Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Kromosomi Region Maintenance 1 (CRM1) on ydin- viejä ja sen estäjä on antituumorivaikutuksen erilaisissa syövissä. Tässä tutkimuksessa arvioitiin terapeuttista tehokkuutta romaani CRM1 estäjä KPT-185 Ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC).

Methods

NSCLC solulinjoja käsiteltiin KPT-185 muutosten arviointiin solujen elinkelpoisuus, solusyklin, apoptoosin, ja proteiinin ilmentymisen. NOD-SCID kuljettaa NSCLC solujen ksenograftit käsiteltiin oraalisesti KPT-276, kliininen analogi KPT-185, tutkia tehoa ja sivuvaikutuksia KPT-276 in vivo.

Tulokset

KPT-185 vähensi merkittävästi elinkelpoisuuden kuusi NSCLC solulinjoja on ajasta ja annoksesta riippuvalla tavalla, mukaan lukien epidermaalisen kasvutekijän reseptori-tyrosiinikinaasi-inhibiittorilla (EGFR-TKI) kestävä H1975 ja H1650GR solulinjat. Lisäksi, KPT-185 indusoi näitä NSCLC-solujen pysäyttämiseksi G1-vaiheessa solusyklin ja aiheutti apoptoosin annoksesta riippuvalla tavalla. KPT-185 hoito vähensi myös CRM1 proteiinin tasot kuudessa NSCLC solulinjoissa, ja vähennys voi täydellisesti poisti proteasomin estäjä bortetsomibi. KPT-185 aktivoitu kaspaasi 3, 8, ja 9, mutta esti surviviinin ilmentymistä NSCLC soluissa. Hiirillä H1975 solu ksenograftimallissa, kasvaimen kasvu estyi merkittävästi suun KPT-276 annon, eikä ollut mitään merkittävää hiiren kehon painon lasku tai muita sivuvaikutuksia.

Johtopäätökset

Nykyinen tutkimus osoittivat anti-kasvain vaikutuksia KPT-185 in NSCLC soluissa, kuten EGFR-TKI-resistenttejä NSCLC solulinjoissa. Lisätutkimukset arvioi antituumorivaikutuksen of KPT-185 kliinisessä tutkimuksessa varten pienisoluista keuhkosyöpää.

Citation: Wang S, Han X, Wang J, Yao J, Shi Y (2014) antituumorivaikutukset Novel kromosomi Region Maintenance 1 (CRM1) Inhibitor on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä in vitro ja hiiren tuumoriksenografteissa. PLoS ONE 9 (3): e89848. doi: 10,1371 /journal.pone.0089848

Editor: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 18 elokuu 2013; Hyväksytty: 28 tammikuu 2014; Julkaistu: 04 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Nämä kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syövän kuolemaan maailma, osuus 1,3 miljoonaa maailmanlaajuisesti syöpään liittyvien kuolemien vuosittain [1]. Histologisesti, noin 85%: lla keuhkosyöpää ovat ei-pienisoluisen keuhkosyövässä (NSCLC) [2], joista suurin osa on diagnosoitu myöhemmissä vaiheissa taudin ja kelpaamattomaksi parantavaa leikkausta. Palliatiivinen hoito sisältää kemo- ja sädehoidon ja äskettäin kohdistettu hoito, kuten epidermaalisen kasvutekijän reseptori-tyrosiinikinaasin estäjät (EGFR-TKI) gefitinibi, erlotinibi ja icotinib. Nämä hoitomuodot ovat parantaneet potilaiden selviytymiseen NSCLC [3]; kuitenkin, potilaat, jotka aluksi vastata EGFR-TKI hoitoja kehittyy lopulta hankittu resistenssi. Siten uusia terapeuttisia aineita, joilla on alhainen myrkyllisyys ja parempia tuloksia tarvitaan kipeästi potilaille NSCLC.

aikana ihmisen syövän synnyn tai syövän etenemiseen, pahanlaatuisia soluja hankkia kyky viedä avain ydin- proteiineja, jotka voivat vaikuttaa hoidon tehoon. Nämä proteiinit sisältävät tuumorisuppressoreilla ja säätelijöinä solujen apoptoosin, ydinvoiman lokalisointi joka tarvitaan niiden oikea toiminta [4]. Kromosomi alue huolto 1-proteiinia (CRM1 tai kutsutaan XPO1) on jäsen Importiini β-superperheen ydinvoiman vienti reseptorien (karyopherins). Lisäksi CRM1 on tärkein välittäjäaine tumasta, voi olla vuorovaikutuksessa leusiinirikkaita tumasta signaaleja (Ness), ja kuljetus proteiinit kautta tumahuokonen komplekseja sytoplasmaan [5] – [7], kuten EGFR, p53 ja ydinvoiman kertoimella kappa kevyt polypeptidigeenituotetta tehostajana B-soluissa -estäjä, alfa (IKB-α) [8] – [10]. Jos aktiivisuus CRM1-välitteisen vienti on estetty, proteiinien toimintaa voidaan muuttaa. Näin ollen, CRM1 estäjien voitaisiin hyödyntää uutta luokkaa kohdistaminen hoidon ihmisen syöpä. Itse asiassa tähän mennessä monia pieniä molekyyli CRM1 inhibiittoreita on kehitetty ja korkea antituumorivaikutuksen, kuten leptomycin B (LMB), ratjadone, goniothalamin, N-azolylacrylates, ja CBS9106 [11] – [15]. Nämä pienet molekyyli-inhibiittorit sitoutua kovalenttisesti kysteiinitähteen (Cys528) on NES-sitovaan uurteeseen CRM1 proteiini [16] – [17]. Vaiheen I kliinisen tutkimuksen LMB tehtiin, mutta LMB ei suositella kliinistä jatkokehitystä, koska korkea myrkyllisyys ja tehon puutteesta [18]. Sen jälkeen useita LMB analogien on raportoitu alentunut toksisuus [19].

Viime aikoina, toinen luokka CRM1 estäjä on tunnistettu, mukaan lukien KPT-185 ja KPT-276 (Karyopharm Therapeutics Inc .; Boston , MA, USA). Nämä inhibiittorit ovat valikoivasti estäjiä tumasta (SINE), ja ovat näytti olevan tehokas hoitoon tiettyjen syöpien, kuten haimasyövän, akuutti myelooinen leukemia, Manttelisolulymfooman aiheuttivat merkittäviä kasvun estymisen ja kasvainsolujen apoptoosia ilman vakavia myrkyllisyys [20] – [22]. Samaan aikaan taso CRM1 proteiinin kohonneet keuhkosyöpä kudoksissa verrattuna normaaliin keuhkojen kudoksiin. Näin ollen tässä tutkimuksessa selvitimme terapeuttinen tehokkuus näiden uusien huumeiden kaltaisia ​​CRM1 estäjät (esim, KPT-185 ja KPT-276) in NSCLC soluissa

in vitro

ja

in vivo

toivottavasti aikaan uusia käsityksen näitä lääkkeitä tulevaa tavoite terapiassa NSCLC.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjat ja reagenssit

ihmisen NSCLC solulinjat A549, H1650, H1975 , H2228, ja HCC827 saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). H1650 Gefitinibi kestävä (H1650GR) solulinja perustettiin laboratoriossamme altistamalla solu kasvavia pitoisuuksia gefitinibin 10 kuukautta. Tuloksena solulinja H1650GR oli resistentti gefitinibin

in vitro

(IC

50 30 uM). NSCLC solulinjoja viljeltiin RPMI 1640 -alustassa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA).

KPT-185 ja KPT-276 toimitti Karyopharm Therapeutics. Bortetsomibi saatiin Selleck Chemicals LLC (Houston, TX, USA). Yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä Z-VAD-FMK hankittiin Calbiochem (San Diego, CA, USA). Vasta-aineita EGFR: ää, GAPDH, pilkottiin kaspaasi-3, kaspaasi-8, pilkotaan-kaspaasi-9, poly- (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP), surviviini, ja toisen vasta-aineet on konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin (HRP) vastaan, kanin IgG: tä, ja hiiren IgG saatiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Lisäksi vasta-aineita CRM1, tumatekijä kappa kevyen polypeptidin geenin tehostaja B-solujen (NF-KB), ja IKB-α saatiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Kaikki muut reagenssit ja kemikaalit saatiin yhtiöltä Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

solunelinkykyisyysmääritys

NSCLC-solut maljattiin tiheydellä 6000 solua per kuoppa 96-kuoppalevylle ja kasvatettiin yön yli. Seuraavana päivänä, kasvualusta korvattiin tuoreella väliaineella, joka sisälsi sarjalaimennoksia KPT-185 (10 uM) tai dimetyylisulfoksidi (DMSO) kontrollina. Kahtena levyt, NSCLC solut altistettiin KPT-185, gefitinibi tai KPT-185 plus gefitinibi. Sen jälkeen, kun solut kasvoivat jopa kolme päivää, solujen elävyys mitattiin käyttäen Cell Titer 96® Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega, Fitchburg, WI, USA). Reagenssi lisättiin soluihin ja inkuboitiin vielä 3 tuntia. Absorbanssi mitattiin sitten 490 nm: ssä, jossa on mikro-levynlukijaa (Bio-rad, Hercules, CA, USA). Tiedot on esitetty prosentteina käsittelemättömien (DMSO-kontrollin) soluja.

virtaussytometrinen solusyklin ja apoptoosin määritystä

jälkeen käsittelemällä NSCLC-soluja KPT-185: ssa 48 tuntia, ne värjättiin propidiumjodi- jodidi (PI) värjäyspuskurilla (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA) 30 minuuttia huoneen lämpötilassa ja sitten mitattiin FACS sytometrialla (BD Biosciences, NJ, USA). DNA histogrammit analysoitiin ModFit LT solusyklin analyysi ohjelmisto (Varmista Software House).

Solun apoptoosia havaittiin Alexa Fluor 488 anneksiini V /Dead solukuoleman Kit (Invitrogen) mukaan kitin ohjeita. Lyhyesti, kun käsittelemällä KPT-185 48 tuntia, solut molemmista jousitus ja kiinnittyminen kerättiin ja co-inkuboitiin anneksiini V-fluoreseiini isotiosynaatti- (FITC) ja PI, sitten mitattiin FACS sytometrialla (BD Biosciences). Prosenttiosuus anneksiini V ja PI negatiivisia soluja määritettiin perustuen pistekuvioita FITC ja PI.

RNA: n eristys ja qRT-PCR

Solun kokonais-RNA eristettiin käyttämällä RNeasy Mini Kit ( Qiagen, Hilden, NRW, Saksa) ja sitten käänteiskopioitiin cDNA: han käyttäen superscript III ensimmäisen juosteen synteesi järjestelmä RT-PCR: llä (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. CDNA-näytteet monistettiin Real-time PCR seuraavat synteettiset alukkeet (Invitrogen): CRM1, 5′-GCCTCACTGAGATTGCTGGT-3 ’ja 5′-TGAAGGGCCTCCATAAGAGT-3′; ja glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH), 5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 ’ja 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’. PCR-olosuhteet asetettiin 20 ui reaktioseosta, joka sisälsi cDNA: ta (2 ui), alukkeita (400 nM kutakin, 1 ui), ja SYBR vihreä master mix (2 x, 10 ui) (Invitrogen). cDNA monistettiin Lightcycler480 Real-time PCR -järjestelmää (Roche Applied Science, Penzberg, Saksa) kanssa seuraavilla sykleillä: 95 ° C: ssa 10 min, mitä seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 s ja 60 ° C: ssa 60 s. Kaikki näytteet analysoitiin kolmena kappaleena ja toistettiin kolme kertaa. Suhteellinen ekspressiotasot CRM1 normalisoitiin GAPDH käyttäen 2-ΔΔCT menetelmällä.

Proteiinin uuttaminen ja Western blot

jälkeen käsittelemällä soluja KPT-185: ssa 48 tuntia, solut pestiin kaksi kertaa kylmällä fosfaattipuskurisuolaliuoksella (PBS) ja hajotettiin kanssa NE-PER puskurilla (Pierce Biotechnology, Waltham, MA, USA) mukaan valmistajan ohjeiden. Supernatantti (kokosolulysaatissa) kvantitoitiin ja sitten elektroforeesissa käyttämällä natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE). Proteiinit siirrettiin sitten PVDF-kalvolle (Millipore, Bedford, MA, USA) käyttäen elektroblottaus. Tämän jälkeen membraanit blokattiin 5% kuivattua rasvatonta maitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa ja Tween 20: tä (TBS-T), 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja sitten inkuboitiin primäärisen vasta-aineen kanssa 4 ° C: ssa yön yli. Seuraavana päivänä, membraanit pestiin TBS-T kolmesti ja inkuboitiin edelleen sekundaarinen vasta-ainetta HRP-konjugaattia huoneen lämpötilassa 1 tunti. Kun oli pesty TBS-T jälleen, proteiinit juovat tunnistettiin Immobilon Western HRP havaitseminen alustan (Millipore). Positiiviset kuvat tallennettiin kemiluminesenssimittaus väline (ProteinSimple, Santa Clara, CA, USA).

Immunofluoresenssimikroskopia

lokalisointi ja ilmaus CRM1, EGFR, IKB-α, NF-KB ja p53 havaittiin läsnä ollessa ja puuttuessa KPT-185 immunofluoresenssimikroskopialla. NSCLC-soluja käsiteltiin KPT-185: ssa 48 tuntia ja kiinteä 30 minuuttia 4% paraformaldehydillä. Seuraavaksi solukalvot olivat läpäiseväksi käsittelemällä Triton X-100 (0,1% w /v) PBS: ssä 15 min. Sen jälkeen, kun esto estopuskurilla, joka koostuu 5% normaalia vuohen seerumia ja 1 h, solut käsiteltiin primaarisen vasta-aineen 1 h. PBS-pesun jälkeen soluja käsiteltiin 1 tunnin ajan sekundaarisen FITC-konjugoitua vasta-ainetta ja DAPI. Mikroskooppivaloku- kuvat tallennettiin käyttämällä fluoresenssimikroskooppia (Olympus, Tokio, Japani).

Hiiri NSCLC solun ksenografti määrityksessä

neljä viikkoa vanhoja naisten ei-lihavilla diabetekseen severe combined immuunivajaisiin (NOD -SCID) hiiret hankittiin Institute of Zoology, Kiinan tiedeakatemia, ja ihon alle istutettiin kylki alueella suspension kanssa H1975-soluja (5,0 x 10

6 solua). Tuumoritilavuudet mitattiin kolmesti viikossa ja laskettiin käyttäen seuraavaa kaavaa: tilavuus (mm

3) = (leveys (mm))

2 x pituus (mm) /2. Kun kasvaimen kasvu oli stabiili (keskimääräinen koko 100 mm

3), hiiret jaettiin satunnaisesti 3 ryhmään ja suun kautta vehikkeliä (Pluronic F-68 /PVP-K29 /32), gefitinibi (100 mg /kg qd 3 viikkoa) tai KPT-276 (100 mg /kg 3 kertaa viikossa 3 viikkoa) [22]. Kasvukäyrät kasvainsolun -ksenografteja syntyy piirtämällä keskimääräinen suhteellinen kasvaimen kokoa +/- SE. Painonmuutokset (mitattu kolmesti viikossa) ilmaistiin suhteena suhteessa painoon juuri ennen ensimmäistä käsittelyä. Hiiret tapettiin, kun yksiulotteinen tuumorin halkaisija oli 15 mm, tai sen jälkeen kun menetys 10% painostaan. Näiden merkitystä eroja eri ryhmien arvioitiin käyttäen ANOVA-testi. Proteiini tasot CRM1, EGFR ja surviviinille ksenograftikasvaimissa havaittiin immunohistokemiallisesti. Tutkimus hyväksyi valiokunnan Ethics Eläinkokeiden of Cancer Institute /sairaala, Kiina Academy of Medical Sciences.

Tulokset

esto NSCLC solujen elinvoimaisuuden KPT-185

arvioimiseksi anti-kasvain aktiivisuus CRM1 inhibiittorin KPT-185, teimme solujen elinkelpoisuuden määritykset kuusi ihmisen NSCLC solulinjoissa. Soluja käsiteltiin sarjalaimennoksilla KPT-185 1 nM 10 uM 2 ja 3 päivää. Tiedot osoittivat, että KPT-185 vähensi NSCLC solujen elinkelpoisuuden annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla, jossa IC

50 1,3 nM 46 uM (kuvio 1A-F). Tässä tutkimuksessa jokaisen NSCLC solulinjaa edustivat eri molekyyli- alatyyppi NSCLC. Mielenkiintoista, KPT-185 yhtä esti elinkelpoisuutta EGFR-TKI-resistenttejä H1975 ja H1650GR solujen ja EGFR-TKI-herkkien HCC827 soluihin, mikä osoittaa, että KPT-185 voi olla hyvä ehdokas tehokkaan valvonnan EGFR-TKI-resistenttejä keuhkosyövässä . Lisäksi tuloksemme osoittivat, ettei välisen yhteisvaikutuksen KPT-185 ja EGFR-TKI (gefitinibi) käsittely kasvainsolujen elinkelpoisuuden esto (kuva 1 G H).

Kuusi NSCLC solulinjoja käsiteltiin KPT-185 48 h tai 72 h. Solujen elinkelpoisuus tukahdutti KPT-185 annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla (A~F). KPT-185 inhiboi solujen elinkelpoisuutta H1975 (G) ja HCC827 (H) soluja verrattuna vaikutus EGFR-TKI gefitinibi hoitoon. (N = 3).

induktio NSCLC solukierron pysähtymisen by KPT-185

Voit selvittää, onko vähentämistä solujen elinkelpoisuuden seuraavista KPT-185 hoitoon liittyi muutoksia solujen sykli jakelu NSCLC soluissa, analysoimme solusykleihin NSCLC soluissa 24 tunnin kuluttua hoidon KPT-185. Kontrolliin verrattuna soluihin, KPT-185 hoitoon pidätetty NSCLC-soluja G1-vaiheessa solusyklin. Tämä havainto ei esiinny H2228 solussa, joka ei ollut herkkä KPT-185 käsittelyä (kuva 2).

Solut pidätettiin G1 vaiheessa solusyklin KPT-185 herkkien solujen. (N = 3).

induktio NSCLC solun apoptoosin KPT-185

Koska KPT-185 indusoi NSCLC solusyklin pysähtymisen G1 vaiheessa solusyklin, me määrätietoisesti onko KPT-185 aiheuttama NSCLC apoptoosin. Itse asiassa, meidän tiedot osoittivat, että KPT-185 käsittelyä varten 48 h nostivat anneksiini V-värjäyksen annoksesta riippuvalla tavalla, mikä osoittaa solujen apoptoosia (kuvio 3A). Lisäksi KPT-185 indusoi H1975-solujen apoptoosiin, mutta gefitinibi ei ollut vaikutusta. Samaan aikaan molemmat KPT-185 ja gefitinibin aiheutti apoptoosia HCC827 soluissa (kuvio 3B, 3C 3D). Lisäksi, käsittelemällä soluja KPT-185: n ja gefitinibin ei johtanut synergistinen vaikutus solujen apoptoosia.

kuuden NSCLC solulinjoja käsiteltiin KPT-185 ja sen jälkeen tuumorisolujen apoptoosia arvioitiin virtaussytometrialla määrityksellä . Tulokset osoittivat annoksesta riippuvan induktion apoptoosin jälkeen 48 h hoidon (A). KPT-185 indusoi apoptoosia H1975 (B) ja HCC827 (C) solut verrattuna EGFR-TKI gefitinibi hoitoon. Edustava data apoptoosin määritystä H1975-soluissa osoitettiin (D). (N = 3).

alassäätely CRM1 ja muiden proteiinien NSCLC soluissa KPT-185

Seuraavaksi analysoimme vaikutus KPT-185 sääntelystä CRM1expression vuonna NSCLC-solut. Taso CRM1 proteiinin väheni merkittävästi käsittelyn jälkeen KPT-185 kaikissa kuudessa NSCLC solulinjoissa verrokkiin verrattuna soluihin (kuvio 4A). Kuitenkin tasot CRM1 mRNA olivat korkeampia H1975, HCC827 ja H1650GR solujen käsittelyn jälkeen KPT-185 kuin kontrollisolujen (kuvio 4B), joka osoittaa, että väheneminen CRM1 proteiinin KPT-185 ei transkriptionaalisella tasolla. Sitten tutkittiin, KPT-185-vähentää CRM1 proteiinin ekspressiota johtui aktivoinnin ubikitiinipromoottori /proteasomi-reitin. H1975, HCC827, ja H1650GR soluja käsiteltiin KPT-185: n läsnä tai poissa ollessa bortetsomibilla (10 nM; proteasomin inhibiittoria) 48 tuntia. Läsnä ollessa bortetsomibin, vähentää CRM1 proteiinin KPT-185 on lähes estetty (kuvio 4C), mikä viittaa siihen, että KPT-185 aiheuttama CRM1 ehtyminen vaatii aktivoinnin ubikitiini /proteasomin reaktiotien. Sitten arvioitiin tasot eri proteiineja, joita osoitettu olevan viemiä CRM1, kuten EGFR, p53, ja IKB-α. KPT-185 hoito vähensi myös EGFR kaikissa kuudessa NSCLC solulinjoissa (kuvio 4D Kuva S1). Kuitenkin, ei ollut merkittävää muutosta tasot NF-KB: n ja IKB-α näissä soluissa, mutta IKB-α ja NF-KB on kertynyt tuman KPT-185 hoitoryhmässä verrattuna kontrolliryhmään (kuvio 4D, 4E Kuva S1). Mielenkiintoista on, että käsittelyn jälkeen KPT-185, taso p53 yläreguloituja A549-soluja, joilla on villityypin p53, kun taas p53-proteiinin säädeltiin vähentävästi ja ainoastaan ​​tuman H1975-soluissa, joilla on p53-proteiinin (kuvio 4D 4E). Samaan aikaan, ei ollut muutosta p53-proteiinin tasoa sekä HCC827 ja H2228-soluja, ja p53-proteiinin ei ollut havaittavissa H1650 ja H1650GR soluja (kuvio 4D).

kuuden NSCLC solulinjoja käsiteltiin KPT- 185: ssa 48 tuntia. Ekspressio CRM1 proteiinin alassäädetty (A 0,05; kuva 6A). Hiiret sietivät suun kautta KPT-276 (100 mg /kg) hoidot, kuten keskimäärin 6,64% laihtuminen (kuvio 6B). Lisäksi kemoterapiaa kaltaisia ​​sivuvaikutuksia, kuten ripulia, ei havaittu. Proteiini tasot CRM1, EGFR ja surviviinille ksenograftikasvaimissa havaittiin immunohistokemiallisesti. Ilmentyminen CRM1 säädeltiin vähentävästi, ja CRM1 rajoittui tuman KPT-276 hoitoryhmässä verrattuna kontrolliin ja gefitinibin hoitoryhmässä (kuvio 6C). Ilmaus EGFR ja surviviini vaimentua in KPT-276 hoitoryhmässä verrattuna kontrolliin ja gefitinibin hoitoryhmässä (kuvio S2).

NSCLC H1975-soluja istutetaan NOD-SCID-hiirissä. Hiiret, joilla on vakiintunut NSCLC solun ksenografti annettiin suun kautta vehikkeliä, gefitinibi tai KPT-276. Kasvainsolujen -ksenografti kasvu arvioitiin 30 päivää. Kasvaimen kasvukäyrät havaittiin tilastollisesti merkitsevä tukahduttaminen H1975 solujen kasvua in vivo verrattuna ajoneuvon tai gefitinibin hoito (

P

0,05, A). Hiirillä, joille annettiin suun kautta KPT-276 (100 mg /kg, kolme kertaa viikossa kolmen viikon ajan) sietivät hoitoa hyvin (B). Proteiini taso CRM1was havaittu ksenograftikasvaimissa immunohistokemiallisesti (C, 400 x).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa selvitimme terapeuttinen tehokkuus uusien huumeiden kaltaisia ​​CRM1 estäjät NSCLC soluissa

in vitro

ja

in vivo

. Tulokset osoittivat, että SINE CRM1 -estäjä KPT-185 vähensi NSCLC solujen elinkelpoisuuden ja indusoi niiden apoptoosia annoksesta riippuvalla tavalla. KPT-185 oli myös voimakas kasvaimen vastainen aktiivisuus EGFR-TKI-resistenttejä NSCLC solulinjoja. Lisäksi KPT-185 indusoi myös solusyklin pysähtymisen G1 /S tarkastusasemaa KPT-185-herkkää NSCLC solulinjoissa, alassäädetty tasot CRM1 ja EGFR-proteiini, kertynyt p53, IKB-α ja NF-KB: nucleus, ja aktivoitu caspases-8, 3, ja 9 proteiineja NSCLC soluissa. Suun kautta anto KPT-276 inhiboi merkittävästi -tuumoriksenografti kasvua H1975-laakeri NOD-SCID-hiirissä, jotka olivat resistenttejä EGFR-TKI hoitoa. Tärkeintä on, että hiiret sietivät KPT-276-hoidon minimaalinen kehon painon ja ilman vakavaa myrkyllisyyttä. Lisätutkimukset arvioi taustalla molekyylitason mekanismeja KPT-185 antituumorivaikutuksen kliinisessä tutkimuksessa varten pienisoluista keuhkosyöpää.

Itse asiassa viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että CRM1 yliekspressio liittyy syövän etenemiseen ja kuolleisuus useissa ihmisen syövissä [23]. Esimerkiksi Zhang osoitti CRM1 siRNA johti CRM1 proteiinia pudotus ja pienentää Manttelisolulymfooman (MCL) solujen elinkykyä, ja Sinesissa aiheuttama CRM1 proteiinin translokaation tumaan, jossa sen ilmentyminen alassäädetty [22]; Näin ollen, nämä tiedot näyttivät olevan vastapäätä entisen CRM1 estäjät [13], [14], [24], [25]. Nykyisessä tutkimuksessa osoitimme, että KPT-185 vähensi NSCLC solujen elinkelpoisuuden aiheuttama apoptoosin, ja pidätti NSCLC solut G1 vaiheessa solusyklin. Nämä tiedot ovat yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten CRM1 estäjiä eri ihmisen syövissä [13], [14], [22] – [25]. Nykyinen data osoitti lisäksi, että SINE estäjä KPT-185 alassäädetty CRM1 proteiinin tasot NSCLC soluihin KPT-185 aiheuttama proteasomin hajoamista CRM1 proteiinia. Näin ollen yksi mahdollinen sytotoksinen mekanismi CRM1 estäjien on kautta ubikitiini /proteasomin reaktiotie, vähentää vienti tuumorisuppressorin proteiinien (TSP) tumasta sytoplasmaan, kuten p53, IKB-α: n ja NF-KB: n. Etchin et ai. lisäksi osoittanut, että CRM1 estäjät voivat sitoutua uraan CRM1 proteiini, joka on yleensä käytössä NES, ja estää CRM1 suunnatun proteiinin vienti [21].

Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että NF-KB: n aktivaatio on tärkeää ylläpitää kasvainsolujen elinkelpoisuuden, ja NF-KB: n aktiivisuus yksinään ei riitä indusoimaan solukuolemaa [26], [27]. Kuitenkin nykyinen tutkimuksessa olemme ei havainnut merkittäviä muutoksia NF-KB ja IKB-α ekspressiotasot NSCLC soluissa jälkeen KPT-185 hoitoa, mutta IKB-α ja NF-KB osittain kertynyt tuman KPT-185 hoitoryhmässä. CRM1 tiedetään viedä villityypin p53 tumasta sytoplasmaan syöpäsolujen kautta C-terminaalisen NES, mikä mahdollistaa tehokkaan hajoamisen p53 proteasomien. Meidän nykyisessä tutkimuksessa, huomasimme, että esto CRM1 aktiivisuuden KPT-185 esti p53 poistumasta ydin, jolloin ydin p53 keskittymisen ja vakauttamiseen p53 laaja tyyppi NSCLC A549-soluja. Vuonna H1975 soluja, joilla on mutantti p53, KPT-185 käsittely alassäädetty p53 tasoilla ja rajoittuu p53 tumaan. Lisäksi p53-tasot olivat vakaa sekä HCC827 ja H2228 soluja, mikä viittaa siihen, että apoptoosin näissä soluissa on p53-riippumatonta. Yllättäen p53 ei ollut havaittavissa H1650 ja H1650GR soluja. H1650 solulinja on aikaisemmin kuvattu solu, joka kantaa mutantin tyyppi p53 [28].

EGFR säännellään tärkeitä tuumorigeenistä prosesseja, mukaan lukien proliferaatio, apoptoosin vastus, angiogeneesiä ja invaasio, ja on usein yli-ilmentynyt kehityksen aikana ja etenemisen NSCLC [29]. EGFR voidaan havaita tumaan ja viedään solulimaan mukaan CRM1. Tutkimuksessamme osoitimme, että EGFR pienensi KPT-185-vähennetty CRM1 ilmentymistä NSCLC soluissa. Noske et ai. [30] osoittivat käänteistä yhdistys EGFR kanssa CRM1 ilmentymistä munasarjasyövän kudoksissa. Tasot EGFR-proteiinin ilmentymisen vähennettiin altistuksen jälkeen munasarjasyövän solujen leptomycin B (LMB), viittaa siihen, että CRM1 on rooli solunsisäisessä transaktivaatiota EGFR [30]. Sen sijaan, Lo et ai. havaittu lisääntynyt ydinvoiman EGFR tasoille LMB hoidon ihmisen epidermoidikarsinooma A431-soluissa [31], mikä osoittaa, että lisääntynyt ydinvoiman EGFR LMB tarjoaa uskottava mekanismi, jonka solut sukkula solun pinnan EGFR kautta tumahuokonen monimutkainen ja osaksi ydin- osastoon.

surviviini on jäsen estäjien apoptoosin perheen ja suojaa apoptoosia vastaan ​​joko suoraan tai epäsuorasti inhiboimaan kaspaasien aktivaatio [32]. PARP on substraatti kaspaasi ja sen aktivointi johtaa apoptoosiin. Meidän nykyisessä tutkimuksessa, KPT-185 pystyi aktivoimaan caspases-8, -9 ja -3, PARP, mutta estävät surviviinille kaikissa kuudessa NSCLC solulinjoissa. Nykyinen data osoitti myös, että KPT-185 kykeni indusoimaan apoptoosia sekä EGFR-TKI-herkkä ja kestävä NSCLC soluja. Lisäksi olemme havainneet, että yleiseurooppalainen kaspaasiestäjä Z-VAD-FMK täysin esti KPT-185 aiheuttama apoptoosin H1975 soluissa. Tuloksemme osoittivat, että SINE aiheuttaman apoptoosin oli riippuvainen kaspaasin aktivaatio NSCLC solulinjoissa.

KPT-185 on osoitettu olevan sopimaton farmakokinetiikan

in vivo

, joko ihon alle tai suun kautta. Kuitenkin KPT-276, rakenteellisesti KPT-185, on sopiva suun kautta hoito [22]. Mutka et ai. huomattava, että LMB on off-tavoite vaikutuksia vastaan ​​proteiineihin kuin CRM1 ja että nämä off-tavoite vaikutukset saattavat osaltaan LMB sivuvaikutusten (-20% painonmenetyksen) [33]. Nykyisissä tutkimuksessa käytimme KPT-276 annoksena 100 mg /kg kolme kertaa viikossa kolmen viikon ajan hoitoon hiiriä, joissa on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä kasvainsolujen ksenografteja. Olemme havainneet, että nämä hiiret siedetty (alle 10% painonmenetyksen) hoitoon. Lisäksi KPT-276 osoitti korkean antituumorivaikutuksen EGFR-TKI-resistenttejä NSCLC solun ksenograftit. Nämä tulokset osoittavat, että KPT-276 voi olla hyödyllinen CRM1 estäjän kliiniseen hoitoon NSCLC potilaiden, erityisesti EGFR-TKI-resistenttien potilaiden.

tukeminen Information

Kuva S1.

lokalisointi ja ilmentyminen EGFR, lKB-α, ja NF-KB: n havaittiin läsnä ollessa ja puuttuessa KPT-185 immunofluoresenssimikroskopialla. Ilmentyminen EGFR säädeltiin vähentävästi, ja IKB-α: n ja NF-KB: n on kertynyt tumaan KPT-185 hoitoryhmässä verrattuna kontrolliryhmään (400 x).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0089848.s001

(TIFF) B Kuva S2.

Proteiini tasojen EGFR ja surviviinin havaittiin ksenograftikasvaimissa immunohistokemiallisesti. Ilmaisu EGFR ja Surviviinin vaimentua vuonna KPT-276 hoitoryhmässä verrattuna kontrolliin ja gefitinibin hoitoryhmässä (400 x).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0089848.s002

(TIF)

Kiitokset

Haluamme kiittää Karyopharm Therapeutics Incorporated yritys tarjota KPT SINE yhdisteitä, ja professori Michael Wang ja Liang Zhang University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston Texas, USA, kriittisten kommentit.

tutkimus esiteltiin Poster AACR 2013 vuosikokouksessa Washington DC, USA (abstrakti # 3444).