesti merkitsevä ero (p = 0,002). Potilaat ilmentävät korkea antiapoptooppinen Mcl-1L näytteillä huono eloonjäämiseen verrattuna niihin ilmentävät matalan Mcl-1L (kuva 3a). Kääntäen, potilaat ilmentävät korkea proapoptoottisten Mcl-1S eläintutkimuksissa merkitsevästi parempi kokonaiseloonjääminen (p = 0,051) verrattuna niihin, joilla on alhainen Mcl-1 S (kuva 3b). On huomattava, että suhteellinen suhde Mcl-1L /Mcl-1S osoitti myös positiivinen korrelaatio (p = 0,006) ja huono eloonjäämisaste suun syöpäpotilaiden (kuvio 3c). Lisäksi yhden muuttujan analyysi paljasti myös huono eloonjäämiseen sisään imusolmukkeisiin versus imusolmukenegatiivisista suun syöpäpotilailla (p = 0,003). Muut parametrit, kuten ikä, tupakka /alkoholi tavat ja erilaistumista ei vaikuttanut merkittävästi eloonjäämisaste näistä potilaista.

(ac) Kaplan-Meier eloonjäämisaste suun syöpäpotilaiden, joilla on alhainen tai korkea ilmentymisen Mcl- 1 isoformit; (D) Monimuuttuja-analyysi suun syöpäpotilailla.

Monimuuttuja-analyysi

Niistä kaksi isoformia (Mcl-1L Mcl-1 S) analysoidaan, theMcl-1L ilmaisu vaikutti yleisen selviytyminen suun syöpäpotilailla. MCL-1L muuttuja, joka oli syntynyt merkittäviä yksiulotteista analyysissä, tutkittiin käyttäen Coxin regressiomallia monimuuttujakalibrointiin analyysi (Figure3d). Potilaat ilmentävät korkea Mcl-1L näytteillä lyhyempi eloonjäämiseen ja 3,2 kertaa korkeamman riskin huonosta eloonjääminen verrattuna niihin ilmentävät matalan Mcl-1L (p = 0,037). Tämä tarkoittaa, että Mcl-1L on riippumaton ennustetekijä suun syöpä.

shRNA välittämää säätelyä alaspäin Mcl-1L

kolme suullista syöpäsolulinjoissa (AW8507, UPCI: SCC040 UPCI: SCC029B) transdusoidaan Mcl-1L shRNA-pTRIPZ lentivirus hiukkasia, Mcl-1L ilmentyminen onnistuneesti vaimentua postitse doksisykliinikäsittely. Ohjaus kuopat edustavat soluja ilman doksisykliinikäsittely. Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR ja western blot-analyysi vahvisti säätelyä alaspäin Mcl-1L sekä mRNA ja proteiini tasoilla, kaikissa kolmessa syöpäsolun riviä (kuva 4). Kuitenkin tasot Mcl-1 S MCL-1ES pysyi muuttumattomana (tuloksia ei esitetä).

(a b) shRNA välittämä alaspäin säätely MCL-1L mRNA proteiinia AW8507, UPCI: SCC040 SCCC29B suun syöpäsolujen verrattuna kontrolliin.

vaikutus Mcl-1L pudotus /tai sisplatiini solukuolemaan

solukuoleman induktioon analysoitiin PI värjäyksessä, mitä seurasi FACS-analyysi kolmessa suusyövän solulinjoissa (AW8507, UPCI: SCC040 UPCI: SCC029B) lähettää eri hoitoja kuten aiemmin on kuvattu. ShRNA välitteisen knockdovvn ekspressoidaan runsaasti Mcl-1L-isoformi tai sisplatiini hoidon paljasti solukuoleman induktioon kaikissa solulinjoissa. Solukuolema indusoitiin AW8507, UPCI: SCC040 UPCI: SCC29B, post Mcl-1L Knockdown oli 31% (SD 2,5), 27% (SD 1,5) ja 24% (SD 3,5) tai postitse sisplatiinihoitoon oli 50% (SD 2,1), 42% (SD 2,7), ja 46% (SD 3,1) vastaavasti. Lisäksi shRNA välittämä Mcl-1L Knockdown seuraa sisplatiinihoitoon yhteen osoitti 78% (SD, 1,2), 71% (SD 1,8) ja 82% (SD 2,0) solukuoleman vastaavasti. Yhdistetyt hoidot Mcl-1L pudotus ja sisplatiini oli tilastollisesti merkitsevä (p 0,05) ero solukuoleman induktio verrattuna joko hoidot yksinään (kuvio 5b), jolloin, mikä viittaa synergistinen vaikutus yhdistetty hoitojen solukuolemaa.

vaikutus BH3 jäljittelevää Obatoclax ja /tai sisplatiini solujen elinkelpoisuuden ja kasvun

Kuva 6a esittää edustaja konfokaalimikroskopia kuvat AW8507 käsiteltyjen solujen Sisplatiini ja /tai Obatoclax. Mielenkiintoista yhdistetyt hoidot Obatoclax Sisplatiini osoitti lisääntynyttä solukuolemaa verrattuna yksittäisiin hoitoihin. Lisäksi trypaanisinivärin syrjäytymisen määritys suoritettiin määrittämiseksi vaikutus solujen elinkelpoisuuteen suun syöpäsolulinjoissa (AW8507, UPCI: SCC040 UPCI: SCC029B) eri käsittelyjen jälkeen. On huomattava, että BH3 jäljittelevää Obatoclax tai Sisplatiini voi onnistuneesti vähentää solujen elävyys kaikissa kolmessa syöpäsolun riviä. Lisäksi yhdistelmä Obatoclax ja sisplatiinia yhdessä merkittävästi (p 0,05) vähensi solujen elinkykyä verrattuna joko hoitoja yksin. Yhdistetyt hoito Obatoclax Sisplatiini näytteillä 3-7 kertainen väheneminen solujen elinkelpoisuuden verrattuna yksittäisiin hoitoihin (kuvio 6b). Lisäksi MTT lisääntymisen määritys paljasti myös merkittävästi (p 0,05) vähenemiseen solun kasvua (2-4-kertainen), kun yhdistelmähoito sisplatiinin ja Obatoclax verrattuna joko hoidot yksinään (kuvio 6c) siten, viittaa synergistinen vaikutus yhdistelmähoito solujen elinkelpoisuuden ja kasvun suun syöpäsoluja.

(a) konfokaali mikroskooppinen edustavat kuvat AW8507-soluissa erilaisia ​​hoitoja; (B) Arvio prosenttia solujen elinkelpoisuuden suun syöpäsolujen lähettää erilaisia ​​hoitoja trypaanisinivärin syrjäytymisen määritys (* P 0,05, vs. yksittäiset hoidot); (C) analyysi leviämisen suun syöpäsolujen erilaisten käsittelyjen jälkeen MTT: llä. (* P 0,05, vs. yksittäisiä hoitoja).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme arvioineet ilmentymistä Mcl-1 isoformia (Mcl-1L, Mcl-1S Mcl-1ES) suun kasvaimissa versus normaaleissa kudoksissa, onko ne olisivat käyttökelpoisia ennustetekijöitä markkereita suun syöpäpotilailla. Toistaiseksi vähän tietoa roolista Mcl-1 kationi synnyssä suun syöpä. Tietääksemme tämä on ensimmäinen tutkimus korreloivan ilmentymisen kolmen Mcl-1 isoformien kliinis parametrien suun syöpäpotilailla. Tutkimuksemme osoittaa merkittävää korkean ekspression anti-apoptoottisten Mcl-1L enemmistönä suun syöpäsolulinjoista ja kasvaimia (64%) verrattuna vastaaviin normaaleihin. Osoitamme myös, että korkea Mcl-1L ilmentyminen oli merkitsevästi yhteydessä huono tulos suun syöpäpotilailla. Edelleen, kohdistaminen Mcl-1L by shRNA tai Obatoclax yhdessä sisplatiinin kanssa voisi synergistisesti aiheuttaa solukuoleman suullinen syöpäsoluja. Niinpä yli-ilmentyminen Mcl-1L voi olla tärkeä mekanismi edistää suusyövän solujen eloonjäämistä, mikä osaltaan kehittämiseen ja etenemiseen suusyövästä.

häiriöstä apoptoosin säätelemiseksi geenien on raportoitu olevan keskeisessä rooli kehityksen ja etenemisen useissa ihmisen syöpäsairauksia. Anti-apoptoottiset Mcl-1 on tärkeä jäsen apoptoosin säätelemiseksi Bcl-2-perheen ja on osoitettu yliekspressoituvan erilaisia ​​syöpiä, mukaan lukien, kohdunkaulan, munasarjojen, haiman, hepatosellulaarinen, ei-pienisoluisen keuhkosyövän, kivesten sukusolujen syövät ja melanoomat [8]. On huomattava, että tässä tutkimuksessa ensimmäistä kertaa osoittaa yli-ilmentymisen Mcl-1L silmukointivariantti suun syöpäsolulinjoissa Suurin osa suun kasvaimista verrattuna normaaleihin kudoksiin. On vain yksi raportti, jossa analysoidaan Mcl-1-isoformit niiden kliinistä merkitystä tähän mennessä selvä solussa munuaiskarsinoomissa [31]. Toisin kuin meidän tuloksia, tämä tutkimus kuitenkin osoitti yhdistys alhaisen Mcl-1L ilmaisutapoja aggressiivinen fenotyyppejä selkeä solussa munuaiskarsinoomissa. Lisäksi ei ole tietoa ilmentymistä Mcl-1 isoformien suusyöpä. Esillä olevassa tutkimuksessa korrelaatio Mcl-1-isoformit ja kliinis parametrit suun syöpäpotilaiden, paljasti merkittävän yhdistys Mcl-1L silmukointivariantti kehittyneitä kasvaimen kokoa (p = 0,013) ja imusolmukkeesta positiivisuutta (p = 0,021). Kaplan-Meier selviytymisen analyysin alhainen verrattuna korkea ekspressoivat MCL-1L mRNA osoitti, että korkea Mcl-1L ilmentyminen oli merkitsevästi yhteydessä huonoon kokonaiselinaikaa (p = 0,002). Kuten noudatettu käsiteltävänä olevassa tutkimuksessa Mcl-1-isoformit, korkea Mcl-1-proteiinin ilmentymisen ja sen yhteydessä huonoon ennusteeseen on osoitettu kohdunkaulan, maha-, keuhko- ja munasarjasyövät [11] – [13], [32]. Kuitenkin aikaisemmassa tutkimuksessa meidän lab ei löytänyt edellä assosiaatio Mcl-1-proteiinin tason [14]. Tässä tutkimuksessa tehtiin selvittämään ilmaisun profiilia Mcl-1 isoformit suun solulinjoissa ja suuri kohortti kasvaimia, joka osoitti yhdistys Antiapoptoottisten Mcl-1L ilmaisutapoja ennusteeseen suusyöpä. Tämä on ensimmäinen tutkimus, joka osoittaa korrelaation MCL-1L silmukointivariantti kanssa lopputulokseen suun syöpäpotilaiden ja Mcl-1L itsenäisenä prognostinen merkkiaine suusyöpä.

Mcl-1 on tiukasti säännelty transkription, post transkription ja translaation tasolla [6] ja tarkka mekanismi Mcl-1 yliekspressio suusyöpä ei tiedetä. Pro-apoptoottinen Mcl-1 S MCL-1ES isoformit ilmennettiin alhaisilla tai havaitsemattomia tasoja verrattuna pääasiassa ilmaisi MCL-1L ja ei korreloinut kliinis parametrien suun syöpäpotilailla. Huomattavaa on, että lyhyen pro-apoptoottisten Mcl-1S vain sitoutuu Mcl-1L mahdollisesti neutraloivat sen anti-apoptoottisen funktion [33]. Lisäksi äskettäin tunnistettu pro-apoptoottisten Mcl-1ES isoformi voi myös sitovat ja neutraloivat anti-apoptoottisen funktion täyspitkä Mcl-1L isoformi, vaikka se ekspressoituu hyvin alhainen tai havaitsemattomia tasoja. Siksi analysoi suhteellisesti vähiten Mcl-1L /Mcl-1 S-isoformien, joka paljasti merkittävä positiivinen korrelaatio huono eloonjäämisaste potilaiden, mikä tarkoittaa, että alhainen ilmentyminen Mcl-1S MCL-1ES in suusyöpä on mahdollisesti riittämätön neutralisoida korkea ilmentyminen Antiapoptoottisten MCL-1L isoformi. Parhaan tietomme tämä on ensimmäinen tutkimus kvantitoidaan ilmaus kolmen Mcl-1 isoformeja ja niiden vastaavuus kliinis parametrien tulos suun syöpäpotilailla. Meidän havainnot tukevat myös edellisen raportit maha- ja kohdunkaulan syöpien osoittaa yhdistyksen välillä korkea Mcl-1-proteiinin ilmentymisen kanssa kasvaimen kokoa, histologinen luokka, imusolmuke osallistuminen, etäpesäke huono kliininen tulos [11], [34]. Lisäksi, prognostisia merkitys korkean Mcl-1-proteiinin ilmentyminen on myös osoitettu rinta-, munasarja-, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä ja useita hematologisia maligniteetteja [10], [13], [35].

Mcl -1 yliekspressoituu erilaisissa ihmisen maligniteettien ja ehdotetaan olevan potentiaalinen terapeuttinen kohde [8]. MCL-1 yli-ilmentymisen näyttää myös olevan keskeinen tekijä vastus eri syöpätyyppien perinteisiin hoitoihin, mukaan lukien säteilyn ja kemoterapiaa. Alas säätely Mcl-1: n on osoitettu herkistää neuroblastoomasoluja solunsalpaajille ja kestävät melanoomasolujen Fas-välitteisen apoptoosin [36], [37]. Lisäksi meidän esillä olevassa tutkimuksessa, shRNA välittämä alaspäin säätely Mcl-1L on osoittautunut chemosensitize suullinen syöpäsolujen (AW8507, UPCI: SCC040 UPCI: SCC029B) sisplatiinia osoittaa keskeinen rooli Mcl-1 hoidossa resistenssin suusyöpä . Tutkimukset kohdistaminen Mcl-1 kautta antisense terapia, ovat myös osoittautuneet chemosensitize maksasyövän solut

in vitro

[38], [39]. Vaikka tutkimus osoittaa ehtyminen Mcl-1L lausekkeen 90%: sta 20%: iin shRNA (4A) minimaalinen solukuolemaa (25%) havaittiin. Tämä viittaa siihen, että lisäksi Mcl-1 saattaa olla muita vaikuttavia tekijöitä eloonjäännin solujen post sisplatiinihoitoon. Useat muut tutkimukset ovat myös raportoitu proteiinien, kuten Surviviinispesifisiä [40], Oct4 Nanog [41], MUC4 [42], sihteeri Kin17 [43], jne. Tärkeä rooli in chemoresistance suun squamous kohdunkaulan soluissa. Kuitenkin tämä on ensimmäinen tutkimus korreloivat yhdistys Mcl-1L silmukointivariantti kanssa chemoresistance suusyövän.

Viimeaikaiset tutkimukset meidän lab ovat osoittaneet rooli Mcl-1L isoformi radioresistance suun squamous masoluja ja kuten ennustetekijä ennustamisessa tautivapaan elinajan suusyövän hoidetuilla potilailla lopullisen sädehoitoa. [15], [17]. Näin ollen, ehtyminen Mcl-1 näyttää olevan edellytys sille, että radio /Chemo herkistää syöpäsolut yli-ilmentävät Mcl-1-proteiini, edistää apoptoosia. Useita yrityksiä on tehty kohdistamaan anti-apoptoottisten Bcl-2-perheen proteiinit, mukaan lukien Mcl-1 kasvaimissa käyttäen erilaisia ​​inhibiittoreita. Näistä lupaavimpia estäjä, BH3 jäljittelevää ABT-737 on jättänyt vastustus johtuu Mcl-1 yli-ilmentymisen. Lisätutkimukset osoittavat, että Mcl-1 alassäätöä yksin voi voimistaa ABT-737 kuolleisuutta leukemiasoluissa [44]. Esillä olevassa tutkimuksessa yleiseurooppalainen Bcl-2 pienmolekyylisalpaajien, Obatoclax (GX15-070), joka on tunnettu antagonisoida Mcl-1 ja voittaa Mcl-1 välitteistä resistenssin apoptoosia käytettiin [21]. Obatoclax on osoitettu sitoa anti-apoptoottisten Bcl-2-perheen proteiinien ja ylös-ekspression säätelemiseksi Puma, Noxa Bim joka edelleen indusoi apoptoosin neoplastisten syöttösolut [45].