Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

MikroRNA ( miRNA) toimivat endogeeninen säätelijöinä biologista käyttäytymistä ihmisen syövissä. Useita luonnollisia ei-koodaavat RNA: t raportoidaan estävän miRNA emäspariutumisen vuorovaikutuksia. Nämä ilmiöt herättävät kysymyksiä siitä, pystyvätkö keinotekoisen säännellä miRNA. Tämän tutkimuksen tarkoituksena on luoda synteettinen laitteisiin, jotka kohdistuvat yhteen miRNA tai miRNA klusterin ja selvittämään niiden terapeuttiset vaikutukset fenotyypit virtsarakon syöpäsoluja.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tandem pullistuneen miRNA sitoutumiskohtia insertoitiin 3′-alue (UTR) ja SV-40-promoottorin perustuva Renilla lusiferaasigeenin rakentaa kaksi ”miRNA-ruohonleikkurit” tukahduttaminen miR-183-96-182 klusterin tai miR-210. Kolmas laite tandem toistosekvenssit ole komplementaarisia tiedossa miRNA synnytettiin kohdistamattomasta-ohjaus. Toiminnallisia analyysejä, virtsarakon syöpä T24 ja UM-UC-3-solut transfektoitiin kunkin kolmen laitteen, jonka jälkeen määritykset havaitsemiseen niiden vaikutuksia. Lusiferaasimäärityksiä osoitti, että toiminta lusiferaasin toimittajille miRNA-niittokoneet oli laskenut 30-50% kohdistamattomien-ohjaus. Käyttämällä Real-Time qPCR ekspressiotasot kohde miRNA osoitettiin alennetaan 2-3-kertaisesti vastaavalla miRNA-leikkuria. Solujen kasvua, apoptoosin, ja muuttoliike testattiin MTT: llä, virtaussytometria määritys, ja in vitro tyhjästä määrityksessä, vastaavasti. Solujen kasvun estäminen, voimistunutta apoptoosia, ja vähentynyt motiliteetti havaittiin miRNA-niittokoneet-transfektoitujen virtsarakon syövän soluissa.

Johtopäätökset /merkitys

Ei vain yksi kohde-miRNA vaan myös koko jäsenet kohde miRNA klusteri voidaan estää käyttämällä tätä modulaarinen strategia. Anti-syöpä vaikutuksia aiheuttama synteettisen miRNA-niittokoneet virtsarakon syövän solulinjoissa. miR-183/96/182 cluster ja miR-210 on esitetty pelata onkogeenisen rooleja virtsarakon syöpään. Potentiaalisesti käyttökelpoisia synteettisen biologian alustan miRNA menettämisestä toiminnon tutkimuksen ja syövän hoidossa on tutkittu tässä työssä.

Citation: Liu Y, Han Y, Zhang H, Nie L, Jiang Z, Fa P, et ai. (2012) Synteettinen miRNA-ruohonleikkurit Targeting miR-183-96-182 Cluster tai miR-210 haittaavat kasvua ja maahanmuutto- ja apoptoosin indusoimiseksi virtsarakon syövän solut. PLoS ONE 7 (12): e52280. doi: 10,1371 /journal.pone.0052280

Editor: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hong Kong

vastaanotettu: 31 elokuu 2012; Hyväksytty: 12 marraskuu 2012; Julkaistu: 17 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoitti Ph.D. Ohjelmat Säätiö Opetusministeriön Kiinassa (20100001110100 sen ZC); edistämisen ohjelma Shenzhen Key Laboratory, Shenzhen, Kiinan kansantasavalta (CXB201005250016A sen ZC). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Siirtymäkauden cell rakkokarsinooman on yleisin virtsateiden syöpä Itä- ja Länsi-maissa [1]. Valtaosa virtsarakon syövät ovat matala-asteinen non-invasiivisen kasvaimet, jotka voivat edetä invasiivisen fenotyypin. Toisin kuin ei-invasiivisia virtsarakon syöpä, lihas-invasiiviset kasvaimet yleensä etäispesäkkeitä muihin elimiin, ja on erittäin huono ennuste [2] – [3]. Yleisin hoitomuotoja virtsarakon syöpä ovat leikkaus, kemoterapia, immunoterapia ja sädehoito. Ne ovat kuitenkin kaukana tyydyttävästä johtuu useista tekijöistä, mukaan lukien tehokkuuden puute, puute spesifisyys, ja täynnä epämiellyttäviä sivuvaikutuksia [4] – [5]. Joten on kasvava tarve kehittää uusia tapoja hoitaa syöpää. Useita uusia antineoplastiset hoidot ovat parhaillaan kokeellisia ja kliinisiä tutkimuksia, mutta mitään merkittäviä läpimurtoja on saavutettu näiden terapeuttisten strategioiden [6].

Jo pitkään on ehdotettu, että syöpäsolut voidaan ohjelmoida uudelleen kokoamalla eri DNA tai RNA-osat uusiksi laitteita saadaan aikaan hyvänlaatuisia biologista käyttäytymistä [7] – [8]. Synteettinen biologia hoito useiden laitteiden suunnattu syöpää geenistä reittejä avaa lupaavia uusia mahdollisuuksia parantaa syövän hoitoon [9]. Pohjalta yksityiskohtainen käsitys geeniprofiileista syöpiä, synteettinen biologit yrittävät tuottaa ennustettavissa ja vankka biologinen joilla on uudenlaisia ​​hoitoa toimintoja, jotka eivät esiinny luonnossa. Vaikka tämä kenttä on suhteellisen uusi ja on edelleen laboratoriossa testausvaiheessa, jotkut liittyvien töiden ovat jo osoittaneet suurta potentiaalit hoitoja erilaisten syöpien [10] – [11].

MikroRNA (miRNA ), luokan lyhyen endogeenisen RNA: iden, säädellä geeniekspressiota sitoutumisen osittain komplementaarisia sekvenssejä 3’UTR mRNA [12]. Lukuisat tutkimukset ovat raportoineet, että miRNA osallistuvat kehittymistä ja etenemistä ihmisen syövissä, mukaan lukien kasvu, apoptoosin, invaasio, ja etäpesäkkeiden [13] – [14]. Edellisessä työssä määritimme genominlaajuisia miRNA profiilit ihmisen virtsarakon syövän syvä sekvensoinnilla. miR-183-96-182 klusteri ja miR-210 havaittiin olevan säädelty ihmisen virtsarakon syövän, mikä viittaa siihen, että niillä saattaa olla tärkeä rooli kuten onkogeenien tässä syöpä [15].

Yksi tärkeimmistä tavoitteet meidän synteettisen biologian tutkimuksen tarkoituksena on liittää synteettisiä geneettisiä laitteiden valvonnan kasvainsolun fenotyyppiin. Tässä artikkelissa esittelemme kaksi hyödyllistä geneettistä laitteet-MIR-183-96-182-klusteri-leikkuri (miRM-183/96/182) ja miR-210-leikkuri (miRM-210) -että kohde miRNA kanssa osittain komplementaariset sekvenssit. Olemme myös tutkineet niiden terapeuttiset vaikutukset fenotyypit virtsarakon syöpäsoluja. Tämä lähestymistapa tarjoaa potentiaalisesti käyttökelpoinen synteettisen biologian alustan miRNA menettämisestä toiminnon tutkimuksen ja syövän hoitoon.

Tulokset

Suunnittelu ja rakentaminen miRNA-niittokoneet

innoittamana havainnot, että jotkut RNA-molekyylien ilmennetty

herpesvirus saimiri

tai ihmisen pseudogeenien säädellä endogeenisen miRNA emäspariutumisen vuorovaikutuksia nisäkässoluissa [16] – [18], olemme luoneet miRNA-niittokoneet sisältävä sitoutumiskohtia osittain komplementaarisia kohteelle miRNA varten miRNA menettämisestä toiminnon tutkimukset ihmisen virtsarakon syövän solut (Fig. 1). Muodostetaan vakaampi vuorovaikutusta miRNA, suunnittelimme useita sitoutumiskohtia of miRNA kohteisiin, jonka keskellä pullistuma katkaisukohdassa asemissa Argonaute 2 [19]. Tämä vaatimus perustuu myös siihen havaintoon, että osittainen välisen pariutumisen miRNA ja niiden kohdesekvenssien on yleisempää eläimille kuin kasveille [12]. Sitoutumiskohdat yhdisti ”linkkereitä” (muutama nukleotidia) varten parantaa sitoutumisen miRNA-proteiini kompleksit (miRNPs) kaikkiin mahdollisiin sitoutumiskohtaan, ja lisäämällä miRNA knockdown tehokkuutta [20].

Olemme rakennettu miRNA-niittokoneet työntämällä useita miRNA sitoutumiskohdista osaksi 3 ’UTR on Renillan lusiferaasin geeni. Jokainen rakentaa hallinnassa on SV-40-promoottorin päättyi SV40 polyadenylaatiosignaali. Sääntelemätön TK-promoottori-driven koodaavan geenin tulikärpäsen lusiferaasi käytettiin kontrollina. Musta neliöt edusti linkkereitä välillä sitoutumiskohdista.

Olemme tehneet 6 peräkkäin puettu kopioita sitoutumiskohtia miR-183-96-182 klusteri (2 kappaletta kutakin miRNA klusterin) . MiRM-183/96/182 sitten rakennettiin insertoimalla nämä sitoutumiskohdat osaksi 3 ’UTR on SV-40-promoottorin perustuva lusiferaasireportteri- geenin siCHECKTM-2-vektoriin (Promega, Madison, WI, USA). Sen osoittamiseksi, modulaarisuus laitteiden, lisäsimme vielä 6 peräkkäin järjestetty kopioita sitoutumiskohdat miR-210 osaksi 3 ’UTR: reportterigeenin tuottaa miRM-210 käyttäen samaa vektoria. Koska kohdistamattomia-ohjaus, myös luoneet laitteen 6 tandem toistuvia sekvenssejä ole komplementaarisia tiedossa miRNA. Sekvenssit käytetty tässä tutkimuksessa olivat saatavilla taulukossa S1 ja Taulukko S2.

Vähentynyt toiminta lusiferaasin toimittajille miRNA-niittokoneet voivat myötävaikuttaa miRNA sitoutumiskohtiin

testaamiseksi tehosta miRNA- niittokoneet, me analysoitiin Renilla lusiferaasiaktiivisuus suhteessa tulikärpäsen lusiferaasi toimintaa T24 tai UM-UC-3-solut 48 tuntia transfektion jälkeen kuhunkin laitteeseen. Lusiferaasireportteri määritykset osoittivat, että toiminta toimittajat sisältävän paksunnetun miRNA sitoutumiskohtien määrä väheni virtsarakon syövän soluissa, verrattuna kohdistamattomia-ohjaus (P 0,01 kussakin ryhmässä). Estoja (%) lusiferaasin ilmaisuja on esitetty taulukossa 1.

Mirna-niittokoneet aikaan tehokas tukahduttaminen tavoite miRNA tasojen virtsarakon syövän solulinjoissa

tutkimiseksi edelleen toiminnallisuutta miRNA-niittokoneet, selvitimme suhteelliset ekspressiotasot kohde miRNA laitteissa transfektoiduissa ihmisen virtsarakon syöpä T24 ja UM-UC-3-soluissa. QPCR tulokset osoittivat, että ilmentyminen vastaavan miRNA-leikkuri indusoi dramaattiseen laskuun ekspressiotasot kohde miRNA kahden virtsarakon syövän solulinjat (P 0,05 kussakin ryhmässä). Estot (%) miRNA ilmaisuja on esitetty taulukossa 2. ekspressiotasot miR-96, miR-182, ja miR-183 ei voi vaimentaa miRM-210. Samaan aikaan, ilmentymisen taso miR-210 on myös voitu muuttaa miRM-183/96/182. Tulokset qPCR kokeessa esitetään taulukossa S3.

Solukasvun inhibitio aiheuttama miRNA-niittokoneet virtsarakon syövän solulinjoissa

Ihmisen virtsarakon syövän solulinjat T24 ja UM- UC-3 transfektoitiin lyhytaikaisesti laitteiden 96-kuoppaisilla levyillä. Sekä virtsarakon solulinjoissa, miRM-183/96/182 tai miRM-210 laski MTT reaktiivisuus (Fig. 2). Tällainen havainto voisi joko osoittavat solun kasvun pysähtymisen tai solukuolemaan.

T24 ja UM-UC-3-solut transfektoitiin laitteiden 96-kuoppaisilla levyillä. Solukasvu mitattiin MTT-määrityksellä eri aikavälein. ANOVA käytettiin vertailua varten käyrien solujen kasvun. (A) miRM-183/96/182 esti solukasvun T24-soluissa (P 0,05). (B) miRM-183/96/182 esti solukasvun UM-UC-3-solut (P 0,05). (C) miRM-210 esti solukasvun T24-soluissa (P 0,01). (D) miRM-210 esti solukasvun UM-UC-3-solut (P 0,01). Tiedot olivat keskimäärin kolmen erillisen kokeen; baareja, SD.

aloittaminen solun apoptoosin aiheuttama miRNA-niittokoneet virtsarakon syövän solulinjoissa

Voit testata solukuoleman, apoptoosin kokeet suoritettiin. Molemmat kaksi solulinjoja siirrostettiin kuusi-kuoppalevyille ja transfektoitiin laitteita. Teimme apoptoosin määrityksiä käyttämällä anneksiini V-PE apoptoosin detektioreagenssipakkaus onko kahden meidän synteettisiä miRNA-niittokoneet indusoivat solujen apoptoosin virtsarakon syövän soluissa. Tulokset on esitetty kuviossa. 3 osoittaa, että apoptoottisten solujen osuus (%) T24 ja UM-UC-3-solulinjojen transfektoitu miRM-183/96/182 tai miRM-210 olivat korkeammat kuin transfektoitu kohdistamattomia-ohjaus.

T24 ja UM-UC-3-solut transfektoitiin laitteiden 6-kuoppaisille levyille. Apoptoosia mitattiin virtaussytometrialla 48 h transfektion jälkeen. (A). Edustavat kuvat virtaussytometria analyysi T24-soluissa. (B). Edustavat kuvat virtaussytometria analyysi UM-UC-3-soluissa. (C). Solujen apoptoosin induktio havaittiin miRM-183/96/182-transfektoitujen virtsarakon syöpä T24 ja UM-UC-3-soluihin käyttämällä virtaussytometria-analyysi. (D). Solujen apoptoosin induktio havaittiin miRM-210-transfektoitujen virtsarakon syöpä T24 ja UM-UC-3-soluihin käyttämällä virtaussytometria-analyysi. Me suoritetaan kussakin kokeessa vähintään kolme kertaa. Virhepalkkien, SD. ** P 0,01 verrattuna kohdistamattomia-ohjaus.

esto solumigraation aiheuttama miRNA-niittokoneet virtsarakon syövän solulinjoissa

Solut ympättiin 12-kuoppaisille levyt ja transfektoitiin laitteita. Sitten tutkittiin rooli kunkin laitteen kasvainsolun muuttoliikettä suorittamalla tyhjästä määrityksiä. Kuten on esitetty kuviossa. 4 liikkumisetäisyyksiä solujen ryhmien transfektoitu miRNA-niittokoneet olivat merkittävästi alhaisemmat kuin ryhmissä transfektoitu kohdistamattomia-ohjaus.

T24 ja UM-UC-3-solut transfektoitiin laitteiden 12-kuoppalevyillä. Solumigraation mitattiin tyhjästä määrityksessä. (A) miRM-183/96/182 ja miRM-210 esti soluvaelluksen T24-soluissa itsenäisesti. (B) miRM-183/96/182 ja miRM-210 esti soluvaelluksen UM-UC-3-solut itsenäisesti. Kukin koe suoritettiin vähintään kolme kertaa ja edustavan kuvan näytettiin. Tulokset on esitetty keskiarvona ± SD. ** P 0,01 verrattuna kohdistamattomia-ohjaus.

Keskustelu

On laajalti tunnustettu, että miRNA aiheuttaa mRNA: n hajoamisen kautta sekvenssi-spesifisiä vuorovaikutuksia. Kuitenkin, viimeaikainen työ on ehdottanut, että tärkeä tehtävä joidenkin miRNA-mRNA: n vuorovaikutukset on estää miRNA, toisin tukahduttaa ilmentymisen kohdegeenien [12]. Useat kokeelliset tulokset tukevat tätä uutta käsitystä miRNA sääntelyä. Nisäkässoluissa

PTENP1

pseudogeenistä kanssa säilytetty miRNA sitoutumiskohtia sen 3’UTR osoitettiin säädellä

PTEN

ilmaisun emäspariutumista vuorovaikutus miRNA. Samanlainen ilmiö havaittiin myös

KRAS

ja sen pseudogeenin

KRAS1P

[16] – [17]. Sekvenssispesifistä miRNA hajoamista hiljattain havaittiin marmoset T-soluissa, jotka on transformoitu

herpesvirus saimiri

(HVS). Virus koodaa pienen koodaamattomasta RNA sanottu HSUR1-, joka sisältää sivustoja, joilla on laaja komplementaarisuudella miR-27a. Base välisen pariutumisen miR-27a ja HSUR1 voivat alas-säädellä ekspressiotasot miR-27a [18]. Näiden tulosten perusteella, me spekuloida, että luonnollinen pieni RNA-molekyyli voidaan toimii ruohonleikkuri miRNA jotka sitoutuvat tiettyyn tunnustusta sivustoja sen nukleotidisekvenssissä. Joten on järkevää, että keinotekoiset miRNA sääntelyyn laitteiden sekvenssit osittain komplementaarinen miRNA kiinnostava on kyky estää vastaavan endogeenisen miRNA aktiivisuutta ja /tai ekspressiota.

Voit testata tätä hypoteesia, rakensimme synteettiset laitteet sisältävät useita pullistunut miRNA sitoutumiskohdat ja nimesi heidät ”miRNA-niittokoneet”. Ilmeisesti syy tähän nimi synteettinen laite on, että se voi ”leikata alas” miRNA ilme aivan kuin ruohonleikkuri. Laitteet on suunniteltu olemaan modulaarinen, jossa tandem sitoutumiskohdat voitiin muuttaa muita. Heidän ilmentyminen ajettiin korkealla tasolla voimakkaasta SV-40 viruksen promoottori ihmisen virtsarakon syöpäsoluja. Käyttämällä kahta validointi kokeita, osoitimme, että miRNA-niittokoneet rakentama meistä olivat toimivia. Ensinnäkin Lusiferaasimäärityksiä vahvisti, että toiminta lusiferaasin toimittajille miRNA-niittokoneet tukahdutettiin kahdessa virtsarakon syöpäsoluja. Toiseksi, Real-Time qPCR suoritettiin havaitsemiseksi ekspressiotasoja tavoite miRNA virtsarakon syövän soluissa, jotka on transfektoitu laitteiden, ja olemme osoittaneet, että määrät näitä miRNA vähennettiin vastaava miRNA-leikkuria. Näiden kahden havaintojen voimme päätellä, että miRNA-ruohonleikkurit voi toiminnallisesti estää yhtenäistavoite miRNA tai estää koko klusterin liittyvien miRNA.

Yhä useammat tutkimukset ovat osoittaneet, että miRNA usein vapautettu monenlaisissa ihmisen syövissä. Koska kriittinen roolit miRNA syövät ovat vähitellen tutkitaan, niiden sovellukset mahdollisina terapeuttisina kohteina ovat tuottaneet suurta kiinnostusta kehittää uusia strategia syövän hoitoon [21] – [22]. Joko yksin tai klusteri, ilmentymisen tasojen miR-96, miR-182, ja miR-183 on osoitettu olevan säädelty useiden syöpien, mukaan lukien eturauhas- syöpä, rintasyöpä, keuhkosyöpä, medulloblastooma, virtsarakon syöpä ja jne. [23] – [27]. Lin et ai. havaitsi, että miR-96 aiheuttama lisääntymistä ja kiinnittymisestä riippumatonta kasvua rintasyövän solulinjoissa [28]. Segura et ai. havaitsi, että miR-182 over-ilmentyminen edisti kulkeutumista ihmisen melanoomasolujen in vitro ja niiden etäpesäkkeiden in vivo [29]. Sarver et ai. havaitsi, että miR-183 toimi onkogeenin lisäämällä syöpäsoluihin muuttoliike [30]. miR-210 on tullut uutena kasvaimen biomarkkereiden säännelty hypoksia. Ainutlaatuinen siemen alue miR-210 erottaa sen kaikista muista miRNA. Expression of miR-210 liittyi kasvaimen kasvua, invaasio ja huono potilaan eloonjääminen [31]. Yang et ai. havaitsivat, että miR-210 downregulation inhiboi solujen kasvun ja indusoi apoptoosia ihmisen hepatoomasoluja [32]. Fasanaro et ai. havaitsivat, että anti-miR-210 transfektion vähentynyt solumigraatio, esti solujen kasvun ja indusoi apoptoosin [33]. Nämä tutkimukset tarjoavat todisteita, että tärkeitä rooleja neljän selektiivisen miRNA patogeneesissä ihmisen syövissä. Kuitenkin niiden vaikutukset fenotyypit virtsarakon syövän solujen pysyvät suurelta osin tuntemattomia.

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että miR-183-96-182 klusteri tai miR-210 tukahduttaminen vastaavalla miRNA-ruohonleikkuri paitsi esti kasvua ja muuttoliike mutta myös indusoi apoptoosin ihmisen virtsarakon syövän soluissa. Inhibitiota solujen kasvua johtui induktion apoptoosin. Nämä tulokset viittaavat siihen, miR-183/96/182 cluster ja miR-210 tärkeitä rooleja säätelyssä biologista käyttäytymistä virtsarakon syöpäsoluja.

Kaikki havaitut muutokset fenotyyppiin pitäisi välittyä miRNA geenien . On osoitettu edellisessä työssä että knockdovvn MIR-183/96/182 klusteri johti rikastuminen apoptoosin reittejä ja häiriöstä PI3K /AKT /mTOR-reitin [26]. Osat PI3K /AKT /mTOR reitin raportoitiin olevan kriittinen kasvaimien synnyn, kuten solujen lisääntymisen, kasvun, eloonjäämisen ja liikkuvuutta [34]. Siellä oli myös raportti osoittaa, että tämä klusteri esti sinkin oton kautta tukahduttaminen sinkki kuljettajat [23]. Sinkki on estäjä HIF-1α ihmisen syövissä, että tukahduttaa tärkeitä geenejä, jotka osallistuvat kasvaimen etenemiseen, kuten VEGF, MDR1 ja Bcl2 [35]. miR-210 on tunnettua säätää hypoksia, mikä on tärkeää syövän solujen eloonjäämistä ja invaasiota. Useita miR-210 tavoitteita, jotka vaikuttavat solujen kasvuun, apoptoosin, ja muuttoliike on jo tunnistettu, kuten E2F transkriptiotekijä 3 (E2F3) [36], fibroblastikasvutekijäreseptori kuten 1 (FGFRL1) [37], homeobox A1 (HOXA1) [38], FLICE-liittynyt valtava proteiinia (FLASH) /kaspaasi-8-liittyvä proteiini-2 (Casp8ap2) [39] ja Efriini-A3 (EFNA3) [33]. Lisäksi analyysit ovat tarpeen tutkia niiden geneettisen säätelyn virtsarakon syövän solut.

On myös huomattava, että kaksi miRNA-ruohonleikkurit eivät ole ehdottoman tehokkaita, koska ne ovat vain johtaneet marginaalinen fenotyyppisiä muutoksia virtsarakon syövän soluissa . On olemassa useita tekijöitä, jotka voivat vaikuttaa tehokkuuteen laitteita. Toiminto on miRNA-leikkuri ei ole riippuvainen pelkästään määrä miRNA sitoutumiskohtia, vaan myös siitä, kuinka paljon leikkurin RNA: iden määrän suhteen endogeenisen miRNA. Jotta Tehokkaamman syövän hoitoon useita pisteitä voidaan ottaa huomioon. Lisäksi enemmän miRNA sitoutumiskohtia laitteisiin voi lisätä pitoisuutta osittain komplementaaristen sekvenssien ja lisätä näin estävät vaikutukset on miRNA-ruohonleikkurit. Ilmaista laitteiden korkealla tasolla, voidaan valita enemmän potentiaalia vahva promoottoreita ajo transkription ja käyttää virusvektoreita toimittamiseen miRNA-niittokoneet. Joitakin muita mahdollisuuksia on vielä esitetty.

Yhteenvetona, anti-kasvuvaikutuksista välittämää apoptoosia ja kulkeutumista estävällä vaikutuksia sekä aiheuttamien synteettinen miRNA-niittokoneet kohdistaminen miR-183-96-182 klusterin tai asennuspalveli- 210 virtsarakon syövän solut. Muita tutkimuksia tarvitaan edelleen todistaa hyödyllisyyttä meidän synteettisen biologian alustan miRNA tehtävät tutkimuksissa ja syöpähoitojen.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja soluviljelmä

Ihmisen virtsarakon siirtymäkauden cell carcinoma solulinjoja T24 ja UM-UC-3 hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Molemmat pidettiin RPMI-1640-(1640-) johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia ja 1% antibiooteilla (100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä sulfaatteja). Soluja kasvatettiin rutiininomaisesti 37 ° C: ssa ilmakehässä, jossa 5% CO

2.

luominen miRNA-niittokoneet

pullistunut miRNA sitoutumiskohdat MIR-96, asennuspalveli- 182, miR-183, ja miR-210 ja linkkerit niiden välillä suunniteltiin ja kemiallisesti syntetisoitu. Joko yhdistelmä-DNA osittain MIR-183-96-182 klusteri sisältää 2 kappaletta sitoutumiskohdat kunkin klusterin miRNA tai erityisten DNA osittain miR-210 sisältää 6 kappaletta sitoutumiskohdat miR-210 kloonattiin siCHECKTM-2 sivektorissa (Promega, Madison, WI, USA) pilkottiin

Xhol-

ja

Notl

. Koska kohdistamattomia-ohjaus, joka on laite, jossa on 6 tandem toistettiin sitoutumiskohtia komplementaarinen ole tunnettuja miRNA rakennettiin myös käyttäen samoja menetelmiä kuin edellä on kuvattu. Perusteellinen kuvaukset liittyvät sekvenssit on esitetty taulukossa S1 ja Taulukko S2.

Cell transfektio

Solut kaksikymmentä tuntia ennen transfektiota saavuttaa 70-80% konfluenssiin aikaan transfektion. 1 ug kunkin laitteen transfektoitiin soluihin käyttäen Hiperfect Transfection Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan protokollien.

lusiferaasireporttiterilla määritys

Solut ympättiin kuuden kuopan levyillä (5 x 10

5 /kuoppa) ja transfektoitu miRNA-ruohonleikkurit tai kohdistamattomia-ohjaus. Havaittu lusiferaasiaktiivisuutta käyttäen dual lusiferaasianalyysissä (Promega, Madison, WI, USA) valmistajan ohjeiden 48 tuntia transfektion jälkeen. Renilla lusiferaasiaktiivisuus normalisoida tulikärpäsen lusiferaasiaktiivisuus. Esto (%) lusiferaasin ilmentymistä laskettiin seuraavalla kaavalla: Inhibitio (%) = (suhteellinen lusiferaasin aktiivisuus kohdistamattomia-ohjaus – suhteellinen lusiferaasin aktiivisuus miRNA-ruohonleikkuri) /suhteellinen lusiferaasiaktiivisuuden kohdistamattomia-ohjaus x 100 %. Kokeet suoritettiin kahtena kappaleena ja toistettiin ainakin kolme kertaa.

RNA ja Real-Time qPCR

Yhteensä RNA: t eristettiin T24 soluista ja UM-UC-3-soluissa käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. cDNA: t syntetisoitiin käyttämällä M-MLV-käänteistranskriptaasia (Promega, Madison, WI, USA). Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen All-in-One

TM miRNA qRT-PCR Detection Kit (GeneCopoiea Inc, Rockville, MD, USA). Pieni nukleaarinen U6-RNA (snRNA) valittiin endogeeninen kontrolli. Mirna qPCR alukkeet tilattiin GeneCopoeia, Inc. luettelo lukumäärät All-in-One ™ miRNA qPCR alukkeet olivat seuraavat: HSA-miR-96~HmiRQP0852; HSA-miR-182~HmiRQP0239; HSA-miR-183~HmiRQP0244; on-miR-210~HmiRQP0317; snRNA U6 ~ HmiRQP9001 (Yritys ei toimittanut sekvenssi tietoa näistä Primers). PCR-seokset valmistettiin valmistajan protokollien kanssa PCR-olosuhteissa 40 sykliä, joissa 15 sekuntia 95 ° C: ssa, 20 s 55 ° C: ssa, ja 30 s 70 ° C: ABI PRISM 7000 Fluorescent Kvantitatiivinen PCR System (Applied Biosystems , Foster City, CA, USA). Suhteellinen ekspressio kunkin miRNA laskettiin käyttämällä 2

-ΔΔCt menetelmiä. Esto (%) on miRNA ilmaisun laskettiin seuraavalla kaavalla: Inhibitio (%) = (suhteellinen miRNA ilmentymistaso soluissa transfektoitu kohdistamattomia-ohjaus – suhteellinen miRNA ilmentymistaso soluissa transfektoitu miRNA-ruohonleikkuri) /suhteellinen miRNA ilmentymistaso soluissa, jotka on transfektoitu kohdistamattomia-ohjaus x 100%.

solukasvumäärityksessä

vaikutukset suunniteltu laitteiden solujen lisääntymiseen tutkittiin MTT: llä mukaisesti raportoitu menetelmiä [40 ]. 24, 48 tai 72 tuntia transfektion jälkeen, 20 ui MTT: tä (5 mg /ml) lisättiin kuhunkin kuoppaan 96-kuoppalevylle, ja soluja viljeltiin 5 tuntia. Sitten MTT väliaineen seoksia heitettiin pois ja 100 ui dimetyylisulfoksidia (DMSO) lisättiin jokaiseen kuoppaan. Absorbanssi mitattiin aallonpituudella 490 nm (630 nm ohjearvon aallonpituus) käyttäen ELISA-mikrolevylukijaa (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Määritykset toistettiin ainakin kolme kertaa.

Cell apoptoosimäärityksessä

Solun apoptoosia havaita käyttämällä anneksiini-V-fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) /propidiumjodidia (PI) apoptoosin detektioreagenssipakkaus (BD, San Jose, CA, USA) toimittajan ohjeiden mukaisesti protokollia. 48 tuntia transfektion jälkeen, solut kerättiin, sentrifugoitiin ja suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan 1 x sitoutumispuskuria. Anneksiini V-FITC: tä (5 ui) ja 10 ui PI lisättiin sitten kuhunkin putkeen. Putkia inkuboitiin pimeässä huoneen lämpötilassa 15 minuutin ajan. -Solujen apoptoosin määritys suoritettiin välittömästi virtaussytometria (EPICS XL-4, Beckman, CA, USA). Jokainen koe suoritettiin vähintään kolme kertaa.

Cell migraatiokokeessa

Cell motiliteettia tutkittiin tyhjästä mukainen määritys aikaisemmin kuvattuja menetelmiä [41]. Solut siirrostettiin 12-kuoppaisille levyille tiheytenä 1,0 x 10

5 solua kuoppaa kohti. Olemme transfektoitujen solujen laitteiden ja inkuboitiin astiat 37 ° C: ssa, kunnes solut saavuttivat 100% konfluenssin. Keinotekoinen aukko tuotettiin sitten raaputtamalla pipetillä kärjestä. Valokuvat otettiin kustakin kuopasta välittömästi ja uudelleen 20 h käyttäen digitaalikamera. Ohjelmisto HMIAS-2000 käytettiin laskemaan solujen vaeltamiseen etäisyys (um). Jokainen koe toistettiin ainakin kolme kertaa.

Tilastolliset analyysit

Tiedot kaikista kokeet ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta (SD). Tilastollinen merkitsevyys määritettiin käyttäen Studentin t-testiä tai ANOVA ja P 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä. Kaikki tilastolliset testit suoritettiin SPSS versio 17.0 ohjelmisto (SPSS, Chicago, IL, USA).

tukeminen Information

Taulukko S1.

Mirna sekvenssit Study.

doi: 10,1371 /journal.pone.0052280.s001

(DOC) B Taulukko S2.

Synteettinen miRNA-Ruohonleikkuri sekvenssit Vector.

doi: 10,1371 /journal.pone.0052280.s002

(DOC) B Taulukko S3.

Delt-Ct-arvoja Real-Time qPCR sekä virtsarakon syöpäsolujen linjat transfektoitu synteettisen laitteisiin.

doi: 10,1371 /journal.pone.0052280.s003

(DOC) B

Kiitokset

kirjoittajat ovat velkaa luovuttajille, joiden nimet eivät kuuluneet kirjailija luettelossa, mutta jotka osallistuivat tähän ohjelmaan.