Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kolmiulotteinen (3D)

in vitro

soluun perustuvat määritykset Eturauhassyöpä (PCA) tutkimus ovat nopeasti tulossa suosituin vaihtoehto tavanomaisiin 2D yksikerrosviljelmissä. 3D määrityksiä tarkemmin matkia microenvironment löytyy

in vivo

, ja siten sopivat erinomaisesti arvioimaan yhdisteitä ja niiden sopivuutta etenemisen lääkekehityksen putki. Halutun suuren suoritustehon tarvitaan eniten seulontoihin automatisoitu määrällisesti 3D viljelmiä on tarpeen. Tätä tarkoitusta varten, tämä paperi raportteja Prototyypin kehittäminen analyysin moduuli automaattisen high-content-analyysi (HCA) järjestelmä, joka mahdollistaa tarkan ja nopean tutkinnan

in vitro

3D soluviljelymalleissa PCA . Java pohjainen ohjelma, jonka olemme nimetty PCaAnalyser, käyttää uusia algoritmeja, jotka mahdollistavat tarkan ja nopean kvantitointi proteiinin ilmentymisen 3D soluviljelmässä. Kuten tällä hetkellä määritetty, PCaAnalyser voi määrällisesti erilaisia ​​biologisia parametrejä kuten: ytimet-count, ytimet-pallomainen jäsenyys ennustus, eri toiminta perustuu luokitteluun oheislaitteiden ja ei-syrjäisillä alueilla mitata ilmentymisen biomarkkereiden ja proteiinin ainesosia tiedetään liittyvän PCA etenemiseen sekä määrittelemällä erilliselle solu-objekteja tehokkaasti erilaisia ​​signaali-kohina suhde. Lisäksi, PCaAnalyser arkkitehtuuri on hyvin joustava, joka toimii yhtenä riippumaton analyysi, sekä eräajona; olennaista suuren tuotantotehon-seulonta (HTS). Hyödyntäminen PCaAnalyser, tarkka ja nopea analyysi automatisoidusti suurikapasiteettisten tavalla tarjotaan, ja toistettavissa analyysi jakelun ja intensiteetti vakiintunut merkkiaineita, jotka liittyvät PCa etenemistä eri metastaattinen PCa solulinjojen (DU145 ja PC3) kanssa 3D-malli osoitti.

Citation: Hoque MT, Windus LCE, Lovitt CJ, Avery VM (2013) PCaAnalyser: 2D-kuva-analyysi Based Module Tehokas määrittäminen Eturauhassyöpä Progression 3D Culture. PLoS ONE 8 (11): e79865. doi: 10,1371 /journal.pone.0079865

Editor: Gajendra P. S. Raghava, CSIR-instituutti Microbial Technology, India

vastaanotettu: 24 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 26 syyskuu 2013; Julkaistu: 20 marraskuu 2013

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat avustusta Eturauhassyöpä säätiön Australia myönnetään VMA. TH tunnustaa Louisiana hallituksen Regents läpi hallituksen Regents tukirahastoon, LEQSF (2013-16) -RD-A-19 osittain valmistelusta lopullinen käsikirjoitus. CJL tukivat australialainen jatko palkinnon. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on suurin esiintyvyys syöpä Australiassa, jossa lähes 20000 uutta tapausta diagnosoidaan vuosittain [1]. Alkaessa PCA hoito edellyttää androgeeniablaatio, joka väliaikaisesti hidastaa etenemistä, mutta syövän uusiutuminen androgeenista riippumaton muoto on yhteinen [2]. Tässä vaiheessa, PCa ei voida enää ohjata standardin hoitojen, etäpesäkkeitä esiintyy, joka on merkittävä kuolinsyy. Tällöin uusia hoitoja tarvitaan taudin torjumiseksi ennen metastasointiin.

on tärkeää käyttää 3D-malleja arviointiin kasvaimen kehitys on kuvattu aikaisemmin [3], [4]. Me ja muut, ovat osoittaneet, että 3D kulttuureissa varaa paremman alustan tutkimuksen kiinteä kasvain massat kuten kasvainsolujen tässä mikroympäristössä hahmottaa antigeeniprofiileissa ja fenotyyppisen käyttäytymistä, jotka jäljittelevät tarkemmin tuumorisoluja niin löytyy

in vivo

[ ,,,0],3], [4]. 3D-soluviljelmässä mahdollistaa hienovarainen vuorovaikutus solujen samaa tai eri alkuperää matriisiin, matkien solu-solu- ja solu-matriisi vuorovaikutuksia samanlaisia ​​kuin

in vivo

. Lisäksi oikean suuntauksen ja paikkatietojen organisaatio 3D on välttämätön syövän etenemistä [5]. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että 3D kulttuureissa voi toimia biologisesti relevantti malli lääkekehityksen putki.

antigeeniprofiileissa kasvainten leikattiin kehittynyt PCa potilaat ovat havainneet muutoksia ilmaisua lukuisten proteiinien. Näistä androgeenireseptorin (AR) [6], α6 [7], [8] ja β1 integriinin alayksiköiden [9], ja viime aikoina kemokiinireseptori CXCR4 [10] ilme on liitetty kasvaneeseen Gleason laatu ja metastaattisen levitys Eturauhassyövän. Potilaan kasvaimet johdonmukaisesti osoittavat ajan sääntely β1 integriinin alayksikkö [11] ja kemokiinireseptoria CXCR4 [12], mukana on uudelleenjaon ja alas säätely α6 integriini [7], [8].

Voimakkaasti sekaantunut PCa luumetastaasien kehittymistä ja etenemistä on integriini β1 alayksikköä [13] – [15]. Expression of α5β1 ja α2β1 on PCa soluissa on raportoitu helpottamiseksi yhteisvaikutuksia luuston stroomasoluja [15] ja edistää aktiivisesti hyökkäys ja kiinnittyminen Eturauhassyövän soluja luuhun strooman

in vitro

[14] ja kokeellinen luustometastaaseja

in vivo

[13]. Samoin laminiinin sitovan integriiniä α6β1 on osoitettu, jotta ekstravasaation ihmisen PCa solujen kierrosta luun strooman

in vivo

[16] – [18].

Vastaavasti, tutkimukset ovat osoittaneet, että kemokiini, CXCL12, on rooli ihmiskaupan PCa soluissa luuhun. CXCL12 ilmaistaan ​​stroomasolut kohde-elimiin Eturauhassyövän etäpesäkkeiden (luu, aivot, imusolmukkeiden), mutta ei muissa kudoksissa [19] ja sen reseptorin, CXCR4, ilmentyy vahvasti luun metastaattinen PCa-solujen [20], [21]. Se oli tavoitteena nykyisen tutkimuksen arvioida ja analysoida ilmaisun kuvioita ja jakelun näitä vakiintuneita merkkiaineita, jotka liittyvät PCa etenemiseen, hyödyntäen 3D-mallin kanssa suurikapasiteettisten kuvantamisen analyysi.

Toinen erittäin vaikutusvaltainen proteiini joka edistää kehitystä PCA AR [6]. AR kuuluu superperheen tumareseptorien ja välittää toiminnan androgeenien kuten 5-α-dihydrotestosteroni (DHT). AR ja sen aktivointi ligandien tärkeä rooli PCA etenemisen välittämällä vastaukset androgeenien ja aktivoimaan geenitranskription. Vaikka monet hyvin tunnettu vaikutuksia AR PCa solut ovat riippuvaisia ​​genomisen vaikutuksia, joihin liittyy kohdegeenien transkription, ei-genomiset androgeenien vaikuttaa myös solujen käyttäytymiseen. Näitä ovat aktivoinnin kinaasireaktiosarjojen ja solun tukirangan uudelleenjärjestelyn jotka voivat stimuloida solun liikkuvuus [22] – [24].

Aikaisemmin olemme raportoineet, että PCa PC3 metastaattinen solut uudelleen ilmentävät ei-kopioinnin suhteen aktiivisia AR, joka on osa välittyy Src-reitin [4]. Hyödyntämällä 3D-mallin kanssa suurikapasiteettisten kuvantamisen analyysi, se oli edelleen tavoitteena nykyisen paperin on arvioitava mahdollisuudet toiminnallista merkitystä endogeenisen AR ylössäätöä tässä solulinjassa, ja miten se voi vaikuttaa muita tärkeitä proteiinin aineosia tiedetään välittävän PCa eteneminen mukaan lukien β1-integriini.

kyky tarkasti analysoida useita kuvantamisen parametreja saatu 3D soluviljelmästä on toistaiseksi riippuvainen pitkälle erikoistuneet ohjelmia, jotka eivät suinkaan ole automatisoitu. Olemassa kuvantamisen ohjelmistoja kärsii pääosin luontaista ongelmaa kyvyttömyys nopeasti sopeutua ja mukautua muuttuviin vaatimuksiin tehokkaasti [25]. Täällä olemme kehittäneet automaattisen kuva-analyysin pohjainen ohjelmisto nimeltä ”PCaAnalyser”, joka kykenee analysoimaan erilaisia ​​muuttujia mitataan 3D soluviljelmässä perustuva 2D-kuvia.

PCaAnalyser on kehitetty kuin ImageJ [26 ] – [28] plugin, on siten mahdollisuus jakaa ja parantaa useita perustoimintoja annetaan ImageJ. Analyysi tekemä PCaAnalyser on koostumus kahden suuren algoritmeihin-rajapintoja. Ensimmäisessä vaiheessa, raja solun 3D sferoidi on havaittu, ja vaaditut maskit syntyy. Toisessa vaiheessa, ytimet havaitaan ja sferoidiviljelmiä-jäsenyydet ovat tuolloin ennustettiin käyttämällä maskeja ja rajat. Samanlaisia ​​lähestymistapoja noudatetaan havaita ja tutkia sytoplasman alueilla eristämällä ne kriittiset melusta.

paradigma PCaAnalyser, mukaan lukien raportoinnin komponentti, on tarkoitus olla joustava, jotta käyttäjä voi helposti manipuloida liittyvä analyysi on monin tavoin, lisäksi oletusasetukset.

Mitä tehokkuuden PCaAnalyser, olemme sisällyttäneet ehdokas-jäsenyyteen perustuva algoritmi nopeuttamaan tumaan-sferoidi havaitsemisen, jolloin yleinen käsittelyaika huomattavasti nopeammin. Aika monimutkaisuus analyysi on säädetty tässä artikkelissa, avustamaan arvioiden käsittelyaika, joka perustuu käytettävissä olevien tietojen-parametrit, kuten määrä pallosia per kuva, useita ytimiä kohti pallomainen ja ympärysmitan ydin. Tämä ominaisuus tarjoaa myös perustan vertailun PCaAnalyser muiden julkaistun algoritmeja.

Nykyisessä tutkimuksessa käytimme Perkin Elmer Opera ™ [29], suurikapasiteettisten konfokaali kuvantamisjärjestelmä, tuottaa ulostulo PCA 3D soluviljelymalli in mikrotiitterilevylle soveltuvassa muodossa HTS. Täydellinen jälleenrakentamiseen rakeita 3D oli muisti ja aika intensiivinen, mikä 2D-kuva hankinta 3D-objekteja, pitkin

xy

suuntainen, levitettiin vaihtoehtona. Tässä väestö pallosia, 2D-kuvan 3D objektit vaihtelivat kuvan resoluutio ja terävyys koska eri polttotasojen, että fyysisten syvyyksissä, sekä koostumus eri solukomponenttien 3D-objekteja, jotka yhdessä tehnyt segmentointia ja tunnistus haastava. Detection erilaisten yhteistyön lokalisoitu ja usean asiayhteyteen objekteja saman kanavan kuvan myös hankaloittanut huomattavasti. PCaAnalyser on suunniteltu onnistuneesti ratkaisemaan tällaisia ​​haasteita. Siten PCaAnalyser esitetään tässä tarjoaa arvokas resurssi käyttävissä 3D-soluun perustuvia malleja, erityisesti käytettäväksi suuren suorituskyvyn automatisoituja järjestelmiä.

hyödyntäminen PCaAnalyser raportoimme tässä onnistunut analyysi jakelun ja intensiteetti hyvin perustettu merkkiaineita, jotka liittyvät PCa etenemistä eri metastaattinen PCa solulinjojen (DU145 ja PC3) 3D-malli. Tarkemmin, olemme osoittaneet, että vasteena ligandin, SDF-1α, CXCR4 jakelun ja ilmaisun muuttunut, mikä viittaa toiminnallisen reseptorin. Lisäksi esitämme tässä novel koskevat tiedot alas-säätely β1-integriini hoidon jälkeen DHT. Nämä tulokset viittaavat siihen, että PC3-soluissa, ei-kopiointia ajatellen aktiivisen AR voi välittää muita tärkeitä proteiinit liittyvät PCa etenemiseen. Nämä tulokset ovat kauaskantoisia vaikutuksia koskevat AR kohdennettuja terapeuttisia myöhäisvaiheen PCa hoitoa.

Materiaalit ja menetelmät

1. Cancer Cell Lines

DU145, PC3 ja MDA-MB-231-solulinjoja ostettiin

American Tissue Culture Centre

(ATCC). PCA DU145 ja PC3 solulinjojen, pidettiin RPMI-1640 (Invitrogen), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Gibco). Breast Cancer (BCA) solulinjaan MDA-MB-231 pidettiin DMEM-F12 (Invitrogen), johon oli lisätty 10% FBS. Kaikki solut kasvatettiin 37 ° C: ssa vakio soluviljelmässä olosuhteissa (5% CO

2, 37 ° C) T75- pulloihin. Media täydennettiin joka 3 päivä. Kun solut olivat saavuttaneet 80-90% konfluenssiin ne maljattiin uudelleen (1/10) T75-pulloissa. Sen jälkeen 10-12 kohtia, solut lopetettiin.

2. Pienoiskomponentit 3D Soluviljelmät

PCA solulinjoja, solut maljattiin päälle 3D matriisin geelikerroksen (matrigeelin: BD Bioscience) in lasipohjaisella 96-kuoppaisille levyille (Matrical: PerkinElmer). Pienennysmenetelmä 3D viljelmiä, kuopat täytettiin 60 ul: n kanssa Matrigeliä ™ /elatusaineessa (70%) ja polymeroitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 1 tunnin ajan. Soluja ympättiin sitten ~5000 solua per kuoppa ja pidettiin, kuten aiemmin edellä on kuvattu. Media poistettiin huolellisesti ja täydennettävä kolmen päivän välein. Viljelmiä ylläpidettiin jopa 12 päivää. Sillä BCA MDA-MB-231, 1000 solua kuoppaa kohti maljattiin päälle 15 ui Growth Factor Reduced Matrigel (GFR Matrigel) 384-kuoppaisella CellCarrier levyn (PerkinElmer).

3. Ligandin ja lääkehoito Analyysit

Käyttäen 96-kuoppalevyformaatissa PC3-soluja kasvatettiin 3D Matrigel kulttuureissa, kuten edellä on kuvattu. Kun 9 päivän viljelyn, 3D-soluja käsiteltiin luonnollisen androgen dihydrotestosteroni (DHT, Sigma-Aldrich) 30 tuntia seerumittomassa mediaa 0, 1, 5 ja 10 nM. Vaihtoehtoisesti, 3D-viljelmät olivat ilman seerumia 16 tuntia ja käsiteltiin sitten CXCR4 ligandin: SDF-1α: (30 ng /ml, R mutta olemme laajentaneet sitä edelleen voidaan käyttää

annoskäsittelytilassa

täydentämään

single-mode

vaihtoehto. ImageJ on päivitetty vastaavasti ja siten käyttämään PCaAnalyser vähintäänkin ImageJ versio 1.44d tarvitaan.

Yksi viidestä tabbed osat liittyvät ”maskin sukupolven” on näkyvissä.

Kaiken algoritmit PCaAnalyser voidaan jakaa seuraavat sekvenssit:

i

) yleinen sferoidiviljelmiä havaitseminen ja naamio sukupolvi,

ii

) tumaan ja jäsenyys havaitseminen,

iii

) havaitseminen ja sytoplasmassa lukea ja

iv

) raportointi.

2.1 Sferoidiviljelmiä Detection ja naamio Generation

Ch-1 on kuva ytimet, ryhmiteltyinä pallomainen . Ch-1 segmentti käsitellään havaita täydellisen pallomainen alue ja rajat, jotka mahdollistavat muodostumista raja-maskin käyttäen algoritmia 1 (kuvio 2) ja vastaava merkittäviä askeleita on esitetty kuviossa 3. raja-maski, jota käytetään prosessoimaan kuvia Ch-2: (a) kohinan poisto ja (b) lukea intensiteettejä soluliman ja kalvon alueet, jotka vaihtelevat nollasta korkeisiin arvoihin. Ch-2 on hyvin epätasainen intensiteettiä, mukaan lukien arvot niin alhainen kuin nolla kalvo ja solulimassa alueen sferoidi, ja myös useita suurempi intensiteetti ja alhaisempi SNR. Näin ollen, Ch-2 ei voida käyttää rajan havaitsemiseksi sferoidi luotettavasti.

Major vaiheet sferoidi algoritmin. Muuttujia näytteen arvojen käsittely osana kulmasulkeita (ts … ).

Suurin vaiheista sferoidiviljelmiä havaitsemiseen on havainnollistettu.

Vaikka käsittelyn Ch -1, liittyvät vaikeudet signaalit johtuvat epätasaisen valaistuksen ovat kokeneita. Käyttämällä tausta vähennyslasku sopivalla säteellä liikkuvan pallo-algoritmi, pystyimme poistamaan tämän kuvan liittyvien artefaktin. Olettaen, korkeus kuin kolmas ulottuvuus on 2D pintaan taustakuvan, tarjoaa pikseli-intensiteetin suhteellisesti kyseisen kuvan. Jonka tarkoituksena on, jolla on sileä tausta, liikkuva-pallo algoritmi voi olettaa pallo valittujen säde on kaataa 2D pinnalla ja rungon volyymi saavutetaan pallo on odotettu tasoittaa tausta. Saavuttaakseen tämän ensin pallomainen-rajan havaittiin tehostamalla kontrastia huomattavasti (6 kertaa) erottamaan alhainen signaalit taustan. Seuraavassa vaiheessa, kaksi tapaa toimitettiin käyttäjälle edetä: (a) auto tai (b) manuaalinen määritellä sopivat ääriviivat perustuu syvyys alkuperäisen signaalin-gradientilla 3D-objekteja ja muut morfologiset parametrit, kuten kierron ja koko (alue). Vaihtoehdot muuntaa kuvat osaksi pienemmällä tasot myös, joka auttaa erottamaan toivottuja fragmentti kuvaa seurauksena epätasaisen valaistuksen aiheuttamaa koejärjestely.

esikäsitellyn ja edellyttäen parametrien ParticleAnalyzer lähetettiin havaita pallojen – algoritmi levitettiin noin 1000 kuvaa ja saatu tunnistus suoritettiin yli 90% tarkkuudella, verrattuna manuaaliseen mikroskopia analyysin ja yksinkertainen objekti tunnustamista ohjelmia. Kuvaa kohti, oli yleisesti 10 pallosia keskimäärin.

2.2 Nucleus ja Jäsenyys Detection

Signaali Ch-1 käytettiin nucleus havaitseminen; mutta vastaava kuva oli epätasaisen valaistuksen mikä näkyi tehokkuuden analyysin ohjelman (katso ”Original Image” kuviossa 3). Siten oli välttämätöntä rakentaa ja sisällyttää vähintään 10 lisäparametreja, jotta tarkkoja ja luotettavia ydin-tunnistus. Lopullinen nucleus algoritmin (algoritmi 2) kehittämä on esitetty yksityiskohtaisesti kuviossa 4.

Pääaskeleet tarvitaan tumaan algoritmin. Muuttujia näytteen arvojen käsittely osana kulmasulkeita (ts … ).

Tuma-kuva, saatavana Ch-1 on myös käytetty pallomainen havaitsemiseen. Kuten esitetään Algoritmi 2, ensisijaisesti, tausta vähennyslasku käytettiin laskevan epätasaisen valaistuksen, ja kuvan resoluutio sitten terävöitetty (vaihe 3). Sisällä annetaan kuva, etteivät kaikki ytimet todettiin sama korkeus pitkin z-akselia, jolloin joista osa on epätarkka kuin he asuisivat vaihtoehtoisessa polttotasoon sisällä 3D pallomainen. Soveltamalla moduulin lisääminen terävyyden ”(ImageJ toiminto), pystyimme vähentämään pikseliä ja siten parantaa ilmaisun annetun signaalin. Olemme myös soveltanut ”moitteettoman toiminnan” (ImageJ toiminto) moduuli, jotta vältetään ei-sileä tai siksak tyypin rajan-havaitseminen tumaan. Sopiva kynnys-algoritmia (vaihe 5) Sen jälkeen haetaan segmentointia ja havaitseminen ydin. Lisäksi, morfologinen suodatin pantiin suodattaa pois ei-toivotun kohinan. Vaiheet Tämän analyysin on esitetty kuviossa 5.

kriittinen liittyvät vaiheet tuman havaitsemiseen, lisäksi hoitamiseen päällekkäin aiemmin luotu vastaavaa pallomainen rajoja.

lisäksi tärkeimmistä vaiheista havaitaan pallomainen-jäsenyys ydin laadullisesti (kuva 5), ​​olemme samanaikaisesti kvantitatiivisesti jäsenyyden. Tätä varten olemme kehittäneet ja käyttöön algoritmi 3 (kuvio 6). Suorittamaan ehdokas-check in algoritmi 3, käytimme bounder-box lähestymistapa tunnistaa, onko objekti Y on mahdollisesti sisällä esine X vai ei (kuvio 7).

Pääaskeleet havaitsemiseen pallomainen-jäsenyydestä tuma on esitetty.

Jos haluat tehdä ehdokas-check in algoritmi 3 ensisijaisesti tunnistaa, onko objekti Y on mahdollisesti sisällä esine X vai ei, käyttäen bounder-box lähestymistapaa. Kun kyseessä on (A), esine Y on sisällä esine X, siis ainakin yksi nurkka bounder-laatikko Y on sisäpuolella bounder-laatikko X. Kuitenkin, vaikka jokin kulmat bounder -box Y on sisällä X, Y voi oikeastaan ​​olla sisällä X, kuten tapauksessa (B).

2.3 havaitseminen ja mittaus intensiteetit kalvo ja Solulima alueet

tiedot kautta Ch-2 odotetaan olevan eri intensiteetin taso (signaalit) ympärille ja sytoplasman alue pallomainen. Merkitykselliset alueet segmentoida tuottamalla raja-peite sferoidi edellisessä vaiheiden (kohta 2.1). Tämän ansiosta voimme luotettavasti lukea pienempi intensiteetti ei-taka-alueen ja välttää meluisia alueita.

objektiivinen oli analysoida soluihin perustuu paitsi keskimääräistä intensiteettiä vaan myös jakeluun annettuja proteiineja. Selvittämiseksi, onko proteiinien ekspression sijaitsevat ensisijaisesti solu-solu-liittymissä, tai sytoplasmassa, auttaa vahvistamaan sekä pohjapinta ekspressiotasot syöpä- ja ei-syöpäsolujen, ja missä määrin tiettyjen käsittelyjen olla proteiinin ilmentymiseen. Algoritmi mukana mittaus- intensiteetin ja luokittelemalla intensiteetti jakelu tarjoaa 4 mahdollista suuria yhdistelmiä (kuva 8), jonka avulla tietty vapaus tutkia eri malleja intensiteetti jakelu, erityisen tärkeää luokitteluun oheislaitteiden ja ei-reuna-alue. Määrittelemme erottelu alueilla automatisoidusti ja toistettavissa tavalla neljällä mahdollisella tavalla. Ne on kuvattu:

mittaaminen intensiteettiä ja luokittelu intensiteetti jakelun.

i) määritellä kiinteä leveys rajan ja alueen määritelty raja-maskin. Tämä yhdistelmä lukea koko alue maskin ja luokittelevat mitatun alueen kahteen osaan: ”perifeerinen-alueen, jonka leveys on

x

(muuttuja) pikseliä sisälle rajan ja loput ei-reuna-alue (Kuva 9).

Major vaiheista tuottaa luokiteltu lukea-kartalla.

ii) määritellä kiinteä leveys rajan ja yhteisen alueen maskin ja edellä kynnyksen. Nämä yhdistelmät ovat samankaltaisia ​​kuin edellä mainitut vaihtoehto, joka on

numero

– (

i

), paitsi sijaan käsittelyssä koko alue maskin, se ottaa huomioon ne intensiteettiä, mikä on ylhäällä määritetyn raja-arvon. Suuret vaiheet on esitetty kuviossa 10. kynnys voidaan määrittää automaattisesti sekä manuaalisesti valintaikkuna esitetty kuviossa 11. On myös mahdollista tarkistaa vaikutusta visuaalisesti. Vastaavanlainen dialogi on saatavilla ImageJ, mutta ImageJ versio dialogi on rajoitettu kulkee valitun kynnyksen-arvot räätälöityjä laajennuksia of PCaAnalyser. Niinpä kehittänyt samanlaisen mutta laajennettu dialogi (kuva 11) PCaAnalyser.

Suurin vaiheista tuottaa luokiteltu lukea-kartan kautta raja-maskin ja kynnyksen-naamio. Kuvat esittävät DU145 sferoidin kasvatetaan 3D matriisi seuraavat immunologiseen merkintää varten α6 integriinin alayksikkö. Paneelit tässä kuviossa viittaavat intensiteetti vasta ja jakelu α6 integriinin alayksikkö. Merkinnät oli läsnä ensisijaisesti reuna-alueella pallomainen rakenne.

iii) Suhteellinen leveys keskeltä pallomainen (objekti) kertoimella y (missä) ja alue määritellään raja-naamio. Toisin kuin kiinteä leveys, tämä vaihtoehto määrittää ensin keskelle kohteen ja sitten soveltaa verrannollinen leveys luokitella pikselin perusteella, onko se kuuluu perifeerinen tai ei reuna-alueella. Prosessi on esitetty kuvassa 12A.

A) Vaiheista käsittelyyn lukea-kartta luokitukset vaihtoehtoja asetettu suhteessa leveyden ja raja-naamio. Kuvat esittävät DU145 sferoidin 3D-matriisiin seuraavat immunologiseen merkinnät β1 integriinin alayksikkö. Paneelit tässä kuviossa viittaavat intensiteetti vasta ja jakelu β1 integriinin alayksikkö. Jakauma β1 pysyi pääosin ympäri ulkokalvon /reuna-alueella pallomainen. B) Alkuperäinen kuva DU145 sferoidiviljelmiä B ”) soveltaminen PCaAnalyser hyödyntäen tallustella-breaking tehtävät, kun suurennuslasin signaali ohjelmisto löytyy nollasta signaalit kahden palloset kuten massat ja se havaita yhtenä sferoidin.

perifeerinen vs. ei-reuna-toiminto (kuva. 12A) oli erityisen käyttökelpoinen tutkittaessa kemokiinireseptori, CXCR4, ilmaisun ja jakelu vastauksena ligandikäsittelyn. Tavoitteena oli arvioida, oliko eroja ilmaisua sekä poissa ja läsnä sen ligandin, SDF-1α. Koska SDF1α, CXCR4 proteiini vasta ilmaistaan ​​reuna-alueiden pallosia. Hoidon jälkeen kuitenkin CXCR4 ilmentyminen muuttuu ja kulkeutuu syvemmälle keskelle pallomainen ja todettiin sisällä kuin reuna-alueilla. Näin ollen, tämä analyysi antaa validointi, onko vai ei-proteiini on toiminnallinen 3D-soluviljelmässä malli järjestelmä, vai ei.

iv) Suhteellinen leveys keskellä pallomainen (objekti) kertoimella y (jossa ,) ja alue on määritelty raja-maskin ja kynnyksen-maskin. Tämä on sama kuin välittömästi edellinen yhdistelmä (

numero

– (

iii

)), paitsi että luku-kartan sulkee pois ne pikselit, ovat alle (ylempi) arvo määritetty kynnys-maskin.

Visuaalisesti kuva kuviossa 12A voitaisiin mahdollisesti pitää kahtena erillisenä rakeita lähellä toisiaan. Kuitenkin on tunnettua, että ajan myötä viljelmässä, sferoidit voidaan yhdistää ja sulautuvat yhteen muodostaen suurempia massoja [3]. Siksi oli välttämätöntä muotoilla prosessi, joka voi todentaa yksittäisiä vs fuusioituneen objekti. Meillä on toteuttanut tämän kautta ominaisuus nimeltä ”false clump-breaking” ehdokas. Tämä ominaisuus auttaa PCaAnalyser ohjelmisto selvittää steroideja todella kytketty vai ei. Väärät clump-breaking on vaikea havaita visuaalisesti, mutta PCaAnalyser ratkaisee tämän ongelman signaalin vahvistamiseksi selkeämmin määritellä tilannetta, jossa pieni signaali olemassa (ts väärät clump-breaking ehdokas) versus mitään signaalia olemassa (ts tosi clump- rikkomatta ehdokas). Periaatteena on, että monistuminen ”ei signaalia” pysyy nolla.