Krooninen sairaus

tiivistelmä

Haimasyöpä on yksi johtavista syöpään liittyvien kuolinsyistä länsimaissa kiireellinen tarve uusille hoitostrategioiden. Äskettäin hyperforin ja nemorosone on kuvattu lupaavana syövän lyijy-yhdisteitä. Vaikka hyperforin on tutkittu perusteellisesti

in vitro

ja

in vivo

,

in vivo

tietoja nemorosone puuttuu vielä. Siten tutkimme kasvua estävää mahdollisuuksia nemorosone on haimasyövän vierassiirrännäiset NMRI nu /nu hiirille ja määritetään perus farmakokineettiset parametrit. Ksenograftikasvaimissa hoidettiin nemorosone ja gemsitabiinin, nykyinen standardi hoitoa. Kasvaimen leikkeitä altistettiin H Hyväksytty: 02 elokuu 2013; Julkaistu: 05 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Wolf et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ sai taloudellista tukea 3 vuoden tutkimuksen apurahan päässä Helmholtz International Graduate School for Cancer Research ja FH. Rahoitusta Saksan opetus- ja tutkimusministeriö osana NGFN PaCaNet konsortio kiittävät. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

huolimatta monista edistysaskeleet alalla syövän tutkimusta ja hoitoa, haimasyöpä edelleen yksi haastavimmista kasvaimia, ja sen kuolleisuus vastaa lähes esiintyvyys [1]. Tämä johtuu pääasiassa vaikeuksista diagnosoinnissa haimasyövän varhaisessa kokoisen vaiheessa ja sen lausutaan Chemo-vastus. Siten yli 80% potilaista on kehittynyt vaiheessa kasvain jo metastasized paikallisiin imusolmukkeisiin ja maksan [2]. Gemsitabiini nykyinen standardi hoitoa haimasyövän, vain hieman parantaa mediaani elossaoloaika välillä 5 ja 6 kuukauden [3], mikä korostaa tarvetta tutkia uusia terapeuttisia yhdisteitä.

Polysykliset polyprenylated acylphloroglucinols (PPAPs) ovat luokka yhdisteitä, joilla on erilaisia ​​biologisia toimintoja, jotka ulottuvat masennuslääke, syövän ja anti-inflammatorisia ja anti-mikrobien toimintaa [4]. Niistä hyperforin (kuvio 1), korjaamiseksi päässä mäkikuisma (

Hypericum

perforatum

), on saavuttanut yleisen edun suosittu mielialalääkkeitä luonnon alkuperää uudella mekanismilla toiminta [5]. On myös osoitettu olevan syövän ominaisuuksia

in vitro

ja

in vivo

[6-8]. Kuitenkin kautta sitoutuminen pregnaani X-reseptori (PXR), hyperforin voimakkaasti ylössäätelee ilmaus CYP3A4, jäsen P450 perhe osallistuu vierasaineiden metabolia [9]. Jos siis yhdistettynä kemoterapia-lääkeaineet metaboloituvat CYP3A4, hyperforin vähentäisi huomattavasti tehoa mahdollisen syövän vastaisen yhdistelmähoito lähestymistavan, koska se nopeuttaa metabolization lääkkeen (s) se on yhdistetty.

Tiiviisti liittyvät kemialliset rakenteet hyperforin (vasemmalla) ja nemorosone (oikea), kahta polysykliset polyprenylated acylphloroglucinols.

Koska rakenteeltaan hyperforin, lausutaan syövän ominaisuuksia on myös osoitettu

in vitro

for nemorosone (kuva 1) solulinjoihin eri alkuperää, heidän joukossaan neuroblastooma ja leukemia [10,11]. Tarkemmat analyysit sen toimintamekanismia haiman syöpäsoluissa osoitti nopea kohoaminen cyctosolic kalsiumpitoisuutesi depolarisaation mitokondrion kalvon seuraa aktivointi apoptoosin kautta stressin vastereitissä tunnetaan avatulla proteiinivaste [12]. Mielenkiintoista on, eriytetty normaalien solujen havaittiin olevan 10-kertaa vähemmän herkkä käsittelemällä nemorosone, mikä avaa mahdollisen terapeuttisen ikkunan tutkia myös sen syövän vastaista aktiivisuutta

in vivo

.

tässä tutkimuksessa osoitetaan, että, toisin kuin hyperforin, nemorosone ei indusoi CYP3A4 ja tutkia sen biologista aktiivisuutta sekä perus farmakokinetiikkaa

in vivo

haimasyövän ksenograftimallissa. On osoitettu, että nemorosone imeytyy nopeasti verenkiertoon ja kykenee estää kasvun ksenograftikasvaimissa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tutkimus toteutettiin tiukasti mukaisesti suosituksia opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health. Protokolla hyväksyi valiokunnan Ethics eläinkokeiden alueneuvoston Karlsruhe, Saksa (Luvan numero: G-204/09). Kaikki Leikkaus suoritettiin ksylatsiinia /ketamiinianestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

Istuttaminen ja hoitoon ksenograftikasvaimissa

Kuudesta kahdeksaan viikkoa vanhoja naaraspuolisia kateenkorvattomiin NMRI nu /nu nude-hiirissä (Charles River Laboratories, Sulzfeld, Saksa) pidettiin ryhmissä 4-6 yksittäin ilmanvaihto häkeissä (IVCs; Techniplast, Saksa) 22 ° C: ssa 12 tunnin valo /pimeä sykli ja annettiin sopeutua asuinoloja yhdelle viikko ennen istutusta kasvaimia. MIA-PaCa-2-soluja ylläpidettiin kuten aiemmin on kuvattu [12], ja 200 ui solususpensiota (~ 2 x 10

6) injektoitiin s.c. oikeaan kylkeen kunkin hiiren vahvistaa ihon alle ksenograftikasvaimissa. Kasvaimen tilavuus seurataan säännöllisesti käyttämällä digitaalista paksuus, ja eläimet jaettiin satunnaisesti järjestäytyneet käsitellyissä ja kontrolliryhmissä kerran kasvaimen tilavuus oli noin 100 mm

3.

Nemorosone, puhdistettu metanolipitoista kukkauutteita kuten aiemmin ilmoitettua [ ,,,0],12], liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) 50 mg /ml, ja gemsitabiinihydrokloridia (Eli Lilly, Saksa) liuotettiin 0,9% NaCl-liuoksessa. Injektioliuokset steriilisuodatettiin ja annettiin intraperitoneaalisesti (i.p.) käyttäen 0,3 ml insuliiniruiskujen (Becton Dickinson, Saksa) steriloinnin jälkeen injektiokohdassa. Kehon paino kontrolloitiin päivittäin ennen i.p. injektio. 1 ul /g kehon paino injektoitiin saavuttamiseksi lopulliseen pitoisuuteen 50 ja 120 mg /kg nemorosone ja gemsitabiini, vastaavasti. Nemorosone ruiskutettiin kerran päivässä taas gemsitabiinin tavallinen hoito aikataulun joka kolmas päivä neljän sykliä käytettiin [13].

immunohistokemiallinen värjäys ksenograftikasvaimissa

Yksi päivä viimeisen käsittelyn jälkeen, hiiret tapettiin katkaisemalla kaula ja ksenograftikasvaimissa resekoitiin, snap-jäädytettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Kasvaimet asennettu cryomicrotome (Leica, Saksa) -25 ° C: ssa ja 5 um leikkeet syntyvät kasvaimen marginaalit ja keskusten siirretään objektilaseille.

hematoksyliinillä ja siinilla (H detektio 303 nm: ssä).

Hiiriä käsiteltiin päivittäin i.p. injektiot 50 mg /kg nemorosone, ajoneuvon ainoa tai 120 mg /kg gemsitabiinia tällä ilmoitettuina ajankohtina (vihreitä pisteitä). Kasvaimen tilavuus mitattiin 2-3 kertaa viikossa käyttämällä digitaalista paksuus. Arvot edustavat keskiarvoa ± SD 8 eläintä ryhmää kohti.

* p 0,05, ** p 0,01 (verrattuna ajoneuvon ohjaus).

Viisi minuuttia post i.p. sovellus, noin 40 ug /ml (80 uM) nemorosone havaittiin hiiren plasmassa, osoittaa kohti hyvin nopean absorption verenkiertoon (kuvio 5A). Samaan aikaan vaiheessa 7 ylimääräisiä piikkejä muistuttavia mahdollisia aineenvaihduntatuotteita havaittiin HPLC-kromatografialla (kuvio 5A, kuvio S2). Kuitenkin plasmassa potentiaalisten metaboliittien (M01-M09), laskettiin olevan 20-200 kertaa pienempi kuin nemorosone. Yli havaittu aika 120 min, nemorosone plasmassa laski logaritmisesti 40-2,7 pg /ml: n puoliintumisaika on noin 30 min. Farmakokinetiikkaan nemorosone jälkeen i.p. sovellus havaittiin parhaiten kuvata kahden osaston disposition malli saadaan kaksivaiheisesti rivi log-asteikko juoni kuvassa 5B. Tämän mallin mukaan, nemorosone imeytyy nopeasti ja jaetaan verenkiertoon ensimmäisten 10 min injektion jälkeen. 20 min jälkeen sovellus, poistaminen näyttää olevan hallitseva prosessi ominaista suora asennettu linjaa. Sen on kuitenkin huomattava, että prosessit ennen 5 min ajanhetkellä (imeytyminen ja jakelu) oletettiin ja vaativat edelleen vahvistusta tarkempi tutkimus. Näin ollen huippupitoisuus ensimmäisten minuutin voisi olla paljon suurempi (~ 100 pg /ml).

jaksot 5 um nemorosone käsiteltyjen ja kontrolli kasvaimia värjättiin hematoksyliinillä-siinilla (H & E, A ja B) tai immunohistokemiallisesti analysoidaan vasta-aineiden kanssa aktiivinen kaspaasi 3 (C ja D) tai Ki-67 (E ja F). Käsitellyt kasvaimia osoitti alentunut kasvaimen massan takia apoptoosin /nekroosin (mustat nuolet) ja pienempi määrä lisääntyvien solujen verrattuna kontrolliin (tummanruskea solut).

Plasma otettiin näytteitä ennen määritelty ajankohtina jälkeen ip soveltaminen 50 mg /kg nemorosone. Nemorosone ja sen aineenvaihduntatuotteet kvantitoitiin RP-HPLC avulla kalibrointikäyrän (kuva S3). (A) plasmakonsentraatio nemorosone (ylempi vihreä linja) ja sen mahdollisten aineenvaihduntatuotteiden (M01 ja M09). (B) farmakokinetiikkaa nemorosone olivat parhaiten kuvata kaksitilamallilla joiden puoliintumisaika on 30 minuuttia.

henkilöllisyys nemorosone vahvistettiin edelleen ESI massaspektrometrialla ilmaisin näyttää molekyyli huippuja protonoitu nemorosone ja sen natrium- ja kaliumsuolat (kuvio S4). Lisäksi massa molekyylin huiput noin aineenvaihduntatuotteiden havaittiin lisätään 16 u, viittaa siihen, että hapetus nemorosone voi olla yksi tärkeimmistä metabolisoitumisen vaiheet. Kuitenkin alhaisen resoluution ESI-MS-detektori, rakenne nemorosone metaboliitteja, voida yksityiskohtaisesti.

Keskustelu

Hyperforin ja nemorosone ovat parhaita tutkittu jäsenet monipuolinen luokka polysyklisiä polyprenylated acylphloroglucinols ja molemmat ovat lyijy-yhdisteistä kehittämistä varten syövän vastaisten terapeuttisten [4,6,12,19]. Kuitenkin tähän asti syövän vastaista aktiivisuutta

in vivo

on vain osoitettu hyperforin mutta ei nemorosone [6]. Siten tämä pilottitutkimuksessa tarkoitus arvioida aktiivisuus nemorosone vastaan ​​haimasyövän ksenograftikasvaimissa

in vivo

sekä tunnistaa perus farmakokineettiset muuttujat kuten absorptiokinetiikka ja metabolization.

Tuloksemme osoittavat, että nemorosone voimakkaasti inhiboi haimasyövän ksenograftien

in vivo

ja näyttää olevan vielä tehokkaampi kuin nykyinen standardi hoitoa gemsitabiinin (kuva 3). Vaikka annettiin nemorosone 50 mg /kg vuorokaudessa oli hyvin siedetty hoitojakson aikana, hyperventilaatio havaittiin heti soveltamisen nemorosone osoittaa jonkin systeemistä aktiivisuutta tätä yhdistettä heti absorption verenkiertoon. Samanlaisia ​​havaintoja tehtiin humulone, rakenteellisesti liittyvän eristetyn yhdisteen humalasta suonensisäisen injektion jälkeen otetaan kissoja [20]. Tämä osoittaa vertailukelpoinen farmakodynaamisia ominaisuuksia, jotka saattavat johtua toiminnan näiden yhdisteiden kalsiumin homeostaasiin lihaksissa. Tätä hypoteesia tukee hetkellinen nemorosone aiheuttama häiriö solun kalsiumin homeostaasin havaittu

in vitro

[12].

Effects of nemorosone hoidon ksenograftikasvaimissa vahvistettiin H & E-värjäystä kudoksen kohdat sekä immunohistokemiallisesti värjäämällä aktiivinen kaspaasi 3 ja leviämisen merkki Ki-67. Nemorosone saaneilla MIA-PaCa-2 kasvaimia esiintyi enemmän nekroottisen ja /tai apoptoottiset alueita, jotka kohonnut kaspaasi 3 toimintaa ja pienempi määrä lisääntyvien solujen ilmentävien Ki-67, sopusoinnussa saadut tulokset MIA-PaCa-2-solujen

in vitro

[12].

mittaus kinetiikka plasmassa jälkeen ip injektio 50 mg /kg nemorosone vahvisti hyötyosuutta ja absorptiota yhdisteen verenkiertoon (kuvio 5). Viisi minuuttia injektion jälkeen, nemorosone plasmassa havaittiin olevan 40 ug /ml (80 uM) kanssa logaritminen poistaminen dominoi 20 min injektion jälkeen ja nemorosone osoittaa plasman puoliintumisaika on noin 30 min. Mitatut arvot kinetiikka plasmassa oli paras sovitettu olettaen kahden osaston disposition mallia myös havaittu farmakokineettisiä tutkimuksia hyperforin plasmassa suun kautta annettaessa [21,22]. Laskettu huippupitoisuus plasmassa nemorosone oli ~ 100 uM. Siten, kun otetaan huomioon korkea annos ensimmäisellä 5-10 minuutin kuluttua hakemuksen havaittu akuuttia hyperventilaatio selittyy nemorosone reversiibelisti häiritsemällä terveiden solujen välillä huippupitoisuus plasmassa ja alkaa eliminaatiovaiheessa noin 10 minuuttia myöhemmin.

Kaikkiaan 9 mahdollista metaboliitteja todettiin hiiren plasmassa, suurin osa heistä oli jo läsnä 5 min kuluttua ip injektio (kuviot 5 ja S2). Tämä osoittaa kohti nopean metaboloituminen nemorosone, sopusoinnussa laskettu puoliintumisaika vain 30 min. Valitettavasti rakenne aineenvaihduntatuotteiden ei saatu johtuen alhainen resoluutio ja ESI-MS-detektori. Kun kuitenkin otetaan huomioon, että se, että retentioaikojen havaittiin RP-HPLC-kromatogrammi ovat alhaisemmat kaikkien aineenvaihduntatuotteiden verrattuna nemorosone, hapettumisen tai hydroksylaatio prosesseja voidaan olettaa. Tätä oletusta tukee myös se, että, verrattuna nemorosone, massa valittu metaboliittien kasvoi 16 u, molekyylimassa hapen (kuva S4). Saada yksityiskohtaisia ​​rakenteellisia tietoja aineenvaihduntatuotteita, LC /ESI-MS-järjestelmä tarkkuus on suurempi tai preparatiivisessa lähestymistapa NMR-analyysi on vahvistettava. Molemmat menetelmät on sovellettu hyperforin metaboloituu rotan maksan mikrosomaalisia järjestelmät ja tuloksena tunnistettiin neljä hyperforin metaboliittien, kukin hydroksyloituu terminaalin metyleeniryhmä yksi neljästä prenyyli sivuketjujen [23]. Kirjoittajat spekuloivat, että kaksi rotan sytokromi P450-isoformien Ortologi ihmisen CYP3A4 olivat pääasiassa mukana metaboloituminen hyperforin. Tämä on yhdenmukaista sen kanssa, että hyperforin indusoi ilmentymisen

CYP3A4 kautta

sitoutumisen pregnaani-X-reseptori (PXR) [9,24].

CYP3A4

ekspressiota havaittiin myös indusoitua voimakkaasti hyperforin ja rifampisiinin, aineen tiedetään aktivoivan PXR, käsittelemällä ihmisen maksasoluissa Tässä tutkimuksessa (kuvio 2). Mielenkiintoista, nemorosone oli vain kohtalaisen tehokas asiakkuutta

CYP3A4

ilmaus: Inkubointi hepatosyyttien kanssa 1 uM nemorosone vain johti 3-kertainen

CYP3A4

mRNA verrattuna 15-kertainen upon inkubaatio 1 uM hyperforin. Tämä tulos on yllättävä ottaen huomioon erittäin joustava ligandia sitova onteloon PXR, joka on osoitettu täydellisesti sitoa hyperforin [24,25]. Koska osapuolet rakenne on samantapainen hyperforin The PXR pitäisi odottaa myös sitoa ja aiheuttaa

CYP3A4

ilmennetty ekvimolaariset nemorosone pitoisuuksina. Tämä ei näytä olevan kyse, mikä tekee suurempia pitoisuuksia nemorosone syövän hoitoon parempi syrjäyttäen hyperforin joille monilääkehoito liittyvät yhteisvaikutukset CYP3A4-induktio on raportoitu [9,18]. Ottaen huomioon, että kohonnut PXR ilmaisu on myös havaittu eri haiman soluja [26], hoito haiman syövän yhdistelmähoitoa lähestymistapa on todennäköisesti onnistunut nemorosone sijaan hyperforin.

Lopuksi, Tutkimuksemme osoittaa merkittävää kasvua estävä vaikutus nemorosone haiman syövän ksenograftien samalla hyvin siedetty. Farmakokineettiset perustiedot analyysi viittaa siihen, että nemorosone imeytyy nopeasti ja metaboloituu kautta hapettumisen CYP3A4-riippumattomalla tavalla. Tämä tekee nemorosone hyvin lupaava johtaa yhdisteen yhdistelmää hoitoja. Siten tarkempia tutkimuksia potilaalle tehdä ksenograftimalleja ja farmakokineettisiä analyysejä korkeamman resoluution tulisi tehdä.

tukeminen Information

Kuva S1.

Ruumiinpaino käsiteltyjen ja kontrolli hiirillä. Kehon paino käsiteltyjen ja kontrollihiirten oli määrittää rutiininomaisesti päivittäin ennen i.p. injektio. Arvot edustavat keskiarvoa ± SD 8 eläintä ryhmää kohti.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0074555.s001

(TIF) B Kuva S2.

HPLC kromatogrammit nemorosone ja sen aineenvaihduntatuotteiden havaittu plasmassa. Overlay valittujen HPLC-kromatogrammit (detektio 303 nm) hiiren (vihreä) ja ihmisen (sininen) plasmanäytettä sekä ihmisen plasmaa piikkeinä 100 ng /ml nemorosone (punainen) ja hiiren plasmassa 5 min kuluttua i.p. soveltaminen nemorosone (musta) on esitetty.

doi: 10,1371 /journal.pone.0074555.s002

(TIF) B Kuva S3.

Standard rivi ihmisen plasmaa, johon on lisätty yhä nemorosone pitoisuuksilla. Kalibrointi linja nemorosone lisätty humaani plasma näytteet laskettiin ja rinnakkain näytteiden uutettu hiiren plasmasta, jotta kvantifiointia nemorosone.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0074555.s003

(TIF)

Kuva S4.

ESI-MS-spektrit nemorosone ja valittujen metaboliitteja. ESI-MS -spektrit rekisteröitiin kunkin piikin, ja spektrien nemorosone sekä aineenvaihduntatuotteiden M01, M06 ja M08 näytetään. Molekyyli-ioni huiput protonoitu nemorosone (m /z = 503,2), sekä sen natrium- (m /z = 525,2) ja kalium (m /z = 541,1), suolat on merkitty mustat nuolet. Mahdollisesti hapetetaan nemorosone natriumia (m /z = 541,1) ja kalium (m /z = 557,2) suolat on merkitty harmaalla nuolilla.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0074555.s004

(TIF) B

Kiitokset

kirjoittajat ovat kiitollisia DKFZ Laboratory animal Facility ja Sven Rüffer teknistä apua aikana soluviljelmissä ja eläinten työtä sekä tohtori Shereen Keleg, Euroopan haima Center, Heidelberg, hänen apua immunohistokemiallisella värjäyksellä.