Krooninen sairaus

tiivistelmä

Lääkeaineresistenssi on haaste kemoterapiassa ja on herättänyt tutkimus kiinnostusta maailmanlaajuisesti ja erityistä huomiota on annettu luonnollisia yhdisteitä voittaa tämä vaikeus. Pulchrin A, uusi yhdiste eristää luonnollisista tuotteista on osoittanut uusia kehityspotentiaalia lääkeaineena. Tunnistaminen pulchrin A suoritettiin käyttäen useita spektroskooppinen tekniikoita, kuten magneettikuvaus, nestekromatografia massaspektrometriä, infrapuna- ja UV-spektrometria. Sytotoksisuuden vaikutukset CAOV-3-soluissa osoittaa, että pulchrin A on aktiivisempi kuin sisplatiinin, joka on IC

50 22,3 uM. Merkittävät muutokset solun morfologiassa oli läsnä, kuten solukalvon kupliminen ja muodostumista apoptoottisia kappaleita. Osallistuminen fosfatidyyliseriinin (PS) apoptoosin vahvistettiin anneksiini V-FITC kuluttua 24 h hoito. Apoptoosi aktivoitiin läpi sisäisen reaktiotien aktivoimalla procaspases 3 ja 9 sekä pilkotun caspases 3 ja 9 ja päättyi klo pyöveli koulutusjakson, jossa esiintyminen DNA: n pilkkoutuminen. Apoptoosi vahvistettiin lisäksi kautta geenin ja proteiinin ekspressiotasot, jossa Bcl-2-proteiini alassäädetty ja Bax proteiini sääteli. Lisäksi CAOV-3 solukierron keskeytyi klo G0 /G1 vaihe, joka johtaa apoptoosin. Molekyylimallinnus Bcl-2-proteiinien osoitti korkean sitoutumisaffiniteetin, joka esti funktio Bcl-2-proteiinien ja johti solukuoleman. Tulokset nykyisen tutkimuksen voi valottaa uusien terapeuttisten aineiden, erityisesti ihmisen munasarjasyöpä hoitoja.

Citation: Nordin N, Fadaeinasab M, Mohan S, Mohd Hashim N, Othman R, Karimian H, et ai. (2016) Pulchrin A New Natural kumariinijohdannainen on

Enicosanthellum pulchrum

, indusoi apoptoosia munasarjasyöpäsoluja kautta Luonnostaan ​​Pathway. PLoS ONE 11 (5): e0154023. doi: 10,1371 /journal.pone.0154023

Editor: Yi-Hsien Hsieh, Institute of Biochemistry and Biotechnology, Taiwan

vastaanotettu: 26 joulukuu 2015; Hyväksytty 7 huhtikuuta 2016 Julkaistu: 02 toukokuu 2016

Copyright: © 2016 Nordin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimuksen rahoittivat yliopiston malaya alla PPP avustus (PG151-2012B) ja opetusministeriön korkeakoulu Malesian High Impact Research Grants (UM -MOHE UM.C /625/1 /HIR /Mohe /SC /09).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä on merkittävä sairaus vaikuttaa ihmisiin kaikkialla maailmassa [1]. Noin puolet kaikista miehistä ja yli kolmasosa naisista on diagnosoitu syöpä aikana heidän elinaikanaan. Samaan aikaan yksi neljäsosa aikuisista kuolee syöpään [2]. Saadut tiedot International Agency for Research in Cancer (IARC) syövän rekisteröinnin ja kuolleisuus osoittavat, että lähes 12,6 miljoonaa uutta syöpätapausta ilmoitettiin pelkästään vuonna 2008 maailmanlaajuisesti [2]. Mukaan National Cancer Registry of Malaysia [3], yhteensä 8123 (44,6%) miehillä ja 10096 (55,4%) naisilla asukkaiden oli diagnosoitu syöpä Malakka vuonna 2007.

Samaan yhteensä 239,000 uutta tapausta maailmanlaajuisesti kirjattiin munasarjasyöpä [4]. Munasarjojen syöpä on kaikkein kohtalokas gynekologinen syöpä lähinnä siksi, että puutteen oireiden spesifisyyden ja biomarkkereita käytettävissä havaitsemiseen alkuvaiheessa sairauden. Useimmissa munasarjasyöpä tapauksissa myöhäisvaiheen diagnoosi oli yleisesti havaittu potilailla, jotka eivät pystyneet tehokkaasti vastata hoitoon. Yleensä näillä potilailla on 5 vuoden pysyvyys, mutta suhdeluku on alennettu 20-30% [5-7]. Hoito munasarjasyöpäpotilaalle perustuu vakioyhteyskäytäntöä jolloin leikkaus on alkuhoitona jälkeen kemoterapiaa. Kolme eri huumeita yleisesti käytetään munasarjasyöpä ovat doksorubisiini, karboplatiinin ja taksaania. Kuitenkin nämä lääkkeet ovat usein vähemmän tehokkaita, jolloin potilaat voivat osoittaa resistenssin lääkkeestä [8]. Nämä haitat ovat saaneet tutkijat tutkimaan mahdollisesti tehokkaita vaihtoehtoisia yhdisteitä hoitoa munasarjasyöpä.

Kumariini ja sen johdannaiset kuuluvat laktoni perhe käsittää bentsopyroni runkorakenteen, joka löytyy luonnossa laajalti [9]. Kumariinin johdannaisia ​​on havaittu olevan huomattavia terapeuttisia ja erilaisia ​​biologisia aktiivisuuksia [10, 11], jotka ovat käyttökelpoisia fotokemoterapiassa, antituumorisessa terapiassa ja anti-HIV-hoidon [12, 13]. Niitä voidaan käyttää keskushermoston (CNS) stimulantit [14], bakteerilääkkeet [15, 16], sienilääkkeet [17, 18], anti-inflammatoriset aineet [19], antikoagulantit [20], tuberkuloosilääkkeet [21] ja väriaineet [22]. Osa kumariinijohdannaiset on myös raportoitu fiksatiivien ja makuaineita. Kuitenkin Yhdysvaltain elintarvike- ja lääkevirasto (FDA) on säännelty käytön kumariinin elintarvikelisäaineina [23-25]. Voimakkaat antibiootit johdettu kumariinin, kuten novobiosiini, coumaromycin ja chartesium ovat kaupallisesti saatavilla [26]. Esillä olevassa tutkimuksessa, uusi kumariinijohdannainen eristettiin ensimmäisen kerran luonnon tuote,

Enicosanthellum pulchrum

. Pitkä alkyyliryhmä kytkettiin heterosyklisen kumariinia rengas tutkia sen mahdollisuuksia lupaavina syöpälääke vastaan ​​ihmisen munasarjasyövän solulinja CAOV-3 pienillä pitoisuuksilla 24 tunnin kuluessa.

Materiaalit ja menetelmät

kokeellinen

silikageeli H ostettiin Sigma-Aldrich, kun taas silikageeliä 60 (230˗400 mesh), dimetylsulfoxide (DMSO), metanoli (MeOH), etanoli (EtOH),

n

heksaani ja etyyliasetaatti (EtOAc) ostettiin Merck Co. (Saksa). 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT reagenssi) saatiin Invitrogen (Carlsbad, USA). RPMI-1640-alustassa (pH 7,4), penisilliiniä /streptomysiiniä ja naudan sikiön seerumia (FBS) hankittiin Nacalai Tesque (Japani) ja trypsiini-EDTA 10X toimitti Biowest (USA). Ultravioletti (UV) spektri ja Infrapuna (IR) spektrit mitattiin UV-spektrofotometrillä (UV-1601 Shimadzu, Japani) ja FT-IR-spektrometriä spektri RXI (Perkin Elmer, USA), vastaavasti. Ydinmagneettinen resonanssi (NMR) -spektrit rekisteröitiin 600 MHz: n Bruker (Sveitsi) spektrometri. Optinen kierto suoritettiin Jusco (Tokio, Japani). Massaspektrit rekisteröitiin elektronin spray (ESI) massaspektrometrialla IT-TOF Shimadzu, Japani. Korkean erotuskyvyn nestekromatografia (HPLC) analyysi tehtiin myös.

valmistaminen kasvin louhinta

Roots of

E

.

pulchrum

kerättiin syyskuussa 2011 vuoristometsien Cameron Highlands (Pahang, Malesia). Johtaja metsäosaston Pahang, Malesia annettiin lupa tulla ja kerätä näytteitä [27]. Tehdas tunnistettiin edesmenneen professori Kamarudin Mat Salleh päässä Universiti Kebangsaan Malesia (UKM). Näyte (SM769) sijoitettiin Botanyn Department Kasvimuseo, Faculty of Science and Technology, UKM (Bangi, Malesia). Juuret ilmakuivattiin ja jauhettiin 40-60 mesh hiukkaskokoon. Uutteet maseroimalla in

n

heksaani liuottimena. Pyöröhaihduttimessa (Buchi, Sveitsi) käytettiin liuottimien poistamiseksi näytteistä.

uuttaminen ja eristäminen pulchrin

puhdistamiseksi pulchrin A heksaani uute erotettiin pylväskromatografialla (CC) käyttämällä silikageeliä tyyppi 60 (230-400 mesh). Liuotin järjestelmää käytetään erottamaan yhdisteet gradienttipylvään vähemmän polaarinen useimpiin polaarisiin (heksaani-EtOAc-MeOH). Yhteensä 157 fraktiot kerättiin käyttäen 20 ml pulloon. Kaikkiaan 12 fraktiota säilyttämiseen perustuva tekijä kunkin yhdisteen ohutkerroskromatografialla (TLC) analyysi. Fraktio 3 (A9-A12) puhdistettiin edelleen käyttäen prep-TLC. Uusi yhdiste onnistuneesti erotettiin käyttäen

n

-heksaani-EtOAc (8: 2) liuotinjärjestelmää. Yhdistettä kutsutaan pulchrin A valaistaan ​​NMR, kun taas puhtaus pulchrin A määritettiin HPLC: llä käyttämällä 10%: sta 100% asetonitriiliä (v /v), gradienttieluointi 15 minuutin aikana virtausnopeudella 0,5 ml /min.

Rakenteelliset selventäminen Analyysit

Ydinmagneettisen resonanssin spektroskopian (NMR).

lyhyesti, pulchrin A analysoitiin NMR: tutkia läsnä protoni- ja hiili-atomia 1D (

1H ja

13C) ja 2D (COSY-45, HSQC ja HMBC) kokeissa. Yhdiste valmistettiin liuottamalla deuteroitu kloroformi (CDCI

3) NMR-putkeen. Ennen analyysin NMR-putkeen pantiin NMR-spektrometri jatkokäsittelyä varten.

massaspektroskopia (MS).

massaspektroskopia on pääasiassa määrittää molekyylipaino pulchrin A. analyysi suoritettiin hyödyntäen LCMS-IT-TOF väline. Pulchrin A liuotettiin MeOH ennen injektointia laitteeseen. Massaspektri kirjattiin positiivista ja negatiivista tilassa.

Fourier-infrapunaspektroskopia (FT-IR).

Fourier-Infrapunaspektroskopian (FT-IR) suoritettiin havaitsemiseksi läsnäolo funktionaalinen ryhmä pulchrin A. yhdiste liuotettiin CHCI

3 ja pudotetaan natriumkloridia (NaCl) pelletti. Ennen analyysiä pelletti laitettiin FT-IR-laitteella. Tulos kirjattiin imeytymistä 500-4000 cm

-1.

Ultraviolet Spectroscopy (UV) ja optinen rotaatio.

Pulchrin A liuotettiin MeOH ennen siirretään osaksi kyvetissä. Aallonpituuksilla käytetään havaitsemaan atomien, vaihteli 190 nm 800 nm. Imeytyminen Sitten kirjattiin UV-spektrofotometriä. Tulokset ilmaistiin muodossa absorptiospektri. Samaan aikaan yhteensä 0,05 M pulchrin A liuotettiin CHCI

3 ja siirretään Jasco P-1020 polarimetrillä. Lämpötila mitataan optinen kierto oli 24 ° C.

Sytotoksisuusmääritvs

kaksi ihmisen munasarjan syöpäsolujen (CAOV-3 ja SKOV-3) alun perin hankittiin American Type Culture Collection (ATCC , Manassas, USA). Kuolemattomiksi ihmisen munasarjan epiteelisoluja (T1074) saatiin Applied Biological Materials (ABM

® Crestwood Richmond, Kanada). Nämä solulinjat viljeltiin meidän laitoksen laboratoriossa. Kaikki solut jatkoviljeltiin ja kasvatettiin 25 ml: n kolviin, joka sisälsi RPMI-1640-alustassa (CAOV-3 ja SKOV-3) ja Prigrow 1 keskikokoinen (T1074) [28], on täydennetty 10% FBS: ää ja 1% penisilliini /streptomysiiniä. Konfluentit solut pestiin PBS: llä, ennen kuin otettiin talteen trypsiinillä-EDTA 10X liuos. Kerätyt solut sentrifugoitiin 1800 rpm: ssä 5 minuutin ajan ja laimennettiin 1 x 10

6 solua /ml soluja. Määritys suoritettiin 96-kuoppaisella levyllä, joka sisälsi 1 x 10

4 solua /kuoppa. Ennen käsittelyä, yhteensä 1 x 10

4 ug /ml pulchrin A valmistettiin lisäämällä 1,0 mg yhdistettä 100 ul: aan DMSO: ta. CAOV-3-soluja käsiteltiin pulchrin A pitoisuus 50 ug /ml jopa 0,78 ug /ml 2-kertainen sarjalaimennos. Soluja inkuboitiin sitten 24, 48 ja 72 tuntia. Ennen mittausta, MTT-liuosta (20

μ

L) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 3 tunnin ajan. Levy on tallennettu absorbanssilla 570 nm käyttäen mikrolevylukijaa. Tulos oli asetettu IC

50-arvo, jolloin sisplatiinia (IC

50: 30,6 uM) käytettiin positiivisena kontrollina tutkimuksessa.

Akridiini oranssi /propidiumjodidia (AO /PI) kaksinkertainen värjäys määritys

AO /PI kaksinkertainen värjäys määritys suoritettiin noudattaen standardin käytetty menettely fluoresenssimikroskopian (Lieca Q-Floro ohjelmisto). Määritys suoritettiin 25 ml: n viljelypulloon (Nunc), jolloin CAOV-3 ja T1074 solut altistettiin kanssa pulchrin A (22 uM) 24, 48 ja 72 tuntia. Ennen värjäystä, korjatun solut pestiin PBS: llä. Yhteensä 10

μ

L AO ja PI (10

μ

g /ml) lisättiin solupelletti. Solut havaittiin 30 minuutin ajan UV-fluoresenssimikroskoopilla (Olympus BX51) arvioida morfologisia muutoksia ennen fluoresenssin häipyminen.

anneksiini-V-FITC määritys

Vaikutus pulchrin A: lla alkuvaiheessa apoptoosi määritettiin käyttäen fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC), anneksiini V apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen

™). CAOV-3-soluja kasvanut 6-kuoppaiselle levylle ja käsiteltiin pulchrin A (22 uM) 24, 48 ja 72 tuntia. Solut (5 x 10

4 solua /ml) kerättiin sitten sentrifugoimalla 1600 rpm 5 minuutin ajan. Yhteensä 100 ui kutakin näytettä siirrettiin koeputkeen, joka sisälsi 5 ui FITC anneksiini V: n ja 10 ui PI. Suspensiota sekoitettiin varovasti ja lisättiin 100 ui 1 x koepuskuria. Detection suoritettiin käyttäen virtaussytometriin (BD FACSCanto

™ II, San Jose, CA, USA).

Kolorimetrinen caspases analyysi

Kysteinyylitähteitä asparagiinihappo-proteaasin (Kaspaasit) -3, – 8 ja -9 testit suoritettiin käyttäen kaupallista kittiä (kaspaasien 3, 8 ja 9 kolorimetristä määritystä: R kukin sykli koostui 2 min käänteistranskriptaasin 50 ° C: ssa, 20 s polymeraasin aktivoinnin 95 ° C: ssa, 1 sekunnin denaturaatio 95 ° C: ssa ja 20 sekuntia ja pariutuminen 60 ° C: ssa. Prosessi saatiin päätökseen, kun 40 sykliä käsittelyssä. Tiedot laskettiin sitten perustuttava suhteelliseen Ct (2-ΔΔCt) standardimenetelmä kuvattu tutkimuksessa Wong ja Medrano (2005) [29].

Western blot -määritys

CAOV-3 soluja siirrostettiin 75 ml: n viljelmä pulloon ja käsiteltiin pulchrin A (22 uM) 24, 48 ja 72 tuntia. Kerätyt solut sentrifugoitiin 13000 rpm: ssä 10 s, ja 400 ui PRO-PREP

™ lisättiin solujen suspendoimiseksi uudelleen. Solut indusoitiin lyysi inkuboimalla -20 ° C: ssa 20 min. Ennen erottamista 10% SDS-PAGE, 100 ug proteiinia jaettiin eriin ja sekoitettiin täyteväriä. Geeli annettiin edetä 90 minuutin ajan ennen kuin se siirrettiin polyvinylidenedifluoride (PVDF) kalvo (Bio-Rad). PVDF kalvo blokattiin 3 h 5% BSA. Ensisijainen vasta-aine

β

aktiinin (1: 1000), Bax (1: 1000), Bcl-2 (1: 1000), surviviini (1: 1000), kaspaasit 3 ja 9 (1: 1000 ) ja pilkotaan kaspaasien 3 ja 9 (1: 1000) on konjugoitu sekundäärisen vasta-aineen (vuohen pAb RB-IgG). Prosessi jatkettiin 1 h huoneenlämpötilassa inkuboinnin jälkeen. Sitoutunut vasta-aine havaittiin käyttäen kolorimetristä havaitsemista kit ja altistettiin useita minuutteja, jotta ulkonäkö bändejä. PVDF kalvo katseltiin ja valokuvattiin käyttäen UV-valoa transilluminaattori.

Protein profiili array

CAOV-3-solut käsiteltiin Pulchrin A (22 uM) arvioitiin apoptoottisen proteiinin markkereita käyttämällä Proteome Profiler Array (RayBio

® Human Apoptosis Vasta Array Kit, Raybiotech, USA) mukaisesti valmistajan protokollaa. Uutettiin proteiinia (200 ug /ml) välillä CAOV-3-soluja lisättiin kuhunkin kuoppaan, joka sisältää kalvon, ja jätettiin yön yli 4 ° C: ssa inkuboinnin jälkeen. Pesumenettelyn käyttäen pestä puskureita I ja II teloitettiin kullekin inkubointia. Ennen havaitsemista, kalvo lisättiin biotinyloidun vasta-aineen cocktail ja sen jälkeen HRP-streptavidiinin inkubointia yön yli. Yhteensä 500 ui havaitsemisen puskuria pipetoitiin kalvon. Alumiinifoliota kalvot siirrettiin ja altistettiin kemiluminesenssi kuvantamisjärjestelmä ja sitten valokuvattiin (Biospectrum AC Chemi HR 410, UVP, Cambridge, UK).

Cell cycle määritys

Käsitellyt solut pulchrin kerättiin talteen ja pestiin sitten kahdesti PBS: llä 1800 rpm sentrifugoimalla 5 min. Solut kiinnitettiin tallennuksesta liuoksessa lisäämällä 700 ui 90% kylmällä EtOH: lla ja pidettiin yön yli 4 ° C: ssa palauttaa solujen eheyden. EtOH heitettiin sitten pois, ja huuhdeltiin 600 ul: lla PBS: ää sentrifugoimalla 1800 rpm: ssä 5 min. Yhteensä 25 ui RNaasiA (10 mg /ml) ja 50 ui propidiumjodidia (PI) (1 mg /ml) sekoitettiin kiinteän soluihin ja inkuboitiin 1 h 37 ° C: ssa. Analyysi DNA sisällön solusyklin pysähtymisen suoritettiin virtaussytometrialla (BFACSCanto

™ II).

proteiini-sitoutumisen vuorovaikutusta

Tämä tutkimus suoritettiin käyttäen anti-apoptoottisen proteiinin Bcl- 2 conjuction standardin Bcl-2-estäjä ABT 737 [30]. Bcl-2 kolmiulotteinen kiderakenne saatiin RCSB Protein Data Bank [31, 32] kanssa 4IEH ATE id: n [30]. Automatisoitu telakointi ohjelmisto (AUTODOCK 4.2) ohjelmaa käytettiin laskettaessa telakointi pienten molekyylien, joka perustuu Lamarckian geneettisen algoritmin [33]. Vesimolekyylit poistettiin valmistamiseksi proteiinimolekyylien. Polar vetyatomit lisättiin rakenteeseen, kun taas ei-polaariset vetyatomit yhdistettiin. Lisäksi Gasteiger maksut ja solvatisoituvat parametrit määritetty oletusarvoisesti. Käyttämällä AutoGrid 4.2 ohjelmisto, ruudukon parametritiedoston asetettiin käyttäen arvoja x, y ja z akselien; ruudukon väli oli 0,375 Å, oletusarvo. Vuorovaikutus sidosenergialla laskettiin myös käyttäen AUTODOCK 4.2 ohjelman.

Tilastollinen

IC

50-arvot määritettiin käyttäen GraphPad Prism ver. 4.0 (Graphpad Software Inc, USA). Kukin koe suoritettiin kolme toistoa ja arvot ilmoitettiin keskiarvona ± keskihajonta (SD). SPSS ver. 17,0 (IBM Corporation, USA), yksisuuntainen ANOVA Dunnettin testillä analysoidaan tietoja tilastollista merkittävyyttä. Samaan aikaan kvantitatiivinen analyysit proteiineja perfomed käyttäen ImageJ ohjelmistoa.

Tulokset

rakenne tunnistaminen Pulchrin

Uusi luonnollinen kumariinijohdannainen, pulchrin A (kuvio 1) oli selvitetty käyttämällä täydellinen NMR-spektrit (taulukko 1), sekä UV-, IR- ja ESI massaspektrometriaa (S1-S7 kuviot).

HMBC korrelaatio on korostettu punainen ja sininen nuolet merkitään

J

2 ja

J

3: lla, kun taas COSY korrelaatiot musta nuoli väri.

valkoinen öljy; Saanto: 0,005%, [α] -16 (

c

0,05, CHCl

3). TLC: (

n

heksaani: EtOAc, 80:20 v /v): R

f = 0,56. UV (MeOH) λ

max (log €): 356 (3,80), 315 (4,03), 280 (4,32) nm. IR ν

max (CHCl

3); 2921, 2853 (CH), 1759 (OC = O), 1463 cm

-1. HRESIMS m /z [M + Na] 465,3240 (10), 338,3380 (90), 339,3430 (60) (laskettu C

30H

50O

2, 442,7066).

1H-NMR (CDCI

3, 600 MHz) δ ppm: 0,89 (3H,

m

, H-21), 1,25 (2H,

m

, H-18) , 1,28 (14H,

m

, H-11, H-12, H-13, H-14, H-15, H-16, H-17), 1,29 (2H,

m

, H-6 ’), 1,30 (2H,

m

, H-19), 1,32 (2H,

m

, H-20), 1,34 (2H,

m

, H-7′), 1,43 (2H,

m

, H-8 ’), 1,51 (2H,

m

, H-2), 1,55 (2H

m

, H-10), 1,59 (2H,

m

, H-5 ’), 2,02 (2H,

m

, H-9), 2,21 (2H,

m

, H-3), 2,25 (2H,

m

, H-1), 2,91 (2H,

m

, H-6), 2,93 (1H,

m

, H-4a), 4,90 (1 H,

m

, H-8a), 5,33 (1 H,

m

, H-7) , 5,35 (1 H,

m

, H-8), 5,40 (2H,

m

, H-4, H-5), 6,98 (1 H,

m

, H-4 ’).

13C-NMR (CDCI

3, 150 MHz) δ ppm: 14,1 (C-21), 22,4 (C-20), 22,7 (C-18), 24,3 (C-3), 25,2 (C- 1), 26,6 (C-2), 27,2 (C-7′), 27,4 (C-9), 27,9 (C-5 ’), 28,0 (C-10), 29,2 (C-6’), 29,5 ( C-11, C-12, C-13, C-14), 29,6 (C-15, C-16, C-17), 29,7 (C-8 ’), 32,0 (C-19), 56,8 (C -4a), 57,3 (C-6), 76,9 (C-8a), 128,3 (C-8), 129,8 (C-7), 131,0 (C-4, C 5), 134,4 (C-3 ’), 148,8 (C-4 ’), 173,9 (C-2’).

Sytotoksinen vaikutus Pulchrin

kolme solulinjat testattiin, mukaan lukien kaksi munasarjasyöpäsoluja (CAOV-3 ja SKOV- 3) ja kuolemattomiksi ihmisen normaalia munasarjan epiteelin solulinja (T1074) määrittämiseksi sytotoksisia vaikutuksia pulchrin A (taulukko 2). Lisäksi, sisplatiini testattiin myös positiivisena kontrollina tässä tutkimuksessa (kuvio 2). IC

50 tulokset osoittivat, että pulchrin inhiboi 50% CAOV-3-solujen kasvua 22,31 uM, verrattuna 33,63 uM vastaan ​​SKOV-3-soluja 24 tunnin jälkeen hoidon. CAOV-3 ja SKOV-3-soluja tutkittiin tarkemmin sytotoksisten vaikutusten 48 ja 72 h, jolla lasku IC

50-arvot, kuten on esitetty kuviossa 2. Samalla, sytotoksisia vaikutuksia pulchrin osoitti vastaavia vaikutuksia verrattuna sisplatiini 24 tunnin vastaan ​​CAOV-3 ja SKOV-3-soluissa, mikä osoitti, että pulchrin kohdistuva suurempi sytotoksisuus sekä munasarjasyövän solulinjoissa. Sitä vastoin vähemmän sytotoksinen vaikutus T1074-soluja havaittiin jopa pitoisuudet ovat yli 100 uM.

Koe tehtiin kolmena kappaleena. Tiedot ilmoitetaan keskiarvona ± SD.

Cytomorphology arviointi Apoptoosi AO /PI Double Värjäys

apoptoottinen vaikutus pulchrin A CAOV-3 ja T1074-soluja havaittu kautta morfologiset muutokset fluoresenssimikroskoopilla. Cytomorphology arviointi tehtiin CAOV-3-soluissa johtuen pulchrin oli pieni IC

50 konsentraatio vastaan ​​CAOV-3-soluissa verrattuna SKOV-3 solujen sytotoksisuusanalyysin. Käsittelyn jälkeen, jonka pitoisuus on 22 uM 24, 48 ja 72 tuntia, CAOV-3-solut osoittivat apoptoottisten ominaisuudet verrattuna T1074 soluihin. Under hoitamatta olosuhteissa solut osoittivat terve pyöristetty muoto ehjän ydin- rakenteen. Solut morfologia muutettiin 24 h kuluttua hoidon CAOV-3-solujen läsnäolo solukalvon kupliminen ja DNA: n fragmentoituminen. Laaja solujen vaurioita voidaan selvästi havaita 48 tunnin jälkeen eteenpäin läsnäolo apoptoottisten kappaleiden ja punertavan oranssi väri, mikä osoittaa, että solut tehtiin myöhään apoptoosin (kuvio 3a). Sen sijaan T1074 solut osoittivat merkittävää eroa solumorfologiaan verrattuna käsittelemättömiin T1074 solujen kohti apoptoosin prosessi, viittaa siihen, että pulchrin A oli vaaraton normaalin munasarjan soluissa (kuvio 3b).

[A] Käsittelemätön ja käsitelty -CAOV-3-solujen kanssa pulchrin A 24, 48 ja 72 tuntia hoidon jälkeen. CAOV-3-solut osoittivat kalvokennoa kupliminen jo 24 tunnin hoidon. Seuraavat 48 tuntia hoidon osoitti enemmän kalvokennoa kupliminen ja läsnäolo apoptoottisten kappaleiden ja cromatin tiivistymistä. Läsnäolo oranssi värjäys soluilla 72 tuntia hoidon, joka edustaa tunnusmerkki myöhään apoptoosin. [B] Käsittelemätön ja käsitelty-T1074 solujen pulchrin A 24, 48 ja 72 tuntia hoidon jälkeen. T1074 solut eivät osoittaneet merkittäviä eroja solujen morfologia jälkeen käsitelty pulchrin jopa 72 tuntia hoidon. VI, eläviä soluja; BL, kupliminen solukalvon; CC, kromatiinin tiivistyminen; LA, myöhään apoptoosin; AB, apoptoottisia kappaleita. (Suurennus 40 x ja 100 x).

Analyysi Kalvo Muuttaminen

Muutokset solukalvon havaittiin anneksiini V-FITC määritys suoritettiin käyttäen 25 ml: n pulloon cointaining CAOV-3 solut, joita käsiteltiin pulchrin A 24, 48 ja 72 tuntia. Kuten kuviossa 4 on esitetty, tulokset osoittivat, että CAOV-3-soluja käsiteltiin pulchrin A 24, 48 ja 72 h tehtiin varhaisessa vaiheessa apoptoosin kuten 5,3, 9,4 ja 14,3% nousu määrä ajasta riippuvalla tavalla, vastaavasti. Solut, jotka kävivät läpi myöhäisen vaiheen apoptoosin ja nekroosia kasvoi myös ensimmäisten 24-72 h käsittelyn jälkeen, toisin kuin eläviä soluja, jotka osoittivat 92,5%: sta 40,5%: n lasku solujen populaation hoidon jälkeen.

[A] ohjaus (käsittelemätön), [B] 24 h, [C] 48 tunnin ajan, [D] 72 tuntia. Tumman punainen, sininen, vihreä ja vaaleanpunainen väri osoitettu elinkelpoinen, varhainen apoptoosin, myöhään apoptoosin ja toissijainen kuolio vastaavasti. Liikkuminen solupopulaation aloitettiin Q3 (elävät solut) Q4 (varhainen apoptoosin) Q2 (myöhäinen apoptoosin), ja lopulta Q1 (toissijainen kuolio). [E] Histogrammi on solupopulaatioiden elinkelpoisten, varhaisen apoptoosin, myöhäisen apoptoosin ja toisen kuolion CAOV-3-soluissa. Tulokset olivat edustettuina keskiarvoja ± SD kolme toistoa. *

p

0,05 osoittaa merkittävää eroa kontrollista.

Analyysi Kaspaasit

Kaspaasit 3, 8 ja 9 testattiin määrittää apoptoosin reittejä. Tulokset Kuviossa 5 osoittavat, että caspases 9 ja 3 aktivoitiin pulchrin altistus luontaista ja toteutus polkuja, tässä järjestyksessä. Sitä vastoin kaspaasi 8 osoitti epäsäännöllinen arvoja, kuten on kuvattu pylväsdiagrammi, mikä viittaa siihen, että ei kaspaasi 8 havaittiin kautta stimuloimalla pulchrin A. aktivointi kaspaasien 3, 8 ja 9 vahvistettiin myös mRNA-tasoja, jossa vain caspases 3 ja 9 näytteillä yli-ilmentyminen suhteessa kaspaasi 8 ajasta riippuva tavalla. Vastaavasti, ilmaus kaspaasi 3 ja kaspaasi 9 proteiinit merkittävästi voimistunut (

p

0,05) suhteessa käsittelemättömän CAOV-3-soluja. Lisäksi, proteiinin ilmentymisen katkaistun kaspaasi 3 ja pilkottiin kaspaasi 9 kasvoi alle kolme erilaista hoitojaksojen, mikä osoittaa, että apoptoosin induktio tapahtui kautta luontaisten ja toteuttamista polkuja.

[A ja B] Kolorimetrinen ja reaa- PCR-analyysi kaspaasien 3, 8 ja 9, vastaavasti. [C] Western blot-analyysi ominaista kuvia ja histogrammi pro-caspases ja katkaistun kaspaaseiksi. Tulokset esitetty keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Merkittävä ero on ilmaistu *

p

0,05.

Analyysi mitokondrio muutokset

Tämä tutkimus suoritettiin tutkimaan osallistumista mitokondrioiden apoptoosin upon pulchrin hoito. Kolme parametrit koko ydin- intensiteetti, solun läpäisevyyttä ja sytokromi

c

release osoitti, että fluoresenssin intensiteetti on lisääntynyt, kuten on esitetty kuviossa 6. fluoresenssin näistä kolmesta parametristä kasvoi niinkin pienillä pitoisuuksilla kuin 22 uM ja merkittävän erot (

p

0,05) määritettiin konsentraationa 33 uM. Sen sijaan, fluoresenssin voimakkuus mitokondrion kalvon potentiaali (MMP) varten pulchrin A-käsitelty CAOV-3-soluissa laski pitoisuudesta riippuvalla tavalla. Merkitsevää eroa ei havaittu käsiteltyjen ja käsittelemättömien CAOV-3-solujen pitoisuuksina yli 33 uM, kun

p

0,05.

solut värjättiin Hoechst, solun läpäisevyyttä, mitokondrion kalvon potentiaalia (MMP) ja sytokromi

c

väriaineita. Kuvat Jokaisen kerroksen vangittiin saman alan. CAOV-3-solut osoittivat väheneminen solujen määrä ja MMP, kun taas solut, joita käsiteltiin pulvhrin A 24 tuntia (20-kertainen suurennus) suurentunut solun läpäisevyyden ja sytokromi

c

julkaisu. Histogrammi edustaa keskimääräistä intensiteettiä havaitaan samanaikaisesti CAOV-3 solujen pitoisuudesta riippuvalla tavalla koko ydin- intensiteetti, solun läpäisevyyttä, MMP ja sytokromi

c

julkaisu. Kaikki tiedot määritettiin keskiarvona ± SD, jossa merkittävä ero ilmaistiin *

p

0.05.

DNA Fragmentation Pitoisuus

Tämä määritys tehtiin vahvistaa esiintyminen myöhään apoptoosin soluissa käsitelty pulchrin A. esiintyminen DNA tikkaat CAOV-3-soluissa havaittiin 24 tunnin kuluttua hoidon (kuvio 7); sama havaittiin seuraavien 48 ja 72 tuntia. Muodostumista DNA tikkaat osoittautui esiintyvän DNA: n fragmentoituminen on CAOV-3-soluissa, joka indusoi apoptoosin.

Kaistat A-C: llä käsiteltyjen solujen pulchrin A 72, 48 ja 24 h, vastaavasti. Kaista D: käsittelemättömät solut.