Krooninen sairaus

tiivistelmä

Wnt /β-kateniinin signalointireitin on tärkeää kasvaimen aloittamista ja etenemistä . Alhainen lipoproteiinin reseptoriin liittyvä proteiini-6 (LRP6) on olennainen Wnt co-reseptorin Wnt /β-kateniinin signalointi ja edustaa lupaavaa syövän vastaista tavoite. Äskettäin antihelmiit- tisiä lääke, niclosamide havaittiin estävän Wnt /β-kateniinin signalointia, vaikka mekanismi ei ole hyvin määritelty. Olemme havainneet, että niclosamide pystyi tukahduttamaan LRP6 ilmaisun ja fosforylaatio, lohko Wnt3A aiheuttama β-kateniinin kerääntyminen, ja estävät Wnt /β-kateniinin signalointi HEK293-soluissa. Lisäksi estäviä vaikutuksia niclosamide on LRP6 ilmaisun /fosforylaatio ja Wnt /β-kateniinin signalointi oli noudatettiin ihmisen eturauhasen PC-3 ja DU145 ja rintojen MDA-MB-231 ja T-47D syöpäsoluja. Lisäksi olemme osoittaneet, että mekanismi, jolla niclosamide tukahdutti LRP6 johtui lisääntyneestä hajoamista, kuten ilmeistä on lyhyempi puoliintumisaika. Lopuksi osoitimme, että niclosamide kykeni indusoimaan syöpäsolujen apoptoosin, ja näytetään erinomainen syövän vastaista aktiivisuutta IC

50-arvot alle 1 uM eturauhasen PC-3 ja DU145 ja rintojen MDA-MB-231 ja T-47D syöpäsolujen . IC

50-arvot ovat verrattavissa esitetty tukahduttaa toimintaa Wnt /β-kateniinin signalointi eturauhas- ja rintasyövän soluissa. Tuloksemme osoittavat, että niclosamide on ainutlaatuinen pieni molekyyli Wnt /β-kateniinin signaloinnin inhibiittoria kohdistuvat Wnt co-reseptorin LRP6 solun pinnalla, ja että niclosamide on mahdollista kehittää uusi chemopreventive tai terapeuttinen aine ihmisen eturauhas- ja rintasyövän .

Citation: Lu W, Lin C, Roberts MJ, Waud WR, Piazza GA, Li Y (2011) Niclosamide vaimentaa Cancer Cell Growth indusoimalla Wnt koreseptorissa LRP6 Hajoaminen ja Inhiboivaa Wnt /β-kateniinin Pathway. PLoS ONE 6 (12): e29290. doi: 10,1371 /journal.pone.0029290

Editor: Lin Mei, Medical College of Georgia, Yhdysvallat

vastaanotettu: 1. syyskuuta 2011; Hyväksytty 24. marraskuuta 2011; Julkaistu: 16 joulukuu 2011

Copyright: © 2011 Lu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Institutes of Health (RO1CA124531, ja YL). Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Wnt /β-kateniinin signaloinnin tärkeä rooli alkion kehitykseen ja voi johtaa kasvaimen muodostumisen kun poikkeavasti aktivoituna. Tunnusmerkki Wnt /β-kateniinin signalointi aktivointi on vakauttaminen sytosolin β-kateniinin, joka tulee tumaan aktivoimaan Wnt kohdegeenien sitomalla transkriptiotekijät T-solu tekijä /lymfaattisen vahvistamistekijä (TCF /LEF) perhe [ ,,,0],1], [2]. Puuttuessa Wnt-ligandien, β-kateniinin tasoja tehokkaasti säädellä supramolekulaarisia kompleksi, joka sisältää adenomatoottisen polypoosin coli (APC), ak- siini, ja glykogeenin syntetaasin kinaasi 3β (GSK3p: n). Tämä monimutkainen edistää fosforylaatiota β-kateniinin by kaseiinikinaasin 1 (Ck1) ja GSK3p. Fosforyloitua β-kateniinin tulee multi-ubikitinoitu (Ub) ja hajottaa 26S-proteasomin. Toiminnan tämän monimutkaisen estyy kun sitoutumisen Wnt sen reseptoreihin solun pinnalla [1], [2]. Erilaisia ​​Wnt /β-kateniinin kohdegeenien on tunnistettu, mukaan lukien ne, jotka säätelevät solujen proliferaatiota ja apoptoosia, mikä välittäjänä syövän taudin alkamisen ja etenemisen [3] – [5]. Kiistatonta näyttöä on osoitettu, että on epänormaali säätely ylöspäin tämän reitin kasvainten synnyssä monien syöpien, ja että häiriöt Wnt /β-kateniinin signalointi edustaa suuri mahdollisuus kehittää uusia lääkkeitä syövän kemopreventiossa ja hoito [6] – [8].

Kokeet suoritettiin Drosophila [9], Xenopus [10] ja hiirillä [11] osoittivat, että LDL-reseptoriin liittyvä proteiini 5 (LRP5: stä) /LRP6 (kutsutaan nuoli Drosophila) toimii yhteistyössä reseptori Wnt ligandeja, jotka ovat vuorovaikutuksessa sekä seitsemän läpäisevään reseptoriin Frizzled (Fz) perheen ja LRP5: stä /6 aktivoi kanoninen Wnt signalointireitille. Sytoplasmisen pyrstöt LRP5: stä /6, kun reseptorin aktivoinnin Wnt ligandi, fosforyloidaan, ja rekrytoida sytosolin tukirakenteen proteiinin ak- siini kalvoon. LRP6 ilmentyy ihmisen syövän solulinjoissa ja säädellään ylöspäin ihmisen pahanlaatuinen kudoksissa [12] – [16]. Studies viime vuosina ovat osoittaneet, että LRP6 on lupaava terapeuttinen kohde kehittää uusia syöpälääkkeitä [6] – [8], [15], [17], [18].

Niclosamide (kaupan nimi Niclocide) on teniacide siinä antihelmintic perhe, joka on erityisen tehokas vastaan ​​heisimatoja, joka tartuttaa ihmiseen. Niclosamide on ollut FDA hyväksytty tällaisia ​​merkintöjä ja sitä on käytetty ihmisellä lähes 50 vuotta [19] – [21]. Uskotaan, että niclosamide estää oksidatiivisen fosforylaation mitokondrioissa heisimatojen; aerobinen aineenvaihdunta, josta monet heisimatojen ovat riippuvaisia. Äskettäin on osoitettu, että niclosamide voi downregulate soluliman β-kateniinin ilmentymistä estävän Wnt /β-kateniinin signalointi [22], [23], ja estää peräsuolen syövän kasvua ja etäpesäkkeiden [23], [24]. Koska mekanismi ei ollut hyvin määritelty, me vielä tutkia tätä. Me osoitettu ensimmäistä kertaa, että niclosamide voi estää Wnt /β-kateniinin signalointi indusoimalla LRP6 hajoamisen, ja että tämä toiminta liittyy läheisesti sen antiproliferatiivisia ja apoptoosin indusoiva aktiivisuus.

Tulokset

Niclosamide lohkot Wnt /β-kateniinin signaloinnin aiheuttama Wnt3A ja LRP6 tukahduttamalla LRP6 ilmentymistä HEK293-soluissa

Kompleksoimaton soluliman β-kateniinin (vapaa β-kateniinin) on aktiivinen muoto β-kateniinin, joka on translokaatio solun tumassa aktivoi transkriptiotekijöitä TCF /LEF perhe, mikä johtaa transkriptioon Wnt kohdegeenien. Sen määrittämiseksi, onko niclosamide voi estää Wnt /β-kateniinin signalointi, HEK293-soluja käsiteltiin kanssa Wnt3A väliaine (CM), kun läsnä on niclosamide tai vehikkeliä (DMSO). Tasot sytosolin vapaan β-kateniinin ja solun kokonais β-kateniinin tutkittiin sitten Western-blottauksella. Kuten kuviossa 1A on esitetty, niclosamide pystyi estämään Wnt3A aiheuttamaa sytosolin vapaan β-kateniinin ja solun kokonais-β-kateniinin kerääntyminen HEK293-soluissa niinkin pienillä pitoisuuksilla kuin 0,6 uM (kuvio 1A).

(A) HEK293-solut 6-kuoppaisilla levyillä käsiteltiin Wnt3A CM (20%) ja niclosamide on ilmoitettuina pitoisuuksina 24 tuntia. Tasot sytosolin vapaan β-kateniinin, solun kokonais β-kateniinin, LRP6 ja fosfo-LRP6 (p-LRP6) tutkittiin. Kaikki näytteet koetettiin myös anti-aktiini-vasta tarkistaa yhtä suuri kuormitus. (B) HEK293-soluissa 24-kuoppalevyillä transfektoitiin ohimenevästi LRP6 plasmidi tai vastaava ohjaus vektori, sekä TOPFlash rakentaa ja β-galaktosidaasi-ilmentävällä vektorilla kuhunkin kuoppaan. Sen jälkeen, kun on inkuboitu 24 tuntia, soluja käsiteltiin niclosamide tai niclosamide plus Wnt3A CM on ilmoitettuina pitoisuuksina 24 tuntia. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin sitten 24 tuntia myöhemmin normalisoinnin aktiivisuuden β-galaktosidaasi. Arvot ovat keskiarvoja kolmen määrityksen kanssa keskihajonnat merkitty virhepalkeilla. ** P 0,01 kontrolliin verrattuna soluihin ilman niclosamide hoitoa.

LRP6 on olennainen Wnt co-reseptori Wnt /β-kateniinin signalointireitin, ja LRP6 fosforylaatio on kriittinen Wnt /β kateniinin aktivaatiota aiheuttama Wnt proteiinit [25] – [28]. Tutkia molekyylimekanismin taustalla Wnt /β-kateniinin signaloinnin inhibition niclosamide, tutkimme LRP6 ilmaisun ja fosforylaatio jälkeen niclosamide hoidon. Kuten kuviossa 1A on esitetty, hoito Wnt3A CM merkittävästi indusoi endogeenisen LRP6 fosforylaatio HEK293-soluissa, mikä poisti niclosamide hoitoon. Mikä tärkeintä, Huomasimme myös, että koko solun endogeenisen LRP6 pieneni suuresti jälkeen niclosamide hoidon HEK293-soluissa (kuvio 1A).

Vahvista estävää vaikutusta niclosamide on LRP6 ilmaisun ja fosforylaatio, teimme Wnt /β-kateniinin signaloinnin reportterimääritys testata onko niclosamide kykenee estämään Wnt /β-kateniinin signaalin aktivaatiota LRP6 ja Wnt3A. HEK293-solut transfektoitiin ohimenevästi LRP6 sekä Wnt /β-kateniinin signaloinnin toimittaja TOPFlash, ja käsiteltiin Wnt3A CM ja niclosamide. Kuten kuviossa 1B on esitetty, LRP6 ilmentyminen lisäsi TOPFlash aktiivisuus HEK293-soluissa, mikä edelleen parantaa, kun solut transfektoitiin LRP6 ja käsiteltiin Wnt3A CM (kuvio 1 B). Lisäksi lisääntynyt TOPFlash indusoimaa LRP6 tai LRP6 plus Wnt3A CM esti niclosamide (kuvio 1 B).

Niclosamide tukahduttaa LRP6 Expression ja fosforylaatio ja Blocks Wnt /β-kateniinin Signaling in eturauhasen ja rintasyövän solujen

voit selvittää niclosamide voi estää Wnt /β-kateniinin signalointi syöpäsoluissa, tutkimme taso sytosolin vapaan β-kateniinin jälkeen niclosamide hoidon. Olemme havainneet, että sytosolisen vapaan β-kateniinin tasoja ihmisen eturauhasen PC-3 ja rintojen MDA-MB-231 syöpäsolut olivat merkittävästi vähentää, kun niclosamide hoidon (kuvio 2A). Lisäksi, kun PC-3 ja MDA-MB-231-soluja transfektoitiin ohimenevästi Wnt /β-kateniinin signaloinnin toimittaja TOPFlash, olemme huomanneet, että niclosamide käsittely vähentää huomattavasti TOPFlash toimintaa PC-3 ja MDA-MB-231-soluja ( Kuvio. 2B).

(A) Eturauhassyöpä PC-3 ja rintasyöpä MDA-MB-231-solujen 6-kuoppaisilla levyillä käsiteltiin niclosamide ilmoitettuina pitoisuuksina 24 tuntia. Tasot sytosolin vapaan β-kateniinin tutkittiin sitten GST-E-kadheriinin sitoutumisen määrityksessä. (B) eturauhassyöpä PC-3 ja rintasyöpä MDA-MB-231-soluja 24-kuoppalevyillä transfektoitiin lyhytaikaisesti kanssa TOPFlash lusiferaasin konstrukti ja β-galaktosidaasi-ilmentävällä vektorilla kuhunkin kuoppaan. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen soluja käsiteltiin 2,4 uM niclosamide. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin sitten 24 tuntia myöhemmin normalisoinnin aktiivisuuden β-galaktosidaasi. Arvot ovat keskiarvoja kolmen määrityksen kanssa S.D. osoitetaan virhepalkeilla. ** P 0,01 kontrolliin verrattuna soluihin.

On hyvin tunnettua, että axin2 on erityinen transkription kohteena Wnt /β-kateniinin signalointireitin, ja että ilmentymistaso axin2 on allekirjoitus aktivaation Wnt /β-kateniinin signalointi [29] – [32]. Sykliini D1 on transkriptionaalinen tavoite Wnt /β-kateniinin signalointi, ja on kriittinen syöpäsolujen lisääntymistä [33], [34]. Määrittämiseksi estäviä vaikutuksia niclosamide on Wnt /β-kateniinin signalointi ihmisen syöpäsoluja, tutkimme axin2 ja sykliini D1 ilmentymisen ihmisen eturauhasen PC-3 ja DU145 ja rintojen MDA-MB-231 ja T-47D syöpäsoluja. Kuten kuviossa 3 on esitetty, niclosamide merkittävästi tukahdutti axin2 ja sykliini D1 ilmentyminen kaikissa neljässä syöpäsolulinjoissa.

(A) DU145 ja PC3 syöpäsolujen ja MDA-MB-231 ja T-47D-rintasyöpäsolujen 6-kuoppaisia ​​levyjä käsiteltiin niclosamide on ilmoitettuina pitoisuuksina 24 tuntia. Koko solun tasot LRP6, p-LRP6, Dvl2, Axin2 ja sykliini D1were tutkittiin sitten. Kaikki näytteet koetettiin myös anti-aktiini-vasta tarkistaa yhtä suuri kuormitus. (B) PC-3 ja DU145 syöpäsolujen ja MDA-MB-231 ja T-47D rintasyövän solut 6-kuoppaisilla levyillä käsiteltiin niclosamide ilmoitetuilla pitoisuuksilla 24 tunnin ajan. Sytosolin tasot Dvl2 tutkittiin sitten. Kaikki näytteet koetettiin myös anti-aktiini-vasta-aine tarkistaa yhtä suuri kuormitus.

määrittää, onko estävä vaikutus niclosamide on Wnt /β-kateniinin signalointi liittyy LRP6 ilmaisun, tutkimme LRP6 ilmaisu ja fosforylaatio jälkeen niclosamide hoidon. Kuten kuviossa 3A on esitetty, niclosamide pystyi tukahduttaa LRP6 ilmaisun ja fosforylaatio kaikki neljä syöpäsolulinjoissa, joka osoittaa, että niclosamide voidaan torjua Wnt /β-kateniinin signalointi rinta- ja eturauhassyöpää solujen tukahduttamalla LRP6 ilmaisu.

niclosamide Aiheuttaa LRP6 Hajoaminen

Jos haluat määrittää molekyylimekanismin taustalla vaikutus niclosamide on LRP6 proteiini tasolla, olemme tutkineet LRP6 liikevaihdon. PC-3-soluja käsiteltiin niclosamide 1,2 uM 0, 3, 6, 10 ja 24 h sykloheksimidin läsnä ollessa, joka on proteiinisynteesi-inhibiittorin. Kuten kuviossa 4 on esitetty, ilman niclosamide hoidon, LRP6 oli hajonnut, jossa puoliintumisaika oli noin 6,9 tuntia. Hoito niclosamide merkittävästi parannettu LRP6 liikevaihdon puoliintumisaika on noin 2,3 h (kuvio 4A). Tämä lyhentäminen LRP6 puoliintumisaika viittaa siihen, että niclosamide voivat stimuloida LRP6 hajoamista. Sen testaamiseksi niclosamide säätelee LRP6 ilmentymisen transkription tasolla liian selvitimme LRP6 mRNA-tasoja reaaliaikaisella RT-PCR. Kuten on esitetty kuviossa 4B, LRP6 mRNA-tasot eivät muuttuneet merkitsevästi jälkeen niclosamide hoidon PC-3 ja MDA-MB-231-soluja. Näin ollen, niclosamide aiheuttama LRP6 vaimennus johtuu pääasiassa tehostetun LRP6 hajoamista.

(A) PC-3-soluja inkuboitiin 10 ug /ml sykloheksimidiä läsnä ollessa Niclosamide (1,2 uM) tai ajoneuvon 0, 3, 6, 10 tai 24 h. Sitten solut otettiin talteen, ja endogeenisen LRP6 tutkittiin Western-blottauksella. Näytteet koetettiin myös anti-aktiini-vasta tarkistaa yhtä suuri kuormitus. Pikseleistä jokaiselle kaistalle mitattiin, normalisoitu ja piirretty. Tiedot ovat keskiarvoja kolmesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta, jossa SD-arvot ilmaistaan ​​virhe baaria. * P 0,05, ** P 0,01 verrattuna vastaavaan kontrolliin arvoa. (B) PC-3 ja MDA-MB-231-solujen 6-kuoppaisilla levyillä käsiteltiin niclosamide 24 tuntia. Sitten solut kerättiin ja LRP6 mRNA-tasot määritettiin reaaliaikaisella RT-PCR: llä ja normalisoitu viestin tasojen GAPDH mRNA: ta. Kaikki arvot ovat keskiarvoja kolmen määrityksen kanssa S.D. osoitetaan virhepalkeilla.

Niclosamide ei vaikuta Dishevelled-2 (Dvl2) eturauhasessa ja Breast Cancer Cells

On raportoitu, että niclosamide downregulates komponentit Wnt-reitin erityisesti sytosolin Dvl2 ilmaisua, jolloin vähentynyt loppupään Wnt /β-kateniinin signalointi kolorektaalisyövissä [23]. Sen testaamiseksi Dvl2 on mukana niclosamide aiheuttama Wnt /β-kateniinin signalointi esto eturauhasen ja rintasyövän soluja, tutkimme sekä totaalisoluproteiinia ja sytosolin tasot Dvl2 ilmaisua. Yllättäen olemme huomanneet, että niclosamide ei ollut vaikutusta sekä solujen kokonais ja sytosolin Dvl2 ilmentymistä ihmisen eturauhasen PC-3 ja DU145 ja rintojen MDA-MB-231 ja T-47D syöpäsolujen (kuvio 3), kun taas LRP6 ekspressio huomattavasti vaimenee sama käsittely (kuvio 3A). Nämä tulokset osoittavat, että LRP6 downregulation on keskeinen mekanismi taustalla niclosamide aiheuttama Wnt /β-kateniinin signaloinnin inhibition ihmisen eturauhasen PC-3 ja DU145 ja rintojen MDA-MB-231 ja T-47D syöpäsoluja.

Niclosamide indusoi Eturauhasen ja Breast Cancer solukuoleman ja estää Cancer Cell Proliferation

Wnt /β-kateniinin reitti on tärkeä syöpäsolu apoptoosin [35], [36]. Todettuaan, että niclosamide on voimakas inhibiittori Wnt /β-kateniinin signalointi eturauhas- ja rintasyövän soluissa, me sitten testataan, onko niclosamide pystyy aiheuttamaan apoptoosin. Kuten on esitetty kuviossa 5A, altistuminen niclosamide 1,2 ja 2,4 uM: ssa 24 tuntia merkittävästi indusoi apoptoottisen DNA: n fragmentoituminen eturauhasen PC-3 ja DU145 ja rintojen MDA-MB-231 ja T-47D syöpäsoluja.

( A) Cancer solut käsiteltiin niclosamide ilmoitettuina pitoisuuksina 24 tuntia. Kelluvat ja kiinnittyneet solut yhdistettiin apoptoosin havaitsemisen Cell Death ELISA Kit Roche Diagnostics Corporation histoni-liittyvät DNA-fragmentit, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. (B) Syöpäsolut 96-kuoppalevyille käsiteltiin niclosamide 72 tuntia. Solujen elinkelpoisuus mitattiin solu-ainetiitteri Glo testausjärjestelmä. Kaikki arvot ovat kolmen rinnakkaisen määrityksen keskiarvoa kanssa S.D. osoitetaan virhepalkeilla. ** P 0,01 verrattuna vastaavaan kontrolliin arvo.

Koska niclosamide voi estää Wnt /β-kateniinin signalointi syöpäsoluissa ja voi indusoida apoptoosia, tutkimme seuraavaksi vaikutus niclosamide syövän solujen proliferaatiota. Kuten kuviossa 5B on esitetty, niclosamide esti syövän solujen proliferaatiota IC

50-arvot alle 1 uM kaikkia neljää testattu solulinjoissa. IC

50-arvot ovat verrattavissa osoitettu tukahduttaa toimintaa Wnt /β-kateniinin signalointi eturauhasen ja rintasyövän soluja.

Keskustelu

Pakottava näyttö osoittaa, että on olemassa epänormaali säätely ylöspäin Wnt /β-kateniinin reitin kasvainten synnyssä monien syöpien riskiä. Vaikka geneettisiä mutaatioita tiettyjen osien Wnt /β-kateniinin reitin, kuten

APC

ja

CTNNB1

, ovat merkittäviä vaikuttaneet tekijät ja peräsuolen syövät, ne ovat yleensä ole hallitsevia liittyvältä monet muut syöpätyypit, kuten rinta- ja eturauhasen syövät. Sen sijaan vaikuttaa siltä, ​​että dysregulaatio Wnt /β-kateniinin signaloinnin solun pinnalla johtaa poikkeavan aktivaation tämän reitin näihin syöpiin [3] – [5], [37]. Siksi kohdennettua estäminen Wnt /β-kateniinin signalointi solun pinnalla on järkevä ja lupaava uusi lähestymistapa syövän hoitoon.

Wnt /β-kateniinin signaloinnin tärkeä rooli maitorauhasen kehitykseen ja syövän synnyn [ ,,,0],4]. Kolmen rintasyöpä (TNBC; ER, PR, ja HER2-negatiivinen rintasyöpä) on yksi vaikeimmista alatyyppejä rintasyövän hoitoon puutteen vuoksi on kohdennettu hoito. Tutkimukset ovat osoittaneet, että Wnt /β-kateniinin signaloinnin aktivointi on edullisesti löytyy TNBC ja liittyy huono kliininen tulos [38]. Basal kaltainen rintasyöpä (BLBC) on monia päällekkäisiä ominaisuuksia BLBC. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että LRP6 on säädelty ihmisen TNBC tai BLBC [14] – [16]. Hiirillä, maitorauhasen kehitykseen ja MMTV-Wnt1 aiheuttama rintarauhasen tuumorigeneesiä viivästyi vuonna LRP6

+/- hiirissä [14], kun taas MMTV-LRP6 siirtogeenisiä hiiriä kehittyi liikakasvun niiden maitorauhasineen takia LRP6 välittämää Wnt /β- kateniinin signalointi [39]. Transkription knockdovvn LRP6 in TNBC MDA-MB-231-solujen vähentynyt merkittävästi Wnt /β-kateniinin signalointi, solujen lisääntymistä, ja kasvaimen kasvu

in vivo

[15]. Lisäksi on osoitettu, että tietyt LRP6 vasta-aineet kykenivät estämään MMTV-Wnt1 tai MMTV-Wnt3 ksenografteissa

in vivo

[17], [18], ja että yhdistelmä-DNA-Mesd proteiini, joka on LRP6 antagonisti, selvästi tukahdutti kasvaimen kasvua MMTV-Wnt1 ksenograftimalleissa [15]. Lisäksi salinomysiiniä, rintasyöpä kantasolujen tappaja [40], oli äskettäin osoitettiin olevan estäjä Wnt /β-kateniinin signalointi indusoimalla LRP6 hajoaminen [41]. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, että niclosamide tukahdutettiin LRP6 ilmentymisen TNBC MDA-MB-231-solujen ja ER-positiivisen rintasyövän T-47D-soluja, ja se esti rintasyöpäsolujen lisääntymistä IC

50-arvot vähemmän kuin 1 uM. Tuloksemme tukevat käsitystä, että LRP6 on lupaava terapeuttinen kohde rintasyövän lukien TNBC.

Kertyneet todisteet ovat osoittaneet merkittävä rooli Wnt /β-kateniinin signaloinnin kehittymistä ja etenemistä ihmisen eturauhassyövän [3] . Vaikka on epäselvää, onko LRP6 on säädellään ylöspäin eturauhassyöpä, olemme hiljattain osoittaneet, että LRP6 antagonisti Mesd inhiboivat merkittävästi Wnt /β-kateniinin signalointi eturauhassyöpä PC-3-solut, ja tukahdutti PC-3-solujen lisääntymisen

vuonna vitro

ja kasvaimen kasvu

in vivo

[42], [43]. Tässä tutkimuksessa, löysimme niclosamide inhiboivat eturauhassyövän PC-3 ja DU145 solujen IC

50-arvot alle 1 uM, jotka ovat verrattavissa osoitettu tukahduttaa LRP6 ilmaisun ja toimintaa Wnt /β- kateniinin signalointi eturauhassyöpäsoluissa. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että LRP6 on potentiaalinen terapeuttinen kohde eturauhassyövässä.

Mutaatiot

APC

ja

CTNNB1

kaksi suurta tekijöitä Wnt /β-kateniinin signalointi aktivoinnin ja peräsuolen syöpiä, mutta viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että tasot Wnt /β-kateniinin signalointi ja peräsuolen syövän soluja voidaan moduloidaan solun pinnalla [44] – [48]. Erityisesti, Ueno

et al.

Osoittaneet, että Wnt-reseptori frizzled-7 aktivoi Wnt /β-kateniinin väylän ja peräsuolen syövän soluja, läsnäolosta huolimatta

APC

tai

CTNNB1

mutaatio ja että frizzled-7-siRNA voidaan käyttää terapeuttisena reagenssina peräsuolen syöpä [48]. Shi

et al

. kertoi, että siRNA vaiennettu Wnt-2, joka on tunnettu yli-ilmentymisen kolorektaalisyövässä, esti Wnt /β-kateniinin signalointi ja indusoi apoptoosin ihmisen peräsuolen syövän solut, jotka sisältävät loppupään mutaatioita [47]. Erittynyt frizzled liittyvä proteiini (SFRP) perheen ja Wnt estävä tekijä-1 (WIF-1) erittyy Wnt /β-kateniinin signalointi antagonisteja, jotka sitoutuvat Wnt ligandeja, ja häiritsevät Wnt-reseptorin vuorovaikutus. On raportoitu, että menetys SFRP perheen ilmaisun liittyi promoottori hypermetylaation kolorektaalisyövässä [44], ja että palauttaminen SFRP toiminta peräsuolen syöpäsoluissa vaimentaa Wnt /β-kateniinin signalointi vaikka läsnä alavirran mutaatioiden [45]. Samoin hän

et al.

Raportoitu, että menetys WIF-1 ilmentyminen liittyi promoottori hypermetylaation kolorektaalisyövässä, ja että palauttaminen WIF-1-toiminto, Wnt-1 siRNA, tai monoklonaalinen anti-Wnt- 1 vasta indusoi merkittävän apoptoosin peräsuolen syövän solut, jotka sisältävät loppupään mutaatioita ja ilmentävät Wnt-1 [46]. Aivan hiljattain on raportoitu, että niclosamide kykeni inhiboimaan Wnt /β-kateniinin signalointi peräsuolen syövän solut, inhiboi peräsuolen syövän kasvua ja S100A4-välitteisen metastasoitunut kolorektaalisyöpä [23], [24]. Kalsiumia sitova proteiini S100A4 on kohdegeenin Wnt /β-kateniinin reitin [49]. Tulevaisuuden tutkimuksia edellytetään puuttua tärkeyttä LRP6 kolorektaalisyövässä kehittymistä ja etenemistä.

kehitys FDA hyväksyi lääkkeitä, joita käytetään muihin käyttöaiheisiin on houkutteleva strategia uusien lääkkeiden syövän kemopreventiossa tai hoitoa antaneet todistettu turvallisuus kirjaa. Häiriöt Wnt /β-kateniinin signalointi edustaa suuri mahdollisuus onko FDA hyväksyi huumeiden voisi olla potentiaalia syövän vastainen teho [6] – [8]. Niclosamide on salicyclamide johdannainen ja huume hoitoon eniten lapamato infektio. Niclosamide kykenee sen Loisten aktiivisuus suolistossa ja imeytyy huonosti ruoansulatuskanavasta [19] – [21]. Kuitenkin hiirillä istutettu ihmisen kolorektaalisyövän ksenografteja, suun kautta niclosamide oli hyvin siedetty, saavutetaan plasman ja kasvaimeen liittyvien tasojen biologinen aktiivisuus ja johti kasvaimen valvontaa [23]. Lisäksi niclosamide ei ole merkittävää myrkyllisyyttä vastaan ​​ei-syöpäsoluja

in vitro

ja näyttää ole ilmeisiä sivuvaikutuksia niclosamide hoidetuissa hiirissä [23]. Osoitamme tässä, että niclosamide on voimakas Wnt /β-kateniinin signaloinnin estäjä indusoimalla LRP6 hajoamisen syöpäsoluissa, ja näyttää erinomaista syövän vastaista aktiivisuutta

in vitro

. Siksi, koska FDA hyväksyi antihelmiit- tisiä lääke, niclosamide tulee mielenkiintoinen comoound optimoitu kasvattamaan hyötyosuutta ja testata sen

in vivo

syöpää ehkäiseviä ja terapeuttisia rooleja tulevaisuudessa.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Niclosamide ostettiin Sigma. Polyklonaalinen anti-fosfo-LRP6 (Ser1490) ja anti-Dvl2 ja monoklonaalinen anti-Axin2 ostettiin Cell Signaling Technology. Monoklonaalisia anti-LRP6 oli Santa Cruz Biotechnology. Polyklonaalisia kaniinin anti-sykliini D1 oli Chemiconilta International. Monoklonaalinen anti-β-kateniinin oli BD Biosciences. Monoklonaalinen anti-aktiini oli Sigmalta. Peroksidaasilla leimatun anti-hiiri-vasta-ainetta ja ECL-järjestelmää ostettiin Amersham Life Science. Plasmidi PCS-Myc-hLRP6 sisälsi täyspitkän ihmisen LRP6 cDNA oli tri Christof Niehrs (Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg, Saksa). Plasmidi Glutationi-S-transferaasi (GST) -E-kadheriinin sen toimitti ystävällisesti Dr. Gail Johnson (University of Rochester, NY). TOPFlash lusiferaarikonstrukti oli Upstate Biotechnology. Β-galaktosidaasi-ilmentävällä vektorilla, lusiferaasimääritystä järjestelmän ja β-galaktosidaasi koejärjestelmässä hankittiin Promega. Kudosviljelyalustat, naudan sikiön seerumia (FBS), ja muovi-ware saatiin Life Technologies, Inc. proteinaasi-inhibiittori cocktail Complete ™ saatiin Boehringer Mannheim. Kaikki solulinjat saatiin ATCC: ltä ja viljeltiin RPMI-1640-väliaineessa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia, 2 mM L-glutamiinia, 100 yksikköä /ml penisilliiniä, ja 100 ug /ml streptomysiiniä. Soluja kasvatettiin antibiootti-väliaineessa solukasvukokeissa. Cell titraaminen Glo määritys järjestelmät olivat Promega. Solukuoleman havaitseminen ELISA kit hankittiin Roche Diagnostics Corporation.

Western blotting

solut 6-kuoppaisilla levyillä lyysattiin 0,5 ml: aan lysis-puskuria (fosfaattipuskuroitu suolaliuos, joka sisälsi 1% Triton X -100 ja 1 mM PMSF) 4 ° C: ssa 10 min. Yhtä suuret määrät proteiinia tehtiin SDS-PAGE pelkistävissä olosuhteissa. Siirron jälkeen Immobilon-P siirto kalvo, peräkkäiset inkuboinnit primäärisen vasta-aineen ja piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen suoritettiin 60-120 minuuttia huoneen lämpötilassa. Immunoreaktiivisia Sitten proteiinit detektoitiin käyttämällä ECL-järjestelmää. Elokuvista immunoreaktiivisia vyöhykkeet skannataan Hp Scanjet 5590.

Sytosoliset vapaa β-kateniinin analyysi GST-E-kadheriinin sitoutumismääritys

GST-E-kadheriinin sitoutumismääritys suoritettiin täsmälleen aikaisemmin kuvatulla tavalla [50]. Kompleksoitumattoman soluliman free β-kateniinin läsnä 100 ug kokosolulysaattia alistettiin SDS-PAGE: lla ja havaittiin käyttäen monoklonaalista vasta-ainetta p-kateniinin.

Reaaliaikainen RT-PCR

Yhteensä RNA eristettiin soluviljelmistä käyttäen RNA-Bee (Tel-Test), ja ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi suoritettiin käyttäen ProSTARTM Ultron HF RT-PCR Kit (Stratagene), oligo (dT) aluketta 20 ul: ssa reaktioseosta, joka sisälsi 1 ug kokonais-RNA: ta. Analysointiin LRP6 mRNA-tasojen, reaaliaikainen RT-PCR suoritettiin erityisiä LRP6 ja GAPDH-alukkeita ostettu SABioscience /Qiagene. LRP6 mRNA-tasolla normalisoitiin GAPDH mRNA-tasolla.

analyysien avulla.Työ sytosolin Dvl2 ilmaisu

Sytosoliset Dvl2 ilmentyminen tutkittiin menetelmällä, kuten on kuvattu muualla [23]. Lyhyesti, solut lyysattiin hypotonisella lyysipuskurilla (joka koostuu 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, ja 0,2 mM MgCl2: a, johon oli lisätty proteaasi-inhibiittoreita, inkuboitiin jään päällä 10 minuutin ajan, ja homogenisoitiin käyttäen tiukka lasi dounce. Sakkaroosi ja EDTA lisättiin loppupitoisuudeksi 0,25 M ja 1 mM, vastaavasti. Lysaatit sentrifugoitiin 20000 x g 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantti edustavat soluliman solu fraktio laimennettiin sitten SDS-näytepuskuriin, ja Dvl2 ilmentyminen tutkittiin sitten Western-blottauksella.

lusiferaasireporttiterilla määritys

Syöpäsolut maljattiin 24-kuoppalevyille. Kun viljelty yön yli, solut transfektoitiin ohimenevästi 0,1 ug TOPFlash lusiferaasi-konstrukti (Upstate Biotechnology), ja 0,1 ug β-galaktosidaasi-ilmentävällä vektorilla (Promega, Madison, WI). 24 tunnin inkuboinnin jälkeen soluja käsiteltiin niclosamide. solut lysoitiin sitten 24 tuntia myöhemmin, ja sekä lusiferaasi ja β-galaktosidaasin aktiivisuudet määritettiin. lusiferaasiaktiivisuus normalisoitu β-galaktosidaasin aktiivisuus.

Apoptosis arviointi

Apoptoosi arvioitiin solukuolemaan havaitseminen ELISA kit ostettiin Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis. Tämä määritys havaitsee oligonukleosomeja vapautettiin kevyesti solun lyysin. Soluja viljeltiin T25-pulloihin halutun keston ajan. Käytetty alusta Kelluvia soluja sisältävä tallennettiin ja pidettiin jäillä. Kiinnittyneet solut kerättiin varovasti trypsinaation ja yhdistettiin kellukkeet varten pelletointi sentrifugoimalla. Varovaisen solujen lyysin puskurilla varustettu detektioreagenssipakkaus, solulysaatti käytettiin ELISA-testissä. Tulokset on normalisoitu proteiinipitoisuuden saatu rinnakkain pulloja, joissa solut on hajotettu käyttämällä puskuria, kuten edellä on kuvattu Western blotting.

Soluproliferaatiomääritys

Solut ympättiin 96-kuoppaisiin kudos- kulttuuri käsiteltiin mikrotiitterilevyillä tiheydellä 5000 solua /kuoppa kokonaistilavuudessa 50 ui. Yön yli inkuboinnin jälkeen solut käsiteltiin niclosamide 72 h lisäämällä 50 ui 2X kantaliuoksia sopiviin kuoppiin, joka sisälsi jo 50 ui solujen ja väliaineen altistaa solut lopulliset pitoisuudet niclosamide tarvitaan. Solujen elinkelpoisuus mitattiin solu-ainetiitteri Glo Assay (Promega).

Tilastot

Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen Studentin pariton t-testi. Tulokset esitettiin keskiarvona ± SD. Erot P 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Kiitokset

Kiitämme Meredith S. Plaxco ja Tommie A. Gamble käynnissä soluproliferaatiomäärityksissä ja tohtori Gail Johnson (University of Rochester) varten tarjoamalla GST-E kadheriinin cDNA.