Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Kertyvät näyttö viittasi siihen, epiteelin -mesenchymal siirtyminen (EMT) ja syövän kantasolujen (CSC) ominaisuudet, jotka molemmat edistävät kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden, liittyvät toisiinsa kanssa miR-21. MiR-21 on yksi tärkeä MikroRNA liittyy kasvaimen etenemiseen ja etäpesäkkeitä, mutta molekyylitason mekanismit EMT ja CSC fenotyypin aikana miR-21 vaikuttaa omalta maahanmuuttoa ja hyökkäys rintasyövän soluja vielä selvittämättä.

Menetelmät /Principal havainnot

tässä tutkimuksessa, MDA-MB-231 /anti-miR-21-solut perustettiin transfektoitujen HSA-miR-21 antagomir osaksi rintasyöpä MDA-MB-231-soluja. EMT arvioitiin muutokset mesenkyymisolun merkkiaineiden (N-kadheriinin, vimentiinistä, ja alfa-SMA), epiteelisolujen merkki (E-kadheriinin), sekä valmiudet solumigraation ja invaasiota; CSC fenotyyppi mitattiin muutokset CSC pinnan markkereita (ALDH1 ja CD44), ja kapasiteetti sphereforming (mammospheres). Huomasimme, että antagonismi miR-21 käänteinen EMT ja CSC fenotyypin, johon liittyy PTEN ylössäätöä ja AKT /ERK1 /2 inaktivointia. Mielenkiintoista, alas-säätely PTEN jonka siPTEN tukahdutti vaikutukset miR-21 antagomir EMT ja CSC fenotyypin, joka vahvistaa, että PTEN on tavoite miR-21 kääntämään EMT ja CSC fenotyypin. Inhibiittorit PI3K-AKT ja ERK1 /2 polkuja, LY294002 ja U0126, molemmat merkittävästi tukahdutti EMT ja CSC fenotyyppi, mikä osoittaa, että AKT ja ERK1 /2 väyliä tarvitaan miR-21 välittävien EMT ja CSC fenotyypin.

johtopäätökset /merkitys

Yhteenvetona tuloksemme osoittivat, että antagonismi miR-21 kääntää EMT ja CSC fenotyypin kohdistamalla PTEN kautta inaktivoinnin AKT ja ERK1 /2 polkuja, ja osoitti uudella mekanismilla, jonka voisi lievittää pahanlaatuinen biologista käyttäytymistä rintasyöpään.

Citation: Han M, Liu M, Wang Y, Chen X, Xu J, Sun Y, et al. (2012) antagonismi miR-21 Kääntää epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon ja Cancer Stem Cell fenotyyppi kautta AKT /ERK1 /2 inaktivaatio kohdistaminen PTEN. PLoS ONE 7 (6): e39520. doi: 10,1371 /journal.pone.0039520

Editor: Abdelilah Aboussekhra, King Faisal Specialist Hospital Tutkimuskeskus, Saudi-Arabia

vastaanotettu: 26 syyskuu 2011; Hyväksytty: 26 toukokuu 2012; Julkaistu: 25 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Han et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain National Natural Science Foundation of China (NSFC 81072147, NSFC 31171336), Natural Science Foundation of Chongqing Science Teknologia-Kiinassa. Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon (EMT) liittyy lisääntynyt aggressiivisuus ja etäpesäkkeiden karsinoomat, kuten rintasyövän, koska se mahdollistaa solujen siirtyä ja hyökätä ympäröivä kysymyksiä ja paeta verenkiertoon, matkalla perustamista etäpesäkkeitä. Kun nämä metastaattinen solut saapuvat määränpäähänsä, ne voivat läpikäydä mesenchymal- epiteelin siirtyminen (MET) perustaa sekundaarikasvaimia, jolloin syövän leviämistä ja hoidon epäonnistumisen [1] – [3]. Molekyylitasolla, läpikäyvien solujen EMT kohti mesenkymaaliset fenotyyppi liittyy menetys tai alentaa ekspressiota epiteelin markkereita, kuten E-kadheriinin, ja lisääntynyt ekspressio mesenkymaalisten markkereita, kuten N-kadheriinin, vimentiinin, ja alfa-SMA [2] , [4], [5]. On tutkimuksia ehdotti, että EMT rintasyövässä on tiukasti sidoksissa pohjapinta-kaltainen fenotyyppi rintasyöpä alaryhmä ja syövän kantasolut (CSCS) [6] – [8].

CSCS ennustetaan olevan kriittisiä kuljettajia syövän etenemistä johtuen CSC ominaisuuksia kuten kyky uusiutua, rajattomat proliferaatiopotentiaali ja etäpesäkkeiden potentiaali, mikä viittaa siihen, että kohdentaminen CSC ominaisuudet todennäköisesti poistamaan CSCS jotka ovat ”siemeniä” kasvaimen uusiutumisen ja etäpesäke. Vaikka CSC hypoteesi ehdottaa, että kasvaimia voi syntyä kantasoluja /esisolujen, tutkimukset monista laboratorioissa osoitti, että EMT voi antaa soluja, joilla CSC ominaisuudet sekä entistä liikkuvia invasiivisia fenotyyppiin [7] – [10]. Aikaisemmin tutkimukset ovat vahvistaneet, että rintasyöpä sisältää CSC-osasto [11] – [13], jotka voidaan rikastuttaa puhdistamalla aldehydidehydrogenaasille 1 (ALDH1) -positiivinen soluihin [13] tai CD44

+ /CD24

– /low-solujen [11] lajittelemalla, ja myös puhdistamalla sphereforming solut (mammospheres) vanhempien soluista [12]. On tutkimukset osoittivat, että EMT fenotyyppi on korkein CD44

+ /CD24

– /matala rintasyövän CSCS (7), ja CSCS rikastetaan rintasyövistä ja metastaattista rintasyöpää Pleuraeffuusiot ilmaista markkereita samanlainen solut, jotka ovat läpikäyneet EMT [7], [14]. Samoin EMT ja CSC markkereita ovat myös usein liittyy rintasyöpäkasvaimet on taipumus etäpesäke, kuten pohjapinta-kaltainen fenotyyppi rintasyövän alaryhmä [15] ja metaplastiset [16] rintasyöpiä.

MikroRNA (miRNA) ovat perheen pieniä ei-koodaavan RNA-molekyylejä, jotka säätelevät geeniekspressiota emäspariutumisen 3′-UTR, että kohde-mRNA: ta. Äskettäin sarjan miRNA on osoitettu kriittisiä rooleja etenemisen ja etäpesäkkeiden ihmisen pahanlaatuisen kasvaimen [17], [18], mukaan lukien rintasyöpä. MiR-21 on yksi ensimmäisistä miRNA havaittu ihmisen genomin, joka on myös yksi miRNA tiedetään olevan säädelty kaikenlaisia ​​ihmisen maligniteettien [19]. Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että useat tuumorisuppressoreilla lukien fosfataasi ja tensin homologin poistetaan kromosomissa kymmenen (PTEN) [20], tuumorisuppressorigeeniä tropomyosin 1 (TPM1) [21], ohjelmoitua solukuolemaa 4 (PDCD4) [22], maspiini [23] ja matriksin metalloproteinaasien estäjät RECK ja TIMP-3 [24] ovat tavoitteita miR-21, mikä viittaa siihen, että miR-21 on tärkeä onkogeenisen miRNA, joka on läheistä sukua kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden.

tutkimukset ovat osoittaneet, että miR -21 on tärkeä osa solun signalointi piiri, joka säätelee EMT-ohjelman [25] – [27], sekä kumppaniaan CSC allekirjoitusta [26], [28], mikä viittaa siihen, että miR-21 on keskeinen rooli prosessi EMT ja hankinta CSC ominaisuuksia, jotka vastaa meidän aiemmin tutkia [29], mutta taustalla olevien mekanismien edelleen epäselviä.

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että miR-21 kasvaa kasvainsolujen proliferaatiota, migraatiota, ja hyökkäyksen kautta kohdistaminen PTEN [20], kasvainsuppressorigeenin, joka on antagonisti phosphatidylinotidol 3-kinaasi (PI3K), poistamalla 3′-UTR fosfaatti fosfatidyyli 3,4,5-trisfosfaatti (PIP3). Mutta rooli PTEN in miR-21 asiakkuutta EMT ja CSC fenotyyppi on vielä selvittämättä. On hyvin tunnettua, että PTEN säätelee negatiivisesti PI3K-proteiinikinaasi B (AKT) reitti [30] ja mitogeeni-aktivoitu proteiinikinaasi (MAPK) /solunulkoisen signaalin säädellään kinase1 /2 (ERK1 /2) reitin [31], samoin kuin sekä AKT ja ERK1 /2 polkuja katsottiin olevan merkitystä ylläpito EMT ja CSC ominaisuudet [32] – [36].

Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että miR-21 voimin kautta AKT ja ERK1 /2 reittejä kohdistamalla PTEN säädellä EMT ja CSC fenotyypin. Tässä tutkimuksessa olemme paljastaneet, että antagonismi miR-21reversed EMT sopusoinnussa CSC fenotyyppiin kautta AKT ja ERK1 /2 reitit kohdistamalla PTEN, osoittaa rakenteisen joka saattaa lievittää pahanlaatuisen biologista käyttäytymistä rintasyövistä.

tulokset

Transfektoidut HSA-miR-21 Antagomir Laskua ilmentymisen miR-21 MDA-MB-231 solut

Tutkitaan onko HSA-miR-21 antagomir voi vähentää ilmaus miR -21, HSA-miR-21 antagomir tai negatiivinen kontrolli transfektoitiin MDA-MB-231-soluja 48 tunnin ajan, sitten suhteellinen ilmentyminen miR-21 mitattiin reaaliaikaisella RT-PCR: llä. Suhteellinen ilmentyminen miR-21 oli 0,10711 ± 0,01272 MDA-MB-231 /anti-miR-21-soluja, jotka oli merkitsevästi alassäädetty, kuin verrata 1,07862 ± 0,09722 negatiivisessa verrokkiryhmässä (p = 0,0015; kuvio. 1A ). Tulokset viittasivat siihen, että HSA-miR-21 antagomir voisi alentaa ekspressiota miR-21 MDA-MB-231-soluja.

MDA-MB-231-solut transfektoitiin HSA-miR-21 antagomir tai hsa- miR-21 antagomir valvonta loppukonsentraatioon 50 nmol: ssa 48 tuntia. (A) MDA-MB-231-soluja käsiteltiin HSA-miR-21 antagomir vähentynyt ilmentyminen miR-21, verrattuna kontrolliryhmiin (n1 = n2 = 3; p = 0,0015), reaaliaikaisella RT-PCR- analyysi. (BE) mRNA-tasot mesenkymaalisten biomarkkerit (N-kadheriinin, vimentiinistä ja alfa-SMA) ja epiteelin biomerkkiaineiden (E-kadheriinin) in MDA-MB-231 /anti-miR-21-solujen ja MDA-MB-231 /kontrollisolujen mitattuna reaaliaikaisen RT-PCR-analyysillä. Reaaliaikaisen RT-PCR-reaktiot suoritettiin 20 ul: n reaktiotilavuudessa kolmena kappaleena, samanaikaisesti. (F, G) suhteellinen proteiinin tasot EMT merkkiaineiden merkitty solut osoittaneet Western blot -analyysillä, ja vanteet ovat semi-kvantitoitiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa. Beta-aktiini käytettiin latauskontrollina. (H, I) Muuttavat ja invasiivisia ominaisuuksia osoitti solut testattiin maahanmuutto- ja invaasiomääritys in Transwell inserttejä. Tunkeutui solut laskettiin ja analysoitiin histogrammissa. Tiedot edustavat ainakin kolmen kokeen tehdään kolmena kappaleena. (* Osoittaa p 0,05;

★ osoittaa p 0,001).

antagonismi miR-21 Vastakkainen EMT sekä Vähentynyt Migration ja Invasion MDA-MB-231 Cells

vaikutusten tutkiminen pakko antagonismi miR-21 EMT prosessin MDA-MB-231-solujen suhteellinen mRNA ja proteiini ilmentymä mesenkymaalisten fenotyypin solun biomarkkerit (N-kadheriinin, vimentiinistä, ja alfa-SMA) ja epiteelin fenotyypin solujen biomerkkiaineiden (E-kadheriinin) in MDA-MB-231 /anti-miR-21-soluja ja vastaavat ohjaus-soluja mitattiin. Antagonismi miR-21 väheni suhteellisen mRNA-tasoja N-kadheriinin, vimentiinin, ja alfa-SMA (p = 0,0038, p = 0,0018 ja p = 0,0023, vastaavasti, Fig. 1B, C, D), kun taas lisääntynyt suhteellinen mRNA-tasolla E-kadheriinin (p = 0,0017; kuvio. 1E) MDA-MB-231 /anti-miR-21-soluja, verrattuna vastaavaan kontrolliin soluihin, reaaliaikaisella RT-PCR-analyysillä. Tulokset viittasivat siihen, että antagonismi miR-21 voisi vähentää mRNA ilmaus mesenkymaalisten fenotyypin solun biomarkkereita, kun taas lisätä mRNA ilmentymistä epiteelisolujen fenotyypin solun biomarkkereiden. Tulokset Western blot-analyysi osoitti, että suhteellisen proteiinin tasoja N-kadheriinin, vimentiinin, ja alfa-SMA oli alassäädetty merkittävästi (p = 0,0003, p = 0,0026 ja p = 0,04, vastaavasti, Fig. 1 F, G) , kun taas E-kadheriinin säädeltiin merkittävästi (p = 0,0053; kuvio. 1F, G) on MDA-MB-231 /anti-miR-21-soluja, verrattuna kontrollisoluihin. Tulokset viittasivat siihen, että antagonismi miR-21 voisi vähentää proteiinin ilmentymistä mesenkymaalisten fenotyypin solun biomarkkereita, kun taas lisätä, että epiteelisolujen fenotyypin solun biomarkkereiden. Nämä tulokset osoittivat selvästi, että antagonismi miR-21 voisi kääntää EMT nojautuen esto EMT fenotyyppisiä biomarkkereita. Toiminnallisesti suhteellinen siirretyn ja tunkeutuu solujen määrä MDA-MB-231 /anti-miR-21-soluja oli huomattavasti huonompi kuin negatiivisen kontrollin (p 0,0001, p 0,0001, vastaavasti, Fig. 1 H, I), ehdotti, että antagonismi miR-21 voisi vähentää solujen vaeltamiseen ja hyökkäyksen MDA-MB-231-solujen, mikä korostuu entisestään toimintaa miR-21 ja metastaasit rintasyövän soluja.

antagonismi miR-21 Käännetty CSC Fenotyyppikuvaus MDA-MB-231 solut

vaikutusten tutkimiseksi antagonismi miR-21 CSC fenotyypin MDA-MB-231-solujen osuus solujen ALDH1

+ (ALDH

kirkas ) ja CD44

+ /CD24

– /alhainen MDA-MB-231 /anti-miR-21-soluja ja negatiivisen kontrollin soluissa mitattiin. Prosenttiosuus solujen ALDH1

+ MDA-MB-231 /anti-miR-21-soluissa oli 0,85

±

0,092, mikä on huomattavasti vähemmän kuin 2,323 ± 0,315 negatiivisessa verrokkiryhmässä (p = 0,0051; kuvio . 2A, B), jonka ALDEFLUOR määritys; prosenttiosuus solujen CD44

+ /CD24

– /alhainen MDA-MB-231 /anti-miR-21cells oli 0,543 ± 0,129, myös huomattavasti pienempi kuin 4,807 ± 1,062 in kontrolliryhmissä (p = 0,0094; Fig. 2C, D), FACS-analyysillä. Nämä tulokset viittaavat siihen, antagonismi miR-21 voisi vähentää rintasyövän CSC osuus, joka ilmentävät CSC pinta biomarkkerit ALDH1

+ ja CD44

+ /CD24

– /matala. Lisäksi suhteellinen mRNA ja proteiini ilmentymistä ALDH1 ja CD44 MDA-MB-231 /anti-miR-21-soluja ja kontrollisoluja mitattiin myös. Suhteellinen mRNA tasoja ALDH1 ja CD44 MDA-MB-231 /anti-miR-21-solut olivat merkittävästi vähentynyt verrattuna kontrolliryhmiin (p = 0,0039, p = 0,0034, vastaavasti, kuviossa. 2E, F), arvioituna reaaliaikainen RT-PCR-analyysillä, mikä viittasi siihen, että antagonismi miR-21 voisi vähentää mRNA ilmaus ALDH1 ja CD44. Proteiinin ilmentyminen ALDH1 ja CD44 myös laski vastaavasti (p = 0,0002, p = 0,0005, vastaavasti, kuviossa. 2G, H), Western blot-analyysi ehdotti, että antagonismi miR-21 voisi alentaa proteiinin ilmentymistä ALDH1 ja CD44 . Nämä tulokset osoittivat, että antagonismi miR-21 voisi kääntää CSC fenotyypin MDA-MB-231-solujen, mikä edelleen ehdotetaan, että miR-21 voisi käsittää sääntelyssä CSC ominaisuuksista. Enemmän Mielenkiintoista, mammosphere numero MDA-MB-231 /anti-miR-21-soluissa oli merkittävästi huonompi hallita ryhmien välillä (p = 0,0017; kuvio. 2I, J), osoitti, että antagonismi miR-21 voisi muodostumisen vähentämiseksi mammospheres, joka ehdotti lisäksi, että miR-21 voisi säädellä CSC ominaisuuksia, kuten kapasiteettia itseuudistumisen ja kyky muodostaa klooneja.

(A, B) ALDH1 entsyymiaktiivisuus (ALDH

kirkas) vakiintuneissa rintasyöpä MDA-MB -231 /anti-miR-21-solujen ja MDA-MB-231 /ohjaus-soluja (n1 = n2 = 3) havaittiin käyttäen ALDEFLUOR määritystä. (C, D) CD44

+ /CD24

– /alhainen fenotyypin osoitettu soluissa (1 = 2 = 3) havaittiin FACS-analyysillä. (E, F) suhteellinen mRNA tasoja ALDH1 ja CD44 havaittiin reaaliaikaisen RT-PCR-määritystä. (G, H) suhteellinen proteiinin tasot ALDH1 ja CD44 havaittiin Western blot -analyysillä. Beta-aktiini käytettiin latauskontrollina. (I, J) määrä mammospheres 1000 MDA-MB-231 /anti-miR-21-soluja tai MDA-MB-231 /ohjaus-solut laskettiin mikroskoopin alla. Kaikki tiedot edustavat vähintään kolmea koetta tehdään kolmena kappaleena. (* Osoittaa p 0,05;

★ osoittaa p 0,001).

antagonismi miR-21 aiheuttama yli-ilmentyminen PTEN

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että asennuspalveli- 21 lisääntynyt solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion moduloimalla tuumorisuppressorigeeniä PTEN [20], mutta rooli PTEN in miR-21 säätelevä kasvain EMT ja CSC fenotyyppi on vielä selvittämättä. Tutkitaan onko antagonismi miR-21 säätelevät PTEN ilme, mRNA ja proteiini tasoilla PTEN mitattiin reaaliaikaisella RT-PCR-analyysi ja Western blot -määritys, vastaavasti. Kuten odotettua, sekä mRNA: n ja proteiinin ilmentymistä PTEN MDA-MB-231 /anti-miR-21-soluja voimakkaasti säädelty, verrattuna kontrolliryhmiin (p = 0,003, p = 0,0437, vastaavasti, Fig. 3A, B, D). Nämä tulokset osoittivat, että antagonismi miR-21 voisi ajan säätelemään PTEN.

(A) ektooppinen ilmentyminen PTEN mRNA: MDA-MB-231 /anti-miR-21-solujen ja MDA-MB- 231 /säätökennoja varmistettiin reaaliaikainen RT-PCR (p = 0,003). (B, C, D) Proteiinitasot PTEN, p-AKT, AKT, p-ERK1 /2, ja ERK1 /2 merkitty soluja havaittiin Western blot -analyysillä, ja vanteet ovat semi-kvantitoitiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa. GAPDH käytettiin latauskontrollina. (* Osoittaa p 0,05).

antagonismi miR-21 Inaktivoitu AKT ja ERK1 /2

AKT ja ERK1 /2 kaksi suurta signalointireittejä säätelyssä solujen lisääntymistä, muuttoliike ja selviytymistä, ja molemmat myös säädeltiin PTEN, mutta roolit AKT ja ERK1 /2 väyliä miR-21 säätelevä kasvain EMT ja CSC fenotyyppi on vielä selvittämättä. Määrittää molekyylejä, jotka ovat mukana ovat antagonismi miR-21 käännetään EMT ja CSC fenotyypin, proteiini tasot fosforyloitua AKT (p-AKT) ja AKT, fosforyloitu ERK1 /2 (p-ERK1 /2) ja ERK1 /2 oli mitattuna Western blot-analyysi. Proteiinin tasot p-AKT ja p-ERK1 /2: MDA-MB-231 /anti-miR-21-soluja voimakkaasti vähentynyt verrattuna kontrolliryhmiin (p = 0,0173, p = 0,0126, vastaavasti, Fig. 3C, D ), vahvistettiin, että antagonismi miR-21 voisi estää AKT ja ERK1 /2 aktivaation kääntämisen prosessissa EMT ja CSC fenotyypin.

Re-ilmentyminen miR-21 aiheuttama EMT ja CSC Fenotyyppikuvaus, Mukana on Down-ilme PTEN sekä aktivointi AKT ja ERK1 /2

edelleen varmistamiseksi roolia miR-21 säätelyssä kasvain EMT ja CSC fenotyypin, HSA-miR-21 jäljittelee tai matkii negatiivinen kontrolli, transfektoitiin perustettiin MDA-MB-231 /anti-miR-21-soluja. Ekspression miR-21 kasvoi yli 22-kertaiseksi, kun HSA-miR-21 jäljittelee käsitelty, verrattuna negatiiviseen kontrolliin (p = 0,0037; kuvio. 4A), osoitti, että HSA-miR-21 jäljittelee transfektio voitaisiin lisätä suhteellinen ilmentyminen miR-21.

perustettu MDA-MB-231 /anti-miR-21-solut transfektoitiin HSA-miR-21 jäljittelee pitoisuutena 40 nmol: ssa 72 tuntia. (A) MDA-MB-231 /anti-miR-21-soluja käsiteltiin HSA-miR-21 jäljittelee kohonnut ilmentyminen miR-21, verrattuna kontrolliryhmiin (n1 = n2 = 3; p = 0,00373), jonka reaaliaikainen RT-PCR-analyysillä. (BF) Proteiinitasot mesenkymaalisten markkereita (N-kadheriinin, vimentiinistä ja alfa-SMA) (B), epiteelin markkeri (E-kadheriinin) (B), CSC markkereita (ALDH1 ja CD44) (C), PTEN (D), p-AKT ja AKT (E) sekä p-ERK1 /2 ja ERK1 /2 (E) osoitti soluissa mitattiin Western blot-analyysi, ja bändit olivat puoliksi kvantitoitiin käyttäen ImageJ ohjelmisto (F). Beta-aktiini tai GAPDH käytettiin latauskontrollina. (* Osoittaa p 0,05;

★ osoittaa p 0,001).

tutkia pakotettu uudelleen ilmentäminen miR-21 voi aiheuttaa EMT ja CSC fenotyypin, alas-säädellä ilmentymistä PTEN sekä aktivoida AKT ja ERK1 /2 polkuja, proteiinin ilmentymisen EMT biomarkkerit (N-kadheriinin, vimentiinin, alfa-SMA, ja E-kadheriini), CSC markkereita (ALDH1 ja CD44), PTEN, p-AKT, AKT , p-ERK1 /2, ja ERK1 /2 mitattiin Western blot -määritys. Verrattuna negatiiviseen kontrolliin ryhmät, pakotetaan uudelleen ilmentymisen miR-21 lisäsi proteiinin ilmentymistä N-kadheriinin, vimentiinin, alfa-SMA, ALDH1 ja CD44 (p = 0,0136, p = 0,0397, p = 0,0067, p = 0,0002 ja p = 0,0006, vastaavasti, Fig. 4B, C, F), kun taas vähentynyt ilmentyminen E-kadheriinin (p = 0,0014; kuvio. 4B, F), ehdotti, että uudelleen ilmentyminen miR-21 voi indusoida EMT ja CSC fenotyypin perustettu MDA-MB-231 /anti-miR-21-soluja. Samaan aikaan uudelleen ilmentyminen miR-21 väheni ilmentymistä PTEN (p = 0,0081; kuvio. 4D, F), osoittivat, että uudelleen ilmentyminen miR-21 voi vaikuttaa ilmentämiseen miR-21 välittömänä kohteena soluissa. Lisäksi uudelleen ilmentäminen miR-21 lisäsi myös ilmaus p-AKT ja p-ERK1 /2 soluissa (p = 0,0008, p = 0,0022, vastaavasti, kuvio. 4E, F), osoitti, että uudelleen ilmentymistä miR-21 voi aktivoida AKT ja ERK1 /2 polkuja. Nämä tulokset tukevat että miR-21 voisi säädellä EMT ja CSC fenotyyppi, ja kera korjauksilla PTEN ja AKT /ERK1 /2 polkuja.

MiR-21 Kohdennettu PTEN kääntämään EMT ja CSC Fenotyyppikuvaus

sen määrittämiseksi, ehtyminen PTEN voi estää miR-21 antagomir käännetään EMT ja CSC fenotyypin, siPTEN tai ohjaus SsiPTEN transfektoitiin MDA-MB-231-soluja. 24 tunnin kuluttua solut transfektoitiin miR-21 antagomir tai negatiivinen kontrolli, ja sitten EMT ja CSC fenotyypin tutkittiin edellä kuvatulla tavalla. Olemme havainneet, että siPTEN merkittävästi alas-säädellä ilmentymistä PTEN (p = 0,002; Fig. 5A, E), verrattuna SsiPTEN ryhmiä. Yhdenmukainen vaikutukset miR-21 antagomir EMT ja CSC fenotyypin MDA-MB-231-soluja (kuvio. 1 ja Fig. 2), antagonismi miR-21 myös käänteinen EMT (N-kadheriinin, p = 0,0025; vimentiinista, p = 0,0025, alfa-SMA, p = 0,0003, E-kadheriinin, p = 0,0308; kuvio. 5B, E) ja CSC fenotyypin (ALDH1, p = 0,0014, CD44, p = 0,002; Kuva. 5C, E) MDA -MB-231 /SsiPTEN solut (

SsiPTEN + miRNA antagomir negatiivisen kontrollin ryhmät vs. SsiPTEN + miR-21 antagomir ryhmien

); ehtyminen PTEN mukaan siPTEN tukossa miR-21-antagomir suunnanvaihtoa EMT (N-kadheriinin, p = 0,0172; vimentiinista, p = 0,0113, alfa-SMA, p = 0,0015, E-kadheriinin, p = 0,016; Kuva. 5B, E ) ja CSC fenotyypin (ALDH1, p = 0,0042, CD44, p = 0,0004, Fig. 5C, E) (

SsiPTEN + miR-21 antagomir ryhmien vs. siPTEN + miR-21 antagomir ryhmien

). Nämä tulokset viittaavat siihen, ehtyminen PTEN voisi estää miR-21-antagomir -reversing EMT ja CSC fenotyypin, joka lisäksi esittänyt, että antagonismi miR-21 voitaisiin kohdistaa PTEN peruutusvalaisimia EMT ja CSC fenotyypin. Lisäksi ehtyminen PTEN aktivoitua miR-21-antagomir-esto AKT ja ERK1 /2 väyliä (p-AKT, p 0,0001; p-ERK1 /2, p = 0,0037, Fig. 5D, E) (

SsiPTEN + miR-21 antagomir ryhmien vs. siPTEN + miR-21 antagomir ryhmät

), osoitti, että AKT ja ERK1 /2 reitit ovat alavirtaan polkuja PTEN säätelyssä EMT ja CSC fenotyypin.

. MDA-MB-231-solut transfektoitiin siPTEN tai sekoitettua kontrollipeptidiä SsiPTEN lopullisessa pitoisuudessa 50 nmol 24 tuntia. Sitten solut transfektoitiin HSA-miR-21 antagomir tai negatiivinen kontrolli, jonka lopullinen pitoisuus on 50 nmol: ssa 72 tuntia. Solut trypsinoitiin, ja suhteellinen proteiinin tasot PTEN (A), EMT markkereita (B), CSC pinnan markkereita (C), p-AKT ja AKT (D), samoin kuin p-ERK ja ERK (D) mitattiin ja semi-määrällisesti (E), kuten aiemmin. Edustaja tulpat hoidot SsiPTEN plus miR-21 antagomir ohjaus, SsiPTEN plus miR-21 antagomir, ja siPTEN plus miR-21 antagomir oli kuvassa. Beta-aktiini tai GAPDH käytettiin latauskontrollina. (* Osoittaa p 0,05;

★ osoittaa p 0,001).

MiR-21 valvotuilla EMT ja CSC Fenotyyppikuvaus sekä Cell Proliferation kautta AKT ja ERK1 /2 polut

tutkimiseksi edelleen rooleja AKT ja ERK1 /2 väyliä miR-21 säätelevä EMT ja CSC fenotyypin, MDA-MB-231 /anti-miR-21-solut transfektoitiin miR-21 jäljittelee pitoisuutena 40 nmol 72 h, ja sitten soluja käsiteltiin LY294002 (estäjä PI3K-AKT) 20 umol /l tai U0126 (inhibiittori ERK1 /2), 10 umol /l: ssa 24 tuntia. Olemme vahvistaneet, että LY294002 hoito esti uudelleen ilmentäminen miR-21 asiakkuutta AKT aktivointi (p 0,0001; Fig. 6A, E), kun taas U0126 hoito poisti uudelleen ilmentäminen miR-21 asiakkuutta ERK1 /2 aktivointi (p 0,0001; Fig . 6A, E). Enemmän kiinnostavaa, uudelleen ilmentäminen miR-21 asiakkuutta EMT ja CSC fenotyypin inhiboi LY294002 (N-kadheriinin, p = 0,0005; vimentiinista, p = 0,0005, alfa-SMA, p = 0,0008, E-kadheriinin, p = 0,0002; ALDH1, p 0,0001, CD44, p 0,0001, Fig. 6B, C, E) tai U0126 (N-kadheriinin, p 0,0001, vimentiinin, p = 0,0005, alfa-SMA, p = 0,0004, E-kadheriinin, s = 0,0003; ALDH1, p 0,0001; CD44, p = 0,0005, Fig. 6B, C, E) soluissa, osoitti, että sekä AKT ja ERK1 /2 reittejä vaativat mir-21 asiakkuutta EMT ja CSC fenotyyppi, joka lisäksi ehdotetaan, että AKT ja ERK1 /2 reitit ovat kaksi rinnakkaista alavirtaan polkuja miR-21 sääntelemiseksi EMT ja CSC fenotyypin. Lisäksi sekä LY294002 ja U0126 ole todettu aiheuttavan PTEN (p = 0,1208, p = 0,4361, vastaavasti, Fig. 6D, E), joka myös tukee, että AKT ja ERK1 /2 reitit ovat alavirtaan polkuja PTEN.

perustettu MDA-MB-231 /anti-miR-21-solut transfektoitiin HSA-miR-21 jäljittelee pitoisuutena 40 nmol: ssa 72 tuntia. Sitten solut trypsinoitiin, ja käsiteltiin LY294002 (20 umol /l) tai U0126 (10 umol /l) 24 tuntia. (AE) Suhteellinen proteiinin tasot p-AKT ja AKT (A), p-ERK ja ERK (A), EMT markkereita (B), CSC pintamerkkiaineita (C), sekä PTEN (D) sokeakoekuoppaa, LY294002, ja U0126 hoitoryhmien näytettiin, ja semi-määrällisesti (E), kuten aiemmin. Beta-aktiini tai GAPDH käytettiin latauskontrollina. (* Osoittaa p 0,05;

★ osoittaa p 0,001;

▴ osoittaa p 0,05). (F) vaikutukset antagonismi miR-21, uudelleen ilmentäminen miR-21, LY294002, ja U0126 soluproliferaatioon solumäärällä (A

vs.

B, p = 0,0077; B + C

vs.

B + D, p = 0,0091; B + D

vs.

B + D + E, p = 0,0109; B + D

vs.

B + D + F, p = 0,0031).

lisäksi, tarkistaa roolit AKT ja ERK1 /2 väyliä miR-21 säätelevä solujen lisääntymistä soluissa, jotka edellä on mainittu, solujen kasvua numerot solut laskettiin 0, 12, 24, 36, 48, 60 ja 72 h kuluttua hoitojen solujen määrä. Olemme havainneet, että pakko antagonismi miR-21 väheni soluproliferaation MDA-MB-231-solujen (p = 0,0077; kuvio. 6F), kun taas uudelleen ilmentymisen miR-21 kohonnut soluproliferaation MDA-MB-231 /anti-miR -21 soluja, aikana 0-72 h (p = 0,0091; Fig. 6F). Tulokset viittasivat siihen, että miR-21 voi säädellä solun lisääminen tietyssä määrin MDA-MB-231-soluja. Samaan aikaan sekä AKT ja ERK1 /2 estoja pienenivät solujen lisääntymistä (p = 0,0109, p = 0,0031, vastaavasti, kuvio. 6F), joka ehdotti, että sääntely AKT tai ERK1 /2 liittyy muutoksiin solujen lisääntymisen.

keskustelu

miRNA ovat ei-koodaavaa pieniä RNA: ita, jotka voivat toimia onkogeenien tai tuumorisuppressorigeeneille [37], [38]. Kasvava näyttö osoittaa, että miR-21 over-ilmentymistä havaitaan erilaisissa ihmisen syövissä, mukaan lukien rintasyöpä, ja se on yhdistetty EMT [25] – [27] ja CSC ominaisuudet [26], [28]. Mutta suora tehtävät ja keskeinen molekyylitason mekanismeja miR-21 säätelyssä rintasyövän EMT ja CSC fenotyyppi on vielä selvittämättä. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että antagonismi miR-21 MDA-MB-231-solujen päinvastainen EMT ja CSC fenotyypin, sääteli ilmentymistä PTEN sekä inaktivoidun AKT ja ERK1 /2 polkuja. Tulokset osoittivat, että antagonismi miR-21 riittää kääntämään EMT ja CSC fenotyypin kautta ilmentymisen moduloimiseksi PTEN ja AKT /ERK1 /2 polkuja, joka tarjoaa jonkin verran suoraa näyttöä ja molekyylitason mekanismeja, jotka miR-21 kykenee säätelemään EMT ja CSC fenotyypin .

roolin tutkimiseksi miR-21 säätelyssä EMT ja CSC fenotyypin rintasyövän soluja, antagomir Mir-21, jotka voivat sitoutua spesifisesti ja estävät endogeenisen miR-21 molekyylejä, tai sen negatiivinen kontrolli oligomeerin , transfektoitiin MDA-MB-231-soluja. Antagomir laski 90% endogeenisen miR-21 ilmentyminen soluissa (Fig. 1A). Mielenkiintoista, suhteellinen EMT ja CSC fenotyypin palautettiin antagonismi miR-21 (Fig. 1 B-G; Fig. 2A-J), joka vastaa miR-21 liittyy edistämisessä EMT ja (tai) CSC fenotyyppi haiman syöpäsoluissa [26], [28], kilpirauhaskarsinoomaa soluihin [27], ja meidän aiemmin opiskella MCF-7-solujen [29]. Liitettävä tulokset, antagonismi miR-21 lisäsi merkittävästi ekspressiota PTEN (Fig. 3A, B, D), samoin kuin vähentynyt AKT ja ERK1 /2 aktivointi (Fig. 3C, D). Nämä tulokset osoittivat, että miR-21 on tärkeä rooli välittämisessä EMT ja CSC fenotyyppi, mukana säätelemällä ilmaus PTEN sekä AKT ja ERK1 /2 aktivointi.

Seuraavaksi selvitimme taustalla olevien mekanismien ja suhteellinen signalointi molekyylien antagonismi miR-21 käännetään EMT ja CSC fenotyypin. Vuonna sopusoinnussa miR-21 estää funktio tuumorisuppressorin PTEN ilmentymistä sitoutumalla sen 3′-UTR [20], osoitimme, että antagonismi miR-21 sääteli PTEN ilmentymistä (Fig. 3A, B, D). Kuten odotettua, PTEN alas-ilmaisu erityisesti estetty miR-21-peruutettaessa EMT ja CSC fenotyypin (kuvio. 5B, C, E), vahvisti, että antagonismi miR-21 näyttelyitä roolinsa osin edistämällä PTEN ilmaisun, ja elpyminen PTEN ilmaisun vähentäisi sen toiminta tuumorisuppressorin.

lisäksi olemme myös havainneet, että uudelleen-ilmentyminen miR-21 miR-21 jäljittelee johti aktivaatioon AKT ja ERK1 /2 väyliä (Fig. 4E, F) . Enemmän kiinnostavaa, käsiteltyjen solujen PI3K-AKT tai ERK1 /2-estäjä (LY294002 tai U0126), kiellettyjä miR-21 jäljittelee takaisin EMT ja CSC fenotyypin (Fig. 6B, C, E). Tulokset viittasivat siihen, että vaikutukset AKT ja (tai) ERK1 /2 miR-21-säätelevä EMT ja CSC fenotyypin mukaisesti, että AKT ja (tai) ERK1 /2 väyliä tarvitaan edistämään EMT ja (tai) CSC fenotyyppi rintasyövän MCF-7-soluja [32], rintojen epiteelisolut [33], [34], paksusuolen syövän soluja [35], kohdunkaulan syövän soluihin [32], ja munasarjojen karsinoomat soluihin [36].

Yhteenvetona tuloksemme osoittivat, että antagonismi miR-21 kääntää EMT ja CSC fenotyypin kautta AKT ja ERK1 /2 reitit inaktivointia indusoimalla PTEN ilmentyminen MDA-MB-231-soluja (kuvio. 7). Tutkimus osoitti suora rooli ja tuntematon mekanismi Mir-21 inversing EMT ja CSC fenotyyppi, ja tieto voi olla hyödyllistä kehittää uuden hoidon hoitoon rintasyöpiä tulevaisuudessa.

antagonismi asennuspalveli- 21 voisi inaktivoida AKT ja ERK1 /2 polkuja oletettavasti kautta PTEN ylössäätöä, ja lopulta kääntää EMT ja CSC fenotyypin MDA-MB-231-soluja.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit ja vasta-

Ihmisen on-miR-21 (MIMAT0000076) antagomir ja negatiivinen kontrolli, matkii ja negatiivinen kontrolli ostettiin Ribobio (Guangzhou, Kiina). PCR-alukkeet syntetisoitiin Sangon Biotech (Shanghai, Kiina). Reaaliaikainen RT-PCR-määritys sarjat ostettiin Takara (Dalian, Kiina). Erityiset siPTEN duplexes ja ryntäily ohjaus siRNA-sekvenssin (SsiPTEN) ostettiin Ribobio. LY294002 ja U0126 hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO, USA). Lipofectamine ™ 2000 ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). ALDEFLUOR® Kit ostettiin Aldagen (Durham, NC, USA). Fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) -leimattua anti-CD44-vasta-aine ja fykoerytriini (PE) -leimattua anti-CD24-vasta-aine hankittiin BioLegend (San Diego, CA, USA). Primaaristen vasta-aineiden, mukaan lukien kani antihumaani E-kadheriinin-vasta-ainetta (o: BS1098, Bioworlde, St. Louis, MO, USA), N-kadheriinin-vasta-ainetta (o: BS2224, Bioworlde), vimentiinin vasta-ainetta (o: BS1776, Bioworlde), alfa-SMA vasta-ainetta (o: ab5694, Abcam, Cambridge, UK), ALDH1 vasta-ainetta (o: ab51028, Abcam), CD44-vasta-ainetta (o: BA0321, Boster, Wuhan, Kiina), PTEN-vasta-aine (o: BS1304, Bioworlde), AKT-vasta-ainetta (