Krooninen sairaus

tiivistelmä

Capan-1 on hyvin tunnettu

BRCA2

vajausta ihmisen solulinja eristettiin maksasta etäpesäke on haiman adenokarsinooma. Kirjoittajat raportoivat genomin laajuinen arviointi rakennevariaatiot ja korkea-syvyys exome luonnehdinta yhden nukleotidin varianttien ja pieni lisäys /poistot Capan-1. Tunnistaa mahdolliset somaattisten ja kasvaimeen liittyvä vaihtelut puuttuessa sovitetun normaalin solulinjan, olemme kehittäneet uuden menetelmän, joka perustuu analyysiin HapMap näytteitä. Osoitamme, että Capan-1 on yksi järjestetään uudelleen genomit sekvensoitiin mennessä. Lisäksi pienet lisäykset ja poistot havaitaan useammin yhteydessä lyhyt jakso toistuu kuin muissa genomien. Olemme myös tunnistaa useita uusia mutaatioita, jotka voivat edustaa geneettisiä muutoksia, jotka ovat vaikuttaneet taudin etenemiseen. Nämä tiedot tarjoavat käsityksen genomiseen vaikutuksia menetyksen BRCA2-toiminto.

Citation: Barber LJ, Rosa Rosa JM, Kozarewa I, Fenwick K, Assiotis I Mitsopoulos C, et al. (2011) Kattava Perimän analyysi

BRCA2

Puutteellinen Human Haimasyöpä. PLoS ONE 6 (7): e21639. doi: 10,1371 /journal.pone.0021639

Editor: Robert Oshima, Sanford-Burnham Medical Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu 17. maaliskuuta 2011; Hyväksytty: 3 kesäkuu 2011; Julkaistu: 05 heinäkuu 2011

Copyright: © 2011 Barber et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat kiitos Läpimurto Breast Cancer, Cancer Research UK, ja American Association for Cancer Research /Stand Up on Cancer rahoitusta tähän työhön. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Yksilöt heterotsygoottinen toimintakyvyn menetystä mutaatioita tuumorisuppressorigeeniä

BRCA2

ovat erittäin alttiita useita erilaisia ​​syöpiä. Naiset, jotka perivät mutantti

BRCA2

alleeli on huomattavasti erittäin kohonnut elinikäinen riski sairastua rinta- ja munasarjasyövän syöpiä [1]. Lisäksi mies rintojen ja eturauhasen syöpiä liittyvät vahvasti

BRCA2

geenimutaatioita [2]. Molemmilla sukupuolilla,

BRCA2

puute lisää riskiä sairastua syöpiin haima, vatsa, sappirakko ja sappitiehyeiden sekä melanooma [3]. Hoito haimasyövän esittelee merkittäviä haasteita, sillä useimmat potilaista on paikallisesti edennyt tai etäpesäkkeitä ja tavanomaisten syöpähoitoihin osoittavat vähäiseksi; vain 5%: lla haimasyöpä hengissä yli viisi vuotta alkuperäisestä diagnoosista [4], [5].

BRCA2 avainasemassa ylläpidossa genomista eheyden, erityisesti sääntelyn DNA: n korjaukseen homologisella rekombinaatio korjaus (HR) [6] prosessia, joka ohjaa myös toisen tuumorisuppressoriproteiinia, BRCA1 [7]. HR on pääosin virheetöntä prosessi, joka palauttaa alkuperäisen sekvenssin paikalla DNA double-säikeen katkoksia (DSB: t) [8]. DSB syntyy suhteellisen usein ja voi johtua normaalista solujen replikaatiota sekä eksogeenisen stressi kuten altistuminen ionisoivalle säteilylle [9]. Koska HR, esimerkiksi menettämisen vuoksi BRCA2-toiminto, DSB näyttävät korjata entistä virhealtista prosesseja, jotka lopulta johtavat kertyminen kromosomaalinen uudelleenjärjestelyjä [10]. Uskotaan, että hyödyntäminen virhealtista DNA korjausprosessien puuttuessa BRCA2 toiminta todennäköisesti edistää tuumorigeneesiä [10]. Osana rooliaan HR, BRCA2 ohjaa lastaus ja poisto DNA rekombinaasin RAD51 klo DSB. Tuloksena RAD51-ssDNA hehkulangan välittää etsiä homologisen DNA-sekvenssin mallineeseen korjaamiseen DSB [11].

Huolimatta suurta kiinnostusta BRCA2-toiminto ja sen rooli tuumorigeneesiä ja DNA: n korjaukseen, on olemassa muutamia kasvainsolun malleja BRCA2 puutos, joka voidaan käyttää tuottavasti laboratoriossa. Näistä Capan-1 on kaikkein hyvin tunnettu. Capan-1 oli peräisin maksasta etäpesäke on 40-vuotias valkoihoinen mies, jolla on ensisijainen haiman adenokarsinooma [12], [13]. Nämä solut puuttuu toiminnallinen

BRCA2

alleeli sijaan kuljettaa

c.6174delT

alleeli. Yhden emäksen deleetion

c.6174

aiheuttaa lukukehyksen, (p.S1982fs * 22) aiheuttaen C-terminaalin 1416 aminohappoa proteiini [14], [15]. Tuloksena typistetty proteiini puuttuu kaksi BRC motiiveja mukana vuorovaikutuksen BRCA2 kanssa RAD51 ja ssDNA [16], sekä C-terminaalisia sekvenssejä ajatellaan vaaditaan ydinvoiman lokalisoinnin BRCA2 ja RAD51 /DNA purkaminen [17], [18] . Tämä katkaistu BRCA2 isoformi on osoitettu olevan sekä sytoplasman ja huonosti HR [19], [20]. Noudattaen käsite, joka BRCA2 toimintahäiriö johtaa perimän epävakaisuuden, SKY karyotyyppi analyysi osoitti, että Capan-1 hallussaan hypotriploid genomi, jossa on 36 määritellyn, järjestelyihin jakautuvat koko genomin [21]. Suurin osa näistä uudelleenjärjestelyjä ovat todennäköisesti hyvin monimutkaisia ​​ja näytä liittyvän enemmän kuin kolme kromosomi segmenttien vaikka kaksi vastavuoroinen toiselle siirtäminen (t (6, 15) ja t (7; 10)) on kuvattu (www.path.cam.ac. uk /~ pawefish).

koska paljon käyttöä Capan-1-solulinjassa mallina paitsi BRCA2 toimintahäiriön, mutta myös haimasyöpä, käytimme seuraavan sukupolven sekvensointitekniikan tutkia genomisen sekvenssin tämän solulinjassa.

tulokset

DNA Sekvensointistrategia

tunnistaa ehdokas, järjestelyihin ensin tuotti keski- syvyys koko genomin sekvenssi Capan-1. Me eristetty DNA: ta Capan-1-solut, ja tuotti 500 emäsparin fragmentin DNA-kirjastosta käyttäen PCR-vapaa lähestymistapa, joka parantaa kirjaston monimutkaisuus [22]. Tämä DNA-kirjasto sekvensoitiin käyttämällä pariksi-end strategia koskevasta Illumina GAIIx Genome Analyser, tuottaen 365811868 raaka 76 emäsparin mate-pariksi lukee (27,8 Gb). Sen jälkeen mukautuminen viittaus ihmisen genomin (hg19 /build37) ja myöhemmät suodatus prosessi poistaa PCR kaksoiskappaleet ja huonolaatuista lukee, tämä tieto on riittävästi genomin kattavuus (90,09%) tutkimiseen, järjestelyihin, mediaani syvyys 8,55 kertainen (taulukko 1, taulukko S1).

tutkimiseksi koodaavan sekvenssin Capan-1 syvällisemmin, käytimme kohdennettua rikastus perustuva strategia Agilent SureSelect in-ratkaisu kaapata. Olemme käyttäneet SureSelect Human Kaikki eksoni kit, kuvaamaan suurempi kuin 38 Mb ihmisen genomista DNA: ta, joka vastaa NCBI konsensuksen CDS tietokantaan. Kaksi itsenäistä kaapata hybridisaatiot tehtiin noin 200 emäsparin fragmentit Capan-1 genomista DNA. Saatu exome kirjastot sekvensoitiin Illumina GAIIx käyttäen pariksi loppuun 2 x 76 bp sekvensointi kulkee. Tämä tuotti 130310847 raaka lukee (9.9 Gb). Samoin koko genomin analyysi, sekvenssi lukee Talteenottoprosessi linjattu viittaus ihmisen genomin (hg19 /build37) käyttäen Burrows-Wheeler Aligner (BWA, [23]) ja sen jälkeen suodatetaan PCR kaksoiskappaleet ja huonolaatuista lukee. Prosenttiosuus lukee tavoite oli 65%, lopullisen kattavuus 98,51% varten syötti alueille, joiden mediaani syvyys 89-kertainen (taulukko 1, taulukko S2), ylittää reilusti 30-kertainen syvyys tunnistamiseen tarvittavat geneettiset variantit kasvainnäytteestä [24].

sekä koko genomin ja exome sekvensointi strategioita, yli 80% lukee linjattiin yhdessä niiden mate-pari (taulukko 1). Kun kyseessä on koko genomin uudelleen sekvensointi, 5,63% ja lukee kartoitettu eri kromosomi verrattuna niiden mate-paria, ja lisäksi 10,31% of lukee oli orvoksi, eli jos mate-pari ei tasata liiallisesta N tai epäsuhta /indeleitä (taulukko 1). Tämä tukee edellinen matalan resoluution spektrin karyotype analyysit (SKY) ja Capan-1, joissa ehdotetaan erittäin jäsensi genomi [21]. Sillä exome järjestyksessä, hieman vähemmän lukee olivat linjassa riippumatta niiden mate-paria kuin kokonaisen-exome sekvensointi, ehkä viittaa siihen, että uudelleenjärjestelyjä sisällä koodaava alue esiintyi harvemmin Capan-1 kuin ei-patogeeniset alueilla (taulukko 1).

Sequence syvyys koko genomin verrattiin tuottamia tietoja array vertaileva genominen hybridisaatio (aCGH) (Fig. S1, taulukko S1). Yleensä mediaani syvyys kunkin kromosomi tunnistaa sekvensoimalla Hyväksytty kopiomäärä profiilin tuottaman aCGH (Fig. S1). Esimerkiksi kromosomeja kuten 4 ja 6, että aCGH näytti olevan läsnä kahtena kappaleena, pääasiassa osoitti jopa syvyys poikki koko pituudeltaan. Lisäksi yhden kopion X-kromosomi palasi suunnilleen puoli määrä lukee kromosomien 4 ja 6. aikaisemmin raportoitu [21], [25] homotsygoottinen deleetio 9p21 joissa

CDKN2A

, ja menetys enemmistön kromosomi Y, myös varmistettiin sekvensoimalla (kuvio 1A, Fig. S1, taulukko S1).

. Genominlaajuisten Circos käyrä uudelleenjärjestelyjen tunnistettu Capan-1 Breakdancer analyysi. Ideogrammi normaali karyotyyppi näkyy ulkoreunalla, ja kopioluvun edustaa sinisen linjan keskellä soi. Suhteellinen asema ja luokka kunkin uudelleenjärjestely on kuvattu sisällä sisäpiiriin, kuvatulla tavalla legenda. B. Vertailu kokonaismäärästä sisäiseen ja kromosomi uudelleenjärjestelyt havaita breakdancer analyysi paneelin

BRCA2

,

BRCA1

, ja ei-

BRCA

mutatoitunut solulinjat ja ensisijainen kasvaimia. C. Näytteet luokiteltiin

BRCA

-mutated (mut) tai BRCA villityypin (wt), ja numerot välisten, sisäisten kromosomi, ja koko uudelleenjärjestelyjä verrattiin. p-arvot viittaavat Mann Whitney analyysin Gaussin approksimaatio. D. vertailu prosenttiosuus kunkin luokan uudelleenjärjestely kussakin näytteessä. Näytteet luokitellaan

BRCA2

,

BRCA1

, ja ei-

BRCA

mutatoitunut, kuten B.

Rakenteelliset vaihtelu

tunnistaa ehdokas, järjestelyihin, olemme analysoineet koko genomin sekvenssi Capan-1 käyttäen breikkaaja [26]. Käytimme tiukat suodatus menetelmää, joka vain tunnistaa uudelleenjärjestelyjä tukee vähintään kymmenen lukee (mediaani syvyys poikki genomi oli 8.55x). Tämä lähestymistapa tunnistettu 354 suuria rakenteellisia vaihteluita Capan-1, joka oli osa-luokiteltu kromosominvälinen deleetiot, insertiot, inversioita tai muun kromosomin suora tai käänteinen translokaatioita (Fig. 1A). Ei insertiot havaittu tämän analyysin, koska ne kaikki kuuluivat rajojen normaali fragmentti kokojakauman (1-1000 emäsparia).

Koska Capan-1 on BRCA2 puutteellinen malli, tutkimme mahdollisuutta, että keskipitkän syvyys, koko genomin sekvensointi voitiin käyttää erottamaan BRCA1 ja BRCA2 puutteellinen kasvaimia ei-familiaalinen muodot. Tähän mennessä kaksi BRCA2 puutteellinen kasvaimia, kaksi BRCA1 puutteellinen kasvaimia, ja kaksi BRCA1 puutteellinen solulinjoja on myös tehty keski- syvyys koko genomin sekvensointi, osana laajempaa tutkimusta ensisijaisen rintasyövistä ja solulinjat [27]. Saimme raakadata Tämän tutkimuksen [27], ja käsitellään sen omilla putki, johon sisältyi analyysi Breakdancer. Näin pystyimme suoraan vertailla taajuuden ja tyyppi, järjestelyihin tunnistettu Capan-1 sekä BRCA puutteellinen ja asiantunteva ensisijainen rintasyövistä ja solulinjoissa (Fig. 1 B-D). Kaikista genomit tutkittu, Capan-1 näytteillä eniten, järjestelyihin, sekä kansainvälisiä ja kromosominvälinen (Fig. 1 B). Vaikka näytteen numero tutkittavana oli suhteellisen pieni (n = 7

BRCA

mutantti kasvaimia vs. n = 15 ei

BRCA

mutantti kasvaimet) vertaaminen Capan-1 data tietojen kanssa

BRCA2

mutantti ensisijainen rintasyövistä ja

BRCA1

mutantti ensisijainen rintasyövistä ja solulinjojen teki ehdottaa suuntaus BRCA puutteellinen näytteiden näytteille suurempia määriä, järjestelyihin, (mediaani määrä

BRCA

mutantti kasvaimet = 72 uudelleenjärjestelyt, mediaani määrä ei-

BRCA

mutantti kasvaimet = 41; Fig. 1 C), sopusoinnussa roolit BRCA1 ja BRCA2 ylläpitämisessä genomista vakautta. Vaikka tämä havainto ei ollut tilastollisesti merkitsevä (p = 0,1368, Mann Whitney), tämä voisi johtua alhaisen otoskoko. Lisäksi kuten mutaatiot geeneissä muu kuin

BRCA1

ja

BRCA2

vaikuttaa HR, on täysin mahdollista, että jotkut näytteistä luokiteltu ”ei-

BRCA

” voisi myös on samanlainen HR puutos

BRCA1 /2

mutantti kasvaimia. Prosenttiosuus koko uudelleenjärjestelyjä kussakin luokassa oli myös verrata koko

BRCA

-mutant että ei-mutanttien ryhmää (Fig. 1 D). In Capan-1, kuten useimpien muiden genomien, kromosominvälinen deleetiot olivat yleisimmät luokan uudelleenjärjestelyä. Kuitenkaan ollut selkeää lajista tai uudelleenjärjestelyjä, joka oli spesifinen

BRCA

-mutant soluja, joka perustuu tämä pieni joukko näytteitä.

Useat brutto, järjestelyihin aiemmin tunnistettu in Capan-1 käyttäen spektrin karyotyyppi (SKY) analyysi [21]. Päätöslauselmassa kuitenkin SKY analyysi on suhteellisen pieni ja monissa tapauksissa koordinaattipaikkoihin monien oletetun uudelleenjärjestelyjä tunnistettu tällaista analyysiä ei voi ennustaa mitään suurta luottamusta. Koska tämä, me vain yrittänyt vertaileva analyysi NGS tietojen SKY kun tietojen koordinaattisijainteja SKY ennustettu uudelleenjärjestelyjä voitaisiin tehdä sisällä -10 Mb. Tämä vertaileva analyysi viittasi siihen, että kuusi aikaisemmin tunnistetut uudelleenjärjestelyjen voitaisiin myös tunnistaa käyttäen koko genomin sekvensoinnin, mutta tarkempia (taulukko 2). Lisäksi monimutkaisia ​​uudelleenjärjestely välillä kromosomeja 6, 8, ja 17 oli aiemmin ehdottanut SKY analyysi, vaikka ei riittävän yksityiskohtaisesti selvittämään tarkat alueet kunkin kromosomin mukana. Analyysimme ehdotti myös monimutkainen toiselle siirtäminen välillä kromosomeja 6 ja 8, ja välillä 8 ja 17 (taulukko 2).

Mielenkiintoista, yksitoista tunnistetuista kromosomien välisen uudelleenjärjestelyihin tunnistettu Capan-1 näytti samaan aikaan aiheuttavaa alueiden sekä raja-arvot, mahdollisesti viittaa geenin fuusio tapahtumia (taulukko 3). Mitään näistä fuusioista on aiemmin raportoitu Cancer Genome Census [28]. Lisäksi 42 uudelleenjärjestelyjä löydettiin geenin sisällä tai ylävirran säätelyalueita yhdellä murtuessa, mikä voisi myös olla haitallisia vaikutuksia (taulukko S3). Yksi näistä uudelleenjärjestelyjä oli keskeytyskohta geeni,

ZNF521

, joka on äskettäin tunnistettu kohteena kromosomitranslokaation akuutti lymfaattinen leukemia [29]. Lisäksi 118 geenit näyttivät vaikuttaa kromosominvälinen uudelleenjärjestelyjä (taulukko S4).

Exome yhden nukleotidin muunnos (SNV) ja Indel löytö

Tunnistaa SNVs ja pieni lisäys /poisto ( Indel) tapahtumia koodaavan sekvenssin Capan-1, käytimme SAMtools [30], että kasautuvat analyysi korkean syvyys exome sekvenssin ja sen jälkeen SNV kutsuvan. Pieni indeleitä (1-6 emäsparia) tunnistettiin käyttämällä mukautettua putki (katso menetelmät). Suuremmat Indel keksintö saatiin aikaan käyttämällä Pindel [31]. Ensisijaisesti, variantit suodatettiin jättää nämä havaita syvyydessä alle kymmenen lukee per kappale. SNVs ja indeleitä Viitattu väestössä polymorfismien dbSNP myös huomiotta, koska olimme laajalti kiinnostuneita tunnistamisessa todennäköisesti syöpää erityisiä muutoksia.

Kuten suurin osa kasvain- solulinjoissa, Capan-1 ei on sovitettu normaali solulinja samasta potilaasta, jotka voitaisiin käyttää auttaa tunnistamaan syövän koskevat muutokset ja poista esineitä, jotka johtuvat sekä näytteestä tuotannosta ja linjaus. Tämän valossa, kehitimme prosessi suodatus exome uudelleenjärjestely, joka perustuu rajat vertaamalla saatuja tietoja analoginen näytteen valmistus ja analyysi neljän normaalin genomin HapMap näytteitä (NA11881 (mies); NA12761, NA12813, ja NA12892 (female )) (taulukko S5). Käyttämällä näitä HapMap näytteet, pystyimme poistamaan esineitä, jotka johtuvat sekä näytteestä tuotannosta (esim vaihtelu hybridisointitehokkuus) ja linjaus (esim homologiset alueet).

analyysi saatuja tietoja exome resequencing on HapMap näytteiden käytössä voimme asettaa raja-arvot homotsygootista (variantti lukee 88% tai 10% kokonaismäärästä) ja heterotsygotian (muunnos lukee 33-67% kokonaismäärästä) muunnelmia. Nämä kynnykset käytettiin suodattaa tunnistettu SNVs ja indeleitä että Capan-1 genomin. Lisäksi koska olimme kiinnostuneita tunnistamaan ehdokas kasvain-mutaatioita, me huomiotta kaikki mutaatiot, jotka olivat myös havaittu HapMap näytteistä, sillä noin normalisointi todennäköisesti ituradan vaihtelu.

Edelleen taso tiukkuuden myös harkittu kopiomäärä muuttuu poikki Capan-1 genomin, määrittelemän aCGH analyysi. Tämä on erityisen tärkeää hyvin järjestetty uudelleen ja aneuploidi genomit, kuten Capan-1. Kokemuksemme, käytöstä aluekohtainen suodattimet sekvensointiin ohjaus helpottaa luotettavampi muunnos tunnistamisen. On selvää, heterotsygoottinen variantteja kutsutaan yhtenä kappaleena alueilla on todennäköisesti väärä (johtuu todennäköisesti siirtymä), ja muualla määrä lukee joissa variantin alleelin voi vaihdella eri tavalla riippuen kopiomäärä tila. Niinpä luottamus kynnysarvoja sovellettiin sekä SNV ja Indel löytö, jonka mukaan vähintään 10 lukee per genomista kopiota. Lisäksi ainakin kolme variantti lukee vaadittiin soittaa SNV ja vähintään seitsemän variantti lukee varten indeleitä, per genomista kopiota. Tuloksena luettelo SNVs ja indeleitä tunnistettu Capan-1 on eritelty taulukoissa S6 ja S8, vastaavasti.

karakterisointi koodaus SNVs

Low suoritusteho ehdokas geenisekvensseihin tutkimuksissa Capan-1 on aiemmin tunnisti kolme homotsygoottinen SNVs in

KRAS

,

Smad4

ja

MAP2K4

. Käyttämällä exome sekvensointi, pystyimme havaitsemaan kaikki kolme näistä muutoksista:

KRAS

c.35G T mutaatio, joka aiheuttaa kliinisesti merkittävää p.G12V aminohapposubstituutio [32], [33], c .1028C G SNV on

Smad4

, joka johtaa ennenaikaiseen lopetuskodoniin [34] ja

MAP2K4

c.661G T mutaatio Capan-1, joka johtaa syöpään liittyvän proteiini katkaisu [35]. Ulkonäkö kaikki kolme näistä mutaatioiden lopullisen suodatetun luettelon exome variantteja, antoi luottamusta analyysimme putkistoja (taulukko S6).

Käytät syvyys exome sekvensointi tunnistimme yhteensä 608 SNVs vuonna Capan -1 jotka vaikuttavat 1270 eri transkriptien (taulukko 4). Useimmat mutaatiot (61%) oli ei-koodaavat alueet (ei-koodaavat geenit tai intronit), tai ne olivat samaa variantteja. Kaksikymmentäneljä prosenttia vaikuttanut transkriptien muutettiin ei-synonyymi koodausta muutoksia. Kaikkiaan, ei-synonyymi SNVs havaittiin 206 eri geeniä, 56, jotka olivat homotsygoottisia (taulukko S6). Kaksitoista geenit sai ennenaikaisen lopetuskodonia, joista neljä oli homotsygoottisia (

GRIA3

,

GRM1

,

MAP2K4

,

Smad4

). Merkittävää on, että määrä todennäköinen somaattisten koodaus mutaatioita havaittiin Capan-1 Tässä tutkimuksessa verrattiin erittäin suotuisasti esitettyjen aiemmissa tutkimuksissa tutkimalla kasvainsolulinjat COLO-829 (172 ei-synonyymi SNV) [36] ja NCI-H209 (94 ei-synonyymi SNV) [24]. Molemmat aikaisempien tutkimusten tunnistaa somaattisista mutaatioista vertaamalla vastaaviin normaaleihin veren DNA ohjaus samasta potilaasta, mikä viittaa siihen, että käyttö HapMap exomes on tehokas vaihtoehto tunnistamiseksi somaattisten mutaatioiden Capan-1, ja muut ”orpo” solu linjat.

kolme romaanin mahdollisten lyhennetty mutaatioita valittiin validointi Sangerin sekvensoinnilla:

GRM1

(

c.C1458A

, p.Y486 *),

SMAP2

(

c.C764G

, p.S255 *), ja

GLT6D1

(

c.G593A

, p.W198 *). Kaikki kolme näytettiin olevan totta SNVs, ja tsygoottisuus havaitsemat exome sekvensointi vahvisti myös Sanger sekvensoinnilla: homotsygoottisia

GRM1

, heterotsygoottinen

SMAP2

ja

GLT6D1

(Fig. 2A-C).

GRM1

koodaa metabotrooppisen glutamaattireseptorin, poikkeava ekspressio, joka on ehdotettu olevan rooli kehityksessä melanooman [37]. SMAP2 on ARF1-spesifinen GTPaasia aktivoivan proteiinin mukana clathrin riippuvainen kalvon kaupan [38].

GLT6D1

geeni koodaa sellaisenaan vielä tunnistamattomia Glykosyylitransferaasia 6-domain-sisältävää proteiinia.

. Kromatogrammi, joka kuvaa stop-voitto SNV in

GRM1

havaita Capan-1. Proteiini ja genomiset viitesekvenssien yläpuolella näkyvät kromatogrammi. SNV on korostettu sinisellä referenssisekvenssissä, ja vaikutti jäännös alleviivattu. B. A ja

SMAP2

. C. As A, sillä

GLT6D1

. D. vertailu yhden emäksen substituutio taajuuksien Capan-1, pohjapinta-kuten rinta- kasvain, NCI-H209, COLO-829, ja U87 MG genomien. E. Vertailu koko genomin ja exome erityisiä emässubstituution taajuuksilla havaittu Capan-1.

Kaikki romaanin SNVs tunnistettu tässä oli ristiviittaus useita online tietokantojen (SIFT [39 ], [40], Mutation Taster [41], [42], DAVID [43], [44], CGC [28], [45]) ennustaa niiden kyky muuttaa proteiinin toimintaan. Yksi mielenkiintoisimmista ehdokkaiden oli homotsygoottinen c.

C162A

mutaatio

FZD10

, jäsen frizzled-geenin perhe, joka koodaa Wnt ligandia sitova reseptoreihin [46]. Homotsygoottinen

c.C162A

muunnos havaittu tässä tutkimuksessa johtaa ei-synonyymi aminohapposubstituution (p.N54K) on erittäin konservoitunut tähde sisällä oletetun Wnt ligandin sitoutumiskohdan (FZ domain) [47] , [48]. FZD10 on positiivinen säätelijä Wnt-βCatenin-TCF signalointireitin, on osoitettu olevan säädelty vahvistavasti ensisijainen Kolorektaalituumorien [49], ja Wnt-beeta kateniini signaloinnin tiedetään olevan poikkeava joissakin haiman adenokarsinoomat [50].

kolme homotsygoottisia variantteja oli läsnä tuumorisuppressorigeenin

DCC

(

Poistettu in kolorektaalikarsinoomasta) B, joka koodaa netrin reseptoria tarvitaan solujen erilaistumista [51], ja myös apoptoosin induktion puuttuessa ligandin [52]. Mutaatiot ja menetys

DCC

on aikaisemmin liitetty haimasyövän, sekä useita muita kasvaimia [52], [53]. Yksi kolmesta uusia variantteja havaittu Capan-1 oli sijoitettava Donorisilmukointikohdassa intronin 20-21, neljä emästä alavirtaan kriittisen GT motiivi. Kaksi muuta vaihtoehdot johtaneet ei-synonyymi proteiinin mutaatiot (p.L1042 M ja p.K1411T). Vaikka kumpikaan näistä jälkimmäinen ei-synonyymi mutaatioita on aiemmin raportoitu, molemmat sijoittuvat lähelle jäämät kiinnostusta: p.F1039S, mutatoituneet adenokarsinooma [54]; ja p.Y1418, kriittinen jäännös fosforyloituu Fyn, ja tarvitaan DCC toiminto [55].

Cross-referointia SNVs havaittu Capan-1 kanssa Cancer Gene konsensuksen (CGC) [28], [45] tunnistettiin kaksitoista geenejä, jotka on aiemmin osoitettu olevan mutatoitunut muilla tähteiden syöpäsolulinjoissa tai ensisijainen kasvaimia. Mikään variantit tunnistetaan Capan-1 tässä tutkimuksessa on kuvattu aikaisemmin. Kuitenkin, suurin osa näistä muutoksista olivat ei-koodausta tai synonyymi muutokset (taulukko S7). Heterotsygoottiseen kuin synonyymi mutaatio havaittiin genomin vakauteen tarkistuspisteen tekijä

ataksia verisuoniluomen mutaation

(

ATM

). Kuitenkin, variantti jäännös (p.R1585S) on ulkopuolella tiedossa funktionaalisia domeeneja, ja sen vuoksi on vaikea ennustaa toiminnallisia seurauksia tämän muutoksen. Toinen romaani heterotsygoottinen kuin synonyymi mutaatio tunnistettiin

TPR

(

siirtämisellä promoottorialueen

), joka koodaa proteiinia, joka on vuorovaikutuksessa tumahuokonen monimutkainen. Tämä mutaatio (p.V779I) käsittää konservoituneen tähteen tiedetään motiivi yhteinen kromosomi eriytymistä proteiineja, vaikka valiini isoleusiiniksi korvaaminen tunnistettu tässä on todennäköisesti neutraali.

Patterns of emässubstituution

halusimme arvioida, onko rakenteessa yhden emäksen substituutioiden Capan-1 heijastuu muiden syöpää genomien. Aiemmin julkaistut ihmisen solulinjassa genomeja, COLO-829 [36], ja NCI-H209 [24] kukin näyttely luonteenomainen emässubstituutioiden edustavan UV ja tupakan karsinogeeni altistumista suurempi. Olemme saaneet tiedot näistä tutkimuksista, sen lisäksi, että glioblastoomasolulinjan U87 MG [56], ja pohjapinta-kuin rinta- kasvaimen [57], ja niitä verrataan Capan-1. Vertaileva analyysi näistä sekvensseistä ehdotti, että Capan-1 ei esiintynyt selvää kuviota emässubstituutiota tai yksilöllinen allekirjoitus edustavat määrättyä mutageeni. Suurin osa koodauksen vaihdot (~45%) in Capan-1 olivat C T /G A, vaikka nämä eivät olleet yhtä hallitseva kuin havaittu COLO-829-solut, joissa C T siirtymät dipyrimidine sivustoja, osoittaa UV-säteily , vallitsevia [36] (Fig. 2D). Perustuen rajallinen määrä syöpä genomit on sekvensoitu tähän mennessä rakenteessa emässubstituutiot havaittu Capan-1 eniten muistuttaa U87 MG ja pohjapinta-kuin rintasyöpä, vain eri merkittävästi prosenttiosuutta A G /T C mutaatioita (Fig. 2D).

Vertasimme myös rakenteessa emässubstituutiot in Capan-1 koko genomin vs. exome. Havaitsimme, että kuvio oli pitkälti sama koodaus ja ei-koodaavat alueet, paitsi että C T /G mutaatioita olivat edustettuina korkeammalla taajuus exome, samanaikaisen pienempi määrä A C /T G vaihdot (Fig. 2E).

karakterisointi koodaus indeleitä

Mitä SNVs, romaani indeleitä tunnistettu Capan-1 solulinjasta mukaan suodatetun kopioluvun. Totesimme, että 93 geenit vaikuttivat pienet indeleitä, jotka vaihtelevat yhdestä kuuteen emäsparia (taulukko S8). Enemmän poistoja tunnistettiin verrattiin lisäyksiä (taulukko 5), kuten voisi odottaa käytöstä gapped-linjaus menetelmiä. 18 indeleitä (yhdeksän insertiot, yhdeksän poistot) olivat homotsygoottisia variantteja, kun taas 62 oli heterotsygoottinen (27 insertiot, 35 poistot). Samoin kuin SNVs, vaihtelu vaikutuksia luokiteltu transkripti (163 poikki 93 geenejä), ja suurin osa indeleitä (72%) havaittiin ei-koodaavilla alueilla. Vain 13% indeleitä aiheutti kehyksenvaihtoja ja 15% vaikuttaa jatkos-sivustoja. Tunnusmerkki

BRCA2 c.6174delT

mutaatio Capan-1 [14], [15] oli yksi 15 geenien pisteytettiin sairastumatta kehyksenvaihdon koodaus poistot.

osajoukko korkean luottamuksen koodaus kehyksenvaihtoja validoitiin PCR ja tavanomaisten Sanger sekvensoinnilla käyttäen biologinen toisinto genomista DNA-näytettä. Kahdeksan novel kehyksenvaihtoja (homotsygoottinen:

PAPLN

; Heterozygous:

EPHB2

,

LRRC7

,

DDIT4L

,

ADD3

,

SF1

,

C17orf57

, ja

ZNF599

) läsnä Capan-1, mutta ei ole havaittu HapMap genomeja vahvistettiin Sanger-sekvensoinnilla, lisäksi vielä 17 lukukehyksen ja 10 kolme emäsparin indeleitä yhteinen sekä Capan-1 ja HapMap. Kaikki uudet lukukehyksen, sekä in-frame indeleitä, oli todennettu Sangerin sekvensoinnilla (Fig. 3A-D ja tietoja ei ole esitetty). Viisi pienen datanopeuden kehyksenvaihtoja joka ei läpäissyt tiukat suodattimia ei voitu vahvistaa, tukee pätevyyden analyysimme. Jotkut geenit vaikuttavat lukukehyksen, kuten

EPHB2

, on aiemmin liittynyt tuumorigeneesiä muissa elimissä [58], nostaa sitä mahdollisuutta, että useat näistä voivat edustaa uusia kuljettajan mutaatioita.

. Kromatogrammi, joka kuvaa poistamista C (korostettu sinisellä) in

PAPLN

havaita Capan-1. Genominen viite sekvenssi on esitetty yläpuolella kromatogrammi. Nuoli osoittaa asemaa poisto. B. A poistetaan kohdan C

EPHB2

. C. As A, T C SNV ja poisto T

DDIT4L

. D. A poisto AG

ZNF599

. E. Vertailu prosenttiosuus indeleitä 1, 2, 3, tai 4 emäsparin pituus, joka reunustaa homologia Capan-1, COLO-829, COLO-829BL, PD3689a, ja PD3690a. Homologia määritellään, jolla on sama sekvenssi kuin lisätään tai poistetaan emäksiä joko välittömästi 5 ’tai 3’ Indel, kuten on esitetty esimerkeissä.

Sequence yhteydessä indeleitä

on oletettu, että viat homologinen rekombinaatio, kuten ne, jotka johtuvat menetyksestä BRCA2 toiminta, voi johtaa lisääntymiseen pieniä deleetioita [10], [59]. Näitä voidaan reunustaa toistuvat sekvenssit, jos vaihtoehtoisia menetelmiä DNA double-lohkon murtuma korjaus, kuten ei-homologisen end liittymällä tai yhden lohkon hehkutus osallistuvat palauttamisessa [10], [15], [59]. Tältä pohjalta tutkittiin välittömästi sekvenssin yhteydessä pienten indeleitä havaittu Capan-1: n genomin, ja verrataan näitä kahta

BRCA2

vajausta kasvaimia sekvensoitiin Stephens aineisto [27], sen lisäksi, että

BRCA

-proficient COLO-829 ja COLO-829BL sovitettu pari [36]. Indeleitä luokiteltiin pituus (1, 2, 3, tai 4 + bp), ja pisteytettiin, onko reunustava sekvenssi on joko 5 ’tai 3’ Indel oli identtinen sekvenssi lisätään /poistetaan (Fig. 3E). Vuonna Capan-1 /HapMap verrattuna, yli 60%: n indeleitä havaittu Capan-1 oli identtinen reunustava sekvenssi. Tämä on merkittävästi enemmän kuin olisi sattumalta odotettua yksinään (50, 12,5, 3, ja 0,8% vastaavasti 1, 2, 3, ja 4 bp Indel) ja oli merkittävästi suurempi kuin mitä havaitaan in COLO-829 /Colo- 829Bl vertailu, jossa oletettavasti HR on aktiivinen. Capan-1 näyttelyitä suurempi taajuus indeleitä liittyy homologiaa kuin COLO829 huolimatta paljon suurempi syvyys genomisen sekvenssin luotu COLO829. Siksi havainnot tehty Capan-1 tuskin ovat artefaktin johtuvat eroista sekvensointi perusteellisesti. Lisäksi yhdistyksen välillä indeleitä ja reunustavan homologia pysyy korkeana kaikissa pituudet indeleitä in Capan-1, joka on ristiriidassa muiden solulinjojen (Fig. 3E).

BRCA2

vajausta kasvainnäytteestä PD3689a ja PD3690a on alhaisempi taajuuksilla indeleitä reunustaa homologian, vaikka on mahdollista, että nämä hinnat ovat aliedustettuina vähäisen järjestyksessä syvyyttä käyttää niiden analyysi (kuvio. 3E) . Yhdessä tämä havainto viittaa siihen, että

BRCA2

vajausta kasvainsoluja saattanut altistua useammin esiintyvyys indeleitä lyhyen toistuvat sekvenssit.

Keskustelu

Tässä on luotu ensimmäinen kattava genomin analyysi

BRCA2

vajausta solulinjassa. Se on myös ensimmäinen tällainen sekvenssi laajalti käytetty solulinja, joka on peräisin haiman tuumori.