Krooninen sairaus

tiivistelmä

Hedgehog (Hh) signalointi on olennaisia ​​rooleja erilaisissa kehitys- prosesseja, ja sen poikkeava sääntely johtaa geneettisen häiriöiden tai maligniteetteja erilaisissa kudoksissa. Hyperactivation Hh-signaloinnin liittyy keuhkosyöpään kehitystä, ja on ollut laajoja ponnisteluja tutkia, miten hallita Hh-signalointireitin ja säätelevät syövän solujen lisääntymistä. Tässä tutkimuksessa selvitettiin roolin CDO, joka on Hh co-reseptorin, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Inhibitio Hh-signaloinnin SANTin-1 tai siCDO keuhkosyövän soluja vähentää proliferaatiota ja tuumorigeenisyyden, yhdessä väheneminen ilmaus Hh komponentteja. Histologinen analyysi NSCLC hiirikudoksessa osoittivat, että CDO ilmaistiin kehittynyt grade syöpä, ja tarkasti yhteistyössä paikallistaa GLI1. Nämä tiedot viittaavat siihen, että CDO tarvitaan leviämisen ja selviytymisen keuhkosyöpään solujen kautta Hh signaloinnin.

Citation: Leem YE, Ha HL, Bae JH, Baek KH, Kang JS (2014) CDO, joka on Hh-koreseptoria , välittää Lung Cancer Cell Proliferation ja tuumorigeenisyystesti kautta Hedgehog Signaling. PLoS ONE 9 (11): e111701. doi: 10,1371 /journal.pone.0111701

Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Lasten Hospital Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 02 kesäkuu 2014; Hyväksytty: 01 lokakuu 2014; Julkaistu 4 marraskuuta 2014

Copyright: © 2014 Leem et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä työ oli rahoittaa National Research Foundation of Korea (NRF) se rahoitettiin Korean hallituksen (MSIP) (2012R1A1A2005448 YEL) ja (NRF-2011-0017315 ja JSK). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Hh-signalointireitin on yksi olennainen signalointireittien, joka on osallisena sikiön kehityksen, morfogeneesiä ja lisääntymistä [1], [2], [3], [4], [5], [6]. Molekyylimekanismin miten säädellä Hh signalointi on edelleen tutkittavana. Yleensä, kun Hh ligandi sitoutuu primaarireseptorinaan, Patched 1 (PTCH1), Smoothenedin (SMO) vapautetaan PTCH1-inhibitiota ja vaeltaa ensisijainen cilium. Stimulointi SMO laukaisee peräkkäisiä signaalitransduktion, joka aktivoi transkriptiotekijät GLI perhe. Aktiivinen muoto GLI proteiinin translokaatio tumaan ja säätelee ilmentymistä alavirran kohdegeenien, kuten PTCH1 ja GLI1 [1], [7], [8].

menetys Hh-signaloinnin alkionkehityksen aikana liittyy useita geneettisiä sairauksia, kuten holoprosenkefalia, joka on yleisin epämuodostuma etuaivojen [9], [10], [11]. Sen sijaan, konstitutiivisen aktivaation Hh-signaloinnin tiedetään olevan osallisena taudin alkamisen ja etenemisen useita syöpiä ihon (satunnaista tyvisolusyöpä, BCC), aivojen (medulloblastooma), lihakseen (rabdomyosarkooma, RMS), maha-suolikanavan, eturauhasen, haiman , ja keuhko [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23] . Linkin Hh-reitin karsinogeneesiin alunperin ilmoitettiin Gorlin oireyhtymä, jossa mutaatio

PTCH1

geeni on vastuussa syövän ilmaantuvuus [24]. Lisäksi poikkeava säätelyä Hh signaloinnin kautta menetys PTCH1 tai voitto-of-function mutaation

SMO

laajasti tutkittu BCC ja varhaissolukasvaimesta [13], [14].

merkitys Hh-signaloinnin karsinogeneesis- myös tutkittava leviämisen pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC), joka on erittäin aggressiivinen keuhkosyöpä muodostavat noin 20-25% kaikista keuhkosyövässä [21]. Aktiivisuuden esto Hh-signaloinnin avulla SMO antagonisti, syklopamiini johti vakaviin kasvun väheneminen SCLC solulinjoissa [21], [23], [25], [26]. Sekä katsoo, että alun perin ehdotti, että Hh-signalointia vähemmän liittyy NSCLC, kaikkein hallitseva tyyppi keuhkosyövän ja kaikkein vaarallisin maligniteetti. Kuitenkin useat todisteet ovat äskettäin osoittaneet, että NSCLC on riippuvainen Hh signalointi aktiivisuutta leviämisen samoin [27], [28], [29], [30].

Vaikka pääreseptori vastaan ​​Hh on PTCH1, on muitakin koreseptorit avustavan Hh signalointia positiivisesti, kuten CDO, BOC ja GAS1 [31], [32], [33], [34], [35]. Hh signalointi on mukana erilaisissa solu- ja kehitys- prosesseja, ja näin tiukka määräyksiä ehdottomasti tarvitaan signaloinnin tunnistaa ja hallita mikro-vaihtelua solun ympäristössä. Samaan aikaan monet keuhkosyövän solulinjat tuottavat eri tasoilla Hh ligandin [25], [30]. Vaikka alhainen Hh ligandin nähdään joissakin keuhkosyövän soluja, nämä solut osoittavat kasvua Hh kohdegeenin ilmentymisen mikä upregulation Hh-signaloinnin. Näissä olosuhteissa, kun läsnä on Hh co-reseptorit voivat osallistua vahvistus heikko solunulkoisen cue syöpäsoluissa lisäksi hienosäätö Hh-signaloinnin sikiönkehityksen aikana.

Näistä co-reseptoreihin, CDO transmembraaniproteiini, joka kuuluu immunoglobuliini (Ig) /fibronektiinin tyypin III (FNIII) superperheen ja sillä on tärkeä rooli lihasten erilaistumisen alkion kehitys ja neuronaalista erilaistumista [36], [37], [38], [39]. Rakenteellinen analyysi osoitti, että fibronektiinin toistojen solunulkoisen domeenin CDO on kriittinen Hh sitoutumisen [39]. Positiivinen sääntely Hh-signalointireitin mukaan CDO tunnistettiin alun perin

Drosophila

. On tunnettua, että ihog (ortologi CDO in

Drosophila

) yhdessä boi (ortologisista BOC

Drosophila

) on tärkeä aktivointi Hh-signaloinnin kehittyvässä siiven imaginaalilevy [ ,,,0],40], [41]. Hiirillä, Cdo puutos esiintyy useita synnynnäisiä vikoja, mukaan lukien holoprosenkefalia, joka on virhe yleisesti, liittyvät mutaatiot Hh signalointi [39], [42]. Lisäksi CDO osallistuu Hh välittämän ventral hermo kuviointi nisäkkään hermostoputken [31] ja sekä Hh-välitteisen soluproliferaation pikkuaivojen rae neuroni esisolujen (CGNPs) [43].

Lisäksi roolia CDO elin- kehittämiseen ja solujen erilaistumista, yhdistys CDO Hh signalointia, joka on tuumorigeneesiin kiehtoi meitä selvittämään roolin CDO keuhkosyövässä solujen lisääntymisen. Tässä tutkimuksessa olemme pyrkineet paljastamaan osuus CDO Hh signalointia NSCLCs sekä lisäksi lisääntymistä ja tuumorigeenisyystesti keuhkojen syöpäsoluja. Huomasimme, että taso CDO oli korkeampi NSCLC soluissa, ja että esto CDO ilmaisun vaimentua Hh signalointi, ja vähentää leviämisen ja tuumorigeneesiä ihmisen keuhkosyövän soluja. Lisäksi CDO ilmentyminen havaittiin pitkälle NSCLC kudoksiin. Yhdessä kaikki tiedot viittaavat siihen, että CDO, kuten co-reseptori Hh, on ratkaisevan tärkeää syöpäsolujen lisääntymistä ja tuumorigeenisyyteen, ja siksi sitä voidaan pitää hyvä ehdokas syövän vastaista terapeuttisia sovellutuksia.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljelmät ja reagenssit

BEAS-2B ja NSCLC solulinjoissa, A549, H1299, H460 ja H520 olivat ystävällisesti professori DH Kim (Sungkyunkwan yliopisto, Samsung Biomedical Research Institute, Korea) [44]. Kulttuuri BEAS-2B seurasi ATCC ohjeita. NSCLC-soluja viljeltiin kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2 RPMI-1640-alustassa (Invitrogen), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS), jota oli täydennetty penisilliinillä ja streptomysiinillä. Mittaamiseksi mRNA /proteiinin ekspressiota tai solukuoleman siCDO-transfektoiduissa soluissa, väliaine vaihdettiin RPMI-1640-väliaineessa, jossa oli 0,5% FBS: ää yhden päivän kuluttua transfektiosta, ja transfektoituja soluja viljeltiin 2 päivää edelleen. 50 uM SANT1 (S4572, Sigma-Aldrich) liuotettuna DMSO: hon tai vastaavaan ajoneuvon tilavuutta DMSO: ta käsiteltiin soluja kasvatettiin RPMI-1640-väliaineessa, joka sisälsi 0,5% FBS: ää ilmoitettuina ajankohtina kohdassa.

RNA-interferenssi kokeet

Jokainen NSCLC solulinja transfektoitiin siCDO käyttäen Lipfectamine RNAiMAX reagenssia (Invitrogen) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Seuraavia sekvenssit käytettiin siRNA vastaan ​​CDO. siCDO # 1, Sense 5′-GGAUCUUGGACCCUUAUGUUU-3 ’, antisense, 5′-ACAUAAGGGUCCAAGAUCCUU-3’. siCDO # 2, Sense 5′-CUUCAAAGUCGAAUAUAAAUU-3 ’, antisense, 5’-UUUAUAUUCGACUUUGAAGUU ”. Sillä

in vivo

tuumorigeenisyyteen määritys, A549-solut, jotka ilmentävät stabiilisti pienet hiusneula-RNA (shRNA) vastaan ​​CDO valmistettiin transfektoimalla pSuper-puro-shCDO. pSuper-puro-shCDO vektori raportoitu aiemmin [42].

Yhteensä RNA: n valmistaminen ja reaaliaikaisen qRT-PCR

Kokonais-RNA eristettiin käyttäen easyBLUE kokonais-RNA: Extraction Kit (Intron Biotechnology Inc. , Korea), ja cDNA syntetisoitiin käyttämällä PrimeScript RT reagenssipakkaus (TAKARA, Japani) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Reaaliaikainen qRT-PCR suoritettiin käyttämällä SYBR Esiseos ExTaq kit (TAKARA, Japani) ja Thermal Cycler noppaa reaaliaikainen järjestelmä (TP800, TAKARA, Japani) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Eteenpäin (F) ja taaksepäin (R), alukkeita käytettiin tässä tutkimuksessa, on lueteltu alla.

SHH

F, 5′-CCAAAAAGCTGACCCCTTTA-3 ’, R, 5′-GCTCCGGTGTTTTCTTCATC-3’;

PTCH1

F, 5′-CAGCACTGGAAAACTCGTCA-3 ’, R, 5′-TCTGATGAACCACCTCCACA-3’;

GLI1

F, 5′-AAGGGGTTTCTATCCTTCCAGA-3 ’, R, 5′-TCCTTTATTATCAGGAAACAGTGTCA-3’;

CDO

F, 5′-GGGAAATACATCTGCGAAGC-3 ’, R, 5′-CTGAGCAGCATCAGGAAGTG-3’;

18S rRNA

F, 5′-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3 ’, R, 5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3’. Suhteellinen kvantitointi geenin ilmentymisen kuvattiin kertainen suhteelliset muutokset mRNA-tasot verrattuna kontrolliin, käyttäen 2

-ΔΔCt yhtälössä [ΔΔCt = ACt (kohdegeenin) -ΔCt (viite-geeni)]. 18S rRNA käytettiin referenssinä geeni.

Solulisääntyminen ja elinkelpoisuus määritys

Solut ympättiin pitoisuudella 5 x 10

3 tai 1 x 10

4 solua 96-syvennys ja viljeltiin RPMI-1640, joka sisälsi 0,5% FBS: ää. Trypsinoitiin solut värjättiin trypaanisinisellä (TB) liuokseen, ja ei-värjätään elävät solut laskettiin. MTT-määritys, 20 ui 5 mg /ml MTT: n (3- [4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli] 2,5-difenyylitetratsoliumbromidi) lisättiin 5 x 10

3 tai 1 x 10

4 solua kohden 96 kuopan. Kun 4 tunnin inkuboinnin jälkeen 37 ° C: ssa, viljelmä keitto vaihdettiin 200 ui DMSO: ta. Absorbanssi mitattiin 595 nm: ssä. BrdU-määritystä, soluja kasvatettiin 10 uM bromideoksiuridiinia (BrdU; Sigma-Aldrich Corp.) 1 tunnin ajan. Kiinteä soluja 4% PFA koetettiin anti-BrdU-vasta-(Chemicon International Inc.). Fluoresenssi havaittiin Alexa Fluor 488 vuohen anti-hiiri-vasta-aineen (Molecular Probe).

virtaussytometrinen määritys apoptoosin

Apoptoosi mitattiin käyttämällä ApoScan anneksiini V FITC apoptoosin havaitsemiseen kit (BioBud, Korea ) ja BD FACS CANTO II virtaussytometrillä (BD Biosciences) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Western blot

Western blot-analyysit suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [37]. Primaaristen vasta-aineiden, joita käytetään tässä tutkimuksessa on lueteltu alla; Lohkaistaan ​​Caspase3 (# 9664, Cell Signaling), Caspase9 (sc-81663, Santa Cruz), Cdk2- (sc-6248, Santa Cruz), sykliini D1 (sc-246, Santa Cruz), sykliini E (sc25303, Santa Cruz), GAPDH (AbFRONTIER, Korea), p21 (sc-6246), p27 (ab7961, Abcam).

Colony muodostavat määrityksessä

Viisi tuhatta soluja varovasti sekoitettiin 10% FBS: RPMI-1640 väliaineessa, joka sisälsi 0,35% agaroosia. Seos päällekkäin 0,5% pohja agaroosi 10% FBS: ia 6-kuoppaisilla ruokia. Pinnoitettu soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa 3 viikkoa ruokinta väliaineen joka toinen päivä. Pesäkkeiden muodostuminen visualisoitiin 0,01% kristalliviolettia, ja analysoitiin preparointimikroskooppia. Kvantifiointi pesäkkeen lukumäärä per kenttä määritettiin käyttämällä ImageJ. Kukin koe suoritettiin kolmena kappaleena ja toistettiin kahdesti.

In viv

o tuumorigeenisyystesti määritys

5 x 10

6 ohjaus (pSuper-Puro) – tai pSuper-puro-shCDO transfektoidut A549-soluja injektoitiin ihonalaisesti kylkiin 6- 8-viikkoisen naaras-nude-hiiriin. Kasvaimen tilavuus mitattiin 4 päivän välein, ja laskettiin edellä kuvatulla [45]. Kaikki eläinkokeet tarkistettiin ja hyväksyttiin kansainvälisen eläinten hoidon ja käytön komitea (IACUC) on SKKU School of Medicine (SUSM). SUSM on Association for arviointi ja akkreditointi Laboratory Animal Care (AAALAC) kansainvälinen akkreditoitu laitoksen ja noudattaa Institute for Laboratory Animal Research (suuruisen,) opas.

Hiiret ja immunohistokemia

LSL-K-ras

G12D

hiiret saatiin Dr. Tyler Jacks (MIT Cancer Center) [46], [47]. Parafiini osastoja

LSL-K-ras

G12D

hiiret immunoreagoivat 2B3 (hiiren askites vastaan ​​CDO) ja anti-GLI1 vasta-aine (1:100; ab49314, Abcam), ja havaittiin käyttämällä immunofluoresenssilla. Konfokaalimikroskopia suoritettiin SKKU School of Medicine-Microscopy Shared Resource Facility Zeiss LSM-510 Meta -konfokaalimikroskoopilla. Kaikki eläinkokeet tarkistettiin ja hyväksyttiin kansainvälisen eläinten hoidon ja käytön komitea (IACUC) on SKKU School of Medicine (SUSM). SUSM on Association for arviointi ja akkreditointi Laboratory Animal Care (AAALAC) kansainvälinen akkreditoitu laitoksen ja noudattaa Institute for Laboratory Animal Research (suuruisen,) opas.

Tilastollinen

Tilastolliset analyysit tehtiin Studentin

t

testiä. Tulokset esitettiin keskiarvoina ± SD vähintään kolmesta itsenäisestä kokeesta ja pidetään merkittävinä, kun

p

arvot olivat 0,05 (*) tai 0,01 (**).

Tulokset

Hh komponentteja, jotka ovat mukana keuhkosyövän solujen lisääntymisen inhiboi CDO ehtyminen NSCLCs

Edellinen kirjallisuus ovat osoittaneet, että CDO toimii lisävarusteena reseptori Hh ligandin ja säätelee positiivisesti Hh signalointi [39] , [48]. Läheinen merkitystä aktivoinnin Hh signaloinnin syöpäsolun leviämisen sai meidät ensin testata CDO ilmentymistä NSCLC soluissa. Voit tehdä koko RNA: t eristettiin A549, H1299, H460 ja H520 NSCLC solulinjoissa samoin kuin BEAS-2B ihmisen ei-syöpä keuhko solu, ja analysointia varten CDO ilmaisun tekemällä reaaliaikaisen qRT-PCR. Tulos osoitti, että CDO ilmaistiin suurempi A549, H1299 ja H520 soluja kuin BEAS-2B kuitenkin H460 paljasti suhteellisesti alemman CDO tasolla (kuvio 1A). Lisäksi olemme tutkineet ilmaus Hh-signaloinnin komponenttien NSCLC soluissa suorittamalla reaaliaikaisia ​​qRT-PCR. Korkeampi ilmentyminen SHH nähtiin kaikissa neljässä NSCLC solulinjat kuin ei-syöpä keuhkojen solu. Samoin alavirtaan kohdegeenien Hh-signaloinnin, PTCH1 ja GLI1 ilmaistiin korkeammat niissä NSCLC-soluja (kuvio 1A). A549 oli suhteellisen alhaisempi Hh-ligandin, verrattuna muita solulinjoja, mutta osoitti, että lisäys Hh kohdegeenin ilmentymistä (PTCH1 ja GLI1). Vuonna H520, CDO, SHH ja PTCH1 ilmaistiin suhteellisesti suurempi kuin muut solulinjat mutta GLI1 ilme oli melko alhainen.

. Reaaliaikainen qRT-PCR varten ekspressiotasot CDO ja Hh signalointi komponentit (SHH, PTCH1 ja GLI1) in BEAS-2B ja NSCLC solulinjoissa (A549, H1299, H460 ja H520). Jokainen ilmentymistason normalisoitui tasolle 18S rRNA. Suhteellinen määrä kunkin komponentin NSCLCs määritettiin määrä kukin BEAS-2B oli asetettu 1,0. B. elävien solujen lukumäärä määritettiin solulaskennalla ilmoitetuilla aikaa A549, H1299, H460 ja H520 käsiteltiin kanssa tai ilman 50 uM SANT1. C. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTT: llä ilmoitetuilla aikaa A549, H1299, H460 ja H520 käsitelty tai ilman 50pM SANT1. Absorbanssi mitattiin 595 nm: ssä. D. RT-PCR CDO A549, H1299 ja H460 transfektoitu salattu siRNA tai siCDO # 1. E. Reaaliaikainen qRT-PCR Hh signalointi komponenttien A549, H1299 ja H460 transfektoitu salattu siRNA tai siCDO. Ilmaisu taso jokaisen komponentin normalisoitui tasolle 18S rRNA. Suhteellinen määrä kunkin komponentin CDO-köyhdytettyä NSCLCs määritettiin määrä kunkin kontrollisoluissa oli asetettu 1,0 (punainen viiva). Kaikki arvot ovat keino ainakin kolmen määrityksen ± 1 SD. *

p

0,05 ja **

p

0,01.

Ensin määritellään estävää vaikutusta muihin SANT1 on Hh signalointi tutkimalla ilmaus hh signalointi kohdegeenien jälkeen SANT1 hoidon. SANT1 sitoutuu suoraan SMO, estää signalointi. Yhteensä RNA: t eristettiin DMSO tai SANT1 saaneista A549, H1299 ja H460 käytettiin analysointiin PTCH1 ja GLI1 ilmaisuja reaaliaikaisella qRT-PCR. Ennustetusti, lisäämällä SANT1 johti vähentäminen PTCH1 ja GLI1 ilmauksia (Kuva S1 File S1). Jotta vaikutuksen määrittämiseksi Hh-signaloinnin proliferaatioon NSCLCs, me esti Hh-signaloinnin A549, H1299, H460 ja H520 käyttämällä SANTin-1. Sitten TB solujen laskenta ja MTT-määritys tehtiin analysoimiseksi solujen lisääntymisen ja elinkelpoisuus. Tiedot osoittivat, että lisäämällä 50 uM SANT1 johti merkittävään vähenemiseen solujen kasvua ja elinkelpoisuus on neljä erillistä NSCLC-soluja (kuvio 1 B ja C). Vaikutus SANT1 inhibitiota oli vahvempi myöhään ajankohtina. Nämä tulokset osoittavat, että testatut NSCLC-solut vaativat Hh signalointiaktiivisuuteen pitämiseksi niiden leviäminen.

Seuraavaksi kysytään CDO osaltaan toimintaa Hh-signaloinnin in NSCLCs. Sen määrittämiseksi, että me transfektoitu kolme erilaista NSCLC solulinjoissa, A549, H1299 ja H460 kanssa siCDO tai salattu siRNA ja arvioidaan vaikutus CDO vajauksen ilmaisuja Hh signalointi komponenttien reaaliaikaista qRT-PCR. Ilmaisu CDO väheni huomattavasti kanssa siCDO kaikissa solulinjoissa (kuvio 1 D). Heikentävistä CDO ilmentymisen, käytimme kahta eri sekvenssit siRNA, siCDO # 1 ja # 2. Molemmat siCDOs osoittivat samanlaisia ​​CDO ehtymisen ja tulokset (tuloksia ei esitetty), ja esitämme datan siCDO # 1. Tasot Hh signalointi komponentit, SHH, PTCH1, ja GLI1 vähensi merkittävästi CDO-köyhdytettyä keuhkosyövän soluja verrattuna salattu ohjaus (kuvio 1 E). Nämä tiedot merkitsevät, että CDO toimii positiivisena sääntelijä Hh signaloinnin NSCLC soluissa, riippumatta sen ekspressiotason.

CDO ehtyminen johti proliferaation esto ja apoptoosin induktio NSCLCs

kuten kuviossa 1B on esitetty, ja C, havaitsimme, että proliferaation NSCLC-solujen oli varsin herkkä SANT1. Niinpä päätimme määrittää vaikutuksen säätely alaspäin Hh-signaloinnin mukaan CDO Knockdown on syöpäsolujen leviämistä. Voit tehdä niin, arvioimme määrä soluproliferaation A549, H1299, H460 ja H520 alle CDO-köyhdytettyä kunnossa suorittamalla TB solujen laskenta ja MTT-määrityksellä (kuvio 2A ja D). Tulos osoitti, että CDO Knockdown kaikilla testatuilla NSCLC solut pienentynyt huomattavasti solujen määrä ja kannattavuus verrattuna salattu ohjaus. Kuitenkin laajuus leviämisen väheneminen ei ollut voimakkaampaa kuin että SANT1 hoitoon (vertaa kuvio 2A ja D kuvioon 1B ja C, vastaavasti). Kaltevuus kuvaajat solujen määrä ja elinkelpoisuuden CDO-köyhdytettyä syöpäsolujen edelleen jatkaneet nousuaan pidemmillä ajankohtana päivä 5, verrattuna että SANT1 hoidossa, vaikka tasot olivat ehdottomasti paljon alhaisemmat kuin salatun ohjaus soluja. Arvioida vaikutuksen CDO heikentymisen leviämisen edelleen, suoritimme BrdU. Tulos osoitti, että CDO Knockdown NSCLC soluissa johti 20-40% lasku solujen lisääntymisen (kuvio 2B).

. Lukumäärä elinkelpoisten solujen määritettiin solu laskemalla ilmoitetuilla aikaa ohjaus- tai CDO-köyhdytettyä A549, H1299, H460 ja H520. B. Solujen lisääntyminen CDO Knockdown A549, H1299, H460 ja H520 määritettiin BrdU. C. Western blot analyysi ilmentymisen solun lukiertosäätelijöistä (sykliini D1, sykliini E ja Cdk2-), repressors (P27 ja p21) ja apoptoottinen markkereita (pilkkoutuu kaspaasi 3 ja halkaistut kaspaasi 9) kontrolliryhmässä tai CDO pudotus A549-soluja. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. D. MTT-analyysi solun elinkelpoisuuden ohjaus- tai siCDO transfektoituja A549, H1299, H460 ja H520 ilmoitetuilla aikaa. Absorbanssi mitattiin 595 nm: ssä. E. anneksiini V-FITC apoptoosin ja virtaussytometria analyysi A549, H1299, H460 ja H520 transfektoitu salattu siRNA tai siCDO. Kaikki arvot ovat keino ainakin kolmen määrityksen ± 1 SD. *

p

0,05 ja **

p

0,01.

väheneminen solujen lisääntymisen ja elinkelpoisuuden että CDO-köyhdytettyä NSCLC-solut voisivat olla alentuneen solusyklin etenemisen ja /tai tehostetun solukuoleman. Tarkistaa ilmentymisen tasot solun lukiertosäätelijöistä /repressoreita, A549-soluja, jotka oli transfektoitu salattu tai siCDO tutkittiin immunoblottauksella. Tämän tuloksena proteiini tasoilla solusyklin säätölaitteet (sykliini D1, sykliini E, ja Cdk2) on vähentynyt, kun taas ilmaisuja Cdk-inhibiittorit (P27 ja p21) oli koholla siCDO käsiteltyjen A549-soluja verrattuna salattu käsiteltyjä soluja (kuvio 2C). Nämä tiedot osoittavat, että esto CDO ilmaisun näyttää aiheuttavan solusyklin pysähtymisen NSCLC soluissa.

Sitten kysyimme CDO ehtyminen siihen liittyi myös solukuolemaan. Immunoblot pilkottu muotoja kaspaasi-9 ja -3 osoittivat, että nämä apoptoottisia tekijöitä havaittiin vahvempi siCDO-transfektoiduissa A549 kuin vertailuryhmässä (kuvio 2C). Johdonmukaisesti, virtaussytometria profiilin apoptoosin A549, H1299, H460 ja H520 näytteillä että suurempi prosenttiosuus anneksiini-V: n ja PI kaksinkertainen positiivisia soluja havaittiin neljässä yksittäisten CDO-köyhdytettyä NSCLCs (kuvio 2E). Siksi nämä tulokset viittaavat siihen, että vähentynyt lisääntyminen NSCLCs kun CDO heikkeneminen johtuu lisääntyneestä solukuolemaan sekä heikennettyä solusyklin etenemisen.

inhibitio CDO ilmaisun NSCLCs osoitti vähentäminen

in vitro

ja

in vivo

kasvainten muodostumiseen

vähentynyt soluproliferaatiota CDO knockdown johti meidät tutkimaan vaikutusta CDO heikentymisen pahanlaatuinen ominaisuuksista NSCLC soluja. Sillä, että arvioimme laajuutta pesäkkeen muodostumisen siCDO-transfektoitujen A549, H1299, H460 ja H520-solujen pehmeässä agarissa (kuvio 3A ja B). Tulos näkyy selvä vähentäminen kyky muodostaa klooneja

in vitro

kun CDO taso väheni.

. Pesäkkeenmuodostusta ohjaus- tai CDO pudotus A549, H1299, H460 ja H520 pehmeässä agarissa. B. kvantitatiivinen analyysi kuvatun kokeen A. Colony lukumäärät kenttä määritettiin ImageJ. Arvot edustavat keinot kolmen määrityksen ± 1 SD. *

p

0,05 ja **

p

0,01. C. Edustavia kasvaimen kasvua 50 päivää sen jälkeen, ihonalaisen nude-hiirten ohjaus- tai shCDO käsiteltyjen A549-solut. D. Tuumorin tilavuus nude-hiirten kanssa ohjaus A549 (n = 8) tai CDO-köyhdytettyä A549 (n = 10), on kuvattu julkaisussa C. Keinot on esitetty virhejanoina. E. Kasvaimet alkaen nude-hiiriin injektoitiin kontrolli A549 tai CDO-köyhdytettyä A549-solut esitetään C.

Tukeakseen tietoihin

in vitro

kasvainten muodostumiseen, valmistimme vakaa solulinjasta A549 ilmentävien shRNA vastaan ​​CDO, ja injektoidaan subkutaanisesti ohjaus- tai CDO-köyhdytettyä solujen paljaiden hiirien kylkiin. Tuumorin koko ajoittain mitattiin. Kuten on esitetty kuviossa 3C, D ja E, merkittävä lasku kasvaimen kasvua havaittiin nude-hiirissä injektoitiin CDO-knockdown A549. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että CDO vaaditaan

in vivo

kasvun NSCLC-solujen.

CDO ilmentymistä havaittiin GLI1 yhdessä pitkälle edennyt NSCLCs

Määritä CDO ilmaisun aikana keuhkosyöpä etenemisen, otimme etuna NSCLC hiirimallissa

LSL-K-ras

G12D

hiirillä [46], [47]. Intranasaalisesti hengittäminen Ad-Cre aiheuttamaan spontaani keuhkojen tuumorigeneesiä

LSL-K-ras

G12D

hiiriä, arvioimme CDO ilmentyminen keuhkoissa kasvainkudoksessa näytetään neljä erillistä laadut syövän etenemisen fluoresoivalla immunohistokemiallisesti. CDO ilme oli lähes havaitsematon grade-1, joka on alkuvaiheessa syövän etenemisen mukana epätyypillinen adenomatoottisen liikakasvun (AAH) tai pieni adenooma (Kuva S2 File S1). Kuitenkin sen ilme tuli rikastettua kuten syövän etenemistä on aikaistettu. Luokalla-2, jossa suurempi adenoomia hieman suurennettu ytimet havaitaan, CDO ilmentyminen havaittiin solujen sytoplasmassa kasvaimen vaurioita, ja tämä korkea ekspressio säilyi, kunnes grade-3 (kuvio 4). Kasvainten edennyt olla invasiivisia adenokarsinoomat (grade-4), CDO ilmentyminen väheni jonkin verran ja on havaittu solukalvon. Ilmaus CDO kasvaimen vaurioita johti meidät tutkimaan ilmentymisen Hh-reitin komponenttien kasvainkudoksessa. Konfokaaliset immunofluoresenssilla kuvat osoittivat GLI1, yksi Hh-signaloinnin tekijöiden colocalized kanssa CDO, ja lisäksi sen ilmentyminen oli myös erittäin havaittiin grade-2 ja -3 tuumorileesioissa, ei grade-4 (kuva 4). Puute GLI1 ilmentymisen grade-4 tuloksia vastaavat minkä useat aikaisemmat tutkimukset [23], [29]. Tulokset näistä kokeista osoittavat, että CDO ilmaisua voidaan korreloida ylössäätöä Hh-signaloinnin tuumorileesioissa ja CDO on myös todennäköisesti liittyy etenemisen keuhkojen kasvain, ei kasvaimen aloittamista.

konfokaali immunofluoresenssimenetelmällä havaitseminen CDO (punainen) ja GLI1 (vihreä) palkkaluokkaan-2, -3, ja -4 keuhkojen kasvain kudoksia

LSL-K-ras

G12D

malli. Soluytimet visualisoitiin DAPI (sininen) ja vaihe kontrastia kuvat näkyvät. Mittakaava osoittaa 50 pm.

Keskustelu

Itse asiassa merkitystä CDO syöpäsolujen lisääntymistä oli hieman peittää ja viittasi aikaisemmin. Hayashi

et al.

[49] pyrki seuloa geenejä, jotka koodaavat transmembraaniproteiineja, jotka ovat erittäin ilmaistaan ​​eturauhassyövän solulinjoissa. Ehdokkaista, he keskittyivät 83% of CDO-yliekspressoitu eturauhassyöpä, ja osoitti, että vähentämällä CDO ilmaisun aiheuttaman apoptoosin ja esti soluinvaasiota eturauhassyövässä. Kuitenkin, molekyylimekanismi miten CDO on mukana leviämisen eturauhasen syöpäsolujen ei selitetty. Tässä tutkimuksessa olemme paljasti, että hienosäätöä ja ylössäätöä Hh-signaloinnin mukaan CDO on varsin tarvitaan soluproliferaation keuhkosyöpä. Olemme lisäksi havaittu, että mRNA taso CDO testatussa keuhkosyövän solulinjat paitsi H520 oli suurempi kuin BEAS-2B, mutta se ei ollut merkittävä. Erityisen CDO mRNA tasolla A549 oli noin 1,7 kertaa suurempi kuin pohjapinta taso sitä BEAS-2B. Vaikka kasvu ei ole dramaattisesti korkea, se ansaitsee ilmoitusta, jos ajattelemme, että CDO ilmentyminen on yleensä löytyy kehityksen aikana sekä alkionkehityksen ja tuskin havaittiin aikuisen kudoksissa [36].

Alun perin oletetaan, että Hh signalointi harvoin liittyy NSCLC koska Hh ja GLI1 havaittiin suhteellisesti heikompia NSCLC. Sittemmin tiedot, mukaan lukien nykyisen tietojen inhibition NSCLC proliferaation jonka SMO antagonisti ehdotti, että aktivointi Hh-signaloinnin kautta alhainen Hh on varmasti liittyy tuumorigeneesiä NSCLC. Tämän seikan CDO voi olla kriittinen rooli ligandina anturi pieni määrä Hh, joka tukee pääreseptorina, PTCH1 ja loppujen indusoi aktivoinnin Hh-signaloinnin.

Samalla toiminta CDO soluun leviämisen tuntuu olevan kaksijakoinen riippuen Hh tasolla. Delloye-Bourgeois

et al.

[50] äskettäin ehdotettu, että Hh-taso on tärkeä CDO toimimaan riippuvuutta reseptori, joka liittyy läheisesti induktioon proapoptoottiset signaalin. Heidän mukaansa, kun Hh ligandia melko rajallinen, kaspaasi 3/9 rekrytoidaan kaspaasi katkaisukohta solujen väliseen alalla CDO ja herättävät proteolyyttisen katkaisun. Tämä kaspaasivälitteinen pilkkominen lopulta laukaisee apoptoosin. Rooli CDO kuin riippuvuus reseptorin pohjimmiltaan ristiriidassa tehtävän CDO syöpäsoluissa Hh ilme, mitä me paljastui tässä tutkimuksessa. Siksi asianmukaisen Hh ligandin näyttää olevan välttämätöntä määritellä toiminnan CDO positiivisena säätelijänä Hh-signaloinnin tai riippuvuus reseptorin.

esto Hh-signaloinnin SANT1 kaikissa NSCLC-solut osoittivat suuremmasta alennuksesta solujen lisääntymisen ja elinkelpoisuuden enää ajankohtana verrattuna inhibitio CDO-geenin ehtyminen (vertaa kuvio 1 B ja C kuvioon 2A ja D, vastaavasti). Rajallinen vaikutus CDO Knockdown on soluproliferaation inhibointi voisi johtua, että muut Hh koreseptorit, kuten BOC ja GAS1 edelleen ilmaistaan ​​ja aktiivinen, vaikka emme voi sulkea pois mahdollisuutta, että ohimenevä CDO ehtyminen siRNA. On osoitettu, että kaikki Hh co-reseptoreihin, CDO, BOC, ja GAS1 kollektiivisesti tarvitaan täydelliseen aktivaatioon Hh-signaloinnin. CDO, BOC ja GAS1 erikseen tehdä kompleksin PTCH1 ja muodostumista kompleksien on kriittinen Hh-välitteisen CGNP leviämisen [43]. Tämän perusteella ymmärtäminen roolit BOC ja GAS1 aikana Hh välittämä kasvaimen kehittymisen tarvittaisiin myöhemmin.

Detection of CDO ilmentymisen korkealaatuisesta kasvainleesion NSCLC hiirimallissa ole vaurion asteen-1 innoissaan uteliaisuuttamme roolista CDO-välitteisen Hh signalointi syövän etenemiseen. On vallitsevasti ehdotettu, että ylössäätöä Hh-signaloinnin näyttää korreloivan kasvaimen vaikka se on kiistanalainen joidenkin syöpien. Eturauhassyövän, mRNA tasot SHH, PTCH1 ja GLI1 olivat erittäin koholla myöhemmissä vaiheissa syöpä, ja kaikki ne osat liittyivät läheisesti Gleason pisteet [51]. Toisaalta, Gialmanidis

et al.

[29] ovat immunohistokemiallisesti analysoitiin parafinoidut keuhkojen kudosleikkeiden 80 pienisoluista keuhkosyöpää. He havaitsivat, että aktivointi Hh-signaloinnin liittyi kasvaimen, ja korkea aktivoinnin signaloinnin pääasiassa havaittu hyvin erilaistunut ja kohtuullisesti erilaistunut kasvaimia. Vankka ilmentyminen CDO korkean luokan kasvain voi johtaa mahdollisuuteen, että CDO positiivisena säätelijänä säätelee ja aiheuttaa poikkeava aktivaatio Hh signaloinnin kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen.

Toistaiseksi ponnistelut löytää syöpähoitoihin on suunnattu pääasiassa SMO, ja jopa useat SMO estäjät on hakemassa klinikalle [52]. Ilmaisu CDO on yleensä rajoitettu kehitys ja alkionkehityksen eikä aikuisten vaiheessa. Epänormaali ilmentyminen CDO että syöpätila on mahdollisesti liittyy poikkeava solujen lisääntymistä.