Krooninen sairaus

tiivistelmä

kliininen onnistuminen Adoptiivisen syövän immunoterapiassa vetoaa valinnan kohde-antigeenejä, jotka ovat erittäin ilmaistaan ​​kasvainsoluissa, mutta ei esiinny olennaista normaaleissa kudoksissa. Joukko koodaavat geenit syöpä /kives tai syöpä ituradan antigeenejä on ehdotettu ihanteellinen tavoitteet immuunihoidolle johtuen niiden voimakasta ilmentymistä useita syövän tyypit ja niiden rajoitettua ilmaisun immunoetuoikeutettu normaaleissa kudoksissa. Tässä työssä me raportoimme eristämistä ja karakterisointia ihmisen T-solu- reseptorien (TCR: t), jotka ovat spesifisiä nivelkalvon sarkooman X murtuessa 2 (SSX2), syövän /kiveksen antigeeni ilmaistaan ​​melanooma, eturauhassyöpä, lymfooma, multippeli myelooma ja haimasyöpä, muun kasvaimia. Me eristetty seitsemän HLA-A2 rajattu T-solujen reseptoreihin luonnollisista T-solukloonien peräisin kasvaimeen soluttautunut imusolmukkeiden kahden SSX2-seropositiivisten melanooma potilaiden, ja valitut neljä TCRiä kloonaamiseen retrovirusvektoreita. Perifeerisen veren lymfosyytit (PBL) transdusoidaan kolme neljästä SSX2 TCRiä osoitti SSX2

41-49 (KASEKIFYV) peptidi spesifinen reaktiivisuus, tuumorisolun tunnustamista ja tetrameerin sitova. Yksi näistä, TCR-5, esillä tetrameerin sitoutuminen sekä CD4 ja CD8-solut ja valittiin jatkotutkimuksia varten. Antigeenispesifisiä ja HLA-A * 0201-rajoitettu interferoni-γ release, solun hajoaminen ja lymfosyyttien proliferaatiota havaittu viljelmä TCR suunniteltu ihmisen PBL asiaan tuumorisolulinjoissa. Kodonioptimointi havaittiin lisäävän TCR-5 ilmentymisen transdusoiduissa T-soluissa, ja tämä rakenne on valittu kehittämistä kliinisen laadun virusvektorin tuottavia soluja. Kasvain-spesifinen malli ilmentymisen SSX2 yhdessä tehokas ja selektiivinen aktiivisuus TCR-5, tekee tämän TCR houkutteleva ehdokas mahdollisten TCR geeniterapiaa hoitoon useita syövän histologialtaan.

Citation: Abate-Daga D, Speiser DE, Chinnasamy N, Zheng Z, Xu H, Feldman SA, et ai. (2014) kehittäminen T-solureseptorin Targeting HLA-A * 0201 Rajoitettu Epitooppi päässä Cancer-Kivesten Antigen SSX2 varten Adoptive syövän immunoterapiassa. PLoS ONE 9 (3): e93321. doi: 10,1371 /journal.pone.0093321

Editor: Nupur Gangopadhyay, University of Pittsburgh, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 joulukuu 2013; Hyväksytty: 04 maaliskuu 2014; Julkaistu: 28 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Hanke tuettiin osittain rahoitusosuudesta Milstein Family Foundation ja jonka Intramural tutkimusohjelma The Center for Cancer Research, National Cancer Institute, Bethesda MD. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Viimeaikaiset edistysaskeleet aloilla kasvaimen immunologian, syöpä genomiikan ja geeninsiirto teknologiat ovat voitu kehittää hoitoja, joka perustuu adoptiiviseen siirtoon autologisia-reaktiivisten T-solujen hoitoon ihmisen maligniteettien [1], [2 ]. Kasvain-reaktiiviset T-solut voivat olla luonnollisia, kuten tapauksessa kasvaimen tunkeutuvia lymfosyyttejä (TIL) puhdistettu toistoleikattiin vaurioita ja stimuloitiin

ex vivo

, tai tuottaa perifeerisestä verestä koodaavien geenien immuunijärjestelmän reseptoreihin [3 ].

Vaikka korkea (50-70%) objektiivisten kliininen vaste saavutetaan TIL potilailla myöhäisvaiheen melanooman vankan proof of concept hoitoon ihmisen syöpien T-solujen kanssa [4 ], [5], sen laaja soveltaminen rajoittaa vaikeus viljelemällä ja laajentamaan näitä T-soluja kliinisesti merkittävää numeroita jokaiselle potilaalle. Vaihtoehtoisena lähestymistapana, antigeenispesifisyys helposti saatavilla perifeerisen veren T-soluja voidaan ohjata antigeenien ilmaistuna kasvainsoluissa geneettistä muuntelua. Adoptiivinen siirto autologisten T-solujen muokattu ilmentämään T-solun reseptorien (TCR: t) tai vasta-johdettu kimeerisen im- reseptorit voivat aiheuttaa voimakkaan soluvälitteisen immuunivasteen vastaan ​​kudoksissa, jotka ilmentävät kohdeantigeeneja, jopa alhaisella tasolla [3], [6] – [ ,,,0],8]. Siksi on instrumentaalinen valita huolellisesti antigeenejä, jotka ilmentyvät kasvainsoluissa mutta puuttuu olennainen normaaleista kudoksista, jotta vältytään on-target /off-kasvain toksisuuksien.

Nykyinen toimia määrittelemällä optimaalinen tavoite antigeenejä otto- immunoterapia pääasiassa keskittynyt neoantigeenien tuottamat somaattiset mutaatiot läsnä kasvaimissa mutta poissa normaaleissa kudoksissa [9], [10], on antigeenejä ilmentyy tarpeettomiksi normaaleissa kudoksissa, ja joukko geenejä, jotka koodaavat syöpä-kives ( CT) antigeenejä. Viimeksi mainitut määritellään niiden ekspressiomalli, joka aikuisilla, on yleensä vain ei-MHC-ilmentävien sukusoluissa kiveksissä, että näin ei esitellä antigeenejä T-soluille, ja kasvainsolujen monipuolinen alkuperää [11] – [13 ]. Adoptiovanhemmat siirto autologisia ääreisveren lymfosyyttejä ekspressoivat TCR on spesifinen syöpää kiveksen antigeeni, NY-ESO-1, välittämän tavoite kasvain taantumat potilailla, joilla on edennyt melanooma ja synoviaalisolukasvun sarkooma, ilman NY-ESO-1 liittyvä myrkyllisyys [14 ].

jotta laajentaa ohjelmistoon antigeenejä, jotka voidaan kohdistaa tätä lähestymistapaa, siis laajentaa potilaiden määrä ja kasvain tyypit, jotka voidaan hoitaa, kehitimme TCR ilmentävä vektori kohdistaminen jäsen nivelkalvon sarkooma X murtuessa perhe, SSX2. Nivelkalvon sarkooma X murtuessa (SSX) geenit sijaitsevat X-kromosomissa ja koodata perheen kymmenen hyvin homologisia tumaproteiinit, SSX1-10. SSX2 tunnistettiin alun perin osana genomisen translokaatio läsnä nivelkalvon sarkooma [15], [16] ja myöhemmin havaittiin olevan identtinen HOM-MEL-40, joka on immunogeeninen proteiini, jonka tiedetään aiheuttavan spontaaneja vasta-ainevasteita 10%: lla potilaista, joilla melanooma [17].

syntyy retrovirusvektoreita koodaavat TCR alfa- ja beta-ketjut suunnattu HLA-A * 0201-rajoitettu epitoopin SSX2

41-49, jotka on eristetty aikaisemmin kuvattu melanooma potilaat, joilla on aktiivinen immuunivaste vastauksia SSX2 [18]. Olemme lisäksi osoittaneet, että T-solut muokattu näillä vektoreilla tunnistaa johdetut solulinjat useita syöpään histologialtaan. Optimointi TCR ilmaisun ja toimintaa muuttamalla sen nukleotidisekvenssiä pystyimme tunnistamaan optimaalinen suunnittelu ekspressoitua tehokkaasti ja voimakkaita antigeenispesifisiä reaktiivisuus vastaan ​​SSX2. Tuotanto kliinisen-luokan retrovirusvektorilla tuottajasolulinjalle edelleen jatkettava sen tulevaa soveltamista adoptiivisessa immunoterapiassa kliinisissä tutkimuksissa.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja ihmisen PBL:

HLA-A * 0201 + /SSX2 + melanoomasolulinja 624, ja ei-HLA-A * 0201 solulinjat 888 ja 938 vahvistettiin kirurgisesti resektoitiin metastaattisen melanooman kasvaimia ja ylläpidettiin Surgery Branch, National Cancer Institute, National Institutes of Health ( Bethesda, MD). HLA-A * 0201 + /SSX2 + glioomasolulinjaa U251 saatiin Division of Cancer Treatment and Diagnosis kasvain Repository, National Cancer Institute, National Institutes of Health (Frederick, MD). Melanooma linjat SKmel23 ja SKmel37, ja rintasyövän solulinjassa MCF7 ostettiin ATCC: ltä (Manassas, VA). COS7-A * 0201 ja 293-A * 0201-solut retroviraalisesti muokattu ilmentämään HLA-A * 0201, kuten aiemmin on kuvattu [19], [20]. COS7-A * 0201-SSX2 ja 293-A * 0201-SSX2 solut transdusoitiin retrovirusvektorilla, joka ilmentää cDNA SSX2. T2 on lymfoblastoidisolulinjaan puuttuu TAP-toiminto, jonka luokan I HLA-proteiinit voidaan helposti ladata eksogeenisillä peptideillä. PG13 pakkaus klooneja käyttämällä PG13 gibboniapinan leukemia virus pakkaus solulinja (ATCC CRL-10686), ja ihmisen ekotrooppista pakkaus solulinjaa, Phoenix ECO (ystävällisesti Dr. Hans-Peter Kiemin, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle , WA). Kaikki solut viljeltiin D10 väliaineessa, joka koostuu korkean glukoosin (4,5 g /l), Dulbeccon modifioidussa perusalustassa (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Hyclone, Logan, UT) ja 6 mM glutamiinia (lopullinen pitoisuus; Invitrogen, Carlsbad, CA). Soluja pidettiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2.

Perifeerisen veren lymfosyytit Tässä tutkimuksessa käytetyt saatiin melanoomapotilailta käsitellään Surgery Branch, National Cancer Institute, National Institutes of Health, on NCI Institutional Review Board-hyväksyttyjen käytäntöjen. Potilaat kunhan kirjallinen suostumus kudosten ja käyttää näitä tutkimustarkoituksiin, kuten esitetään yksityiskohtaisesti protokollan 03-C-0277. Ihmisen lymfosyyttejä pidettiin AIM-V-väliaineessa (Invitrogen, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 5% ihmisen AB-seerumia (Valley Biomedical, Winchester, VA), 50 U /ml penisilliiniä, 50 ug /ml streptomysiiniä (Invitrogen), ja 300 IU /ml IL-2 ja pidettiin 37 ° C: ssa 5% CO2. SSX2 spesifisten T-solujen klooneja juuri muodostettujen tuumoriin infiltroituneista imusolmukkeesta peräisin olevien potilaiden T-solut Lau 567 ja Lau 672, samalla tavalla kuin aiemmin on kuvattu [18].

Synteettiset peptidit

SSX2

41-49-peptidi (KASEKIFYV) vastaa aminohappoja 41-49 ja SSX2, ja homologisia peptidejä, jotka ovat peräisin SSX1 (KYSEKISYV), SSX3 (KVSEKIVYV), SSX4 (KSSEKIVYV), SSX5 (KASEKIIYV), SSX6 (KFSEKISCV), SSX7 (KSLEKISYV), SSX8 (KYSEKISYV), SSX9 (KSSEKIIYV), SSX10 (KASEKILYV), IGSF22 (KESAKIFYD), ARHGAP1 (KFGQKIFYV), GPR82 (SCYEKIFYG), PHF8 (LKGEKIFYL), LIPM (TGQEKIYYV), SYT14 (IVGEKIFYL), TCOF1 (KASEKILQV), RBL2 (SPREKIFYY) ja FRAS1 (SPREKIYYV) syntetisoitiin GenScript (Piscataway, NJ). Peptidejä liuotettiin DMSO: hon ja laimennettiin RPMI 1640 väliaineessa lastaus T2-soluja. Sitoutumisaffiniteetti HLA-A2 * 0201 ennustettiin kullekin peptidille käyttämällä NetMHC-3,0 [21]. Tunnistaminen peptidien homologisia SSX2

41-49, joissa voisi olla ristireaktiivisuutta suoritettiin blast hakuun (Blastp- algoritmi).

rakentaminen retrovirusvektorit ilmentymisen SSX2-specific HLA-A * 0201-rajoitettu TCR: ien

MSGV1-pohjainen retrovirusvektoreiden rakennettiin päällekkäin PCR kanssa alfa- ja beeta-TCR-ketjujen järjestetty seuraavassa järjestyksessä: TCR alfa-ketju, kytkijäpeptidiä furiinin-SGSGP2A, TCR beeta-ketju , kuten aiemmin on kuvattu [22]. Kloonatun TCR insertit varmistettiin restriktioentsyymi profiloinnin ja suora DNA: n sekvensointi. CDNA, joka koodaa kodonioptimoidun versio SSX2-spesifisten TCR ja kodonioptimoitu TCR hiiren vakioalueet syntetisoitiin GenScript. Ihmisen ja hiiren hybridi version TCR-5 suunniteltiin aiemmin kuvattu [23].

T-solujen transduktio

Retrovirusperäinen supernatantit tuottamat transfektoimalla kukin pMSGV1-SSX2-TCR plasmidiin yhdessä vektori koodaa RD114 kirjekuori 293-GP-soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 reagenssia (Invitrogen) Opti-MEM (Invitrogen) [22]. Virussupernatantteja ladattiin sitten RetroNectin päällystetty (Takara Bio, Japani) kudosviljelmällä-käsiteltyjen kuuden kuopan levyillä. PBL: t stimuloitiin OKT3 (50 ng /ml) ja rhIL-2 (300 IU /ml) 48 h ennen transduktiota, ja transduktio suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [24].

Tetrameerivärjäys

HLA-A * 0201-rajoitettu SSX2 peptidin SSX2

41-49 (KASEKIFYV) tuotettiin National Institutes of Health tetrameeriä Core Facility Emory University (Atlanta, GA) käyttäen fykoerytriini (PE) kuin fluorikromia. Arviointiin TCR transduktion tehokkuutta T-solujen alaryhmästä, transdusoidut T-solut värjättiin FITC-leimatun anti-ihmis-CD8 (BD Pharmingen, San Jose, CA) ja PE-leimattua HLA-A * 0201 tetrameerejä. Solut analysoitiin FACScan-virtaussytometrillä, jossa CellQuest-ohjelmaa (BD Biosciences) tai FlowJo ohjelmisto (Tree Star, Ashland, OR).

Sytokiinien vapautumisen määrityksellä

TCR-transdusoidut lymfosyytit testattiin antigeeniin erityisiä reaktiivisuus sytokiinien vapautumisen määrityksissä käyttäen peptidi-ladattu T2-soluja tai syöpäsoluja. Tätä varten efektorisoluja ja kohdesoluja viljeltiin yhdessä yhdellä 1:01 suhde (1 x 10

5 kutakin) 200 ul: AIM-V-väliaineessa kahtena kuoppiin 96-kuoppalevyn. Viljelmän supernatantit kerättiin 18-24 tuntia aloittamisen jälkeen yhteisviljelmä ja analysoitiin interferoni-γ (IFNy) ELISA (Thermo Scientific).

[

51Cr] vapautumisen määrityksellä

kyky transdusoitujen PBL: hajottamiseksi HLA-A * 0201 + SSX2 + kasvainsolujen arvioitiin käyttäen standardia [

51Cr] vapautumisen määrityksellä, kuten aiemmin on kuvattu [25] Lyhyesti, TCR-suunniteltu PBL: t viljeltiin vähenee suhteet

51Cr-leimattuja kohdesoluja (E: T-suhteella) AIM-V-väliaineessa 96-kuoppaisilla U-levyillä 37 ° C: ssa 4 h. Hajoaminen mitattiin [

51Cr] release keskipitkällä kaavan mukaisesti: prosentuaalista hajoamista = (mallitiedotetta – vähintään release) /(maksimi release – pienin release) x 100%. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona kaksoisnäytteillä.

Generation of a PG13 pakkauksen klooni koodaa SSX2-erityinen TCR

PG13 retroviruspakkauksen solu- klooni tuotettu kuten aiemmin on kuvattu seuraavin muutoksin [24] . Phoenix ECO-solut transfektoitiin 9,5 ug: lla plasmidi-DNA: ta (pMSGV1-SSX2.567.5-co) käyttäen Lipofectamine 2000CD transfektioreagenssia (LifeTechnologies, Carlsbad, CA). 48 tunnin kuluttua supernatantti talteen ja käytetään transduktion retroviruspakkauksen solulinjassa, PG13. Kudosviljelmällä käsiteltiin 6-kuoppaisille levyille päällystettiin 20 ug /ml RetroNectin, kuten valmistaja on kuvannut. Retrovirusvektorisupernatantin (4 ml), lisättiin kuhunkin kuoppaan, jota seuraa sentrifugointi (2000 x g) 32 ° C: ssa. 2 tunnin jälkeen, supernatantti poistettiin ja 5 x 10

5 PG13 soluja lisättiin hyvin, sentrifugoitiin (1000 x g) 10 minuutin ajan 32 ° C: ssa. Kaksi kierrosta transduktion tehtiin ja sitten PG13 pakkaus klooneja rajoittavan laimennuksen kloonausta. Puutteen vuoksi selektiomarkkerin, korkean tiitterin kloonit tunnistettiin RNA dot blot kuten aiemmin on kuvattu [24], [26]. Retrovirusvektori alkaen 6 korkein tiitteri kloonien luotiin kuvatulla. Lyhyesti, 175 cm

2 kudosviljelypulloihin (Nunc, Cole-Parmer, Vernon Hills, IL) ympättiin 4 x 10

4 solua /cm

2, jonka jälkeen väliaine vaihto (30 ml) 3. päivänä Supernatantti kerättiin 24 tuntia myöhemmin, jaettiin osiin ja säilytettiin -80 ° C: ssa myöhempään käyttöön saakka. Supernatantti kunkin kloonin arvioitiin kyky tehokkaasti transdusoida ihmisen PBL ja saada IFNy on sytokiinien vapautumisen määritystä. Korkea tiitteri klooni valitaan tuotantoon on kantasolupankit ja myöhemmät GMP retrovirusvektorisupernatantilla.

Generation GMP retrovirusvektorisupernatantin

Yhteensä 26 1700 cm

2 laajennettu pinta roller-pulloissa ympättiin päivänä 0 solutiheyteen 4 x 10

4 solua /cm

2 200 ml: aan D10 välineellä. Päivänä 3 elatusaine vaihdettiin ja korvattiin 120 ml: lla D10 väliaineessa. Väliaine, joka sisältää retrovirusvektorin kerättiin päivittäin, kun pulloja syötettiin uudelleen 120 ml: lla väliainetta. Glukoositasoja tarkkailtiin päivittäin käyttäen Rochen Accu-check-järjestelmä (Roche, Basal, Sveitsi). Jos glukoosipitoisuus putosi alle 2 g /l, tilavuus väliaineen vaihdon kaksinkertaistettiin 240 ml /rulla pulloon myöhempiä satoja. Kaikki sadot jaettiin eriin ja säilytettiin -80 ° C: ssa myöhempään käyttöön saakka. Alikvootti kustakin sadosta testattiin transduktiotehoa ja sytokiinien vapautumista, kuten aikaisemmin on kuvattu. Kaikki kliiniset tuotteet alistettiin laajan bioturvallisuutta testausohjelman mukaisesti nykyisen sääntelyn suuntaviivat (US Food and Drug Administration, Center for Biologics Evaluation and Research; viittaus pistettä harkitsemaan tuotanto ja testaus New Drugs and Biologicals valmistetaan yhdistelmä-DNA-tekniikalla , 1985; pistettä harkitsemaan luonnehdinta solulinjojen tuottamaan käytetty Biologicals, 1993; Guidance for Industry: Guidance for Human somaattinen soluterapia ja Gene Therapy, 1998 Guidance for Industry, inds – Approaches noudattamaan CGMP vaiheessa I 2006).

tulokset

kloonaus ihmisen SSX2-reaktiivisen TCR: ien

koodausalueissa TCR alfa- ja beta-ketjut kloonattiin aiemmin on kuvattu luonnossa esiintyvät SSX2-reaktiivinen T-solut kaksi melanoomapotilailta [18]. Näiden HLA-A2-restriktoituja CD8-solut tunnistavat epitoopin, joka käsittää aminohappotähteet 41: sta 49: cDNA syntetisoitiin 5′-RACE käyttäen spesifisiä alukkeita vakioalueen TCR-geenien ja tuotteet sekvensoitiin, tunnistaa seitsemän eri paria TRAV ja TRBV geenit ( pöytä 1). Ekspressiokasetit, jotka sisältävät alfa- ja beta-TCR-ketjujen erotettu 2A linkkeri-peptidi [27], [28], muodostettiin päällekkäin PCR: llä ja kloonataan pMSGV1 tuottamiseen retroviraaliekspressiovektoreiden kloonit 5, 8, 9 ja 11 ( kuvio 1A).

koodausalue kunkin TCR-alfa-ketju monistettiin PCR: llä käyttäen alukkeita, jota reunustavat NcoI-restriktiokohdan 5′-päähän ja riippuvan sekvensointi, joka sisältää elementin 3′-pään. Rinnakkain, kumpikin TCR beeta-ketju monistettiin PCR: llä käyttämällä eteenpäin-aluketta, joka sisälsi 5 ’uloke, joka limittyy 3’ ulokkeen läsnä alukkeen monistamiseen käytettiin alfa-ketjun. Reverse-aluketta käytetään monistamiseksi beeta-ketjun sisälsi lopetuskodonin ja

Eco

RI-restriktiokohdan. Toisessa PCR-kierroksella, tuotteiden alfa- ja beeta-ketjun monistukset yhdistettiin, ja ligaatio sekä cDNA-fragmenttien läpi päällekkäisten ulokkeita saatiin aikaan PCR: llä käyttämällä ulkoista alukkeita. Tuloksena saadut PCR-tuotteet kloonattiin pMSGV1 vektoriin retrovirus tuotantoon. LTR: pitkä terminaalinen toisto, sd: silmukointidonori, sa: akseptorisilmukointikohtien, ψ: retrovirus kapselointisignaalin.

Kloonatun TCRiä ihmisen lymfosyyteissä

retrovirusvektorisupernatanttien tuotettiin tilapäisellä transfektiolla 293GP ja käytettiin transduktion OKT3-stimuloitujen ihmisen T-soluilla. Expression ja oikea kokoonpano TCRiä arvioitiin virtaussytometrialla käyttäen fluoresoivasti leimattua HLA-A2-SSX2

41-49 tetrameerejä. TCR5 oli tehokkaasti ilmaistu sekä CD8 ja CD4-solujen, TCR9 ja TCR11 ilmennettiin vain CD8-soluja, kun taas ekspressio TCR8 ei havaittu tällä tekniikalla (kuvio 2 A).

A) analyysi pintailmentymistä SSX2

41-49-erityisiä TCR: ien in CD8 ja CD4 T-solujen populaatioita virtaussytometrialla. Ihmisen perifeerisen veren mononukleaarisia soluja stimuloitiin OKT3 ja transdusoitu osoitetun retroviraaliekspressiovektoreiden. Yksi viikko myöhemmin solut värjättiin anti-ihmis-CD3, CD8-vasta-aineita ja fluoresoivasti leimattua tetrameerin, joka sisältää SSX2

41-49-peptidin. Tulokset yhdestä edustavasta luovuttajalta vähintään neljän itsenäisen kokeen. Tapahtumat aidatulla imusoluilla, single, elinkelpoinen, CD3 + soluista. B) – D) pitoisuus IFNg supernatanteissa TCR transdusoimattomien T-soluja viljeltiin yön yli osoitetuilla tavoitteiden (1 x 10

5 effektorit vs 1 x 10

5 tavoitteita). Tulokset esitetään keskiarvona kaksoiskappaleita kaksi edustavaa luovuttajien neljästä. UT: untranduced.

reaktiivisuus PBL transdusoitu ihmisen anti-SSX2 TCR: ien vastaan ​​SSX2-positiivisia kasvainsoluja

oikea käsittely ja esittely SSX2

41-49 epitooppia , ja tunnustaa TCR-suunniteltu PBL testattiin in vitro viljelemällä PBL johdannaisilla Cos-7 ja HEK293-solut, jotka ilmentävät HLA-A * 0201 tai ilman samanaikaista antigeenin ilmentymistä SSX2 (Cos-A2, Cos-A2 SSX2 , 293-A2 ja 293-A2 SSX2, vastaavasti). Kuten kuviossa 2B, T-solut transdusoitu TCR-5, -9 ja -11 erittyy suuria määriä IFNg (suuruusluokkaa 1 x 10

4 pg /ml), kun viljellään kanssa SSX2-transfektanttien. TCR-8-transdusoidut T-solut erittää vain taustatasoja IFNg mukaisesti puute tetrameerin sitoutuminen kuviossa 2A. Sen tarkistamiseksi, HLA-A * 0201 rajoitus näistä TCR, joka on SSX2-positiivinen HLA-A * 0201-negatiivisia melanoomasolulinjalla (938) tai sen johdannaisen muokattu ilmentämään HLA-A * 0201 (938-A2) käytettiin kohteina yhteisviljelmä kokeita. Kuten kuviossa 2C, lymfosyytit ekspressoivat TCR-5, -9 ja -11 erittää IFNy vain silloin, kun läsnä ollessa viljeltyjen 938-A2-soluja. Recognition of 938-A2 endogeenisen SSX2 oli vahvempi TCR-5 transduktoitu- lymfosyytit, osoituksena 2 kertaa korkeampi IFNy eritystä ne solut verrattuna T-solujen transdusoitu TCR-9 ja -11 (kuvio 2C).

kyvyn testaamiseksi näiden TCRiä tunnistaa endogeeninen SSX2 ilmaiseman tuumorisolut, me viljelty PBL: t (transdusoitiin TCR-5, -8, -9, -11) ja johdetut solulinjat melanoomaa (888, SKMEL-23, 624), gliooma (U251), ja rintasyöpä (MCF-7). Kuten kuviossa 2D, TCR-5, -9 ja -11 välittämän IFNy-vapautumista transdusoitujen lymfosyyttien kun niitä viljellään, kun läsnä on HLA-A * 0201-positiivisia SSX2-positiivisia kasvainsoluja gliooma ja melanooma. Huomattavaa on, että TCR-5 välittämän vahvin kohde tunnustamista kesken eri TCR: ien testi. Tämän perusteella ja sen tehokasta ekspressiota sekä CD8 ja CD4-T-solujen, valitsimme TCR-5 edelleen karakterisointia.

ristireaktiivisuutta muiden jäsenten SSX perheen ja ei-SSX proteiineja

SSX perhe käsittää 10 geeniä, jotka koodaavat proteiineja, jotka ovat erittäin homologisia keskenään. Erityisesti epitooppi SSX2 kohteena TCR-5 kuuluu ensisijaisesti yksi alueen välisen homologian perheenjäsenten. Kuten kuviossa 3A aminohapposekvenssin SSX5 ja SSX10 eroavat SSX2

41-49 vain yhtä tähdettä; SSX1, SSX3, SSX4, SSX8 ja SSX9 poikkeavat SSX2

41-49 kahdessa aminohappoa; ja SSX6 ja SSX7 poikkeavat SSX2

41-49 kolmessa aminohappoja. Lisäksi SSX2, SSX3 ja SSX5 ennustettiin sitoutuvan HLA-A2-molekyylien suurella affiniteetilla. Peptidejä, jotka ovat peräisin SSX4, SSX7, SSX9 ja SSX10 ennustettiin sitoutuvan HLA-A2, joilla on alhaisempi affiniteetti. Reaktiivisuus TCR-5 toisiaan vastaan ​​näiden peptidien testattiin yhteisviljelmä kokeissa, joissa käytettiin ihmisen ilmentävien lymfosyyttien TCR-5 efektoreina ja peptidi-pulssi T2-soluja kohteina, ja eritys IFNg arvioitiin markkerina antigeenitunnistukseen. Kun TCR-5-ilmentäviä soluja erittää IFNy altistettaessa SSX2

41-49 pieninä pitoisuuksina peptidin ( 0,01 ng /ml), ne reagoivat SSX3-, SSX4-, SSX5-, SSX9- ja SSX10- johdetut peptidit ainoastaan ​​silloin, kun altistuvat suurille peptidin (yli 10 ng peptidiä /ml, kuvio 3 A). Tämä ero reaktiivisuudessa kolmesta neljään suuruusluokkaa osoittaa, että TCR-5 on suhteellisen spesifinen SSX2

41-49, ja ehdottaa, että tunnustamista solut, jotka ilmentävät homologista peptidejä, jotka ovat peräisin muista SSX geenit voivat olla epätodennäköistä.

Perifeerisen veren T-soluja, jotka ilmentävät TCR-5 viljeltiin yhdessä yön yli T2-soluja aiemmin pulssitettu sarjalaimennoksia osoitettujen peptidien. Tulokset IFNg keskittyminen viljelmäsupernatanteissa ilmaistaan ​​keskiarvona toistot tyypillisen kokeen. Sekvenssikohdistuksen testatuilla peptideillä on kuviossa esitetty legenda A) SSX-perheen geenien ja B) ei-SSX geenien kanssa päällekkäisiä sekvenssejä. IGSF22: immunoglobuliinisuperryhmän jäsen 22, ARHGAP1: Rho GTPaasia aktivoiva proteiini 1, GPR82: Todennäköinen G-proteiiniin kytkeytynyt reseptori 82, PHF8: histoni lysiiniä demetylaasientsyymin PHF8, LIPM: lipaasi jäsen M, SYT14: synaptotagmin-14, TCOF1: siirappi proteiinia, RBL2: retinoblastooma-kaltainen proteiini 2, FRAS1: soluväliaineen proteiinin FRAS1. Prediction of sitoutumisaffiniteetti HLA-A2 * 0201 on esitetty kullekin peptidille, ilmaistuna dissosiaatiovakio (K

D, nM).

yhdeksän ylimääräistä proteiinia koodaavan geenit tunnistettiin räjähdys hakua kuten osittain homologinen SSX2

41-49 epitooppi: IGSF22, ARHGAP1, GPR82, PHF8, LIPM, SYT14, TCOF1, RBL2 ja FRAS1. Päällekkäiset peptidit kahdessa näistä proteiineista, IGSF22 ja TCOF1, erosivat vain kaksi jäämiä kohdennettuja SSX2 epitoopin. Lisäksi, peptidit, jotka ovat peräisin SYT14 ja TCOF1 ennustettiin olevan vahva ja heikko HLA-A2-sideaineet, vastaavasti (kuvio 3B). Analysoimme tunnustamista näiden nonameeri peptidien TCR-5 yhteisviljelmä kokeita käyttäen peptidilisätty T2-soluja. Kuten kuvassa 3B, IFNy vapautumisen aiheuttama SSX2

41-49 peptidi oli kaksi-neljä kertaluokkaa parempi kuin aiheuttama homologisten peptidien vahvistaa spesifisyyttä TCR-5.

kodonioptimointi ja murinization TCR-5

seuraavan arvioidaan, onko optimointi kodonin käyttö koodaavan sekvenssin TCR-5 ja /tai käyttö ihmisen ja hiiren hybridi TCR: ien voisi parantaa TCR-5 ilmentymisen ja /tai biologisen aktiivisuuden . cDNA, joka koodaa samaa aminohapposekvenssiä kuin TCR-5, mutta jossa on nukleotidisekvenssi, joka on optimoitu kodonien käyttö ihmisillä syntetisoitiin ja kloonattiin pMSGV1 tuottamiseen retrovirusvektoreita. Vastaavasti, kodoni-optimoitu versio TCR-5, joissa TCR vakioalueet korvattiin vakioalueen hiiren TCR [23] syntetisoitiin ja kloonattiin pMSGV1. Kolme versiota TCR-5 (WT, kodonioptimoitu ja kodonioptimoidun + hiiren muuttumattoman alueen, kuvio 4A) oli seuraava verrattuna niiden ilmaisun ja kyky tunnistaa antigeeni ja välittävät solujen hajoamista.

A) Kaavamainen esitys kolmen konstruktien tuotettu ekspression TCR-5 ja johdannaiset. LTR: pitkä terminaalinen toisto, sd: silmukointidonori, sa: akseptorisilmukointikohtien, ψ: retrovirus kapselointisignaalin, MC: hiiri TCR vakioalue, 2A: kytkijäpeptidiä. B) ekspression analysointi TCR-5 vaihtoehtoja tetrameerivärjäyksellä. OKT3-stimuloitujen lymfosyyttien transdusoitiin kahdesti vastaava TCR-ilmentävällä vektorilla ja värjättiin anti-CD3, anti-CD8- ja SSX2

41-49 tetrameerejä viikon kuluttua transduktion. Edustaja Tulokset kolmesta riippumattomasta kokeesta. Suluissa olevat arvot edustavat keskiarvoa fluoresenssin voimakkuuden tetrameerivärjäyksellä sisällä CD8 T-solujen populaation. C)

51Cr-release assay arvioimiseksi antigeenispesifisten sytolyysi aiheuttama TCR-5-transdusoituja lymfosyyttejä jälkeen neljän tunnin yhteisviljelmä, jossa on valittu kohdesoluissa. Prosenttiosuus lysis kuvattu kunkin kohdesolulinjana eri efektori: kohde-suhteilla on keskiarvo kaksoiskappaleet edustavassa kokeessa kolmesta itsenäisestä kokeesta. UT: trandusoidun T-soluja käytetään negatiivisena kontrollina epäspesifisen lyysi, WT: Villityypin TCR, Co Op: copon-optimoitu TCR, MCR: kodonioptimoitu TCR hiiren vakioalueen.

Kun retroviruksen transduktio OKT3-stimuloitujen ihmisen lymfosyyteissä, tetrameerivärjäyksellä käytettiin arvioimaan ilmentymisen kolmen konstrukteja. Kuten kuviossa 4 B, kodonioptimointi lisääntynyt tiheys kalvon ilmentymisen TCR CD8-T-solujen on osoituksena lisääntynyt fluoresenssin keskimääräinen intensiteetti (MFI) SSX2

41-49 tetrameerivärjäyksellä soluissa transdusoitu kodonioptimoidun TCR-5 (910 fluoresenssiyksiköt), verrattuna transdusoitu villityypin versio (656 fluoresenssiyksiköt). Kuitenkin käyttö hiiren vakioalueen lisäksi kodonien optimoinnin vain vähän lisääntynyt tetrameerin sitoutumisen TCR (949 fluoresenssiyksiköt). Biologinen aktiivisuus TCR: t testattiin yhteisviljelmä kokeissa, joissa TCR-transdusoidut lymfosyytit altistuvat useille HLA-A * 0201-positiivisia kohdesoluja, jotka olivat positiivisia SSX2 (Cos-A2-SSX2, 293-A2-SSX2, K562- A2, 624, 938-A2 ja U251). Pitoisuus IFNg supernatanteissa mitattiin ELISA: lla yön yli yhteisviljelmä, ja tulokset on esitetty taulukossa 2. Lymfosyytit transdusoitu kodoni-optimoitu versio TCR-5 erittyy, keskimäärin 30% enemmän IFNy kuin transdusoitu villityypin TCR. Läsnä hiiren TCR vakioalueen myös lisääntynyt IFNy eritystä verrattuna villityypin TCR, mutta tämä muutos ei lisätä IFNy eritystä kodonioptimoidun variantti (taulukko 2). Kolme konstruktioita näytetään samanlaisia ​​ominaisuuksia kannalta induktion antigeenispesifisten T-solujen lisääntymistä in tymidiininotto määrityksissä (kuvio S1A), T-solujen aktivaation yhteydessä antigeenitunnistuksessa (osoituksena säätely ylöspäin aktivoinnin merkki CD137, kuva S1B) ja interleukiini -2 (IL-2) tuotantoon (kuvio S1C).

induktio solulyysi ilmentävien kasvainsolujen SSX2

kyky kunkin variantin TCR-5 indusoimiseksi antigeeniä tiettyyn soluun kasvainsolujen lyysin tavoitteiden ihmisen lymfosyyttien määritettiin käyttäen kromin vapautumisen määrityksellä. Kromi (

51Cr) -leimattua 938, 938-A2, Cos-A2, Cos-A2-SSX2, 624, SKmel37 ja 888-soluja viljeltiin yhdessä ihmisen perifeerisen veren T-solut transdusoitiin villin tyypin TCR-5 tai sen kodoni optimoitu tai kodonioptimoiduista murinized variantit, eri efektori: kohde-suhteilla. Trandusoidun T-soluja käytettiin negatiivisena kontrollina. Kuten kuvassa 4 C, lymfosyytit transdusoitu jommankumman SSX2

41-49-spesifinen TCR: ien aiheuttama voimakas sytolyyttisen vaikutuksen 938-A2-solujen mutta ei 938-soluissa, mikä osoittaa, että lyysi on HLA-A * 0201-rajoitettu. Lisäksi, Cos-A2-SSX2 solut hajotettiin TCR-5-ilmentäviä soluja, mutta ei Cos-A2, joka ei ole ilmentyminen SSX2, mikä osoittaa, että tämä vaikutus on antigeeni-spesifinen. Vastaavasti, 624 ja SKmel37 soluja, jotka ovat HLA-A * 0201-positiivisia, ja luonnollisesti ilmaista SSX2, hajotettiin lymfosyyttien transdusoitu joko TCR-5 muunnos, kun taas HLA-A * 0201-negatiivinen 888 solut eivät. Yhdessä nämä tulokset vahvistavat, että TCR-5-peräisiä konstrukteja ovat biologisesti funktionaalisia ihmisen perifeerisen veren T-soluja, ja että niitä voidaan käyttää ohjaamaan niiden antigeenispesifisyyden SSX2, on HLA-A * 0201-spesifisellä tavalla. Kumpikaan kodonioptimointi tai murinization ja TCR: ien ollut vaikutusta TCR-5-lyysin.

kehittäminen ja testaus kliinisen laadun retrovirusvektorisupernatanttien

Koska kasvaimen selektiivisen kuvio ilmentymisen SSX2 ja voimakas, mutta selektiivinen antigeenin tunnista- ominaisuudet TCR-5, päätimme valmistaa ja testata kliinisissä-luokan retrovirusvektoreiden sopivia ilmentämiseen TCR-5 perifeerisen veren T-solujen syöpäpotilailla. Stabiileja line vahvistettiin transduktio PG13 solujen retrovirusvektorilla koodaavan kodonin-optimoitu versio TCR-5. Kahden transductions, PG13 solut kloonattiin rajoittavalla laimennuksella ja kloonit testattiin virus-RNA: n ekspression dot-plot (ei esitetty). Kuusi kloonia, jotka ilmentävät korkeimmat vektori-RNA (A8, A10, C3, D8, F2 ja H2) monistettiin ja supernatantit testattiin niiden kyky indusoida TCR ilmentymisen OKT3–stimuloitujen PBL: ien kolmesta eri luovuttajilta. Tetrameerivärjäyksellä Transdusoitujen T-solujen paljasti, että supernatantit kuudesta kloonista välittämän tehokkaan transduktion lymfosyyttien (kuvio 5 A).