Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kasvain progenitorisolujen edustavat väestöä lääkkeille vastustuskykyisten soluja, jotka voivat selviytyä perinteisen kemoterapian ja johtaa kasvaimen uusiutumisen. Kuitenkin vähän tiedetään rooli kasvaimen progenitorisolujen eturauhassyövässä etäpesäkkeitä. Tutkimukset tässä raportoidaan osoittavat, että CXCR4 /CXCL12-akselin, keskeinen säätelijä kasvain levittämistä, on merkitystä ylläpitoon eturauhassyövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja. CXCL4 /CXCR12 reitin aktivoidaan CD44

+ /CD133

+ eturauhasen progenitoripopulaation ja vaikuttaa erilaistumisen potentiaalin, soluadheesiota, kloonikasvuun ja kasvainten muodostumiseen. Lisäksi eturauhasen -tuumoriksenografti hiirissä osoittivat, että yhdistelmä CXCR4-reseptorin antagonisti AMD3100, joka kohdistuu eturauhassyövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja, ja tavanomaisen kemoterapeuttisen lääkkeen Taxotere, joka on suunnattu suurin kasvain, on huomattavasti tehokkaampi hävittämään kasvaimet verrattuna monoterapiaan.

Citation: Dubrovska A, Elliott J, Salamone RJ, Telegeev GD, Stakhovsky AE, Schepotin IB, et al. (2012) CXCR4 Expression in Eturauhassyöpä kantasolut. PLoS ONE 7 (2): e31226. doi: 10,1371 /journal.pone.0031226

Editor: Diane Renee Bielenberg, lastensairaala Harvard Medical School, Yhdysvallat

vastaanotettu: 30 elokuu 2011; Hyväksytty: 04 tammikuu 2012; Julkaistu: 16 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 Dubrovska et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Susan G. Komen varten Cure Grant PDF0707903 (AD). Tätä työtä tukivat Novartis Research Foundation ja The Skaggs Institute for Chemical Biology. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhasen syöpiä ovat toiseksi yleisin syy syövän kuoleman miehillä. Useimmat eturauhasen syöpiä ovat hormonien riippuvaisia ​​ja vastata androgeeniablaatio hoitoa. Kuitenkin Ablaatiohoitoa ei ole parantava metastasoineeseen eturauhasen syöpien, koska nämä kasvaimet lopulta hormoniresistentti ja kasvaa huolimatta androgeeniablaatio, vaikka alkuhoitona ilmestyi onnistunut [1], [2]. Solunsalpaajahoitoa, jotka sisältävät lääkeaineen doketakseli (Taxoteren) ulottuvat eloonjäämismediaani kahdella-kolmella kuukaudella potilailla, joilla on edennyt eturauhassyöpä, joka ei enää reagoi hormonihoito. Kuitenkin on 5 vuoden eloonjäämisaste 17% potilaista ja eloonjäämismediaani 2-3 vuoden ajanjaksoa, ennuste metastasoituneen eturauhassyövän edelleen heikko [3].

On väitetty, että kasvain kantaisä soluilla on keskeinen rooli kasvainten kehittymiseen ja edustavat lääkkeille vastustuskykyiset solupopulaation, joka voi selvitä tavanomaisen hoidon ja aiheuttaa taudin uusiutumisen [4]. Tämä käsite viittaa siihen, että hoitoja kohdistaminen kasvain esiasteita voi johtaa tehokkaampia syöpälääkkeitä [5], [6]. Solupopulaatiot ilmentävät pintamerkkiaineita CD133 ja CD44 on tunnistettu otaksuttu kantasolupopulaatioita eturauhanen [5], [7], [8], [9]. Me ja muut ovat osoittaneet, että CD133

+ /CD44

+ soluja perustettu eturauhassyöpäsolulinjoissa ovat myös itseuudistuvien ja multipotentteina, ja on vahva Tuumorigeenisuustutkimuksissa

in vivo

[5], [ ,,,0],7], [10], [11], [12]. Kun taas eturauhassyöpäsolulinjoissa viljeltynä pitkäaikaisten yksikerrosviljelmään ehdot sisältävät alle 2% eturauhassyöpä esiasteita, tämä CD133

+ /CD44

+ syöpä progenitoripopulaation voidaan laajentaa alle ankkurointi riippumaton seerumittomissa olosuhteissa (pallo muodostavat olosuhteissa) [5], [11]. Tämä rikastettu progenitoripopulaation ylläpitää lisääntynyt kyky uusiutua ja tuumorigeenisyystesti [5]. mRNA: n ilmentymisen analyysi osoitti, että kemokiinireseptoria CXCR4 on erittäin ylössäädelty näissä soluissa verrattuna soluihin, viljelty yksikerroksista kasvuolosuhteissa [5]. Tiedetään, että aktivoituminen CXCR4 /CXCL12-reitin muuttaa kiinnittyminen, muuttoliike, ja hyökkäys syöpäsolujen, mukaan lukien eturauhassyöpä [13], [14], [15]. Kuitenkin tiedetään vähän roolista tämän reitin ylläpito eturauhasen kasvain aloittamista solupopulaatioiden. Tässä me raportoimme tutkimuksiin, joiden mukaan CXCR4 /CXCL12 akseli aktivoidaan eturauhassyövässä progenitorisolujen ja on rooli itseuudistumisen, erilaistumisen potentiaalin, soluadheesiota, ja kasvainten muodostumiseen. Lisäksi hiiren ksenografti-tutkimukset viittaavat siihen, että inhibitio CXCR4 reitti voi olla hyödyllistä kohdentamisessa eturauhassyövän progenitorisolujen

in vivo

.

Tulokset

Euroopan CXCL4 /CXCR12pathway aktivoidaan että CD44

+ /CD133

+ eturauhasen progenitoripopulaation

Useat otaksuttu kantasolukkoa on havaittu eturauhasen ja on ominaista solun pinnalla merkkiaineita CD44, CD133, ja integriini α2β1

korkea [5], [7], [8], [9], [10], [11], [12]. Eturauhassyöpä solut, jotka ilmentävät CD44 ja CD133 solunpintamarkkereiden voidaan rikastaa eturauhassyöpäsolulinjoissa kasvattamalla niitä pallojen kantaisä viljelyliuosolosuhteissa [5]. Me ja muut ovat vahvistaneet, että tämä CD133

+ /CD44

+ solupopulaation muodostaa alijoukon eturauhassyövän solut, jotka ovat itse uusiminen, erilaistua heterogeeninen kasvaimia, ja ne ovat erittäin tuumorigeenisia immuunivajaissa hiirillä [5], [ ,,,0],7], [8], [9], [10], [11], [12]. Tunnistaa signalointireiteissä aktivoida selektiivisesti tässä CD133

+ /CD44

+ väestö, suoritimme mikrosiruanalyysi geenien ilmentymisen DU145 ja PC3-soluissa käyttäen Affymetrix U133 paneelit [5]. Geeniekspressioprofilointi osoitti, että kemokiinireseptoria CXCR4 on erittäin ylössäädelty molemmissa solulinjoissa kasvatettiin alalla muodostus verrattuna yksikerroksista kasvuolosuhteiden (13-kertainen lisäys ja 104,6-kertainen lisäys PC3 ja DU145-solut, vastaavasti) [5]. Korkea CXCR4 ekspressiotaso havaittiin microarray kokeet vahvistettiin kvantitatiivinen RT-PCR: llä ja Western blot -analyysillä (kuvio 1A).

(A) Soluja kasvatettiin alalla muodostavissa olosuhteissa osoitti lisääntynyttä ilmentymistä tason CXCR4 analysoituna RT-PCR: llä ja Western blot -analyysillä. Sillä alalla muodostumista, yksittäisiä soluja maljattiin 500 solua /ml 10-cm: n maljoihin, joiden ultralow kiinnityspinnan ja kasvatettiin seerumittomassa epiteelin tyvi- väliaineessa 7 päivää. (B) Virtaussytometrianalyysi osoitti merkittäviä rikastamisen CXCR4

+ väestönosat CD44

+ /CD133

+ soluja verrattuna koko solupopulaatio varten DU145 ja PC3-solut (p 0,001). Solut olivat kolminkertainen värjätään ja analysoitiin BD LSR II virtaussytometrillä. (C) edustaja loisteputki kuvia CD133 ja CD44 yhteistyössä immunovärjäyty- osoittaa, että CXCR4

+ DU145 ja PC3-solut on suurempi osuus CD44

+ /CD133

+ soluja verrattuna CXCR4

– soluja. Solut, jotka ilmentävät korkea alhainen CXCR4 oli FACS-puhdistettu, maljattiin 384 hyvin musta kirkas pohjalevyt tiheydellä 100 solua /kuoppa seerumittomassa epiteelin ruselatusaineeseen. 18 tunnin jälkeen solut kiinnitettiin 3,7% formaldehydillä PBS: ssä ja värjättiin anti-CD133 ja anti-CD44-vasta-aineita. Solut ainakin viisi satunnaisesti valittua näkökentät laskettiin kullekin kunnossa. Nuolet osoittavat kolminkertainen positiiviset solut. Scale palkit osoittavat 15 pm. * – P-arvo 0,05. (D) immunoväriäys parafinoidut osat ksenograftikasvaimissa muodostaman FACS puhdistettua CD44

+ /CD133

+ ja CD44

– /CD133

– solut osoittivat yli 13% CXCR4

+ oleviin soluihin johdettu CD44

+ /CD133

+ soluja verrattuna 2,2% CXCR4

+ solujen ksenograftikasvaimissa johdettu CD44

– /CD133

– soluja. Yhteensä 10

3 FACS-lajiteltu DU145 CD133

+ /CD44

+ tai CD133

– /CD44

– soluja upotettu BD matrigeeliä injektoitiin s.c. osaksi NOD /SCID-hiiriin. Kasvainten annettiin kasvaa 42 päivää, kunnes kasvaimet tuottama DU145 CD133

+ /CD44

+ saavuttanut koko 400 mm

3 ja kasvaimet tuottaman DU145 CD133

– /CD44

– saavuttanut koko 125 mm

3. Solut ainakin viisi satunnaisesti valittua näkökentät laskettiin kullekin kunnossa. Scale palkit osoittavat 30 pm. (E) CXCR4 immunovärjäyksellä on parafinoidut osat ksenograftikasvaimissa tekemät soluja kasvatettu pallo muotoilu ja yksikerroksista olosuhteissa osoitti yli 6% CXCR4

+ solujen alalla johdettuja kasvaimissa verrattuna 1,4% CXCR4

+ solut yksikerroksisessa johdettu ksenograftikasvaimissa. ** – P-arvo 0.01.Scale palkit osoittavat 30 pm.

Yhä useammat todisteet ovat osoittaneet, että CXCR4 on tärkeä rooli syövän leviämisen, levitys, invaasio ja lääkeresistenssin [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22]. Kuitenkin tiedetään vähän rooli CXCR4 /CXCL12 signalointireitin ylläpito eturauhassyövän esisolujen. Voit varmistaa, että CXCR4 ilmentyminen ylössäädellään eturauhasen kasvain aloittamisen soluja, tarkastelimme CXCR4 tasoilla CD44

+ /CD133

+ eturauhassyövän progenitorisolujen ja yhteensä solupopulaatioiden DU145 ja PC3 solulinjat virtaussytometrillä. Havaitsimme 10.3- ja 2,3-kertainen rikastus prosenttiosuuden CXCR4

+ solujen CD44

+ /CD133

+ väestö verrattuna prosenttiosuus CXCR4

+ solujen koko väestöstä DU145 ja PC3-soluja, vastaavasti (kuvio 1 B). Tämän mukaisesti havainnon, FACS-puhdistettu DU145 CXCR4

+ ja PC3 CXCR4

+ väestö on huomattavasti suurempi osuus CD133

+ /CD44

+ soluja verrattuna CXCR4

– soluja ( 5,8-kertainen ja 2,8-kertainen lisäys DU145 ja PC3-soluissa, vastaavasti) (kuvio 1 C). Tämä kohonnut taso CXCR4 ilmaisun CD133

+ /CD44

+ solupopulaatio viittaa tärkeä rooli CXCR4 signalointi ylläpidossa eturauhassyövän esiasteita.

Voit selvittää, onko sama korrelaatio

in vivo

analysoimme CXCR4 ilmentyminen kasvaimissa injektoitujen hiirien CD133

+ /CD44

+ rikastettu soluja sekä soluja kasvatettu pallo muodostavat olosuhteet. Sekä eturauhasen solujen populaatiot on aiemmin osoitettu olevan lisääntynyt kasvainten muodostumiseen [5], [12]. Histologinen analyysi DU145 ksenograftikasvaimissa johdettu FACS-puhdistettua CD44

+ /CD133

+ solut paljasti merkittävästi suurempi CXCR4

+ solupopulaation kuin kasvaimet muodostuvat CD44

– /CD133

– -solut (kuvio 1 D). Vastaavasti analyysi CXCR4 ilmaisun ksenograftikasvaimissa injektoitujen hiirien DU145 soluja kasvatettiin pallo tai yksikerroksista olosuhteissa osoitti, että CXCR4 ilmentävät solut muodostavat 6,1% koko solupopulaation alalla johdettu kasvaimia, kun taas yksikerroksista johdettu kasvaimet ovat 1,4% CXCR4 positiivisia soluja (kuvio 1 E). Näin ollen suurempi osa soluista, jotka ilmentävät CXCR4 liittyy myös kasvaimia, jotka ovat peräisin sekä CD44

+ /CD133

+ soluja tai kasvatettu alalla muodostavat olosuhteet.

Seuraavaksi analysoidaan suhdetta CXCR4 ilmaisun ja itsensä uusiutumiskyky ja tuumorigeenisyystesti eturauhassyövän progenitorisolujen. Molemmat FACS lajiteltu DU145 ja PC3 CXCR4

+ populaatioiden osoitti kasvua alalla ja pesäkkeitä muodostavien mahdollisten yli CXCR4

– soluja (2,3-kertainen ja 3,9-kertainen, vastaavasti) (kuvio 2A, B). Samoin CD44

+ /CD133

+ /CXCR4

+ solut ovat korkeammat spherogenic potentiaali verrattuna CD44

+ /CD133

+ /CXCR4

– soluja (kuvio 2C). Arvioidaan kyky uusiutua CXCR4

+ soluja, toissijainen pallojen kertyi dissosioituneissa ensisijainen pallojen johdettu PC3 CXCR4

+ ja PC3 CXCR4

– soluja (kuvio S1A). Määrä toissijaisia ​​pallojen 1000 tai 500 solua oli suurempi pallojen johdettu CXCR4

+ soluja kuin mistä CXCR4

– soluja (5,5-kertainen ja 3,2-kertainen, vastaavasti). Sen määrittämiseksi, onko aktivointi CXCR4 /CXCL12 akselin stimuloi proliferaatiota eturauhassyövän esisolujen, PC3 ja DU145-soluja käsiteltiin CXCL12 10 ja 100 ng /ml 5 päivää seerumittomassa epiteelin kasvua väliaineessa. Kuten kuviossa 2D on esitetty, aktivointi CXCR4 /CXCL12 signalointireitin lisää merkittävästi CD44

+ /CD133

+ väestöstä sekä PC3 ja DU145 eturauhassyöpäsolulinjoissa annoksesta riippuvaisella tavalla (jopa 3,5-kertaiseksi ja 2,6-kertainen lisäys, vastaavasti). Samoin adenovirusvälitteisellä yliekspressio CXCR4 DU145 soluissa johti yli 2,5-kertainen CD44

+ /CD133

+ väestöstä (kuvio 2E ja kuvio S1B), mutta oli vähän vaikutusta CD44

– /CD133

– ja koko solupopulaatioiden. Edelleen karakterisoimiseksi kasvain muodostavat potentiaalin CXCR4

+ soluja, 1000 FACS-puhdistettiin CXCR4

+ ja CXCR4

-DU145 solua injektoitiin subkutaanisesti NOD /SCID-hiiriin. CXCR4

+ solujen havaittiin olevan huomattavasti korkeampi tuumorigeenisyyden kuin CXCR4

– soluja (jopa 3,8-kertainen ksenograftin kasvaimen kasvua, kuvio 2F, kuvio S1C). Itse CD44

+ /CD133

+ ja CXCR4

+ solut osoittivat samanlaisen Tuumorigeenisuustutkimuksissa

in vivo

. Nämä tulokset osoittavat, että ilmentyminen CXCR4 myötävaikuttaa Tuumorigeenisuustutkimuksissa androgeenireseptorin tulenkestävä eturauhassyövän solulinjoissa.

CXCR4

+ DU145 ja PC3-solut osoittivat kasvua (A) kyky muodostaa klooneja ja (B) pallo muodostavat kyky yli CXCR4

– soluja. (C) CD44

+ /CD133

+ /CXCR4

+ DU145 soluissa osoitti kasvua alalla muodostavat kyky verrattuna CD44

+ /CD133

+ /CXCR4

– soluja. Solut puhdistettiin FACS ja maljattiin 24-kuoppaisille matalan kiinnitys levyyn tiheyteen 100 solua /kuoppa seerumittomassa epiteelin ruselatusaineeseen ja kasvatettiin 10 päivää. ** – P-arvo 0,01. (D) Virtaussytometria-analyysi osoitti, että CXCL12 stimuloi proliferaatiota eturauhassyövän progenitorien DU145 ja PC3 solulinjoja annoksesta riippuvalla tavalla. DU145 ja PC3-soluja kasvatettiin seerumittomassa, EBM elatusainetta täydennetään ja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla CXCL12 täydennetään päivittäin 5 päivää. (E) yli-ilmentyminen CXCR4 eturauhassyöpäsoluissa johti 3-kertainen CD44

+ /CD133

+ väestöstä. DU145 solut infektoitiin adenovirus, joka koodaa CXCR4 valvonnassa tet-off sääntelyjärjestelmää, ja ohjaus- adenoviruksen ja analysoitiin 4 päivää infektion jälkeen. CXCR4 ilmentyminen validoitiin virtaussytometrialla analyysi. (F) CXCR4

+ soluilla korkeampi tuumorigeenisia ominaisuudet verrattuna CXCR4

– soluja. 10

3 CXCR4

+, CXCR4

-, CD44

+ /CD133

+ ja CD44

– /CD133

– DU145 solut kerättiin FACS lajittelu upotettiin BD Matrigel ja pistetään sc osaksi NOD /SCID-hiiriin. Jokainen koeryhmä sisälsi vähintään viisi hiirtä. Virhe palkit edustavat SEM.

Lopuksi selvitettävä, CXCR4

+ ja CXCR4

– soluilla selvä erilaistumisen potentiaalin analysoimalla nämä solupopulaatioiden ilmentymistä eturauhasen linjaa markkereita. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että eturauhasen syöpä voi olla peräisin CK5

+ tyvisoluihin kanssa multilineage erilaistumista potentiaalia [23], [24]. DU145 ja PC3-solut lajiteltiin CXCR4

+ ja CXCR

– jakeet ja kasvatetaan kudosviljelmässä käsitelty muovi alla erilaistumisolosuhteissa. Mielenkiintoista, CXCR4

+ populaatioiden DU145 ja PC3 solulinjat ovat heterogeenisiä verrattuna CXCR4

– soluja ja sisältävät CK5

+ populaatio pohjapinta epiteelisolujen, väli- väestö pohjapinta-kaltainen CK5

+ /CK18

+ soluja, ja CK18

+ väestö Ontelonsisäisen epiteelisolujen. Sen sijaan, CXCR4

– soluja erilaistumaan CK5

– /CK18

+ ja CK5

+ /CK18

+ solut, mutta eivät aiheuta CK5

+ pohjapinta epiteelisoluihin ( kuvio 3). Tämä tulos viittaa siihen, että CXCR4

+ väestö satamat tuumorigeenisemmiksi pohjapinta kaltaisia ​​soluja, joka on yhdenmukainen viimeaikaisten havaintojen että pohjapinta epiteelisoluihin ovat solun alkuperän eturauhassyövän [25].

FACS puhdistettu CXCR4

+ ja CXCR4

– DU145 ja PC3-soluja viljeltiin erilaistumisen olosuhteissa, kun läsnä on 10% FBS.CXCR4

+ solut erilaistuvat toCK5

+ pohjapinta epiteelisoluihin (10,7%), CK5

+ /CK18

+ välisolujen (32,2%), ja CK18

+ luminaalisen epiteelisolujen (57,1%). Sen sijaan, CXCR4

– soluja erilaistumaan CK18

+ soluja (91,9% koko solupopulaation) ja CK5

+ /CK18

+ soluja (8% koko solupopulaation), mutta ei pohjapinta epiteelin solut. Scale palkit osoittavat 15 pm.

CXCR4 /CXCL12 reitin säätelee eturauhasen syöpäsolujen kautta PI3K /AKT /FOXO3A riippuvainen takaisinkytkentäsilmukka

Viime aikoina olemme osoitti, että aktivoituminen PI3K /AKT-reitin on tärkeää, eturauhassyöpä kantaisä itseuudistumiseen ja tuumorigeenisyystesti [5], [12]. Lisäksi, edellinen tutkimus osoitti, että CXCR4 /CXCL12 vuorovaikutus aktivoi PI3K /AKT signaloinnin eturauhassyöpäsoluissa [26]. Näin CXCR4 voi edistää ylläpitoon eturauhassyövän esisolujen aktivaation kautta PI3K /AKT-akselilla. PI3K /AKT signalointi säätelee transkriptiota kautta forkhead perheen transkriptiotekijöiden (FOXO) fosforyloimalla konservoituneet seriini /tähteitä. Kopioinnin suhteen aktiivisia FOXOs vaikuttaa monenlaisia ​​biologisia prosesseja, kuten solun selviytymisen, DNA korjaus, oksidatiivisen stressin vastaus, ja pitkäikäisyys [27]. Niistä jäsenet FOXO perheen, FOXO3A on osoitettu olevan tärkeä ylläpito hermo, hematopoieettisten ja endoteelisolujen kantasolut [28], [29], [30], ja eturauhassyöpää kantasolujen kaltainen solupopulaatioiden [5] , [12]. Yhdenmukainen aiempien tutkimuksiin, joiden mukaan FOXO3a riippuvaa geeniekspressiota estyy CD44

+ /CD133

+ eturauhassyövän esisolujen versus CD44

– /CD133

– soluja [5], huomasimme, että FACS puhdistettu CXCR4

+ PC3 solupopulaation osoitti vähentynyt ekspressiotasot FOXO3A reagoiva geenejä, kuten p21, GADD45, p130, BIM1 ja CyclinG2 verrattuna CXCR4

– soluja, mikä viittaa siihen, että lisääntynyt ilmentyminen CXCR4 liittyy PI3K aktivointia (kuvio 4A). Eturauhassyövän hoitoon solujen CXCL12 pitoisuutena 100 ng /ml indusoiman aktivaation PI3K /AKT-reitin (jopa 1,5-2,0-kertainen kasvu AKT-fosforylaation PC3 ja DU145-solut, vastaavasti) (kuvio 4B), lisäksi lisäämällä CD44

+ /CD133

+ väestö sekä PC3 ja DU145 soluja (kuvio 2D). Sitä vastoin PI3K esto poistetaan kokonaan vaikutus CXCL12 proliferaatioon CD44

+ /CD133

+ esiasteita (kuvio 4C), ja vähensi taso CXCR4 ilmentymistä sekä DU145 ja PC3-solujen

in vitro

ja

in vivo

(kuvio 4D, E).

(A) eristetty CXCR4

+ PC3 solut osoittivat vähentynyttä ilmentymistä tasoilla FOXO3A reagoiva geenejä, kuten p21, GADD45, p130, BIM1, CyclinG2 verrattuna CXCR4

-PC3 soluja. mRNA-tasot määritettiin kvantitatiivisella RT-PCR: llä ja normalisoitiin GAPDH mRNA. (B) hoito eturauhasen syöpäsolujen kanssa CXCL12 indusoitu aktivointi PI3K /AKT-reitin. DU145 ja PC3-soluja kasvatettiin seerumittomassa, EBM elatusainetta täydennetään ja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla CXCL12 ja NVP-BEZ235 18 tuntia. (C) proliferatiivista vaikutusta CXCR4 /CXCL12 signaloinnin CD44

+ /CD133

+ esisolut voitiin kokonaan lakkautetaan PI3K esto. DU145 ja PC3-soluja kasvatettiin seerumittomassa, EBM elatusainetta täydennetään ja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla CXCL12 ja NVP-BEZ235 täydennetään päivittäin 5 päivää. (D) käsittely DU145 ja PC3-solujen PI3K-estäjien LY294002 ja NVP-BEZ235 alentaneet joidenkin CXCR4. (E) PI3K esto vähenee CXCR4 ilmaisun

in vivo

. DU145-soluja injektoitiin subkutaanisesti NOD /SCID-hiiriin. Kun kasvaimet olivat kasvaneet kokoon 300 mm

3, hiiret käsiteltiin NVP-BEZ235 (12,5 mg /kg joka päivä suun kautta) tai ajoneuvon 5 viikkoa. Histologinen analyysi parafiiniin upotettujen leikkeiden osoittaa vähentäminen CXCR4 ilmaisun ksenograftikasvaimissa käsitelty PI3K estäjä. Scale palkit osoittavat 15 pm. (F) DU145-solut stabiilisti transfektoitu FOXO3A-GFP on vähentynyt CXCR4 ilmentymistä. Western blot-analyysi osoittaa endogeenisten ja yli-ilmentyy FOXO3A fuusioproteiinit (nuolet). (G) ChIP määritys osoittaa, että FOXO3A sitoutuu CXCR4-promoottori. DU145 ja PC3-solut transfektoitiin stabiilisti joko GFP tai FOXO3A-GFP, kuten on kuvattu [17]. Solut silloitettu formaldehydin ja kromatiinin immunosaostettiin anti-FOXO3A /FKHRL1 vasta-ainetta. Silloitetun genominen CXCR4-promoottorin on havaittu PCR: llä. FOXO3a säännelty geeni eNOS käytettiin positiivisena kontrollina. Saostuneen FOXO3A-CXCR4-promoottorin lisääntyi DU145 pysyvästi transfektoitujen solujen FOXO3A-GFP-proteiinia.

Havaitsimme myös lasku CXCR4-proteiinia tasot vastauksena FOXO3A yli-ilmentymisen DU145-soluissa (kuvio 4F ) viittaa siihen, että FOXO3A voisi säädellä CXCR4 tasoja suoraan CXCR4 transkription säätelyyn tai epäsuorasti toisen FOXO3A kohdegeenin. Tarkastus CXCR4 promoottori [31] paljasti oletetun FOXO sitovan sekvenssin GCAAACA [32] asemissa -187–181. Sen varmistamiseksi, että FOXO3A sitoutuu CXCR4-promoottorin, kromatiinin immunosaostus määritys (ChIP) suoritettiin. Saostuneen CXCR4-promoottorin nostettiin DU145 pysyvästi transfektoitujen solujen FOXO3A-GFP-proteiinia (kuvio 4G) osoittaa, että FOXO3A sitoutuu CXCR4-promoottori. Nämä tiedot osoittavat suhde PI3K /AKT aktivaatiota, CXCR4 ilmaisun ja itsensä uusiutumiskyky ja aiheuttavan kasvaimia CD44

+ /CD133

+ eturauhassyövän esisolut.

CXCR4 säätelee kasvain kantasolujen adheesion

rooli CXCR4 syövän etenemisessä on yleensä analysoitu yhteydessä syöpäsolumetastaasi [19], [20], [21], [22], [33]. Molekyylitasolla, CXCR4 on tärkeä välittäjä vuorovaikutuksen eturauhaskasvainsoluissa soluväliaineen proteiineja, kuten laminiinin, fibronektiinin ja kollageenin, joka edistää metastaattisen prosessin [14], [34], [35]. Huolimatta siitä, että CXCR4 ei suoraan moduloida soluunkiinnittymisaktiivisuutta, CXCR4-reseptoriin sitoutumista CXCL12 on keskeinen rooli hallinnassa soluadheesiota moduloimalla integriini ilmaisun, FAK fosforylaatio ja aktivaatio p38 MAPK ja ROCK-kinaasien [34], [36]. Jotta voidaan tutkia roolia CXCR4 solun tarttumista ja kulkeutumista eturauhasen kasvain aloittamista solujen vertasimme, FACS-lajiteltu CD44

+ /CD133

+ /CXCR4

+ solujen muut populaatiot soluadheesioanalyyseissä. Huomasimme, että CD44

+ /CD133

+ /CXCR4

+ soluilla on merkittävästi suurempi CXCL12-riippuvainen adheesio fibronektiiniin kuin CD44

+ /CD133

+ /CXCR4

– tai CD44

– /CD133

– /CXCR4

– solupopulaatioiden (kuvio 5A). CXCL12-indusoidun adheesion eturauhasen syöpäsolujen soluväliaineen välittyy integriinien. Mielenkiintoista on, että ekspressiotasot α2, α5, ja β3 integriinin alayksiköiden vahva lisäävä säätely on CD133

+ /CD44

+ DU145 verrattuna CD133

– /CD44

– DU145-solut (kuvio 5B), sopusoinnussa viimeaikaiset tutkimukset, jotka osoittavat, että aktivoituminen CXCR4 /CXCL12 väylän DU145 soluissa johtaa tehostetun ilmentymisen α5 ja β3 integriinien [14]. Lisäksi inaktivaatio PI3K polkuun NVP-BEZ235 (200 nM) laski merkittävästi CXCR4-riippuvaisen adheesion CD133

+ /CD44

+ DU145 solujen fibronektiiniin, ja tämä esto voitaisiin poistaa, kun läsnä on 200 ng /ml CXCL12 (kuvio 5C). Merkillistä, tarttuvuus CD133

– /CD44

– DU145 solut eivät reagoineet CXCL12 hoitoon tai PI3K signalointi esto (kuvio 5C). Yhdessä nämä tutkimukset osoittavat, että ilmentyminen CXCR4 voisi tarjota valikoivaa etua vuorovaikutusta soluväliaineen ja helpottaa preinvasive sitoutuminen kasvaimen progenitorisolujen jotta jatkettaisiin kasvain levittämistä.

(A) DU145 CD44

+ /CD133

+ /CXCR4

+ soluilla on merkittävästi suurempi CXCL12-riippuvainen adheesio fibronektiiniin kuin CD44

+ /CD133

+ /CXCR4

– tai CD44

– /CD133

– /CXCR4

– solupopulaatioiden. Soluja, FACS-lajiteltu ja maljattiin fibronektiinillä päällystetyille levyille ja annettiin kiinnittyä 1 tunnin ajan. Solut laskettiin kolme syvennystä per ehto käyttäen faasikontrastimikroskoopissa. * – P-arvo 0,05. (B) Ilmaisu taso α2, α5, ja β3 integriinien alayksiköistä on vahvasti yliaktiivista CD133

+ /CD44

+ DU45 verrattuna CD133

– /CD44

– DU45 soluja. (C) inaktivointi PI3K polkuun NVP-BEZ235 merkittävästi vähentää CXCR4-riippuvaisen adheesion CD133

+ /CD44

+ DU45 solujen fibronektiiniin. Tarttuvuus CD133

+ /CD44

+ DU45 soluja voitaisiin palauttaa läsnäollessa CXCL12. Tarttuvuus CD133

– /CD44

– DU45 ei vastannut CXCR4 ja PI3K signalointi modulaatio, * p-arvo 0,05.

esto CXCR4 polku johtaa väheneminen eturauhassyövän kantaisä populaatiot

tuovat lisänäyttöä siitä, että CXCR4 /CXCL12 signalointi on tärkeää kantasolujen kaltaisia ​​solujen ylläpito ja kohdistamista tämän reitin voi johtaa inhibitioon eturauhassyövän kantaisä kasvua, testasimme jos inaktivointi CXCR4 /CXCL12 akselin neutralisoivien vasta vaikuttaa eturauhassyövän esisolujen

in vitro

ja

in vivo

. DU145-soluja käsiteltiin 10 ug /ml neutraloivia anti-CXCR4 (hiiren monoklonaalinen IgG, klooni 44716, R * – P-arvo 0,05. (B) Virtaussytometria-analyysi paljasti vaimennus CD44

+ /CD133

+ väestön DU145 soluissa, joita käsiteltiin 10 ug /ml neutraloivia anti-CXCR4 (hiiren monoklonaalinen IgG, klooni 44716, R * – P-arvo 0,05. (C) Western blot-analyysi DU145-solujen käsiteltiin 10 ug /ml neutraloivia anti-CXCR4-vasta-ainetta 5 päivää osoitti downregulation PI3K /AKT-reitin aktivaatio verrattuna soluihin käsiteltiin 10 ug /ml ohjaamaan vasta-aine. Solun kasvatettiin väliaineessa, jota oli täydennetty 2% FBS: ää. Kasvatusliuos päivittyy joka toinen päivä. (D) esi-inkubointi eturauhassyöpäsolujen neutraloivilla anti-CXCR4-vasta-aine merkittävästi hidastaa kasvaimen kasvua. 5 x 10

5 DU145 soluja oli esikäsitelty neutraloivat anti-CXCR4 tai kontrolli vasta-aine 5 päivän upotettiin BD matrigeeliä ja injektoidaan s.c. osaksi NOD /SCID-hiirissä. * – p-arvo 0,01.

testataan vaikutuksia CXCR4-erityinen pieni molekyyli antagonisti AMD3100 selviytymisen kantaisä väestöstä (CD44

+ /CD133

+) eturauhasen syöpäsolulinjoissa. PC3-soluja käsiteltiin 0,5 uM AMD3100 tai 75 uM tavanomaisen kemoterapeuttisen lääkeaineen 5-fluorourasiilin kanssa 4 päivää seerumittomassa epiteelin kasvua väliaineessa. Virtaussytometrianalyysi paljasti 2,2-kertainen lasku CD44

+ /CD133

+ väestöstä AMD3100 hoitoa (kuvio 7A ja kuvio S2A), kun taas tämä populaatio nostettiin tasolle 2,1 kertaiseksi vastauksena tavanomaista hoitoa. Sen sijaan CD44

– /CD133

– väestö oli herkkä tavanomaisten kemoterapia esittää 2,1-kertainen pieneneminen, mutta oli vastannut AMD3100 hoitoon. Lisäksi yhdistelmä AMD3100 ja kemoterapeuttisen lääkkeen johti vähenevät samanaikaisesti sekä CD44

+ /CD133

+ ja CD44

– /CD133

– solupopulaatioiden (≥1.8-kertainen pieneneminen ja 1,7 kertainen pienenee vastaavasti).

(A) Käsittely CXCR4-antagonisti AMD3100 vähentää CD133

+ /CD44

+ väestöstä, mutta ei merkittävästi vaikuta CD133

– /CD44

– perusjoukko syöpäsolujen. Käyttö sytostaattien yksin johtaa väheneminen lisääntyvissä tuumorisoluissa, vaan johtaa yleiseen kasvuun väestön suhteellinen kasvain aloittamista solujen. Kombinatorisista hoito PC3-solujen kanssa AMD3100 ja tavanomaisen kemoterapeuttisen lääkeaineen 5-fluouracil pienentää sekä eriytymättömiä ja erilaistuneita soluja populaatiot. PC3-soluja kasvatettiin seerumittomassa, EBM elatusainetta täydennetään ja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla AMD3100 ja 5-fluouracil. On 5

päivänä solut altistettiin virtaussytometrialla analyysi; * P-arvo 0,05. (B) Kombinatoriset terapia

in vivo

osoittaa merkittävää tuumorin kasvun estäminen verrattuna yhden lääkehoitoa. Hiiriä käsiteltiin Taxotere (20 mg /kg, 1q.w., p.o.), kuten on kuvattu (19). Alzet pumppuja käytettiin toimittaa AMD3100 vakionopeudella 0,25 ug /kg /tunti. Pumput ladattu AMD3100 tai suolaliuosta istutettiin ihon alle. Hiiriä tarkkailtiin 8 viikkoa ulkonäön ja kasvaimia. (C) CD133 ja CD44 immunovärjäys jääleikkeillä of ksenograftikasvaimissa käsitelty kombinatorisista tai mono-terapiaa (B) paljasti selektiivinen esto CD133

+ /CD44

+ väestöä CXCR4-antagonisti AMD3100; * P-arvo 0,05. (D) Western blot-analyysi osoitti merkittävää vähenemistä FOXO3A fosforylaatio kasvainten käsitelty AMD3100.

Yhdistelmähoitoa kohdistaminen kantasoluihin ja bulk kasvainsolujen johtaa tehostetun kasvaimen taantumiseen

Määritä Kaikki Leikkaus suoritettiin natrium- pentobarbitaalianestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen.