Krooninen sairaus

tiivistelmä

Yleiset aktivointi hypoksian indusoituva tekijä (HIF) väyliä on klassisesti liittyy haitallisia ennusteeseen syöpää ja on ehdotettu edistää kasvaimia ajaa. Selvänä cell munuaissyöpä (CCRC) HIF reitit voimistunut inaktivoimalla von-Hippel-Lindaun kasvain vaimennin. Kuitenkin HIF-1α ja HIF-2α on erottuvan vaikutuksia kokeellisen kasvaimen etenemiseen. Jotta voitaisiin paremmin ymmärtää tämä paradoksi tutkimme yleiseurooppalaisen genomista malleja HIF DNA: ta sitovaa ja liittyy geeniekspression vastauksena manipulointi HIF-1α ja HIF-2α ja liittyvät havainnoista CCRC ennustetta. Meidän havainnot paljastavat erillisiä yleiseurooppalaisen gemonin kanoninen ja ei-kanoninen HIF isoformi-spesifisen DNA sitoutumisesta tuhansia sivustoja. Kaiken yhdistysten välillä ei havaittu HIF-1α-spesifinen sitoutuminen, ja geenit liittyvät suotuisat ennustetta ja välillä HIF-2α-spesifisen sitoutumisen ja haitallisia ennustetta. Kuitenkin jokaisessa isoentsyymiselektiivisiä määritettyjen yksittäisten geeni yhteydet olivat heterogeenisiä merkki ja suuruus, mikä viittaa siihen, että aktivointi kunkin HIF-α-isoformi vaikuttaa erittäin monimutkainen yhdistelmä pro- ja antituumorigeenistä vaikutuksia.

Citation: Salama R, Masson N, Simpson P, Sciesielski LK, Sun M, Tian yM, et al. (2015) heterogeeninen vaikutukset Suora Hypoksia Pathway Aktivointi munuaissyöpä. PLoS ONE 10 (8): e0134645. doi: 10,1371 /journal.pone.0134645

Editor: Jörn Karhausen, Duke University Medical Center, Yhdysvallat |

vastaanotettu: toukokuu 27, 2015; Hyväksytty: 10. heinäkuuta 2015 Julkaistu: 11 elokuu 2015

Copyright: © 2015 Salama et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: Data ollut talletettiin NCBI Gene Expression Omnibus tietokanta (GSE67237, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE67237).

Rahoitus: Tätä työtä tukivat jonka Cancer Research UK (lupanumeroon A16016) RS, NM ja DRM, Ludwig Institute for Cancer Research on PJR ja MS, Korkeakoulujen rahoitus neuvosto Englannin DRM, Wellcome Trust (lupanumeroita 078333 /Z /05 /Z, WT091857MA) ja PJR, YMT ja PS, ja Saksan tutkimussäätiön (lupanumeroon SC132 /2-1) ja LKS. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

hypoksia liittyy vahvasti haitallisia ennusteeseen syövän ja hypoksia signalointireitteihin yleisesti aktivoidaan syövän kehityksen [1-4]. Tästä ovat esimerkkinä kirkas solu munuaissyövän (CCRC), jossa inaktivointi von Hippel-Lindaun tuumorisuppressorigeeni (pVHL) on yleinen ja varhainen tapahtuma [5-7]. pVHL on tunnustus komponentti E3 ubikitiinipromoottori ligaasilla monimutkaisia, että tavoitteet hypoksian indusoima tekijä (HIF) α-alayksiköiden varten hajoamista ubikitiinipromoottori-proteasomin koulutusjakson, ja inaktivointi pVHL johtaa konstitutiivisen aktivoitumisen HIF transkription polku [8]. HIF transkription tavoitteita ovat monet toiminnot yhdistävät yhteiset ilmiasun syöpä (esim tehostettu angiogeneesi, säädeltyyn energia-aineenvaihduntaan, lisääntynyt solun liikkuvuus), ja se on yleisesti oletettu, että oncogenesis ohjaa paljolti yhdistäminen myönteisiä vaikutuksia HIF aktivoinnin Tällaisissa prosesseissa.

transkription aktivaatio HIF välittyy pääasiassa sitoutumalla HIF α /β-heterodimeerien ydin konsensussekvenssin (RCGTG) hypoksia vaste-elementit (hRes) [9]. Vaikka kaksi parhaiten tunnettu HIF-α alayksiköistä, HIF-1α ja HIF-2α, ilmeisen samanlainen domain arkkitehtuuria, ja erottamattomat DNA-sitovan sekvenssit [10], he transaktivoimaan erillisiä tavoitteita ja näyttää erottuvan tuumorigeenisia roolit [11,12]. Yllättäen vahva lisäävä säätely HIF seuraavan inaktivoitumisen VHL vuonna CCRC liittyy epätavallinen bias HIF isoformin ilmentyminen, kohti HIF-2α [13]. Useita rivejä tutkimuksen osoittavat, että tämä on toiminnallisesti tärkeää kehitettäessä CCRC. Genome-laajuinen yhdistys tutkimukset tunnistettu polymorfisia variantteja, jotka vaikuttavat alttiuteen CCRC klo HIF-2α, mutta ei HIF-1α, lokus ja lokusten sisällä HIF-2α transkription polku [14]. Kääntäen, HIF-1α geeni annostus on yleisesti pienenee CCRC menetys kromosomissa 14 q [15], ja HIF-1α-geenin, mutta ei HIF-2α-geeni, sovelletaan pieni mutta merkittävä ylimäärä inaktivoivat mutaatiot [16] . Lisäksi HIF-2α mutta ei HIF-1α, voivat yli-ratsastaa kasvain suppressoriaktiivisuutta pVHL kokeellisissa kasvainten [17,18]. Erityisesti uudelleen ilmentäminen HIF-1α in CCRC linjat, joilta puuttuu villin tyypin HIF-1α hidastaa kasvua, kun taas yli-ilmentyminen HIF-2α kiihdyttää kasvua tuumoriksenografteja [11,15].

Nämä havainnot haastavat paradigma, että yleinen aktivoituminen HIF signalointi asemien oncogenesis aktivoitumisen kautta pieni määrä erillisiä transkription tavoitteita, ja ehdottaa monimutkaisempi liitännän. Esimerkiksi yleiseurooppalaisen genomista analyysit paljastivat satoja tuhansia suoraan HIF transkription tavoitteet [10,19-22]. Koska HIF-1α ja HIF-2α saattavat kilpailla sitoutumisesta HIF-1β tai täyttöaste hRes, tai ne voivat sitoa erillistä sarjaa transkription tavoitteita, on epäselvää, miten isoformispesifisiä manipulointi HIF-α vaikutukset transkription kuviot liittyvän kanssa CCRC.

tämän tutkimiseksi suoritimme yksityiskohtainen chip kohdat ja RNA-seq analyysi HIF-α isoformi sitoutumiskohta käyttöasteen ja geenien ilmentymistä pVHL-viallisen CCRC 786-0 solulinja, seuraava uudelleen ilme HIF-1α tai yliekspressio HIF-2α, ja niihin liittyvät näiden havaintojen ennusteen niihin liittyvien kuvioiden geenin ilmentymisen ihmisen CCRC kasvaimissa [6]. Meidän havainnot paljastavat lukuisia erillisiä isoentsyymiselektiivisiä erityinen HIF-α sitoutumiskohtia jotka ilmenevät isoformi-erityisiä genomista arkkitehtuuri, aktivoi erilliset kuviot geenin ilmentymisen ja yhdistää vastakkaisia ​​ennustetekijöiden geeniekspressiomalleja kliinisissä CCRC. Vaikka selkeä yleinen yhdistysten välillä ei havaittu HIF-1α liittyvien geenien ja hyvää kliinistä ennustetta ja välillä HIF-2α liittyvien geenien ja huono kliininen ennuste, tämä kahtiajako oli epätäydellinen. Tasolla yksittäisten geenien, vaikutukset olivat epäyhtenäinen sekä allekirjoittaa ja vaikutuksen suuruudesta, mikä viittaa siihen, että myös tässä määritellyn yhteydessä, kukin HIF-α-isoformi on potentiaalisesti sekä pro- ja antituumorigeenistä vaikutuksia.

Materiaalit ja menetelmät

Laboratoriomenetelmät

Cell Culture.

786-O ja HEK293T solut hankittiin ATCC (https://www.lgcstandards-atcc.org) ja kasvanut Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine, johon oli lisätty 10% vasikan sikiön seerumia, 2 mM L-glutamiinia, 100 U penisilliiniä ja streptomysiiniä 50 U /ml (tilavuus /tilavuus) (Sigma-Aldrich).

valmistus 786-0 HIF -1α /HIF-2α-soluissa.

HIF-1α ja HIF-2α-cDNA-sekvenssien [11] kloonattiin ensin pRRL.IRES.EGFP (ystävällinen lahjoitus Kamil Kranc, Glasgow) tuottaa bisistroninen vektoreita. Sitten ne ko-transfektoitiin pCMV-dR8.2 ja PCMC-VSVG osaksi HEK293T-soluissa, ja tuloksena viruspartikkelit eristettiin sentrifugoimalla ja ultrasuodatuksella. 786-0-solut (ATCC) transdusoidaan sitten joko ohjaus (pRRL), HIF-1α (pRRL-HIF-1α) tai HIF-2α (pRRL-HIF-2α) ilmentävien virus.

ChIP-seq .

Single Chip-seuraavat analyysit suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [19]. Chromatin immunosaostettiin käyttämällä kanin polyklonaalisia antiseerumeja HIF-1α (PM14), HIF-2α (PM9) [23], HIF-1β (NB-100-110, Novus Biologicals, UK) tai pre-immuuni seerumi kontrollina.

PolyA + valitaan RNA-seq.

Yhteensä RNA valmistettiin kolmena kappaleena käyttäen Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion; Life Technologies Ltd, Paisley, UK) ja käsiteltiin DNaseI (TURBO DNA-ilmaiseksi, Ambion ). PolyA + RNA: ta kirjastoista valmistettiin sitten käyttäen ScriptSeq v2 RNA-Seq kit (Epicentre, Madison, WI, USA).

Suurikapasiteettinen sekvensointi.

Kaikki kirjastot valmistettiin Illumina protokollien ja sekvensoitu on HiSeq 2000 alusta (Illumina, San Diego, CA, USA).

Liittyminen koodeja.

ChIP-kohdat ja RNA-seq tietoja on saatavissa Gene Expression Omnibus (GSE67237).

bioinformatiikka- analyysi chip-seuraavissa data

Initial Analysis.

Illumina adapteri sekvenssit leikattiin käyttäen Trimgalore (0.3.3) ja lukee linjattu Genome Reference Consortium GRCh37 ( hg19) käyttämällä BWA (0.7.5a-R405). Heikkolaatuinen kartoitus poistettiin (MapQ 15) avulla SAMtools (0.1.19) [24] ja lukee kartoitus Duke Encode mustan listan alueista (https://hgwdev.cse.ucsc.edu/cgi-bin/hgFileUi?db = hg19 g = wgEncodeMapability) jätettiin käyttäen BEDTools (2.17.0) [25]. Monista lukee oli merkitty syrjäytymiseen Picard työkalujen (1,106) (https://picard.sourceforge.net/). Lue tiheydet olivat normalisoituneet ja ilmaistiin lukee kohti ke miljoonasosaa lukee (RPKM) [26]. Yksi miljoonaa satunnainen ei-päällekkäisiä alueita valittu KOODAAMISEEN DNaasi Cluster II piikit (https://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/encodeDCC/wgEncodeRegDnaseClustered/) käytettiin kontrollina.

Peak Calling .

chip seuraavat piikit tunnistettiin käyttäen T-PIC (Puu muoto Peak tunnistaminen siru-Seq) [27] ja MACS (malli perustuva analyysi ChIP-Seq) [28] ohjaustilassa. Peaks havaita molemmat huippu soittajat suodatettiin kvantitatiivisesti käyttämällä yhteen laskettu alle piikin sisältämään vain piikit, jotka olivat yli 99.99th prosenttipiste satunnainen taustan alueita valitaan ENCODE DNaasi ll klusteri (p-arvo 0,0001).

De novo Motif Analysis.

reunustavat sekvenssit kunkin peak huippukokouksessa (± 150bp) oli toista-naamioitu käyttämällä RepeatMasker 4.0.3 (https://www.repeatmasker.org). De-novo motiiveja tunnistettiin käyttäen Meme-chip (4.9.1) [29] ja Hyväksytty, TomTom moduulia, tunnettuihin transkriptiotekijän motiiveja 2009 Jaspar ydin tietokantaan [30].

pääkomponenttianalyysiin (PCA).

Sitoutumiskohdat kaikki alayksiköt sisältyvät PCA yhdistettiin yhdeksi sitova sarja. PCA tehtiin käyttämällä singulaariarvohajotelma (Prcomp, R 3.1.1 -stats kirjasto, https://cran.r-project.org) sekä yksittäisille sitoutumiskohtia ja kokonaisuudessaan siru-seq signaali kullekin alayksikköä. Biplots kertyi R.

Heat karttoja.

sitoutumiskohta lämpö kartat luotiin käyttäen Ngsplot (2,08) [31] kanssa parametrit: FL = 50, M = 5, RZ = 1 , SC = 0-1, MQ = 15.

motiivi todennäköisyys.

Jokaisessa HIF-α sitova alue (huippukokous ± 150bp) skannattiin HRE (Jaspar /MA0259.1) ja AP-1 (Jaspar /MA0491.1) sitovat motiivit käyttäen asentoon paino matriisit (pulssinleveysmodulaattorit) noudetaan 2009 Jaspar Core tietokantaan [30]. Normalisoitu todennäköisyys suhde (NLR) kunkin motiivi on laskettu yhtälön 1 enimmäispituus normalisoitu todennäköisyys suhde kutakin sitova alue on raportoitu sekä HRE ja AP-1-motiivi kuten on annettu yhtälössä 2.

yhtälön (1) yhtälö (2)

Missä

j

on asema huippu,

i

on asema aihe,

L

on pituus motiivin,

PWM (b

,

i) b on PWM arvo

i

vastaavan pohjan

b

,

b (b)

on taustalla paino vastaavan pohja laskettuna yli miljoona satunnainen DNAse sivustoja ja

W

on piikin leveys.

bioinformatiikka- analyysi RNA-seq data

Initial Analysis.

Adapter sekvenssit leikattiin kuten edellä. Lukee sitten linjassa GRCh37 käyttäen Tophat 2.0.8b (https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml) ja smokkirusetti 1.0.0 (https://bowtie-bio.sourceforge.net/index. shtml) ja ei-ainutlaatuisesti kartoitus fragmenttien ulkopuolelle käyttämällä SAMtools (0.1.19) [24]. Yhteensä lukea laskee kullekin UCSC määritelty geeni uutettiin käyttäen HTSeq (0.5.4p3) [32] kanssa ”risteys-tiukka” -tilassa ja merkittävästi geenien tunnistettiin käyttämällä DESeq2 (vrt. [33]).

Gene Aseta Enrichment Analysis (GSEA).

GSEA rikastamiseen analyysiä käytettiin 10000 permutaatioista, painotettu rikastamiseen pisteet ja pre-ranking geenien [34]. Molemmat differentiaalikaavojen merkitys mukaan DESeq2 ja taita-ero kaksi ehtoa käytettiin listalla geenejä [35] (Eq 3).

Yhtälö 3

Jos φ

i on log2 kertamuutosta ja

pv

i

on p-arvo geenin

i

.

Cancer Genome Atlas (TCGA) GSEA.

Kliininen ja RNA-seq V2 tiedot Munuaiset Munuaisten Clear cell carcinoma (KIRC) potilasta (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/) [6] koottiin. Potilaat, joilla puuttuvat kliiniset tiedot tai useita RNA-seq aineistot jätettiin pois. Normalisoitu mRNA lasketaan käytettiin säädetty. Potilaat jaettiin kahteen ryhmään käyttäen ennustetyövälineenä pisteet, lisäämällä 1 jokaiselle; ikä yli 60, patologinen vaiheessa 3 tai 4, läsnäolo etäpesäkkeitä, tai potilaan kuolleen. Hyvää ennustetta potilaille sai 0 tai 1 ja huono ennuste potilasta sai 2, 3 tai 4. ero ilmentyminen kunkin geenin välissä potilasryhmien arvionsa uskottavuusosamäärä negatiivisten binomiselle asennetaan malleja käyttäen glm.nb R (3.1.1 ). Geenit rankattiin varten GSEA perustuvan yhdistetyn merkityksestä ja taita-muutoksen edellä.

Disease Lisäykset.

Sitovat sivusto rikastaminen laskettiin -log10 että binomisen testi FDR (q-arvo) by SUURI (genomialuetta rikastaminen Annotations Tool [36]) 2.0.2. Syöpä alatyyppejä ilman rikastamiseen joko chip seuraavissa aineisto poistettiin.

Sidonta Gene Predictor.

Geenit 10-kb sivustoja, joilla on vähintään 3-kertainen ero HIF-1α ja HIF -2α sitoutuminen valittiin suunnitella geeniin ennustaja käyttää Ohjattu pääkomponenttianalyysi (SPCA) [37,38]. Ensinnäkin, HIF-sitova geenit osoittavat yhden muuttujan merkitys (p 0,05) ennustaa potilaan ennusteeseen (Coxin suhteellinen vaara malli) valittiin. Kunkin sarjan geenejä (näiden sitovien uudelleen käyttöön HIF-1α tai yli-ilmentyy HIF-2α) singulaariarvohajotelma (SVD) kaikissa TCGA potilasta, siirtää geeni painot [37,38]. Kukin geeni ennustaja validoitiin käyttäen ”jätä-yksi-out” ristivalidointi, työllistää 414 potilasta kerrallaan tuottaa geenin ennustaja ja sitten ennustaa selviytymisen kunkin vasemman-out potilaalle. Lopullinen merkitys ja riskisuhde potilaan riski ennustaja arvioitiin samanlainen yhden muuttujan analyysiin,.

Tulokset

Ensinnäkin määritellä HIF isoformispesifisiä toimintoja, jotka liittyvät vastakkaisia ​​vaikutuksia kasvuun CCRC -johdannainen VHL-vialliset 786-0 soluja, altaat soluja viruksia ilmentävät tyhjän vektorin (VA), villityypin HIF-1α, tai villityypin HIF-2α, ja pan-genomista malleja HIF-sitovia ja geeni ilmentyminen analysoitiin chip kohdat ja RNA-seq. HIF-1α ja HIF-2α infektioiden aikaan suunnilleen yhtä mRNA, jotka olivat noin 10 kertaa suurempi kuin endogeeniset HIF-2α mRNA tasolla (S1A kuvio). Samoin, HIF-2α-proteiinin tasot olivat suunnilleen 8 kertaa suurempi HIF-2α infektoiduissa soluissa kuin kontrolliryhmässä soluissa, kun taas HIF-1α-proteiinin tasot olivat 15-20-kertaa korkeampi HIF-1α infektoiduissa soluissa kuin toisessa CCRC solussa line (RCC4), joka ilmentää täyspitkää HIF-1α (S1B kuvio). Kontrollisoluissa, yhteensä 1719 huiput sitoutumisen endogeeniseen HIF-2α tunnistettiin. Kuten odotettua, nämä sivustot näyttää korkeatasoinen yhteensopivuutta HIF-1β signaali, sopusoinnussa sitoutumisen HIF-2α /1β heterodimeerin (S2 Kuva).

RNA-seq-analyysi vahvisti aiempia havaintoja [15] että vaikka 786-0 solut eivät ilmennä villityypin HIF-1α, ne ilmentävät useita katkaistun ja /tai fuusio selostukset kattaa HIF-1α eksonit 1-9, mutta ei distaalisemmissa sekvenssit (S3 kuvassa), ja ennustetaan kykene koodaavan kopioinnin suhteen aktiivisia HIF-1α. Re-ilmentyminen täyspitkän villityyppisen HIF-1α in 786-0 soluissa on negatiivinen vaikutus kasvuun kuin kasvaimen hiirissä. Siksi aloitettiin tarkastelemalla pan-genomista kuviot DNA sitoo HIF-1α, HIF-1β ja HIF-2α tällaisissa soluissa, ja verrannut niitä ohjaus 786-0 soluihin.

Re-ilmentymä HIF- 1α ei antagonisoivat HIF-2α sitova

Koska HIF-1α ja HIF-2α molemmat dimerisoimaan kanssa HIF-1β, ja tunnistaa samanlainen konsensus DNA-sekvenssi, mutta ovat vastakkaiset vaikutukset -tuumoriksenografti kasvun 786-0, me ensin huomioon mahdollisuutta, että uudelleen ilmaistu HIF-1α saattaa antagonisoida HIF-2α DNA-sitova, joko suoraa kilpailua sitoutumiskohdista tai kilpailun HIF-1β. Hieman yllättäen genominlaajuisia analyysi paljasti, että HIF-2α sitoutuminen vaikutti vähän uudelleen ilmentäminen HIF-1α (kuvio 1A, vertaa i ja iii). Tämän mukaisesti, pääkomponenttianalyysi (PCA) ja HIF-2α sitoutumisen HIF-1α re ilmentävien solujen osoittanut voimakasta yhteistyötä ristiriidassa HIF-2α sitoutumisen ohjaus soluissa (kuvio 1 B, vertaa vektoreita HIF-2α (VA) ja HIF -2α (1αRE)). Nämä analyysit viittaavat siihen, että HIF-2α sitova paljolti riippumattoman HIF-1α uudelleen ilme. Testata tätä enemmän määrällisesti vertasimme suhteellinen vahvuus HIF-2 sitovat signaaleja HIF-1α uudelleen ilmentävät, versus kontrolli solujen poikki 1719 endogeeninen HIF-2α sitoutumiskohdat tunnistettiin valvonnassa soluissa. Tämä analyysi paljasti tiivis korrelaatio keskitetty oman pääoman sitoutumisen kahdessa solulinjassa, sekä HIF-2α sitovia ja HIF-1β sitova (S4 kuvio). Niinpä näissä olosuhteissa, HIF-1α uudelleen ilmaisua ei näytä globaalisti antagonisoida HIF-2α häiritsemällä HIF-2α sitova, joko suoraa kilpailua sitoutumiskohdista, tai kilpailevien HIF-1 p pois HIF-2α.

(A) HIF-1α sitoutumiskohdat HIF-1α uudelleen ilmentäviä soluja tunnistettiin huippu kutsuvan ja sijoittui pystyakselin mukaan signaalin voimakkuuden. Lämpöä karttoja näistä alueista (± 5 kb on vaaka-akseli) osoittaa ChIP-seuraavissa lukea tiheys ilmoitettu HIF alayksiköt tuotettiin sekä kontrollisolujen (i, ii) ja HIF-1α uudelleen ilmentäviä soluja HIF-1α uudelleen käyttöön (iii-v). Rakenteessa HIF-2α sitoutuminen minimaalisesti vaikuttaa uudelleen ilmentyminen täyspitkän HIF-1α (vertaa i ja iii). Sites sitova uudelleen ilmaistaan ​​HIF-1α ovat pitkälti yhdessä käytössä HIF-1β (vertaa iv ja v). (B) Biplot osoittaa Principal Component Analysis (PCA) chip-seq signaalin voimakkuuden (RPKM arvot) sekä yksittäisille sitoutumiskohtien (pisteet) ja HIF-alayksiköt (vektorit) kaikissa HIF-sitoutumiskohdat tunnistettiin kontrolli soluissa ja HIF- 1α uudelleen ilmentäviä soluja. Sites sitovan endogeenisen HIF-2α kontrollisoluissa näkyvät sinisenä sivustot sitova uudelleen ilmaistaan ​​HIF-1α näkyvät punaisina, sivustot sitovat molemmat ovat värillisiä violetti ja loput alueista esitetään harmaalla. PCA kutakin alayksikköä osoittaa korkea yhteistyötä vaihtelut HIF-2α sitova kontrolliryhmässä soluissa ja HIF-1α uudelleen ilmentävien solujen (vertaa HIF2α (VA) ja (HIF2α (1αRE)). Tämä osoittaa vain vähäisiä muutoksia HIF -2α sitova seurauksena HIF-1α uudelleen ilme. Kääntäen, HIF-1β vektori muuttuu dramaattisesti HIF-1α uudelleen ilmentymisen (vertaa HIF1β (VA), jossa HIF1β (1αRE)) ja kohdistuu tarkasti vektori uudelleen ilmaisi HIF-1α (HIF1α (1αRE)). yksittäiset sitoutumiskohdat ohjaus- ja HIF-1α re ilmentävien solujen (siniset ja punaiset pisteet) linjassa tiiviisti niiden PCA vektoreita. (C) Histogrammi etäisyydestä lähin transkription aloituskohdasta (TSS) ja HIF-1α sitoutumiskohtia soluissa uudelleen ilmentävät HIF-1α. (D) HIF-1α sitoutumiskohdat uudelleen ilmentävät solut luokiteltiin luokan (Ensemble) lähimmän geenin. suhteellinen tiheys kussakin luokassa näytetään ympyräkaavio. (E) Gene setti rikastamiseen analyysi (GSEA) varten joukon geenejä lähimpänä HIF-1α sitoutumiskohtia, kun geenit on luokiteltu kertamuutosta ja merkitystä mRNA ilmaisun seuraavissa re -ilmaisu HIF-1α (vaaka-akseli).

Laaja sitoutuminen uudelleen ilmaisi HIF-1α ovat uudet toiminnalliset sivustoja

toisin kuin rajallisia vaikutuksia nykyisiin HIF-2 sitovat uudelleen ilmentäminen HIF-1α johti laajoihin uusia sitovia koko genomin, jossa on erityinen HIF-1α signaali tunnistaa 5147 sivustoja. Merkitty korrelaatiota ei havaittu HIF-1α ja HIF-1β sitoutumisen näihin HIF-1α uudelleen ilmentäviä soluja (kuvio 1A, vertaa iv ja v). Pitäen mielessä, PCA vahvisti vahvan covariance välillä HIF-1α ja HIF-1β in HIF-1α uudelleen ilmentävien solujen osoittaa, että nämä sivustot ovat pitkälti eroavat sitovan endogeenisen HIF-2α (kuvio 1 B, vertaa vektoreita HIF-1α ( 1αRE) ja HIF-1β (1αRE) ja toisin HIF-2α (VA) ja HIF-1β (VA)). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että sen jälkeen uudelleen ilmentyminen HIF-1α sitoutuu useita sivustoja erillisiä endogeenisen HIF-2α sivustot, todennäköisesti koska HIF-1α /HIF-1β heterodimeeri. Lisäksi koko HIF-1β chromatin immunosaostus signaali (lukumäärä lukee kartoituksen huippuun alueita) kasvoi noin 2-3-kertaiseksi seuraavien uudelleen ilmentymisen HIF-1α (katso myös S5 kuvassa). Tämä viittaa siihen, että HIF-1β proteiinin runsauden ei rajoittava endogeenisen HIF sitoutumisen VHL-viallisia 786-0 soluja, ja että lisää HIF-1β voidaan palvelukseen DNA sitoutumiskohtiin seuraavat voimistunutta ilmentymistä dimerointifunktiosta kumppanin.

analyysi HIF-1α sitova osoitti, että sen yleiseurooppalainen genomijakauman oli silmiinpistävän ei-satunnainen, on vahvasti rikastettu lähellä tietyn tyyppisille geenin promoottorin (kuvio 1 C ja 1 D) ja muistuttavista HIF-1α-erityisiä malleja sitoutumisen muissa solutyypit [10,20,22,39]. Merkinnästä HIF-1α ”lähimmän naapurin” promoottorit, mukaan transkriptio luokan, paljasti, että 68% liittyy proteiinia koodaavan geenien, ja loput pitkälti liittyvät pitkän ei-koodaavat RNA: t (lncRNAs) ja antisense-RNA: ita (kuvio 1D ); mittasuhteet, jotka ovat samanlaisia, joita on raportoitu HIF-1α MCF7 rintasyöpäsoluissa [39].

vieressä tarkoituksena on määritellä funktionaalisia vaikutuksia tämän uuden HIF-1α sitovan geenien ilmentymisen. Pan-genomista geeniekspressio profiloitu ohjaus ja HIF-1α re ilmentävien solujen RNA-seq. Geenit rankattiin mukaan yhdistelmän kertamuutosta transkriptipitoisuuksissa tasolla seuraavissa uudelleen ilmentymisen HIF-1α ja merkitystä tämän muutoksen [35]. Käyttämällä tätä sijoitusta, geeniperimä rikastus analyysi (GSEA) [34] lähimmän geenin kullekin HIF-1α sitoutumiskohta osoitti erittäin merkitsevä (p 0,001) assosiaatio HIF-1α sitova ja positiivinen, mutta ei negatiivinen, sääntely näistä selostukset (kuvio 1 E). Tämä vastaa aikaisempia havaintoja, HIF toimii pääasiassa niin transkriptioaktivaattorina [10,19]. Se osoittaa myös, että uuden HIF-1α sitoutuminen on toimiva, ja sillä on suoria ja enimmäkseen myönteisiä vaikutuksia ilme suurelle määrällä geenejä.

Sen sijaan havaitsimme muutamia vaikutuksia HIF-1α uudelleen ilme transkriptio tasot (lähimmän naapurin) HIF-2α sitovia geenejä. GSEA osoitti positiivista, mutta ei-merkitsevä (p = 0,15) vaikutus HIF-1α uudelleen ilme ilmentymä HIF-2α sitova geenit (S6 kuvio), oletettavasti suorasta vaikutuksesta HIF-1α sitoutuminen joitakin näistä sivustoja (kuvio 3C). Mikä tärkeintä, ei ollut näyttöä laajamittainen alas-säätely HIF-2α sitova geenit (eli ei rikastuminen HIF-2α sitova geenien joukossa vaimentua geenejä) seurauksena HIF-1α uudelleen ilmentymisen 786-O-solut. Tämä vahvistaa havainto, että uudelleen ilmaistu HIF-1α ei merkittävästi antagonisoivat HIF-2α leviämisestä koko genomin.

yli-ilmentyminen HIF-2a edelleen aktivoi endogeenisiä tavoitteet

Koska yliekspressio HIF- 2α in 786-O-solut on päinvastainen vaikutus -tuumoriksenografti kasvuun uudelleen ilmentymisen villityypin HIF-1α [11], tutkimme seuraavaksi lisäävät HIF-2α tasot HIF sitova ja geenien ilmentymistä. Ensin pyrittiin erottamaan onko sitoutuminen HIF-2α in VHL viallinen 786-O-solut on tyydyttynyt tai onko yliekspressio HIF-2α lisäisi sitova sivustoja, jotka ovat jo käytössä hallinnassa soluissa. Tämän testaamiseksi me korreloivat vahvuus HIF-2α sitovia signaaleja soluissa yli-ilmentävät transfektoiduissa HIF-2α kanssa valvonnassa soluissa. Tämä paljasti lisää sekä HIF-2α signaaleja ja HIF-1β signaalien suurimman endogeenisen HIF-2α sitoutumiskohtia seuraavat HIF-2α yliekspressio (S7 kuvio), joka ilmaisee, että endogeeniset tasot HIF-2α in 786-0 solut eivät ole riittäviä täysin ladata nämä HIF-2α sitoutumiskohtiin.

Laaja kaanoniin sitoutuminen yli-ilmentynyt HIF-2α

Yllättävää kuitenkin yleiseurooppalainen genominen analyysi paljasti yhteensä 5283 diskreetti HIF-2α sitoutumiskohtia että 786-0 soluissa yli-ilmentävät HIF-2α. Nämä sivustot ovat monet näistä käytössä endogeenisen HIF-2α. Toisin kuin havainnot seuraavat uudelleen ilmentymisen HIF-1α, lämpö kartta analysointia HIF-2α ja HIF-1β sitova osoitti, että monet näistä paikoista ovat käytössä ainoastaan ​​HIF-2α, ilman HIF-1β (kuvio 2A, vertaa iii ja iv). Yhdenmukaisia ​​tämän, PCA-analyysi paljasti, että transfektoidut HIF-2α ja HIF-1β sitova yhteistyö vaihtelevat vähemmän laajasti soluissa yli-ilmentävät transfektoiduissa HIF-2α kuin kontrolliryhmässä soluissa (kuvio 2B).

(A) HIF- 2α sitoutumiskohdat HIF-2α yliekspressoivia solut tunnistettiin huippu kutsuvan ja sijoittui pystyakselin mukaan signaalin voimakkuuden. Lämpö karttoja näistä sivustoista (± 5kb on vaaka-akseli) osoittaa chip seuraavissa lukea tiheys varten ilmoitettu HIF alayksikköjä kertyi sekä ohjaus soluja (i, ii) ja solut HIF-2α yliekspressoitu (iii, iv). Toisin kuin uudelleen ilmaistaan ​​HIF-1α, yliekspressoituu HIF-2α sitoutuu suuri määrä osoittaa (vertaa i ja iii) ilman HIF-1β (vertaa III ja IV) ja on vain vähän vaikutusta jakautumiseen HIF-1β ( vertailla ii ja iv). (B) Biplot osoittaa Principal Component Analysis (PCA) chip-seq signaalin voimakkuuden (RPKM arvot) sekä yksittäisille sitoutumiskohtien (pisteet) ja HIF-alayksiköt (vektorit) kaikissa HIF-sitoutumiskohdat tunnistettiin kontrolli soluissa ja HIF- 2α yli-ilmentävät solut. Sites sitovan endogeenisen HIF-2α kontrollisoluissa näkyvät sinisenä sivustot sitova uudelleen ilmaistaan ​​HIF-1α näkyvät punaisina, sivustot sitovat molemmat ovat värillisiä violetti ja loput alueista ovat värillisiä harmaa. PCA for HIF alayksikköjen osoittaa, että HIF-2α ja HIF-1β yhteistyötä vaihtelevat tiiviimmin kontrolliryhmässä soluissa (vertaa HIF2α (VA) ja HIF1β (VA)) kuin yliekspressoivat soluissa (vertaa HIF2α (2αOE) ja HIF1β (2αOE) ). (C) Histogrammi etäisyyden lähimpään transkription aloituskohdasta (TSS) ja HIF-2α sitoutumiskohtia soluissa yli-ilmentävät HIF-2α. (D) HIF-2α sitoutumiskohdat HIF-2α yliekspressoivia soluja luokiteltiin luokan (Ensemble) lähimmän geenin. Suhteellinen tiheys kunkin luokan näkyy ympyräkaavio. Gene set rikastus analyysi (GSEA) varten joukon geenejä lähimpänä (E) HIF-2α sitoutumiskohtia kontrolliryhmässä soluissa ja (F) vastatunnistetun HIF-2α sitoutumiskohdat yli-ilmentävät solut, kun geenit on luokiteltu kansiosiirrossa muutos ja merkitys mRNA: n ilmentymisen seuraavissa yli-ilmentymisen HIF-2α (vaaka-akseli).

Kuten HIF-1α sitoutumisen uudelleen ilmentävien solujen jakautumista transfektoitujen HIF-2α sitovat kohdat oli silmiinpistävän non Yhdenmukaiset poikki genomin (kuvio 2C ja 2D). Mielenkiintoista, vaikka suuri kasvu sivustojen määrä ne sopeutui kuvio samanlainen kuin endogeenisen HIF-2α molemmissa (S8 kuvio) ja ei-CCRC (MCF7-solut) [10,39], mutta selvästi erilainen kuin HIF-1α. Toisin HIF-1α, jakauma oli promoottori-distaalinen (kuvio 2C). Lisäksi, kuten endogeenisen HIF-2α sitovia malleja, merkinnästä ”naapuriin” geenejä paljasti, että huomattavasti suurempi osa olivat ei-koodaavan geenilokukset, kuin havaittiin uudelleen käyttöön tai endogeenisten HIF-1α (kuvio 2D). Nämä erot HIF-α-isoformien, jotka havaittiin riippumatta solutyypin ekspressiotason tai useita sivustoja sidottu, viittaavat siihen, että kyky tunnistaa promoottori-kaukaisessa parantajina at koodaamattomalla geenilokukset versus promoottori proksimaalisen sivustoja on synnynnäinen ominaisuus HIF- α-isoformit.

Lopuksi pyrittiin selvittämään, onko lisääntynyt lastaus nykyisten HIF-2α sitoutumiskohtia, tai sitominen HIF-2α at havaittuja sivustoja, tai molemmat, liittyy toiminnallisia vaikutuksia geenien ilmentymisen. Käytimme GSEA testata rikastuminen HIF-sitovan loci (lähimmän naapurin geenit) keskuudessa geenejä, joiden ilmentyminen oli muuttunut HIF-2α yliekspressio (mitattuna RNA-kohdat). Suoritimme tämän analyysin sekä sitoutumiskohtien, jotka hoitivat endogeenistä HIF-2α, ja ne, jotka olivat äskettäin havaittu HIF-2α yli-ilmentymisen. Yhdistys positiivista, mutta ei negatiivinen vaikutus geenien ilmentyminen havaittiin molemmissa ryhmissä sitoutumisen loci (kuvio 2E ja 2F). Siten konstitutiivinen aktivaatio HIF-2α in 786-0 soluissa on submaksimaalisella ja lisäämällä HIF-2α johtaa sekä määrällisiä ja laadullisia vaikutuksia HIF kohdegeenin ilmentymisen.

Mielenkiintoista, lähellä tarkastus ilmeisesti uuden sitoutumiskohtia usein paljasti alhainen HIF sitovien näillä paikoilla valvonnassa soluissa, jotka olivat alle kynnysarvojen merkityksellisten sitovia, mutta ennen niitä havaittiin joukko säätelyalueita (S9A kuvio). Tämä viittaa siihen, että nämä signaalit ovat itse asiassa ”todellinen” ja heijastaa epätasainen lastaus mahdollisten HIF sitoutumiskohtia (S9B kuvio).

Analyysi HIF-2α ja HIF-1α sidosmotiivien

Koska HIF -1 ja HIF-2 raportoidaan tunnistamaan identtisen ydin DNA: ta sitovan sekvenssin [10], on epäselvää, miksi sitoutumisen HIF-1α ja HIF-2α jakautuu niin eri tavalla. Ongelman aloitimme analysoimalla immunosaostettiin sekvenssit transkriptiotekijän sidosmotiivien käyttäen MEME-siru. Kuten odotettua, kanoninen HRE motiivi (Jaspar /MA0259.1) [40] on rikastunut esitetään kaikki sitoutumiskohtia; ne käytössä endogeenisen HIF-2α, yliekspressoituu HIF-2α ja uudelleen ilmaisseet HIF-1α ja rikastaminen korreloi positiivisesti vahvuus HIF-1β signaali (kuvio 3A ja 3B ja S8C kuvio, sininen viiva). Toiseksi rikastettua motiivi oli AP-1 (TRE) sitova motiivi (Jaspar /MA0491.1) [40]. Kiinnostavaa kyllä, tämä rikastus oli varsin eri tavalla jakautunut HIF-1α ja HIF-2α sitovan loci. Vahva rikastus havaittiin sekvenssit sitoutumisen ilmentynyt HIF-2α (kuvio 3B). Kuitenkin toisin kuin EU HRE aihe, että sitova asetettu yliekspressoitujen HIF-2α, rikastuminen AP-1 motiivi oli korreloi käänteisesti vahvuus HIF-1β sitova (kuvio 3B). Lisäksi joukko HIF-1α sitovia lokusten, AP-1 sitova motiivi oli merkittävästi tyhjentynyt (kuvio 3A). Kaiken ero jakelu AP-1 motiivi välillä HIF-1α ja HIF-2α sitovan loci oli erittäin merkitsevä (p 10

-16).