Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

rooli neutrofiilien tuumoribiologiassa on suurelta osin ratkaisematta. Äskettäin riippumattomat tutkimukset osoittivat joko neutrofiilien ekstrasellulaarisen ansat (verkolla) tai Tissue Factor (TF) osallistuminen syövän biologian ja niihin tromboosi. Kuitenkin niiden erillisistä tai yhteenlasketuista rooli paksusuolen adenokarsinooma on edelleen tutkimaton.

Methods

kolektomian kudosnäytteet ja vaihteleva määrä tyhjennys imusolmukkeet saatiin kymmenelle potilaalle adenokarsinooma. NETeista laskeuman ja neutrofiilien läsnäoloa sekä TF ilmaisun tutkittiin immunovärjäyksellä. Vaikutus verkkojen syöpäsolujen kasvua tutkittiin

in vitro

yhteistyössä viljelmistä Caco-2 cell line ja akuutti myelooinen leukemia alkusolut. Lisääntymistä ja apoptoosia /nekroosia syövän solut analysoitiin virtaussytometrialla.

Tulokset

TF-laakeri NETeista ja neutrofiilien lokalisointi olivat näkyvästi tuumorisektioiden ja vastaavien metastaattinen imusolmukkeiden. Mielenkiintoista, neutrofiilikeräytymän ja NETeista keskittyminen vähitellen vähennetty kasvain massa distaaliseen marginaali.

in vitro

-muodostunutta NETtien estäneet kasvua syövän soluviljelmissä indusoimalla apoptoosin ja /tai proliferaation.

Johtopäätökset

Nämä tulokset tukevat edelleen rooli neutrofiilien ja NETeista syövän biologian. Ehdotamme myös niiden osallistuminen on syöpäsolujen kasvua.

Citation: Arelaki S, Arampatzioglou A, Kambas K, Papagoras C, Miltiades P, Angelidou I, et al. (2016) Gradientti Soluttautuminen Neutrofiilien Extracellular Trap Colon Cancer ja todisteet niiden osallistuminen Kasvainkasvua. PLoS ONE 11 (5): e0154484. doi: 10,1371 /journal.pone.0154484

Editor: Nades Palaniyar, The Hospital for Sick Children ja Toronton yliopisto, Kanada

vastaanotettu: 1 maaliskuu 2016; Hyväksytty: 14 huhtikuu 2016; Julkaistu: 02 toukokuu 2016

Copyright: © 2016 Arelaki et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: hanke tukivat hallintoneuvoston yliopistollisen sairaalan Alexandroupolis. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

syöpä on johtava syy sairastavuus ja kuolleisuus kaikkialla maailmassa, jossa etäpesäkkeitä ja syöpään liittyvän tromboosin käsittää kuolinsyistä joissa syöpäpotilaille. On hyvin tunnettua, että suhde syövän ja immuunijärjestelmä ei ole rajoitettu ainoastaan ​​valvonnan nousua vastaan ​​monoklonaalisia sairauksia, vaan myös perustettu pahanlaatuisia kasvaimia. Vuorovaikutusta immuunijärjestelmää ja syövän määrittää monia näkökohtia kliinisen esityksen ja taudin etenemistä [1]. Vaikka neutrofiilit muodostavat yleensä näkyvin tulehdussolujen väestön suhteellisen vähän tiedetään niiden vaikutuksia ihmisen kasvaimissa. Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että neutrofiilit välittävät välinen ylikuuluminen syövän ja immuunijärjestelmän [2,3]. Kasvaimen infiltroituneen neutrofiilejä on myös raportoitu helpottamiseksi etäpesäkkeiden, lähinnä muuttamalla microenvironment metastaattisen vaurion [4-6]. Lisäksi neutrofiliaa on liittynyt huonompi ennuste syöpäpotilailla [7], kun taas neutrofiilien ja lymfosyyttien osuus on ehdotettu ennustetekijä useiden syöpätyyppien, kuten paksusuolen syöpä. [8]

äskettäin avainmekanismin neutrofiilien, neutrofiilien Solunulkoisilla Trap (NETien), on uudelleen niiden roolia tuumoribiologiassa [4-6,9-11]. NETit ovat solunulkoinen chromatin rakenteita koostuu soluliman, rakeinen ja ydin- komponentteja neutrofiilien, määritettiin aluksi antimikrobinen vastauksena [12,13]. On kuitenkin yhä enemmän näyttöä avainroolia-verkkoja ei-tarttuvien tautien, kuten tromboosiin [14,15], autoimmuunisairauksien [16], autoinflammatorisen [17], sydän- ja verisuonitaudit [15], fibroosia [18] ja syöpä [ ,,,0],11]. Tähän mennessä on ehdotettu, että verkoilla toimittava primaarikasvaimen edistää syövän etenemistä [4,11], kun taas kauko-sivustoja he sitovat verenkierrossa syöpäsoluja suosimalla etäpesäkkeiden [5,6,19]. Lisäksi NETit ovat sekaantuneet syöpään liittyvä tromboosi [9,11].

Lisäksi Tissue (TF) tärkeimmät

in vivo

aloitteentekijä hyytyminen on raportoitu olevan keskeisessä rooli syövän biologian [20,21]). TF-trombiinin akselilla, sen lisäksi implisiittisesti vuonna syöpään liittyvän tromboosi, on osoitettu olevan hyvin tehokas angiogeeninen kiinteistön kautta signalointi sen seriiniproteaasien kautta PAR. Näin ollen, tämän reitin on osoitettu olevan osallisena neoangiogeneesin ja syövän etäpesäkkeiden [22]. Niistä solut osaa ilmaista TF, syöpäsolut ja neutrofiilit muodostavat lähde tämän prokoagulanttiaktii- ja proinflammatoristen agentti. Kuitenkin yhdistetty rooli TF ja-verkkoja syöpäbiologian ole koskaan ollut aiemmin käsitelty.

Tässä tutkimuksessa selvitettiin läsnäolo-verkkoja kiinteiden kasvainten ja metastaattisen imusolmukkeiden paksusuolen adenokarsinooma potilaille ja heidän

vuonna vitro

vaikutuksia kulttuureissa paksusuolen syövän parit ja leukemiasoluja. Osoitamme ensimmäistä kertaa, että verkot on läsnä kirurgisista näytteistä paksusuolen adenokarsinooma ja vastaavien metastaattisen imusolmukkeet ja ne ovat myös koristeltu TF. Olemme myös ilmoittaa, että NETeista voivat rajoittaa syöpäsolujen kasvua

in vitro

indusoimalla apoptoosin ja /tai proliferaation.

Materiaalit Menetelmät

Human näytteet

Tätä tutkimusta varten, formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettuja kirurginen kudosnäytteiden 10 potilasta, joille oli tehty kolektomian varten adenokarsinooma, mukaan lukien tyhjennys imusolmukkeet, tutkittiin. Potilaiden ominaisuudet osoitettu S1 taulukossa. Osiot tehtiin peräkkäin kohden cm päässä kasvaimen massan jopa kirurginen marginaali jokaisesta näytteestä paksusuolen adenokarsinooma. Lisäksi sekä metastaattisen ei-metastasoituneen tunnistettavissa imusolmukkeet tutkittiin.

Lisäksi 10 terveen luovuttajan otettiin verinäytteet eristämiseksi polymorfonukleaarisista neutrofiilien (PMN).

Kirjallinen lupa oli myöntämä kaikki henkilöt mukana tässä tutkimuksessa. Tutkimuksen protokollan suunnittelu oli mukaisesti Helsingin julistuksen ja hyväksyi eettinen Review Board of yliopistollisen sairaalan Alexandroupolis.

immunohistokemia /Immunofluoresenssikoe

Osiot poistettiin parafiini ja immunosolukemiallisten värjäys suoritettiin käyttämällä LSAB /HRP-pakkausta (DAKO), kuten aiemmin on kuvattu [23]. Neutrofiilielastaasin havaittiin IgG kanin polyklonaalista anti-neutrofiilielastaasin-vasta-ainetta (1/50 laimennus, Santa Cruz, CA, USA, sc-25621). Sitten leikkeitä vastavärjättiin hematoksyliinillä, kuivattu ja kiinnitetty. Hiiren monoklonaalinen IgG1 käytettiin negatiivisena kontrollina. Näytteet visualisoitiin valomikroskoopilla (Nikon, malli Eclipse E400) ja kuvien otettiin käyttäen Nikon digitaalikamera (ACT-1 Nikon-ohjelmisto).

immunofluoresenssilla, leikkeet värjättiin kuten aikaisemmin on kuvattu [24]. Ei-spesifinen sitoutuminen estettiin 2% vuohen seerumia 2% BSA-PBS: llä. NET värjättiin kaniinin anti-sitrullinoitujen histoni H3 polyklonaalista vasta-ainetta (Abcam, UK; ab5103), hiiren anti-NE monoklonaalinen vasta-aine (Santa Cruz, sc-55548), kanin anti-NE poluclonal-vasta-ainetta (Santa Cruz, SC- 25621) ja hiiren anti-myeloperoksidaasi monoklonaalinen vasta-aine (Santa Cruz, sc-52707). TF havaitsemista IgG1-TF mAb (Sekisuin Diagnostics, Lexington, USA; 4508) käytettiin. Vuohi anti-kani-Alexa fluor 647-vasta-ainetta (Invitrogen, Carlsbad, USA, A21244), ja polyklonaalinen kanin anti-hiiri-Alexa fluor 488-vasta-ainetta (Invitrogen, A11059) käytettiin sekundaarisena vasta-aineita. Osiot vastavärjättiin DAPI, asennettu ja visualisoida konfokaalimikroskopia (Spinning Disk Andor vallankumouksen konfokaali System, Irlanti) on PLAPON 606O /TIRFM-SP, NA 1,45 ja UPLSAPO 100XO, NA 1,4 tavoitteita (Olympus, Hampuri, Saksa).

Solujen eristämisen

Perifeerisen veren neutrofiilien eristettiin heparinisoidusta verestä terveiltä luovuttajilta, kuten aikaisemmin on kuvattu [24]. Ensisijainen ihmisen akuuttia myelooista leukemiaa (AML) soluja eristettiin käyttäen Biocoll erottavan Solution mukaan valmistajan ohjeiden (Biochrom, Berliini, DE) perifeerisestä verinäytteistä peräisin potilaista yliopiston sairaalan Alexandroupolis, Kreikka. AML diagnoosi tehtiin noudattaen Maailman terveysjärjestön kriteerien.

Soluviljely, stimulaatio ja Inhibitiotutkimuksissa

Caco-2 [Caco2] (ATCC

® HTB-37

™) (ATCC, Manassas, USA) soluja viljeltiin 5% CO

2, 37 ° C: ssa, ja L-glutamiinia Eaglen Minimum Essential Medium (EMEM; Gibco BRL, New York, USA). AML-soluja viljeltiin 5% CO

2, 37 ° C: ssa Myelooisen pitkäaikaista Culture Medium (Myelocult

™ H5100; Stem Cell Technologies, Vancouver, Kanada). Sekä Caco-2 ja AML-soluja stimuloitiin 500 ng: NET rakenteet eristetään neutrofiilien käsitelty edellä mainittujen aineiden tai koko PMN esikäsitelty näillä aineilla, 4 päivää. NET rakennustelineet esto, eristetty NET rakenteita esi-inkuboitiin DNase1 (10 U /ml; Fermentasilta, Vilna, Liettua) tai hepariinia (hepariininatrium, 100 ug /ml; LEO Pharma A /S, Ballerup, Tanska) 60 min . TF inhibitio IgG1 hiiren anti-humaani TF mAb (10 ug /ml; Sekisui Diagnostics) käytettiin.

Neljä kuvaa otetaan satunnaisesti eri alueiden kuhunkin kuoppaan 100x suurennus koetta kohti analysoitiin. Keskimääräinen pinta-ala kattaa solut laskettiin Fiji /ImageJ [25].

NET rakenne sukupolvi, eristäminen ja kvantifiointiin

Tuottaa NETit, 1,5 x 10

6 neutrofiilejä ympättiin kuusi-kuoppaisilla viljelylevyillä (Corning Incorporated, New York, USA) matalan seerumin RPMI (Gibco BRL), kuten aikaisemmin on kuvattu [13], ja niitä käsiteltiin sepsis seerumin [14], on eristetty verinäytteistä peräisin sepsispotilaista on Academic Hospital of Alexandroupolis, Kreikka, 210 min. Neutrofiilit inkuboitiin myös forboli-12-myristaatti-13-asetaatti (PMA) (40 ng /ml; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), joka on yleinen indusoija NET vapautumisen, 210 min. Sen jälkeen väliaine poistettiin ja solut pestiin RPMI. Lisäksi 1 ml RPMI lisättiin kuhunkin kuoppaan ja NET kerättiin sen jälkeen voimakkaasti sekoittaen. Elatusaine sentrifugoitiin 20xg 5 min ja NET kerättiin supernatantti vaiheessa. Nämä pitoisuudet ja ajankohtina olivat optimaalisia neutrofiilien stimulaatio mukaan optimointiin kokeita. DNA-pitoisuus määritettiin käyttäen Nanodrop.

Solujen proliferaatio ja apoptoosi

analyysi solujen lisääntymistä, Caco-2- ja AML solut värjättiin 5 (6) -carboxyfluorescein diasetaatti N-sukkinimidyyli esteri (CFSE, Sigma-Aldrich) [26], CD34 APC (klooni 8G12, BD Biosciences, New Jersey, USA) ja CD45 PerCP (klooni 2D1, BD Biosciences) ennen stimulaatiota. Kokeet suoritettiin ja analysoitiin ajastin sarja kokeita harkitsevat isän väestön vertailun solujen korkeimmat CFSE intensiteetti, mukaan maamerkki julkaisuihin [27,28].

analyysi apoptoosin /nekroosin, Caco-2 ja AML solut värjättiin FITC-anneksiini V (BD Biosciences) ja propidiumjodidilla (PI, Sigma-Aldrich). AML solut värjättiin myös CD34 APC (klooni 8G12, BD Biosciences).

leviämisen ja apoptoosin analyysi suoritettiin 4 päivän kuluttua yhteistyön kulttuurin verkoilla on FACScalibur -virtaussytometrissä (BD Biosciences). Kaikki tiedot analysoitiin Flowjo V10.

Tilastollinen

Tilastolliset analyysit tehtiin käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysi (ANOVA), jossa Scheffen testi post hoc vertailuissa. P-arvot olivat alle 0,05 pidettiin merkittävinä. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin OriginPro 8.

Tulokset

NETit ovat läsnä ihmisen paksusuolen adenokarsinooma ja metastaattinen imusolmukkeiden

Koska on äskettäin ehdotettu, että NETeista kietoutuvat syövän etenemisen ja etäpesäkkeiden hiiren keuhkoissa ja maitorauhasen kasvain mallit [4,11], tutkimme, ovatko ne läsnä ihmisen paksusuolen adenokarsinooma ja niiden metastaattinen imusolmukkeiden.

tätä varten käytimme konfokaalimikroskopia tutkia kasvain näytteet kolektomian varten adenokarsinooma kymmenen potilasta. Havaitsimme merkittävän laskeuman NETeissa tuumorisektioiden, kuten solunulkoinen rinnakkaispaikantumisen of neutrofiilielastaasin kanssa sitrullinoitujen H3 (kuvio 1Ai ja 1Aii) ja neutrofiilielastaasin kanssa myeloperoksidaasi (kuvio 1Aiii) in konfokaalimikroskopia, toisin kuin niiden puuttuessa normaalin suolen osissa samaa potilailla. Erityisesti NETit olivat paikallisia läheisyydessä syöpäsolujen ja strooman (kuvio 1Aii) ja jopa rauhas lumenin tärkeimmistä paksusuolen massan. Voit tarkistaa havaintomme alemmissa suurennuksen, sama kudosnäytteet tutkittiin neutrofiilien läsnäoloa neutrofiilielastaasi immunohistokemiallisesti. Neutrofiilit värjättiin NE oli samanlainen lokalisointi kasvain kuin NETeissa (kuvio 1 B). Odotetusti, neutrofiilit olivat nähtävissä myös hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0.05.

tutkimme seuraavaksi NETit estävät Caco-2 kasvu apoptoosin kautta. Näin ollen, Caco-2-soluja käsiteltiin edellä mainittujen aineiden ja osoitti kohonneita apoptoottisten ja myöhäisten apoptoottisten solujen, kuten arvioidaan anneksiini V /PI virtaussytometrialla (kuvio 4C ja 4D). DNaasi I tai hepariinin heikennettyjä tämä vaikutus apoptoosiin (kuvio 4C ja 4D). Lisäksi, apoptoosin induktion NET oli pitoisuudesta riippuvainen (tuloksia ei ole esitetty) .Nämä tiedot osoittavat, että NET, riippumatta NET tuottavien ärsyke, toimivat voimakkaita inhibiittoreita koolonkarsinoomasoluissa kasvu

in vitro

indusoimalla apoptoosin näissä soluissa.

NETit estävät myös akuutti myelooinen leukemia solujen kasvua

in vitro

selventää, onko tämä estävä rooli-verkkoja syöpäsolukasvua soveltuu vain paksusuolen adenokarsinooma tai ilmenee muun tyyppisiä maligniteetteja samoin, tutkimme niiden vaikutuksia ihmisen hematopoieettisten syöpä. Näin ollen teimme

in vitro

yhdessä viljelemisen kokeilut ensisijainen AML-solujen läsnä ollessa NET.

Samoin Caco-2-soluihin, PMA tai sepsiksen aiheuttamaa NET tai vastaavasti pre-stimuloitujen neutrofiilit merkittävästi tukahdutti kasvua AML-solujen (S2B kuvio) ja indusoi apoptoosin (S2C ja S2D kuvassa). Lisäksi NET-käsiteltyjen AML soluista osoitti huomattavaa vähentämistä niiden leviäminen verrattuna kontrolleihin, joka arvioidaan virtaussytometrialla (kuvio 5A ja 5B). Toisaalta, NET chromatin tukirakenne estäjät (DNaasi tai hepariini) lakkautetaan NETeista vaikutuksia sekä AML soluproliferaatioon ja apoptoosiin (kuvio 5A ja 5B, S2D kuvassa).

(A), (B) CFSE virtaussytometrialla AML-solujen viljeltiin yhdessä joko PMA: lla tai sepsis seerumin aiheuttama NET läsnä ollessa tai poissa ollessa NET tukirakenteen estäjiä. (A) edustaja sirontakuvaajiin. (B) Tiedot neljästä itsenäisestä kokeesta esitetään keskiarvona ± SD. ei riittävä-ei merkittävästi verrattuna kontrolliin, * p 0.05.

Nämä tiedot yhdessä edellisen havainnot viittaavat siihen, että NETtien, riippumatta ärsyke, on myös potentiaalisesti universaali estävä rooli ensisijainen ihmisen syöpäsolujen viljelmillä havaittiin soluissa akuutin myelooisen leukemia.

keskustelu

tässä tutkimuksessa osoitimme ensimmäistä kertaa läsnäolo NETien, koristeltu TF, paksusuolen adenokarsinooman osissa sekä primaarikasvaimen massa ja vastaavien metastaattinen imusolmukkeiden . Tarjoamme myös näyttöä mahdollisesta roolista NETien rajoittaa

in vitro

syöpäsolujen kasvua indusoimalla apoptoosin sekä viljelmiä Caco-2 ja ensisijainen AML soluja. Lisäksi NETit esti

in vitro

proliferaation AML soluissa.

Aiempien raporttien, että niissä on NETeissa syövän koepaloja [6,19], osoitimme runsaasti-verkkoja paksusuolen adenokarsinooma kohdat molemmat primaarikasvaimen ja metastaattisessa imusolmukkeiden, kuten solunulkoinen colocalizations of neutrofiilielastaasin kanssa sitrullinoitujen histoni H3 tai MPO. Lisäksi havaitsimme lisääntynyt tunkeutuminen neutrofiilien nämä kohdat selvittämiseen lähde näitä verkkoja. Varsinkin NET tuottavien neutrofiilit osoitti yhdistelmäraportti kuvio, mahdollisesti seurauksena neutrofiilien kiinnittämiseksi on jo muodostunut NETeista ja edelleen tuottaa enemmän verkkoja. Vaikka lisääntynyt läsnäolo neutrofiilien havaittiin myös standardin histokemiallista H 0.05.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0154484.s002

(TIF) B S1 Taulukko. Kliiniset ominaisuudet Potilaat, joilla on peräsuolen syövän.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0154484.s003

(DOC) B