Krooninen sairaus

tiivistelmä

Korkeatasoinen vakavien karsinooma (HGSC) on yleisin ja tappavin munasarjasyöpä. Silti se on suurelta osin oireeton alkuvaiheessa. Opiskelu alkuperä ja varhainen etenemistä tämä tauti on siis kriittinen tunnistaa merkkiaineiden varhaista havaitsemista ja seulontaa varten. Tissue-pohjainen massaspektrometria kuvantaminen (MSI) voidaan käyttää puolueeton tapa tarkastella paikallisten aineenvaihdunnan muutoksia terveiden ja syöpäkudoksen suoraan alkaessa tauti. Tässä tutkimuksessa kuvaamme MSI tulokset

Dicer-PTEN

double-pudotuspelit (DKO) hiiriä, hiirimallissa uskollisesti jäljittelee kliinistä luonnetta ihmisen HGSC. Käyttämällä ei-negatiivinen matriisin tekijöihin jako (NMF) varten ilman valvontaa analyysiä desorption sähkösumutusionisaatiota (DESI) aineistot, kudoksen alueet erillisiä perustuvat spektrikomponentit puolueettomasti, jossa muutoksiin liittyviä HGSC korostettuna. Tulokset saadaan yhdistämällä NMF kanssa DESI-MSI paljasti useita metabolisen lajeja koholla kasvainkudoksessa ja /tai ympäröivä veren täyttämä kysta kuten ceramides, sfingomyeliinit, bilirubiini, kolesteroli sulfaatti ja erilaiset lysofosfolipidit. Useita tunnistetut aineenvaihduntatuotteet sisällä kuvantamistutkimukseen myös havaita muuttuneita tasoilla seerumin aikaisemmassa metabolomic tutkimus saman hiirimallissa. Esimerkiksi työnkulun ominaisuudet tunnistettu tässä tutkimuksessa käytettiin rakentaa oPLS-DA malli pystyy kohdella eri DKO hiirten aikaisen vaiheen kasvaimista ja säätimet jopa 88% tarkkuudella.

Citation: Paine MRL, Kim J, Bennett RV, Parry RM, Galliaan DA, Wang MD, et al. (2016) Whole sukuelimiin ei-negatiivinen Matrix Tekijöihin massaspekrometria kuvantaminen alkuvaiheen munasarjasyöpä Mouse Model. PLoS ONE 11 (5): e0154837. doi: 10,1371 /journal.pone.0154837

Editor: Shengtao Zhou, West Kiina Second sairaala, Sichuanin yliopiston, Kiina

vastaanotettu: 28 joulukuu 2015; Hyväksytty: 20 huhtikuu 2016; Julkaistu: 09 toukokuu 2016

Copyright: © 2016 Paine et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki kuvantaminen datatiedostot ovat saatavilla figshare tietokannasta (https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.3171715.v1).

Rahoittajat: Munasarjojen Cancer Research Fund (oCRF) Ohjelman kehitysopas avustus ( http: //http: //www.ocrf.org) ja Challenge Grant päässä Marsha Rivkin Foundation (http: //http: //www.marsharivkin.org). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Korkeatasoinen vakavien karsinooma (HGSC), alatyypin munasarjasyöpään tunnetaan myös korkea-asteen vakavien munasarjasyöpä, on vastuussa 70% kaikista munasarjojen syöpäkuolemista ja silti alkuperä ja varhainen etenemistä tätä tappavaa tauti on edelleen huonosti. [1-4] luotettavia seulontatestejä kliinisessä työssä ovat tällä hetkellä saatavilla, ja oireeton kurssin kautta alkuvaiheessa taudin varhainen havaitseminen HGSC erittäin vaikeaa. Niinpä useimmissa HGSC tapauksissa ( 95%), ja laajemmassa useimmissa munasarjasyövän tapauksissa diagnosoidaan myöhemmissä vaiheissa johtaa huono 5-vuoden eloonjäämisluvut-noin 44,6% kaikkien sairastuneiden aikana 2004-2010. [1 , 5-7] kuitenkin, kun syöpä on diagnosoitu varhaisessa vaiheessa, ja rajoittuu primaarikasvaimen sivusto, 5 vuoden eloonjäämisprosentti kasvaa yli 90%. [8] sen vuoksi on välttämätöntä, että varhainen havaitseminen menetelmiä kehitetään torjumiseksi munasarjojen syöpään kuolleisuus.

tunnistaminen biokemiallisia muutoksia kudoksia varhaisen ja myöhäisen vaiheen HGSC voisi tarjota välineet valita markkereita, jotka voitaisiin seurata veressä tai virtsassa varhaista havaitsemista ja diagnoosia. Suuri haaste liittyy tämän lähestymistavan on kuitenkin vaikea löytää potilailla, joilla alkuvaiheen munasarjasyöpä, koska alkuvaiheessa ovat oireettomia. Viimeaikaiset hiiri malleja munasarjasyöpä HGSC peräisin munanjohtimeen tai munasarjojen, esittää ainutlaatuisen mahdollisuuden voittaa tämän haasteen. [9-11] Kun kaksi kriittistä geenejä ehdollisesti käytöstä (

Dicer

flox /flox

PTEN

flox /flox

Amhr2

cre /+), nämä kaksinkertainen pudotuspelit (DKO) hiiret kehittävät munanjohdin-alkunsa HGSCs, joka levisi munasarja ennen metastasizing koko vatsaonteloon aiheuttaen vatsaonteloon sekä johtaa kuolemaan. [9] Vaihtoehtoisesti kaksinkertainen mutantti hiiriä, joissa on mutantti p53 ja

PTEN

poisto tuottaa munasarja-alkunsa HGSCs sekä ei-HGSCs munasarjoissa normaali munanjohtimet. [10] Lisäksi triple-Mutanttihiiristä (

p53

LSL-R172H /+

Dicer

flox /flox

PTEN

flox /flox

Amhr2

cre /+), jotka sisältävät mutantti p53, yleisimmin havaittu mutaatioita ihmisen HGSC (~ 97%), myös kehittää munanjohdin-alkunsa HGSC kanssa identtiset kuvion etäpesäkkeiden kuin DKO-hiirissä. Vaikka molemmat DKO ja TKO malleja kahtena yhtä hyvin kliinistä luonnetta ihmisen HGSC The DKO mallia on ominaista molekyylitasolla, jossa DKO HGSC näytteille molekyyli samankaltaisuus ihmisen HGSC. Näin ollen tässä tutkimuksessa DKO-hiiriä valittiin jatkotutkimuksiin käyttämällä massaspektrometriaa-kuvantaminen analyysejä.

massaspektrometrialla kuvantaminen (MSI), massaspektrit kirjataan erillisiin spatiaalisen puolilla kudosnäyte, joka johtaa datacube jonka massa spektri kunkin (x, y) kuvapisteen. Kaksiulotteinen vääriä värikuvia joka kartoittaa alueellisen jakautumisen erityisiä analyyttien on luotu näitä tietoja. [12] Kaksi vakiintunut MSI menetelmiä, jotka on sovellettu syövän tutkimukset ovat matriisi laserdesorptio /(MALDI), [ ,,,0],13-18] ja desorptio sähkösumutusionisaatiota (DESI). [19-25] Erityisesti varten munasarjasyöpä, useat MALDI MSI tutkimuksia on julkaistu keskittymällä sekä proteiini- ja peptidi biomarkkereiden tunnistamiseen. [26-29] Vain raportti Liu et al on tutkinut mahdollista roolia aineenvaihduntatuotteiden käyttäen MSI. [30] tässä tutkimuksessa MALDI kokeiluja ohjasi transcriptomic analyysi ja keskittyi erityisesti havaitsemiseen sulfatidejä, alaluokka glykosfingolipidien. DESI MSI, toisaalta, on sovellettu vain tutkimiseen molekyylitason muutoksia havaittu ennen ja jälkeen ovulaation, mutta ei varhaisen syövän biomarkkereiden tunnistus. [31]

Koska suuri ainemääriä tuotetut MSI, uuttamalla biologisesti-asiaan liittyvää tietoa tiettyyn tekijänä voi olla yksinkertaista, vaativat silmämääräinen tarkastus ja vertaaminen satoja jopa tuhansia kuvia kunkin kokeen. Yksinkertaistaa MSI data-analyysi, vertailu spektrejä useista alueiden tai useiden näytteiden on mahdollista käyttää alue-of-korko (ROI) valinta. [32] ROI vertailut ovat yksinkertaisia, keskimäärin spektrit saatiin kunkin pikselin valitun alueen, ja ovat paras sopivia analyysejä, joissa histologista rajat on selkeästi määritelty. Kuitenkin tapauksissa, joissa histologisia rajat eivät ole yhtä selviä, tai kun uusia biologisia hypoteesia ovat syntyy, käsin määrittelemällä ROI: n voi olla haastavaa. Tutkimuksessa sairauden etenemisen suurissa kudosleikkeiden esimerkiksi kemiallisia markkereita voidaan harvaan jaettu ja alhaisilla runsaus, joten niiden havaitseminen ROI valinnan vaikeaksi.

Semi-valvottu käyttävillä klusterointialgoritmeja joka automaattisesti antaa segmentointi kartat mukaan malleja yhteistyössä paikallisen molekyylejä voidaan käyttää tällaisissa tilanteissa. Nämä menetelmät edelleen jakaa datan erillisiksi tilasegmentteihin ja vaativat käyttäjän tarkastaa monien yksittäisten ioni kuvaa vahvistamaan ne vastaavat vastaavan segmentin. [33] valvomaton menetelmät perustuvat tilastollisiin algoritmeja siis edullisia data mining suurten, heterogeenisten kudosnäytteitä, jotka vaativat vain vähän ihmisen osallistumista. [34, 35] Tällaisia ​​algoritmeja on tutkittu analyysi MSI aineistoja kuten Principal Component Analysis (PCA) [36], Maximum autokorrelaatiofunktio Tekijöihin [37], K-Means [38] ja sumea C Keinot [39] klusterointia, Todennäköisyyspohjainen Piilevä semanttinen analyysi [40], ja ei-negatiivinen Matrix Tekijöihin (NMF) [41]. Vertailu Pearsonin korrelaatio tuotannon osan kuvien ja todellisista mallikuvia osoitti, että kaikki nämä menetelmät, NMF oli korkein keskiarvo kuvaa korrelaatiota. [35] Lisäksi, koska sisäänrakennettu ei-negatiivisuus rajoitteet, NMF komponentti kuvat ovat helposti tulkita ja sopii paremmin massaspektrillä dataa kuin muut monimuuttujamenetelmien tilastollisia menetelmiä, kuten PCA. [42, 43]

Tässä me seurata meidän seerumin metabolomiikan tutkimus

Dicer-PTEN

DKO hiiret joiden DESI MSI tutkimuksen täydellisen sukuelimiin saman hiirimallissa. [44] DESI MSI monimuuttuja-analyysi suoritettiin uuden version omniSpect [45], nyt pystyy käsittelemään suurempia (~ TB) MSI aineistot. Erottamalla MSI datan useiksi NMF komponenttien kautta omniSpect, ominaisuudet edustavat metabolomic muutoksia terveiden ja syöpäkudoksen oli helppo visualisoida. Vastaava NMF ”osa spektri” kuvataan näitä kuvia sitten tutkittiin, tunnistaa kemiallisten muuttunut siinä HGSC kasvaimen mikroympäris-, joista useat oli myös aiemmin havaittu seerumin tasolla. [44]

Materiaalit ja menetelmät

Dicer-PTEN Double-Knockout (Dicer-PTEN DKO) Hiiret

Dicer-PTEN

DKO (

Dicer

flox /flox

PTEN

flox /flox

Amhr2

cre /+) hiiret tuottamat pariutumisen miehillä (

Dicer

flox /flox

PTEN

flox /flox

Amhr2

cre /+) ja naisten (

Dicer

flox /flox

PTEN

flox /flox). Nainen

Dicer

flox /flox

PTEN

flox /flox (genotyypin ei kanna

Amhr2

cre /+) hiirissä käytettiin valvontaa. Kaikki hiiret saatiin talon jalostus on Baylor College of Medicine ja oli sijoitettu vivariums kanssa kontrolloidussa lämpötilassa 21 ° C. Niitä ruokittiin 5053 säteilytetty PicoLab Jyrsijöiden Ravinto 20 ja oli pääsy juomaveden purkeissa.

Dicer

flox /flox

PTEN

flox /flox

Amhr2

cre /+ DKO hiiriä käytettiin tässä tutkimuksessa kehittää askites kuten kasvaimia etäispesäkkeitä . Kun hiiret alkanut osoittaa merkkejä askites, he seurattiin päivittäin. Hiiriä suositellaan eutanasian kun askites määrä oli 10% eläimen painoon. Kaikki hiiret käytettiin tässä tutkimuksessa (10 yhteensä) tapettiin ennen raja eutanasian kautta yliannostuksen hengittämisen hiilidioksidia estää tarpeetonta kipua ja kärsimystä mukaisesti eläimelle protokolla (AN716) hyväksymä Institutional Animal Care ja käyttö komitea (IACUC) on Baylor College of Medicine.

Näytteiden esikäsittely

koko sukuelimiin of DKO hiirten (mukaan lukien kohtu, munanjohtimet ja munasarjat) leikattiin irti ja flash pakastettiin -80 ° C. Ehjä poistettu kudos upotettiin vesiliuokseen gelatiinia (10% w /v) ja karboksimetyyliselluloosa (5% w /v) ja jäädytettiin -80 ° C: ssa. Embedded kudosblokeista sijoitettiin kammioon on Cryostar NX70 kryostaattiin (Thermo Scientific Inc., San Jose, CA, USA) 30 minuutin ajan ja sen jälkeen leikattiin 20 um paksuuteen sekä Leikkuukappaleen ja näytteen lohko pidettiin -20 ° C: ssa . Kudosleikkeet sulaa asennettu Superfrost Plus Micro Kalvot (VWR International LLC., Radnor, PA, USA) ja pidettiin -80 ° C: ssa analysointiin saakka.

desorptio sähkösumutusionisaatiota-massaspektrometria Imaging

DESI-MS kuvat hankittiin käyttäen erikoisvalmisteinen ioni lähde koostuu Omni Spray DESI sumutin (Prosolia Inc., Indianapolis, IN), joka kykenee hienosäätöjä manuaalisen vaiheissa ja multi-akseli alustoilla (Thorlabs, Inc., Newton, NJ). Seuraavat DESI-MS geometrinen ja kokeelliset muuttujat optimoitu kuvauskokeessa: korkeus sumutin-kärjen pinnan yläpuolelta (5 mm), tulokulman (55 °), sumutin-tip etäisyyden MS sisääntulo (15 mm), tulo- korkeus pinta ( 1 mm), spray liuotin (metanoli), liuotin virtausnopeus (5 ui min

-1), Sumutusjärjestelmät (typpi), Sumutusjärjestelmät kaasun paine (100 psi), ja spray jännite (-5 kV) . Massaspektrometriin syötössä käytetään suunniteltu erityisesti DESI-MS kuvantaminen ja työntyy 18 cm edestä instrumentin, joka mahdollistaa pääsyn suurempi näyte pinnoille.

Vaikka DESI ruisku ja MS syötössä pidettiin paikallaan, näyte kuvattavan siirrettiin hengessä ”kamman” muotoinen polku, jonka avulla DESI ruisku raster koko näytteen pintaa 2-mitat käyttämällä Optiscan II moottoroitu mikroskoopilla vaiheessa (Prior Scientific Inc., Rockland, MA) ohjataan Labview VI ohjelma kuvatulla tavalla. [19, 45] vaihe nopeus asetettiin 160 um s

-1

x

-ulottuvuudella viivalla vaihe 200 um

y

– ulottuvuus. Negative-ionimassaspektrit hankittiin koskevasta Exactive Plus Orbitrap massaspektrometriin (Thermo Scientific, San Jose, CA) ovat alueella

m /z

400-1000 vuonna painopisteen tilassa optimoinnin jälkeen seuraavat kokeellinen muuttujat: massa resoluutio (17,500 at

m /z

200), automaattisen vahvistuksen säädön kohde (1 e

6 ionit), microscans per skannaus (2), s-objektiivi jännite (75 V), maksimi injektio aika (100 ms), ja kapillaari lämpötila (250 ° C).

data Processing

MS kuvantaminen datatiedosto yhtenä, jatkuvana hankinta sekä Labview ajan ja tulostesijainnin tiedostot ladataan omniSpect web-pohjainen palvelin (https://cs.appstate.edu/omnispect).[45] From Labview syntyvän viritystä ja ajoitustietoja, omniSpect luo kuvan kuution rivi-line käyttämällä massaspektrit kerätään ensimmäisenä kulkea pitkin kampa-muotoinen polku. Alkuperäinen Massaspektrit interpoloidaan lineaarisesti päälle säännöllisin välein ruudukon pitkin x-akselilla. [46]

kerätyt spektri, omniSpect ensimmäinen arvioi täyden profiilin käyttäen yhteistä logaritmisesti jakautunutta

m /z

asteikko kaikille skannaa ja soveltamalla pieni Gaussin ikkunan ympärille jokaisen piikin. Käytimme keskihajonta

m /z

0,001 ja bin-leveys

m /

z 0,0005 osoitteessa

m /z

850 nämä tiedot. Yleensä vähentää bin-leveys mahdollistaa Gaussin keskus tarkemmin edustaa painopisteen data huippu keskus (

i

.

e

., Kokeellinen

m /z

arvo) ympäröivien astiat täytetään suurtuotantoa vuorossa aikana kokeen. Keskihajonta vastaa siten siedetty varianssi Tämän massan muutos ja edustaa odotettavissa piikin leveys, jos tiedot kerättiin profiilin. Tarkkuus on centroided data on konfiguroitavissa uusin versio omniSpect (https://cs.appstate.edu/omnispect/) kolmella esiasetuksilla:

m /z

± 0,1, 0,01, ja 0,001. Korkeimmalla tarkkuus, tämä lähestymistapa tuottaa tietoja kuutioiksi hyvin suuret mitat, mutta hyvin harva tietoja. Esimerkiksi tyypilliset hiiri MSI tuotetun tiedon kuvan kuution koon [805 × 59 × 2556741], joka vaatisi 904 GB säilytettynä ohjeiden kaksinkertaisen tarkkuuden arvoja. Koska vain 0,06% elementit eivät ole nollia, käyttäen harva matriisi edustus tuloksia tiedostoista tarvitaan vähemmän kuin 2 Gt muistia.

Koska MSI data kuutio, NMF malleja jokaisen komponentin spektriä kuin ei-negatiivinen lineaarinen yhdistelmä lähteen spektrien ja jokaisen komponentin ionin kuvan ei-negatiivinen lineaarinen yhdistelmä lähde kuvia. Esimerkiksi lähde spektrit tietyssä kudoksessa otos saattaa koskea eri ionien yhdistelmiä tai ”osia”, tuotetaan eri kudosten tyyppejä, joista molemmat ovat erilaisia ​​mutta mahdollisesti korreloivat paikkatietojen jakaumia. NMF palauttaa ei-negatiivinen komponentti spektrit ja paikkatietojen jakaumia minimoimalla ero mallinnetun ja havaitun datan.

Ensinnäkin 3-D data kuutio muunnetaan 2-D matriisin vectorizing pikselin koordinaatit yhdeksi ulottuvuuteen. Käyttäjä valitsee komponenttien määrää poimia ja NMF arvioi niitä. Useiden algoritmeja NMF, käytämme Vuorottelevan Least Squares (ALS) lähestymistapa minimoida Frobenius norm [47]: jossa V edustaa datamatriisille W edustaa komponentti kuvia, ja H edustaa komponentti massaspektrit. Jokainen sarake W ja vastaava rivi H edustaa jakauma ja massaspektrit yhdestä komponentin, vastaavasti. Tuotteensa, WH, edustaa lineaarisen yhdistelmän komponentteja, jotka approksimoi tiedot. Algoritmi alkaa alustamalla H positiivisia arvoja. Sitten se ratkaisee W, joka minimoi

D

kiinteiden H käyttäen pienimmän neliösumman ratkaisu: jossa # esittää Moore-Penrose pseudoinverssi. Mahdolliset negatiiviset arvot W korvataan nollilla, ja prosessi toistetaan H. Erityisesti

D

minimoidaan uuden arvon W:

Jälleen negatiiviset arvot korvataan nollilla, ja prosessi toistetaan vuorotellen W ja H asti lähentymistä. Sen jälkeen arviointi, komponentti kuvia edustettuina 2-ulotteinen väärä väri tontteja ja suhteellinen runsaus ionien sisällä spektrit normalisoidaan base-piikin sisällä joukko NMF komponentteja. [47]

Data Analysis

Massaspektritulokset piirteitä neljännestä NMF komponentti oli ristiviittaus uutettu ja kuraattorina luettelo spektrin ominaisuuksista saadaan seuraavat UPLC-MS-analyysi seerumin 14 alkuvaiheen kasvain (ET) DKO hiirillä ja 11 ohjaa. [ ,,,0],44] UPLC-MS spektripiirteinä poimittiin tietoja käyttämällä MZmine 2.0 -ohjelman [48] ja mukana kromatogrammi linjaus, huippu tunnistaminen ja integraatio, piikin pinta louhinta, ja normalisoituminen jälkeen curation tietojen matriisi. Curation tietojen koostui poistamisen signaaleja, jotka olivat läsnä nollanäytteet, liuotin, tai niitä ei ole läsnä vähintään 50% seeruminäytteistä. Massaspektritulokset ominaisuuksia päällekkäisyyden valitun NMF komponentin ja kuratoituja UPLC-MS lista käytettiin rakentaa malli näytteen luokkasyrjintä kautta kohtisuorassa osittainen pienimmän neliösumman erotteluanalyysi (oPLS-DA) MATLAB (MATLAB versio 7.13.0, MathWorks, Natick, MA kanssa PLS_Toolbox v.6.71, ominaisvektori- Research, Wenatchee, WA).

tulokset

neljä

Dicer-PTEN

DKO hiirillä iässä 8 kuukautta tapettiin ja ehjä sukuelimiin kerättiin. Yksi hiiri näkyy suuri primaarikasvaimen, kun veren täyttämä kysta lopussa yhden kohdun sarvi ja terve munasarja kanssa ennen tai ei-syöpä kysta toisessa kohdun sarvi (kuvio 1A). Tämä näyte valittiin MSI analyysissä oletettiin, että kuvioimalla terve munasarja, esi- tai ei-syöpä kysta, ja kypsä kasvain yhdessä, suora spektrien vertailuja voidaan tehdä eri kudoksen alueille. Erilaiset spektrikomponentit havaittu, erityisesti sijaittava kasvain /kysta alueella, voitaisiin sitten ominaista ja arvioida niiden biologinen rooli tai potentiaalisina markkereita taudin.

(a) valokuva ohuen kudoksen leikkausta DKO hiiri sukuelimiin sulaa-asennettu lasilevylle. (B) Yksi komponentti NMF esittävän kuvan DESI-MS negatiivinen-ioni-tilassa tietoja DKO hiiren sukuelimiin ja (c) vastaava NMF spektrin. (D) kokonaismäärä Ionivirran (TIC) image varten DESI-MS negatiivinen-ioni mode data ja (e) vastaaviin TIC spektrin.

Negatiivinen-ioni mode DESI-MS kuva otettiin alkaen 20 uM paksu osa täydellisen sukuelimiin leikattiin edellä mainituista DKO hiiri. Kuvio 1 esittää optisen kuvan kudosnäytteen yhdessä vääriä värikuvan ja vastaavat spektrit sekä kaikkien ionien kronogrammissa (TIC) ja yhden komponentin NMF tulos. Vertailu sekä kuvien ja spektri havainnollistavat, miten tarkasti ALS algoritmi voi lähentää data kuution tekijöitä ja siksi kuinka hyvin NMF tulokset edustavat todellista dataa. Kuvat esitetty kuviossa 1B ja 1D ovat samankaltaisia ​​mutta eivät identtisiä, koska NMF lähennetään jokainen spektri tämän kuvan skaalattu versio yhden komponentin spektrin. Alueet NMF komponenttikuvassa jotka eivät vastaa TIC kuva osoittaa ne alueet ovat spektrejä, jotka poikkeavat TIC spektrin. Esimerkiksi kasvain /kysta alueen oikealla näkyy suurempi intensiteetti on väärä väri mittakaavassa TIC kuvan mutta keskimääräinen spektrin kyseisellä alueella ei ole mallinnettu hyvin joita ”keskimääräinen” taajuuksia koko kuvan. Siksi verrattuna, kasvain /kysta alue edustaa alempi suhteellinen intensiteetti on väärä väri mittakaavassa yhden komponentin NMF kuva. Kuitenkin spektri kuviossa 1C ja 1E ovat lähes identtiset huippu luetteloita ja suhteellinen runsaus säilyneitä. Asteittain segmentointi tiedot kahteen tai useampaan komponentteja NMF voisi siten tarjota mielekkäitä tuloksia koskevat biologisia eroja, jotka liittyvät taudin etenemistä paljastamalla nämä spektrin eroja. Määritetään optimaalinen määrä NMF osatekijöistä, jotta mallintaa todellisen biologisen varianssi hylkäämällä toivotun kohinan, tekninen vaihtelua, ja esineitä on siten keskeinen ymmärtämisessä tasolle hyödyllistä tietoa näissä tietoja.

Kuva 2A ja 2C esittävät tulokset halkaisu data kuution kahteen NMF komponentteja. Kuva kuvassa 2A muistuttaa kuvion 1B kanssa peruspiikkiin osoitteessa

m /z

885,5436 dominoi vastaavaa spektrien molemmat kuvat. Tarkka massa on huippu viittaa se vastaa [MH]

– ioni on fosfatidyyli (PI) 38 kokonais- hiiltä ja 4 yhteensä kaksoissidosta asyyliketjut (theo. [MH]

–

m /z

885,5499). Tämä lipidilajien on yksi yleisin hapan lipidilajien läsnä nisäkkään solukalvojen ja on rutiininomaisesti havaita suoritettaessa MSI nisäkkäiden kudoksissa. [49] Merkittävin ero kuvioiden 2A ja 1B on vähentää signaalin intensiteettiä kuviossa 2A sisällä kasvain /kysta alueella. Kuvio 2C esittää toista NMF komponentti ja paljastaa jyrkässä ristiriidassa ensimmäisen NMF komponentti, lisääntynyt signaali intensiteetit kasvain /kysta alueella ja laski intensiteetit terve munasarja alueella. Kuvio 2D esittää vastaavia taajuuksia kuvan kuvassa 2C, paljastaen lajeja, jotka edistävät lisääntynyt signaalin voimakkuuden sisällä kasvain /kysta alueella. Kolme suurta lajia havaittiin kuviossa 2D osoitteessa

m /z

572,483, 682,589, ja 684,595. Lajeja on

m /z

572,483 ja 684,595, M + 2 huippu havaittiin suhteellisen runsaasti suhteessa 3: 1, mikä viittaa siihen, että läsnä on yksi klooriatomi kunkin lajin. Sillä

m /z

682,589, M + 2 signaali limittyy lajien

m /z

684,595. Lajit at

m /z

684,595 on suhteellisen runsaasti paljon suurempi kuin odotettua, että

37CI isotooppi

m /z

682,589. Siksi ioneja

m /z

684,595 katsotaan johtuvan erillisen kemiallisia mahdollisesti osuutta alkaen

37CI isotooppia. Mielenkiintoista, nämä kolme ionit havaittiin myös tutkimuksessa, joka tutkittu solu lipidiuutteita rottaeläimen kasvainsolulinjoilla ESI-MS ja tunnistettiin [M + CI]

– ionit C16, C24: 1, ja C24: 0 ceramides (Theo.

m /z

572,4815,

m /z

682,5911, ja

m /z

684,6067, vastaavasti). [50] Korkeus näistä kolmesta aineenvaihduntatuotteiden on raportoitu olevan osallisena kasvaimen aiheuttama dendriittisolujen apoptoosia alaspäin säätäminen fosfoinositidi-3-kinaasi (PI3K) kautta. [50] vapauttamalla nämä immunosuppressiiviset signalointi yhdisteitä, kasvaimen luo suotuisan mikroympäristön jolloin se voi kiertää isännän immuunivastetta ja lisääntyä. [51]

saatu NMF komponentti kuvaa (a) ja (c), ja vastaavat spektrit (b) ja (d) jakamalla DESI-MS negatiivinen ioni tilassa hankinta kahteen NMF komponentteja. (E) TIC kuva samasta aineisto osoittaa alueen palvelukohteesta (ROI) käsin valittu alkuvaiheen kasvain ja veren täyttämä kysta alueita (punainen soikea) ja (f) vastaavan keskimäärin spektrin ROI. (G) TIC kuva osoittaa alueen palvelukohteesta (ROI) valittiin alkuvaiheen kasvainpaikkaa vain (punainen soikea) ja (f) vastaavan keskimäärin spektrin ROI.

Region-of-korko (ROI) spektriä yhdistetyn alkuvaiheen kasvain ja veren täyttämä kysta alueella (kuvio 2E) ja alkuvaiheen kasvain itse (kuvio 2G) poimittiin tiedot kuution avulla MATLAB käsikirjoituksen vertailua vastaavaan NMF komponentti kuvan. Valitsemalla manuaalisesti ROI tietylle kudoksen alueen, joka on keskimäärin spektri tuotetaan spektreistä kunkin pikselin sisällä valittua aluetta. Toinen NMF komponentti spektri (kuvio 2D) ja ROI spektri (kuvio 2F) jakaa hyvin samankaltaisia, jossa kaikki suuret ionien havaittu ROI spektrin läsnä myös NMF komponentin spektrin, joskin vähäisiä eroja suhteellinen runsaus . Suurimmat havaitut erot kuvassa 2D ja 2F johtuvat NMF korostetaan enemmän yhdistelmiä lajeja havaittiin korkeammilla vaihtelu muiden alueiden kuvan. Sen varmistamiseksi, että suuret piikit tunnistetaan kuvassa 2D ja 2F ovat todella läsnä kasvaimen alueella ja eivät yksinkertaisesti liittyy biologiseen erot veren ja kiinteä kudos, ROI kirjo alkuvaiheen kasvain ilman verta sisältävän kysta on kuviossa 2 H. Vastaava ROI spektri sisältää kaikkien mukana olevien piikkien yli 5%: n suhteellinen runsaus sisällä Kuva 2D. Kuitenkin kuviossa 2H nämä samat piikit ovat läsnä paljon pienempiä suhteellinen runsaus johtuu erittäin runsas membraanilipidejä,

i

.

e

., PI (38: 4) osoitteessa

m /z

885,54. ROI menetelmä tarjoaa tarkemman edustus kaikkien lajien läsnä valitun alueen; kuitenkin, NMF voi eristää lajeja, jotka erottavat alueiden välillä, mahdollisesti avustaisivat löytö lajien suhteellisen alhainen runsaus, jotka saattavat muuttua. Tämä ominaisuus on kriittinen yritetään tunnistaa taudin etenemiseen kudoksen läpi ilman valvotun käyttäjän väliintuloa määritellä rajat sairaan ja terveen kudoksen.

Jakamalla aineisto kolmeen, neljään, ja viisi NMF osat (S1 ja S2 kuviot, ja kuvio 3, vastaavasti) asteittain erottelee signaalit, jotka selvästi liittyy kasvaimen /kysta alueen muusta tervettä kudosta. Mikä esiin on kuva kuvaa erityisesti yhtiön terve munasarja, yksi tai useampi kuva (riippuen määrä komponentteja valittuna) joilla on eri ioni jakaumat koko kohtu ja terve munasarja, ja kuva osoittaa kohonnut lajien kasvain /kysta alueella. Spektrit vastaava terve munasarja komponentti kuva (kuvio 3C), joka toimii myös pseudo-kontrollinäyte tämän kokeilun hallitsee ioni

m /z

885,5436 kaikkien muiden ionien havaittiin suhteellisen runsaasti 5% tai vähemmän. Progressiivinen NMF factorization signaalien edistää kohtuun (kuvio 3A, 3E ja 3I) oli alhaisempi suhteellinen runsaus ionin osoitteessa

m /z

885,5436 kuin kuvassa 3C. Lisäksi, suurempi suhteellinen osuus muista ionit näiden spektrien havaitaan, erityisesti ne, jotka ovat lipidiä välisellä alueella

m /z

600-1000 mahdollisilta fosfatidyylietanoliamiinit (PE;

m /z

716.5247, 722.5070, 746.5053, 766.5324 ja 794.5395), fosfatidyyli- (PS;

m /z

788,5369, 810,5229, 834,5229), fosfatidyyliglyserolit (PG;

m /z

747,5108), ja fosfatidyylinositoleja (PI;

m /z

833,5120, 857,5111, 909,5489). [49]

viidestä NMF komponentti kuvia, kuvio 3A osoittaa korkeimman intensiteetin kasvaimen alueella. Kuitenkin, kuvio 3A esittää myös suhteellisen korkea korrelaatio NMF-komponentin spektrit (kuvio 3B) kautta suurin osa kudoksen osassa. Vaikka piikit kuviossa 3B ovat kohonneet kasvain alueella, ne eivät välttämättä ihanteellisia biomarkkerit erottaa kasvaimen ja terveen kudoksen. Tätä tukee enemmistö huiput tunnistetaan kuviossa 3B on yhteinen nisäkkään solukalvon lipidit, joiden tiedetään olevan koholla, koska korotettuun lipidisynteesiin syöpäkudoksiin. [52] Päinvastoin, kuvio 3G esittää paljon suurempi suhteellinen ero kasvain /kysta alueen ja jäljellä olevan kudoksen osassa. On totta, että suurin intensiteetit ja suurin osa voimakkain pikselit havaitaan kysta, mutta on vielä merkittävä määrä pikseleitä koholla intensiteetit kasvaimen alueella. Koska komponentti kuvan kuvassa 3G lähes yksinomaan näyttää kasvaimeen /kysta alueella minimaalisella osuudet muun kudoksen alueita, tämä komponentti on todennäköisesti erittäin edustava aineenvaihdunnan muutoksia kasvain microenvironment. Kolmen muun NMF komponentteja kuvataan oletettavasti ei-syöpä alueilla kudoksen (

i

.

e

., Terve munasarja ja suurin osa kohtu). Siksi komponentti kuva kuvassa 3G odotetaan sisältävän minimaalinen osuudet kemiallisia koske erityisesti syövän biologian, vastaavan spektrin kuvassa 3H.

Suorituskyky NMF kuin valvomattoman segmentointialgoritmi sovellettu MSI tiedot arvioitiin vertailu enemmän tyypillinen klusterointialgoritmi kuten K-means klusterointi. K-Means tuloksia segmentoimasta MSI aineisto tulee

k

= 5 klustereita on esitetty S3 kuvassa. Neljä viidestä K-Keinot klusterit ovat tilallisesti ja spektrisesti hyvin samanlainen NMF havaitut tulokset kuviossa 3, jossa veren täytetty kysta, terve munasarja, ja jäljellä oleva kudos kaikki segmentoitu erillisiin klustereita. K-Means analyysi, yksi klustereiden sisälsi suuria maksuja kemiallisesta taustan signaalin ja siksi, että klusterin korreloi tilallisesti kanssa alueen ulkopuolella biologiseen kudokseen. Segmentointi Tätä taustaa alueella ei havaittu sisällä NMF tulosten sijasta kohtu erotettiin kolmeen segmenttiin (verrattuna kaksi K-means klusterointi). On selvää, että NMF sopii paremmin MSI tietojen analysointiin kuten NMF tarjoaa korrelaatio jokaisen pikselin spektrin approksimaatio asettaa jokaiselle komponentin, kun taas K-Means vain antaa binary viitteitä kunkin pikselin sisällyttämistä kyseiseen klusteri. Näin NMF kuvia tarjota entistä informatiivinen avainsana MSI dataa kuin K-means klusterointi.

havainnollistamiseksi valikoiva voimaa NMF, ionien havaitaan kasvaimen taajuuksien runsaasti ≥ 5% suhteessa peruspiikkiin ovat