Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

sisplatiinin tehoa kemoterapiaan ei-pienisoluinen keuhkosyöpä rajoittaa hankitun lääkeresistenssin. Tunnistaminen RNA: t, jotka liittyvät sisplatiinin vastus voi auttaa parantamaan kliinistä hoitovaste.

Methods

Microarray ilmentymisen profilointi mRNA lncRNA ja miRNA tehtiin vuonna A549-soluja ja sisplatiini kestävä A549 /CDDP soluja . Ilmentyvät eri mRNA lncRNAs ja miRNA, varmistettiin reaaliaikainen RT-PCR, alistettiin polkuun analyysiin. Expression of NKD2 ja β-kateniinin arvioitiin reaaliaikaisen RT-PCR ja western blot-analyysi. Vaikutus lncRNA AK126698 sisplatiinilla indusoiman apoptoosin tutkittiin anneksiini-V /PI virtaussytometria.

Tulokset

Yhteensä 1471 mRNA 1380 lncRNAs ja 25 miRNA differentiaalisesti ilmaistut A549 /CDDP ja A549-soluja. Niistä 8 mRNA: t, 8 lncRNAs ja 5 miRNA differentiaalisesti ilmaistut geenilastuun analyysiin validoitu. Korkean rikastaminen polku analyysi tunnistaa, että klassista reittejä osallistui proliferaatiota, erilaistumista, välttäminen apoptoosin, ja lääkeainemetaboliaan olivat eri ilmaistu näissä soluissa linjat. Gene koekspressio verkko tunnistaa monia geenejä, kuten FN1, CTSB, EGFR, ja NKD2; lncRNAs lukien BX648420, ENST00000366408, ja AK126698; ja miRNA kuten miR-26a ja anna-7i mahdollisesti ollut keskeinen rooli sisplatiinia vastarintaa. Joista, kanoninen Wnt polku tutkittiin, koska se osoitettiin kohdistetaan sekä lncRNAs ja miRNA lukien lncRNA AK126698. Knockdown lncRNA AK126698 paitsi suuresti vähentynyt NKD2 joka voi säädellä negatiivisesti Wnt /β-kateniinin signalointia mutta myös lisääntynyt keskittymisen ja ydinvoiman translokaation β-kateniinin, ja merkittävästi masentunut apoptoosin hinnan aiheuttamien sisplatiinin A549-soluissa.

Johtopäätös

Sisplatiini vastus ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut voivat liittyä muutoksiin ei-koodaavaa RNA: t. Näistä AK126698 näyttää antavan sisplatiinia resistenssin kohdistamalla Wnt-reitin.

Citation: Yang Y, Li H, Hou S, Hu B, Liu J, Wang J (2013) Ei-koodaavat RNA Expression Profile ja vaikutus lncRNA AK126698 sisplatiinilla Resistance in Non-Small-Cell Lung Cancer Cell. PLoS ONE 8 (5): e65309. doi: 10,1371 /journal.pone.0065309

Editor: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Espanja

vastaanotettu: 07 elokuu 2012; Hyväksytty: 29 huhtikuu 2013; Julkaistu: toukokuu 31, 2013

Copyright: © 2013 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukivat Natural Science Foundation of China (nro 81071910, 81070042). LncRNA microarray Kokeet suoritettiin KangChen Bio-Tech, Shanghai, Kiina. MiRNA microarray Kokeet suoritettiin Genminix Informatics Ltd, Shanghai, Kiina. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat seuraavat edut. LncRNA microarray Kokeet suoritettiin KangChen Bio-Tech, Shanghai, Kiina. MiRNA microarray Kokeet suoritettiin Genminix Informatics Ltd, Shanghai, Kiina. Ei ole olemassa patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteiden julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yksi yleisimmistä ihmisen syöpien kaikkialla maailmassa ja edelleen liittyä suurimman vaikutuksen ja kuolleisuus kaikista syövistä [1], [2]. WHO: n mukaan GLOBOCAN projekti, 1,6 miljoonaa uutta keuhkosyöpää, osuus 12,7% koko maailman syövän esiintyvyys, todettiin vuonna 2008 [3]. Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) kattaa noin 85% kaikista keuhkosyöpää [4]. Tehokkain hoito NSCLC on valmis keuhko resektio. Kuitenkin eloonjäämisaste jälkeen täydellinen keuhko resektio on kaukana tyydyttävästä ja useimmat potilaat tarjotaan kemoterapiaa vaihtoehtona, erityisesti sisplatiini (CDDP; cis-diamminedichloroplatinum II) -pohjaisen kemoterapiaa.

Sisplatiini ensisijaisesti säädösten aiheuttamalla DNA vahinkoa [5]. Kuitenkin kyky syöpäsolujen tulla vastustuskykyisiä CDDP edelleen merkittävä este onnistuneen kemoterapiaa. Aiemmat tutkimukset ovat ehdottaneet useita mahdollisia mekanismeja sisplatiinin vastus [6]. Mutta meillä on jatkuva tarve paikantaa tarkkaa mekanismia, jotta löydettäisiin uusia tavoitteita estämiseksi lääkeresistenssi.

Nopea kehitys molekyylibiologian mahdollistaa havaita molekyylien välisiä eroja eri soluja. Tämä lähestymistapa voi antaa tärkeitä vihjeitä koskevat lääkeresistenssin. Ymmärtäminen suhteet sisplatiinin vastus ja molekyylitason muutosten avulla ennustaa sisplatiinin vastus etukäteen ja parantaa tehokkuutta terapeuttisen intervention.

Ihmisen transcriptome käsittää suuria määriä proteiinia koodaavan lähetti-RNA: t (mRNA: t), yhdessä jossa suuri joukko nonprotein koodaus selostukset myös pitkän ei-koodaavaa RNA: ita ja microRNA joilla on rakenteellisia, sääntelyyn tai tuntematon toimintoja [7], [8]. Pitkä Koodaamattomat RNA: t (lncRNAs) joille on ominaista monimutkaisuus ja moninaisuus niiden sekvenssit ja toimintamekanismit ovat erillisiä pieniä RNA: ita tai rakenteellisia RNA: t ja niiden ajatellaan toimia joko ensisijaisena tai saumattu selostukset [9]. Altered lncRNA tasot on osoitettu johtavan poikkeava ilmentyminen geenin tuotteita, jotka saattavat edistää eri tautitilojen, mukaan lukien syöpä [10], [11]. Kuitenkin yleinen patofysiologisia osuus lncRNAs sisplatiinin vastuksen edelleen suurelta osin tuntematon.

MikroRNA (miRNA) ovat perhe ~22nt pieniä, ei-koodaus, endogeeninen, yksijuosteinen RNA: t, jotka säätelevät geenin ilmentymistä. Aikuinen miRNA ja Argonaute (Ago) proteiinit muodostavat RNA aiheuttama hiljentäminen kompleksi (RISC), joka välittää posttranskriptionaalisen geenien induktion kautta mRNA: n hajoamisen tai translaation estäminen [12]. Jotkut miRNA oli löydetty pelata tärkeä rooli sisplatiinin vastus [13], [14], mutta lisätutkimusta tarvitaan tutkia suhteita miRNA, lncRNAs ja mRNA syövän biologian prosessi.

Wnt /β kateniinin kanoninen signalointireitin aiemmin pidetty millä on keskeinen tela määritettäessä solukohtalo- [15]. Wnt-reitin on nyt havaittu olevan muuttunut monissa syöpätyypeissä [16]. Sitoutumisen jälkeen Wnt sen reseptoriin, Dishevelled proteiinit (DSH /DVL) aktivoituvat, mikä johtaa inaktivointi ak- siini /adenomatoottisen polypoosin coli (APC) /glykogeenisyntaasikinaasi (GSK) 3β kompleksin, joka estää hajoamisen β-kateniinin [ ,,,0],17]. Tämä johtaa stabiloitu β-kateniinin kulkeutuu tumaan, jossa se sitoutuu jäsenten T-solun tekijän /lymfaattisen tehostajana sitova tekijä (TCF /LEF) perheen transkriptiotekijöitä, ja pystyy ilmentymisen moduloimiseksi laajan kohdegeeneihin säädellä solukohtaloina.

Wnt-β-kateniinin reitin [18] ovat tarkasti ohjaa useita sääntelyviranomaisten. Niistä paljain kynsivalliin (NKD) perheeseen kuuluu Drosophila alasti orvaskesi ja sen kaksi selkärankaisten ortologeil- NKD1 ja NKD2 on osoitettu säätelemään negatiivisesti kanonisen Wnt signalointia sitoutumalla DVL. Kuitenkin onko Wnt reitin osallistuu sisplatiinin resistenssin tai sen sääntely on vielä tuntematon.

Tässä tutkimuksessa lncRNA miRNA ja mRNA ilmaisun profiileja verrattiin villityypin A549- ja sisplatiinin vastus solulinjat A549 /CDDP käyttäen Gene Chip tekniikkaa. Integroiva analyysi yhdistetään muutoksia kolmeen ryhmään RNA sisällä erilaisten geneettisten verkkoja käytettiin geenien tunnistamiseksi ja polkuja, jotka saattavat liittyä sisplatiinin vastarintaa NSCLC. Kokeet lncRNA AK126698 Knockdown käytettiin tarkkailla sen vaikutus kanoninen Wnt polku ja soluvasteita sisplatiiniin.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ihmisen keuhkon adenokarsinoomasolulinjan A549 ja sisplatiini-variantin A549 /CDDP ostettiin Pekingin unionin Medical College, Peking, Kiina. A549 ja A549 /CDDP-solut ylläpidettiin RPMI-1640-alustassa (Life Technologies), jota oli täydennetty 10% vasikan sikiön seerumia (Gibco, Gran Island, NY, USA) kosteassa atmosfäärissä, joka sisälsi 5% CO

2 37 ° C: ssa . A549 /CDDP solumediumissa sisälsi lisäksi 2 mg /l sisplatiinia säilyttääkseen sen lääkeresistenttiä fenotyypin. Solujen kasvun logaritmisessa vaiheessa käytettiin kaikissa kokeissa.

LncRNA microarray

Lyhyesti, A549 ja A549 /CDDP-soluja käytettiin syntetisoimaan kaksijuosteinen komplementaarinen DNA (cDNA). Kaksijuosteinen cDNA leimattiin ja hybridisoitiin 8 x 60 K LncRNA Expression Microarray (Arraystar, Rockville, MD). LncRNA ilmaisun microarray Tässä tutkimuksessa käytetty pääasiassa luokittelee koettimilla, kuten seuraavat alatyyppi: 1). Enhancer LncRNAs: Sisältää profilointitiedot kaikista LncRNAs kanssa tehostajana kaltainen toiminto [19]. 2). Rinn lincRNAs: Sisältää profilointitiedot kaikista lincRNAs perustuu John Rinn paperit [20], [21]. 3). HOX cluster: Sisältää profilointitiedot kaikista antureista neljän HOX loci, kohdistaminen 407 diskreetti transkriptio- alueita, lncRNAs ja koodaus selostukset [22]. 4). LincRNAs lähellä koodaavan geenin: Sisältää ilmentyvät eri lincRNAs ja lähellä koodaavan geenin paria (etäisyys 300 kt). 5). Enhancer LncRNAs lähellä koodaavan geenin: Sisältää ilmentyvät eri tehostajana kaltainen LncRNAs ja niiden lähistöllä koodaus geenit (etäisyys 300 kt). Hybridisaation jälkeen ja pesun käsitellyt kalvot skannattiin Agilent DNA Microarray Scanner (tuotenumero G2505B). Agilent Feature Extraction ohjelmisto (versio 10.7.3.1) käytettiin analysoimaan hankittu array kuvia. Rikvantiilin normalisointi ja sitä seuraavan tietojenkäsittelyn suoritettiin käyttäen GeneSpring GX v11.5.1 ohjelmistopaketti (Agilent Technologies). Kukin solulinja suoritetaan lncRNA mikrosirun kolmena rinnakkaisena.

Mirna mikrosirujen

Microarray profilointi miRNA suoritettiin käyttäen Affymetrix GeneChip- miRNA pakat (Santa Clara, CA, USA) valmistajan suositteleman protokollan. Lyhyesti, 1 ug kokonais-RNA: ta soluista leimattiin polyA-polymeraasia käyttämällä Genisphere FlashTag HSR kit noudattaen valmistajan suosituksia (Genisphere, Hatfield, PA). RNA hybridisoitiin Affymetrix miRNA array suosittelemia myyjä. Standard Affymetrix array kasetti värjäystä, pesu ja skannaus suoritettiin käyttäen hybridisaation jälkeisiä kit (# 900720; Affymetrix) ja GeneChip- Skanneri 3000. Feature uutto suoritettiin käyttäen Affymetrix komentokonsoli ohjelmisto. Raakadata käsiteltiin seuraavassa järjestyksessä: tausta tunnistus seurasi RMA maailmanlaajuinen tausta korrelaatio kvantiiliinformaatio normalisointi, mediaani arviointi ja log2-transformaatio käyttäen miRNA QC ohjelmistotyökalu (Affymetrix). Kukin solulinja suoritetaan miRNA microarray kolmena rinnakkaisena.

In vitro lääkeaineen herkkyys määrityksessä

Solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 5 x 10

3 solua /kuoppa ja inkuboitiin yön yli 37 ° C: ssa. Soluja inkuboitiin eri pitoisuuksien kanssa sisplatiinia 48 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Kun oli lisätty 20 ui CellTiter 96R vesikerros liuosta (Promega) kuhunkin kuoppaan, levyjä inkuboitiin 2,5 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Kunkin kuopan absorbanssi 490 nm: ssä (A490) luettiin spektrofotometrillä. Pitoisuus, jossa kukin lääke on valmistettu 50% kasvun estämisen (IC50), arvioitiin suhteellisen eloonjäämiskäyrät. Kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin kuusi rinnakkaisista kuopista.

Realtime RT-PCR

Reaaliaikainen RT-PCR: ää käytettiin sen varmistamiseksi, ero ilmentymistä 16 geeniä, jotka havaittiin, että LncRNA Expression Microarray. CDNA syntetisoitiin käyttäen käänteistranskriptaasia (TaKaRa), oligo (dT) alukkeita, 1 ug RNA: ta samoista näytteistä kuin ne, joita käytetään mikrosirun. Käytetyt alukkeet on lueteltu taulukossa S1. Jokainen reaaliaikaisen RT-PCR-reaktio (20 ui) sisälsi 2,5 x SYBR Green Realtime PCR Master Mix (TIANGEN), 0,5 uM alukkeita ja 0,5 ui templaatti-cDNA. Pyöräily olosuhteissa oli ensimmäinen, yksi sykli 2 min 94 ° C: ssa, mitä seurasi 40 sykliä 15 s 94 ° C: ssa, 20 s 63 ° C: ssa, ja 30 s 68 ° C: ssa. PCRmonistukset suoritettiin kolmessa kopiot jokaisesta näytteestä. Geenien ilmentyminen kvantitoitiin suhteessa ilmaus 18S käyttäen optimoitua vertaileva Ct (ΔΔCt) arvo menetelmällä. Erot geeni-ilmentymisen tasoja eri ryhmien välillä verrattiin käyttäen Studentin t-testiä. P-arvot 0,05 katsottiin tilastollisesti merkittäviksi.

QRT-PCR miRNA

Bulge silmukan ™ miRNA qRT-PCR Primer setit (yksi RT-aluketta ja pari qPCR alukkeita kunkin set) spesifisiä miR-17, miR-21, miR-138, miR-194, ja miR-anna-7i suunnitellut RiboBio (Guangzhou, Kiina). Lyhyesti, kokonais-RNA uutettiin käyttäen MiRNeasy Mini Kit (QIAGEN). Mirna pullistuma silmukan käänteiskopioitiin kanssa Quantscript RT Kit (TIANGEN). Jokainen reaaliaikaisen RT-PCR-reaktio (25 ui) sisälsi 2 x SuperReal esiseos (TIANGEN), 10 uM alukkeita, ja 1 ui templaatti-cDNA. Pyöräily olosuhteissa oli ensimmäinen, yksi sykli 3 min 95 ° C: ssa, mitä seurasi 40 sykliä 10 s 95 ° C: ssa, 20 s 60 ° C: ssa ja 30 s 70 ° C: ssa. PCRmonistukset suoritettiin kolmessa kopiot jokaisesta näytteestä. Suhteellinen määrä miRNA normalisoitui vastaan ​​U6 snRNA, ja kertamuutos kunkin miRNA laskettiin 2

-ΔΔCt menetelmällä. P-arvot 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Sirna (siRNA) B

arvioimiseksi esto AK126698, 50 nM AK126698 siRNA (Shanghai Genepharma, Kiina) transfektoitiin A549 -soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 mukaista reagenssia valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solut, jotka on transfektoitu transfektion aineen ja sekoituskoodin-ohjaus siRNA (negatiivinen kontrolli), käytettiin kontrolleina. Solut kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen. Neljä paria siRNA nimettiin siRNA AK126698-291, siRNA AK126698-341, siRNA AK126698-424 ja siRNA AK126698-1492, vastaavasti. Verrattuna kontrolli vain siRNA siRNA AK126698-291 ja AK126698-424 menestyksekkäästi pienentää ilmentymisen tasoa lncRNA AK126698. Sekvenssit AK126698 siRNA ja sekoituskoodin ohjaus siRNA on lueteltu taulukossa S2.

Western blot-analyysi

A549-solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille (2 x 10

5 solua /kuoppa ). 48 tuntia transfektion jälkeen ja AK126698 siRNA tai negatiivinen kontrolli, solut kerättiin ja homogenisoitiin lyysipuskurilla. Kokonaisproteiinia erotettiin denaturoivalla 10% SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Detection suoritettiin Odyssey järjestelmä (Gene Company Limited, USA). Ensisijainen vasta-aineet β-kateniinin, fosfo-β-kateniinin (Ser675) ja β-aktiini ostettiin Santa Cruz Biotechnology, Cell Signaling Technology ja Sigma-Aldrich, vastaavasti. Primaaristen vasta-aineiden Cell cycle reitin fosfo-cdc2 (Tyr15), fosfo-Rb (ser807), fosfo-Chk2 (Thr68) ja fosfo-p53 (ser15) ja MAPK signalointireitin fosfo-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185) ja fosfo-p44 /42 MAPK (Erk1 /2) (Thr202 /Tyr204) ostettiin Cell signalointi Technology. Vasta-aine laimennukset olivat 1:2000 varten β-kateniinin, 1:1000 varten fosfo- β-kateniinin, 1:1000 varten fosfo-Rb (ser807), 1:1000 varten fosfo-Chk2 (Thr68), 1:1000 varten fosfo- cdc2 (Tyr15), 1:200 varten fosfo-p53 (ser15), 1:200 varten fosfo- SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185), 1:200 varten fosfo- p44 /42 MAPK (Erk1 /2) (Thr202 /Tyr204) ja 1:5000 varten β-aktiini. Proteiini tasot normalisoitiin p-aktiini ja muutokset määritettiin.

virtaussytometria

Solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille (2 x 10

5 solua /kuoppa). 24 tuntia transfektion jälkeen siRNA AK126698 kuten edellä on kuvattu, A549-soluja käsiteltiin CDDP lopulliseen konsentraatioon 10 mg /l. 24 tuntia käsittelyn jälkeen CDDP, Virtaussytometriaa käytettiin havaitsemaan apoptoosia transfektoitujen A549-soluja määrittämällä suhteellinen määrä anneksiini V-FITC-positiiviset-PI-negatiivisia soluja.

Data Analysis

Jokainen koe toistettiin vähintään kolme kertaa. Numeeriset tiedot esitettiin keinot ja keskivirheet (± SEM). Erot avulla analysoitiin käyttäen Studentin t-testiä. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS11.0 ohjelmistoa (Chicago, IL).

Merkittävät Differential Gene Analysis.

random varianssi malli (RVM) t-testiä käytettiin tunnistamaan differentiaalisesti ilmentyvien geenien torjunta- ja kokeiluryhmässä. Tämä malli on enemmän valtaa kuin vakiotestejä poimia suuria muutoksia ilmaisua, lisäämättä väärien positiivisten [23]. Kun merkittävä analyysin ja väärien löytö määrä (FDR) analyysi, valitsimme differentiaalisesti ilmentyvien geenien mukaan ennalta P-kynnysarvot ( 0,05) [23], [24], [25]. Tulokset differentiaalisesti ilmentyvien geenien tehtiin ilman valvontaa hierarkkinen ryhmittely (Cluster 3.0) ja TreeView analyysi (Stanfordin yliopisto, Stanford, CA, USA).

MicroRNA tavoitteet ennustaminen.

tavoitteet mRNA miRNA ennustettiin ne perustuvat TargetScan (https://www.targetscan.org/) versio 5.2. TargetScan ennustaa biologista tavoitteet miRNA etsimällä läsnäolo konservoituneen 8mer ja 7mer sivustoja, jotka vastaavat siemenen alueen kunkin miRNA [26]. Havaitsi ovat sivustoja kohtaanto siemen alueella, joka kompensoidaan säilyneet 3 ”pariksi [27]. Nisäkkäillä, ennusteet paremmuusjärjestykseen perustuvat ennustettuun tehoon kohdentamista lasketaan yhteydessä + tulokset sivustoja linjaukset [28], [29]. TargetScanHuman katsoo ottelut lisätä merkintöjä ihmisen UTR ja niiden ortologeille määrittelemän UCSC koko genomin linjaukset. Konservoituneisiin kohdistaminen on myös havaittu sisällä avointa lukukehystä (ORF).

Pathway analyysi.

Pathway analyysiä käytettiin tunnistamaan merkittäviä väyliä tasauspyörästön geenien mukaan Kioton Encyclopedia of Genes and Genomes , BioCarta ja Reatome tietokantoja. Käytimme myös Fisherin ja chi-neliö kokeet valita merkittäviä polkuja. Kynnys merkitystä määriteltiin P-arvon ja FDR. Rikastamista Re antoivat: (R

e = VÄKEVÖIMINEN), jossa on määrä ero geenien sisällä tiettyyn ryhmään, on kokonaismäärä geenien samaan luokkaan, on määrä ero geenien koko microarray ja on kokonaismäärä geenien microarray [30], [31], [32].

GeneRelNet (koekspressiota verkko).

Gene -parin verkkoja käytetään tunnistamaan geenin vuorovaikutusta [33]. Gene -parin verkot rakennettiin mukaan normalisoitu signaalin voimakkuuden erityinen ilmentymä geenejä. Kunkin parin geenien, laskimme Pearsonin korrelaatiokerrointa ja valitse merkittävä korrelaatio paria rakentaa verkkoon [34].

Sisällä verkon analyysin aste geenin keskeisyyden määritellään linkkien määrä yhdestä solmusta toiseen, käytettiin määrittämään sen suhteellinen merkitys [35]. K-sydämiä käytettiin kuvaajan topologian analyysiä. K-ydin verkon oli aliverkko, jossa kaikki solmut on yhdistetty ainakin ”k” muita geenejä aliverkossa. Sisällä proteiini-proteiini vuorovaikutus, k-runkoverkkojen sisältävät yleensä yhtenäinen proteiinien ryhmää [35], [36].

Tulokset

Microarray A549 ja A549 /CDDP solulinjat

Ensinnäkin, sisplatiini-vastus A549 /CDDP solulinja arvioimalla IC50-arvo A549 /CDDP villin A549-solulinja. Kuten kävi ilmi, kuviossa 1A, IC50 sisplatiinia lääkeaineille A549 /CDDP-solulinja oli 17,06 ± 0,68 mg /l, joka oli 3,9 kertaa korkeampi kuin villityypin A549-solulinja (4,36 ± 0,78 mg /l). Tämä tulos osoitti, että A549 /CDDP-solut olivat resistenttejä sisplatiinia kuin villityypin solut.

Soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla sisplatiinia (0,5 mg /l 128 mg /l). 48 tuntia myöhemmin solujen elinkelpoisuus mitattiin MTS (A). Heat kartoissa lncRNA (B), mRNA (C) ja miRNA (D) profiilit, jotka erottavat A549 /CDDP A549. Kukin näyte analysoitiin kolmena rinnakkaisena. Sekä alassäädetty (vihreä) ja sääteli (punainen) RNA: t tunnistettiin A549.

Sitten geeni siru Tutkimus suoritettiin näiden kahden solulinjan tutkimaan mahdollisia RNA ilmaisun muutoksia sisplatiinia resistenssin keuhkoadenokarsinooma soluissa käyttämällä Arraystar koetin aineisto, johon kuului 33045 lncRNAs ja 30215 koodaus selostukset. Hierarkkinen ryhmittely osoitti systemaattista vaihtelua ilmentymisen lncRNAs ja proteiinia koodaavat RNA: t kahden solulinjojen (kuvio 1B ja 1C). Verrattuna A549-solulinja, 725 koettimet lncRNAs lisääntynyt ja 655 antureista laski A549 /CDDP solulinjassa. Lisäksi 625 mRNA ero anturi kasvaa ja 846 mRNA koetin laskua löytyivät A549 /CDDP solulinjassa.

Tutkia jos microRNA ilmaisua muutettiin sisplatiinia resistentit solut, miRNA ekspressioprofiileja arvioitiin käyttäen Affymetrix miRNA geeni siru, joka sisälsi 1,105 ennalta miRNA ja 1105 kypsän-miRNA koettimet. Lisäanalyysiä keskityimme kypsä-miRNA. Tulokset osoittivat, että A549 /CDDP soluja, 16 miRNA vaimentua ja 9 miRNA yliaktiivista verrattuna A549-solulinja (P 0,05; kuvio 1 D). Microarray data Tässä artikkelissa on talletettu National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO) ja ovat käytettävissä (GEO) Sarjan hakunumerolla GSE43494 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov /geo/query/acc.cgi?acc=GSE43494).

validointi microarray tietoja käyttämällä qPCR

validoimiseksi mikrosiruanalyysi havaintojen ekspressiotaso 8 t, jotka arvellaan tärkeässä asemassa lääkeresistenssin ja 8 lncRNAs jotka oli korrelaatiot edeltävä mRNA: t joukossa ero ilmaisua RNA: t, analysoitiin käyttäen kvantitatiivista reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR). Varten lncRNA, tulokset osoittivat, että AK123263, CES1P1-001, RP3-508I15.14, AK126698, TP53TG1, ja AC090952.4.1 väheni, kun taas uc003bgl.1 ja NCRNA00210 kasvoi A549 /CDDP (kaikki P 0,05; kuvio 2A) . MRNA: n ekspressio BMP4, CTSB, NKD2, BAG1, TGFB1, EGFR JUN ja CUL2 osoitti tilastollisesti merkitseviä eroja kahdessa solulinjassa (P 0,05; kuvio 2B). Kaikki qRT-PCR-tuloksiin edellä vastasivat mikrosirulla. Nämä tulokset osoittavat, että joukko lncRNAs ja mRNA: t poikkeavasti ilmaistaan ​​sisplatiinin vastus solulinjoissa.

suhteellinen määrä kunkin mRNA (A) ja lncRNA (B) normalisoitiin 18S rRNA, ja kukin miRNA (C ) oli normalisoitu U6 snRNA. Tietojen histogrammit ovat keskiarvoja ± SD, * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001 verrattuna A549 (t-testi).

5 miRNA joukossa suodatetaan validoituja merkittävästi toisistaan ​​sisplatiinipiikin kestävä A549 /CDDP ja vanhempien A549-solulinja (P 0,05). Kuten esitetään (kuvio 2C), tasot miR-17, miR-21, ja miR-anna-7i oli alassäädetty A549 sijaan A549 /CDDP, kun miR-138 ja miR-194 ilmentyminen oli ylös- säännelty. Tämä havainto on yhtäpitävä tulosten mikrosirun hybridisaation.

Microarray-pohjainen koulutusjakson analyysi

Huomattava polkuja ero geenien verrattiin Kegg tietokantaan tarkentaa ja tunnistaa kohde-mRNA: iden joukossa 1471 tunnistettu geenejä. Nämä geenit on esitetty kuviossa 3A ja 3B. Korkean rikastamiseen reittejä kohdistettu yli-ilmentynyt mRNA: t olivat mukana aminoasyyli-tRNA biosynteesissä, DNA: n replikaatiota ja proteiinien käsittely Endoplasmakalvosto. Sen sijaan merkittäviä väyliä vastaa ali-ilmentynyt mRNA: iden näytti olevan vastuussa lääkeainemetaboliaa, antigeenin käsittely ja esittely ja sytokiinin sytokiinireseptorin vuorovaikutuksia. Näistä suurin rikastettu-väyliä liittyvät leviämisen ja lääkeainemetaboliaan ehdottivat rooli sisplatiinilla vastarintaa.

signalointireitit erilaisesti ilmaisi voimistunut mRNA: t (A) ja vaimentua mRNA: t (B). Western blot-analyysi MAPK-reitin (C) ja Cell cycle reitin (D) tasot A549-soluja ja A549 /CDDP-soluja. P-P44 /42 MAPK, fosfori-p44 /42 MAPK; P-SAPK /JNK, fosfori-SAPK /JNK; P-cdc2, fosfori-cdc2; P-Rb, fosfori-Rb; P-Chk2, fosfori-Chk2; P-p53, fosfori-p53. Signalointipolkujen risteyksessä välillä eri tavalla ilmaistuna mRNA: ita ja ennakoi maalin geenit eri ilmaistuna voimistunut mRNA: t (E) ja vaimentua mRNA: t (F). Pathway analyysi perustuvat pääasiassa Kegg tietokantaan. P-arvot 0,05 käyttäen kaksipuolista Fisherin testiä luokiteltiin olevan tilastollisesti merkitsevä. Pystyakselilla polku luokka ja vaaka-akseli edustaa -log10 (p-arvo) näistä merkittävistä reittejä.

Solusykli ja MAPK-signalointireitin olivat valitsi oikeellisuuden koulutusjakson analyysitulokset . Verrattuna A549-soluja, avaintekijöitä Cell cycle fosfo-cdc2 (Tyr15) ja fosfo-Rb (ser807 /811) lisääntynyt proteiinin taso A549 /CDDP soluja edustavat säätelyä Cell cycle reitin. Vähentynyt of cdc2 negatiivinen säätelijä fosfo-Chk2 (Thr68) ja fosfo-p53 (ser15) vahvistettu tämän tuloksen. Myös fosfo-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185) ja fosfo-p44 /42 MAPK (Erk1 /2) (Thr202 /Tyr204), jotka ovat tärkeimmät tekijät MAPK -signalointireitistä, laski A549 /CDDP solulinjassa. Ja nämä tulokset listattu kuviossa 3C ja 3D.

Tavoitteena mRNA: t ilmentyvät eri miRNA ennustettiin käyttämällä TargetScan (https://www.targetscan.org/) ja 7814 niiden väliset suhteet havaittu (taulukko S3) . Leikkauspiste asetettu ennakoi maalin mRNA: iden ja ilmennetty eri mRNA: ita edellä mainittu valittiin. 497 suhteet jätti tämän vaiheen jälkeen kuten taulukossa S4. Merkittävät väyliä näiden geenien (P 0,05) ajatellaan säänneltävä miRNA mukaan Kegg tietokantaan analysoitiin (kuvio 3E ja 3F). Merkittävä reitit mukana Wnt-signalointireitin, transkription misregulation syövän ja insuliinin signalointireittejä.

seulotaan pois 21 ilmennetty eri mRNA sisplatiinin vastus soluissa (taulukko S5), jotka korreloivat negatiivisesti ja mahdollisesti säätelee miRNA. Nämä mRNA: t olivat mukana 11 polkuja, jotka ajateltiin olla tärkeä rooli sisplatiinin vastus.

perustaminen geenin ilmentäminen rinnakkain verkon

Pearsonin korrelaatiokertoimet arvioitiin kullekin geeniä ja merkittävät korrelaatio paria sulautettiin miRNA tutkia lncRNA miRNA ja mRNA koekspressoimalla. Verkko-analyysi tarkoituksena oli selvittää mikä geeni tai geenit ollut keskeinen rooli sisplatiinin vastus (kuva 4). Gene verkostoja rakennettiin funktionaalinen geeni yhdistysten ja on kuvattu yksityiskohtaisesti taulukossa S6. mRNA: t, jotka ovat vuorovaikutuksessa sekä lncRNAs ja miRNA korostettiin keltainen väri. Vuonna verkkokaavioita, sykli solmut edustavat geenejä, ja reunojen kahden solmun edustavat vuorovaikutukset geenien kvantifioidaan astetta. Astetta verkon sisällä kuvaavat useita yksittäisten geenien, jotka säätelevät muiden geenien ja edustavat koko syklin solmun. Mitä korkeampi, sitä enemmän keskeinen geeni on verkon sisällä. Reunat kahden solmun liitettiin eri mekanismeilla. LncRNA-mRNA ennustettiin korrelaatio analyysi menettää tehokkaan selvitystä asiasta. miRNA-mRNA ennustettiin TargetScan, joka on laajimmin käytetty menetelmä suuren suoritustehon microRNA tietojen tavoitteet ennustaminen. mRNA-mRNA määritettiin perustuen Kegg monta mRNA suhteet oli kerätty täällä. LncRNA-lncRNA ja miRNA-miRNA ei osoittivat ne ovat merkityksettömiä. LncRNA-miRNA ei voida laskea rajoitettu tietokanta ja tekniikalla.

LncRNA-miRNA-mRNA-verkosto A549 (A) ja A549 /CDDP (B). Sininen edustaa säätelyä alaspäin ja oranssi edustaa ylös sääntelyä. Laatikko solmut edustavat microRNA, ympyrä solmut edustavat mRNA, ja kuusikulmio solmut edustavat lncRNA. Mustat reunat kuvaavat mahdollista suhdetta lncRNA ja mRNA, vihreät reunat kuvaavat inhibitive vaikutus mikroRNA mRNA, ja punaiset reunat edustavat suhdetta mRNA ja mRNA.

Clustering kertoimet käytetään arvioitaessa monimutkaisuus vuorovaikutuksia geenien naapurissa ydin geeni, lukuun ottamatta ytimen geenin osallistumisen. Alempi klusterointi kerroin, sitä enemmän riippumaton ytimen geenejä kannalta vuorovaikutussuhteita geenien viereisissä sydämiä [35]. Tulokset osoittivat, että monet geenit kuten FN1, CTSB, EGFR, ja TGFB1; lncRNAs lukien BX648420, ENST00000366408, ja ENST00000404247; ja miRNA kuten miR-26a ja anna-7i mahdollisesti ollut keskeinen rooli verkostossa. Aliverkossa, monet eristetty mRNA: t liittyvät Wnt signalointireitille. He olivat ehdokkaita niillä voi olla merkittävä rooli sisplatiinia vastus säätelee lncRNAs.

Verkko analyysin tulokset viittaavat siihen, että mRNA: t voidaan käyttää samanaikaisesti säädetään eri lncRNAs yhdessä eri miRNA. Esimerkiksi, BAG1 voidaan säätää 3 miRNA ja 3 lncRNAs samanaikaisesti. Ilmiö saattaa selittää, miksi jotkut mRNA: t ennustettiin mahdollisina miRNA tavoitteita eivät muuttuneet vastakkaiseen suuntaan sen vastaavan miRNA.

Konckdown of AK126698 aktivoitua kanoninen Wnt-signalointireitin ja aiheuttama sisplatiinin vastarinnan A549 solulinjassa

edellä polku analyysit on osoittanut, että Wnt-signalointireitin ja monet yksittäisiä jäseniä se lueteltu suhteellisen eristyksissä verkossa merkittävästi muuttuneet A549 /CDDP solulinjassa. Nämä tulokset viittaavat meille, että Wnt-signalointireitin oli mukana NSCLC chemoresistance. Tämän lisäksi taso AK126698 läheisesti korreloi monien jäsenten Wnt-reitin (kuten taulukossa S7). Niinpä rooli lncRNA AK126698 säätelyssä Wnt-signalointireitin tutkittiin. Transfektio siRNA AK126698-424 ja siRNA AK126698-291 A549-soluissa johti vähenemiseen NKD2 mRNA: n ilmentymisen, joka on negatiivinen säätelijä Wnt-signalointireitin (kuvio. 5A). Samaan aikaan keskeinen transkriptiotekijän kanoninen Wnt koulutusjakson β-kateniinin lisääntyi myös proteiinin tason jälkeen AK126698 knockdown. Proteiini taso fosfo-β-kateniinin (Ser675), joka edustaa β-kateniinin translokaatio, lisääntynyt käsittelyn jälkeen siRNA AK126698. Nämä havainnot ehdottivat, että siRNA AK126698 aktivoitu kanoninen Wnt /β-kateniinin signalointireitin (kuvio 5B). Samaan aikaan, vaikutus pudotus AK126698-424 ja siRNA AK126698-291 on A549-solujen apoptoosia havaittiin käyttämällä anneksiini-V /PI-määrityksellä.