Krooninen sairaus

tiivistelmä

MicroRNA-210 (miR-210), Master hypoxamir näyttelee pleiotrooppista rooleja tietyissä syövissä ; kuitenkin, sen rooli inhimillisen peräsuolen syöpä on edelleen epäselvä. Tässä me raportoimme että miR-210 on usein säädelty kolorektaalisyövässä kudoksissa, korkean miR-210 ilmentymisen merkittävästi korreloi suuri kasvaimen kokoa, imusolmuke etäpesäke, kehittyneet kliinisessä vaiheessa ja huonon ennusteen. Toiminnallisesti miR-210 yli-ilmentyminen edistää muuttoliikkeen ja invaasion peräsuolen syövän soluja. Lisäksi miR-210 voidaan indusoida hypoksia ja välittää hypoksian indusoiman etäpesäkkeiden paksusuolisyövän soluja. Lisäksi vakuoliin kalvo proteiini 1 (VMP1) tunnistetaan suoran ja toiminnallinen kohteena miR-210. Siten miR-210 on käyttökelpoinen biomarkkeri hypoksisia kasvainsoluja ja ennustetekijä joka on olennainen rooli peräsuolen syövän etäpesäkkeiden.

Citation: Qu A, Du L, Yang Y, Liu H, Li J, Wang L, et ai. (2014) Hypoksia-indusoituva MiR-210 on itsenäinen ennustetekijä ja edistää etäpesäkkeiden peräsuolen syövän. PLoS ONE 9 (3): e90952. doi: 10,1371 /journal.pone.0090952

Editor: Fabio Martelli, IRCCS-Policlinico San Donato, Italia

vastaanotettu: 19 syyskuu 2013; Hyväksytty: 06 helmikuu 2014; Julkaistu: 14 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Qu et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Natural Science Foundation of China (nro 81271916, 81301506); Shandongin maakunnassa Natural Science Foundation of China (nro ZR2010H004); Research Fund Tohtorikoulutuskeskuksen of Higher Education of China (nro 20120131110055) ja National Key kliininen Medical Specialties perusta. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on edelleen kolmanneksi yleisin maligniteetti maailmanlaajuisesti ja osuus viides suurin syy syöpään liittyvien kuolemaan Kiinassa [1]. Vaikka viimeaikaiset parannukset diagnoosimenetelmistä ja kliinisen hoidon ovat lisänneet varhaista havaitsemista CRC ja vähensi kuolleisuutta, noin 25% CRC potilailla esiintyy vaiheessa IV sairaus [1]. Lisäksi potilailla, joilla on edennyt sairaus usein kehittää uusiutuva sairaus Seuraavat pidennetyt radikaali asemointia siten osoittaa erittäin huono eloonjäämisasteesta johtuen etäpesäkkeiden [2], ja 5 vuoden postsurgical pysyvyys putoaa 90%: sta 10% tai jopa vähemmän, kun etäpesäke on tapahtunut . Yhä useammat tutkimukset ovat osoittaneet, että sekä kasvainsoluissa ja mikro-ympäristötekijät orchestrate kriittiset tapahtumat, jotka johtavat etäpesäke [3], mikä korostaa tarvetta ymmärtää kasvain microenvironment ja molekyylitason mekanismeja tuumorimetastaasissa.

Hypoksia tai alhainen happipitoisuus jännitteitä, on yhteinen piirre kiinteän kasvaimen microenvironment. Hypoksinen kasvaimet ovat yleensä aggressiivisempia, todennäköisesti etäispesäkkeitä, kestävät paremmin tavanomaisiin hoitoihin, ja jotka liittyvät huonoon ennusteeseen [4] – [6]. Geeni, joka koodaa HIF1 (hypoksia-indusoituva factor-1), joka koostuu HIF1α ja HIF1β alayksiköitä, on ehkä eniten tutkittu geeni, joka on olennainen rooli vastauksena hypoksia [7]. HIF1α on stabiili hypoksisissa olosuhteissa, sen ilme vähenee nopeasti alle happiolosuhteissa, kun taas HIF1β ilmentyy molemmissa olosuhteissa [8]. Näyttöä kertyy suhteen merkitystä HIF1α ilmentymisen erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia [9] – [11], ja nousi HIF1α ilmentyminen on viime aikoina raportoitu edistää paksusuolen syövän etäpesäkkeiden [12], [13].

MikroRNA (miRNA, MIRS) ovat uusi luokka endogeenisiä, pieni, ei-koodaavat RNA-oligonukleotidejä, jotka säätelevät geenin ilmentymistä kohdistamalla 3′-alueen (3′-UTR), vastaavan mRNA: n [14], [15]. Häiriöstä miRNA on tunnettu keskeinen prosessi patogeneesissä moniin syöpiin ja voi tapahtua milloin tahansa, aloittamisesta etäpesäkkeiden. On toiminnallinen yhteys hypoksia ja microRNA säätelyhäiriö syövässä. Esimerkiksi Chen H on raportoitu, että miR-103/107 lisättiin, kun läsnä on hypoksia ja se voi edistää hypoksia-stimuloidun etäpesäke CRC [16]. Monet MikroRNA, kuten miR-21, 93, 103, 107, 192, 195, 210, ja 213, voidaan saada aikaan, ja merkittävästi ajan säädellään HIF1α syöpäsoluissa hypoksisissa olosuhteissa [17], [18]. Niistä miRNA aiheuttama HIF1α miRNA-210 on näkyvin ja johdonmukaisesti sääteli miRNA aikana hypoksinen vaste erilaisissa kasvainsolujen ja normaalien solujen [19], [20]. Äskettäin Ying et ai. osoittivat, että hypoksian indusoima miR-210 voisi lisätä maahanmuuttoa ja hyökkäys maksasolusyövän (HCC) [21], ja Redova ja työtovereiden totesi, että downregulation miR-210 esti muuttavien ja invasiivisia potentiaalia munuaissolukarsinooma (RCC) [ ,,,0],22], Rothe raportoitu samankaltaisia ​​tuloksia rintasyövän [23]. Useimmat tutkimukset ovat osoittaneet, että miR-210 voi toimia kasvaimia synnyttävää miRNA ja liittyy huonoon ennusteeseen joissakin ihmisen epiteelisyöpien [21], [24] – [26]. Kuitenkin muutamat tutkimukset ovat osoittaneet, että miR-210 ilmentyminen menetetään aikana tumorigenesis ja että miRNA kohdistaa kasvain-vaimennin vaikutuksia ihmisten munasarjan epiteelin ja ruokatorven okasolusyöpä [27], [28]. Nämä tulokset osoittavat, että miR-210 voi olla ratkaiseva rooleja kasvaimen kehittymisen ja syövän etenemiseen ja voi käyttää erilaisia ​​vaikutuksia eri syöpiä. Vaikka se on raportoitu, että miR-210 ilmentyy ja suuresti säädellään ylöspäin vasteena hypoksia CRC solulinjoissa (HCT-116 ja HT-29), toiminto miR-210 kolorektaalisyövässä ei ole selvitetty tähän mennessä ja sen rooli peräsuolen syövän etenemisessä on edelleen epäselvä.

nykyisessä tutkimuksessa olemme keskittyneet miR-210, hypoksian aiheuttamaa miRNA, ja tutkitaan sen ilmentymistä ihmisen CRC kudoksissa, analysoinut korrelaatio kliinis ominaisuudet ja ennuste, ja sitten paljastui rooli miR-210 hypoksian aiheuttaman etäpesäkkeiden aikana peräsuolen syövän etenemisen.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaiden ja kudosnäytteiden

kudosnäytteitä, kuten kasvain kudosten ja viereisen ei-syöpä kudoksia, saatiin 193 CRC potilaiden leikkauksen aikana laitoksella General Surgery, Qilu sairaalan Shandong University, Jinan, Kiina, kesäkuusta 2003 helmikuuta 2008. kukaan potilaista oli yhä saanut kemoterapiaa, sädehoitoa tai leikkausta. Kaikki kudokset pantiin välittömästi nestemäiseen typpeen ja sitä jäädytettiin -80 ° C: ssa, kunnes RNA. Tutkimus hyväksyi eettinen komitea Qilu sairaalan, Shandongin yliopistossa, ja kirjallinen suostumus saatiin kunkin potilaan.

kliinis tiedot, kuten sukupuoli, ikä, kasvaimen sijainti, kasvain vaiheessa kasvaimen koko, paikallinen invaasio, histologisia erilaistumista ja imusolmuke etäpesäke kerättiin takautuvasti. Kesto seurannan laskettiin alkaen leikkauksen kuolemaan tai Viimeisimmässä seurannassa, ja saimme seurantaa huhtikuussa 2012. potilaita ei otettu analyysiin kliinis ominaisuuksista ja ennuste, jos heillä oli epätäydellinen potilastietoja tai riittämättömiä jatkotoimia.

Soluviljely

CRC solulinjoja (HT-29, SW480 ja SW620) ja HEK (ihmisen alkion munuainen) 293T solulinjaa ostettiin Type Culture Collection of Kiinan Academy of Sciences (Shanghai, Kiina), ja HCT116 solulinja hankittiin Shanghai Institute Biokemian ja Cell Biology (Kiina). Kaikki solulinjat viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM; Hyaline, Logan, UT), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Gibco, Carlsbad, CA) 37 ° C: ssa, 5% CO

2-inkubaattorissa. Aiheuttavan hypoksia, solut altistettiin tasaisesti alhaisen hapen kaasuseos (1% O

2, 5% CO

2, ja 94% N

2) kosteutetussa inkubointikammiossa (MiniGalaxy, RSBiotech, Irvine, Skotlanti).

RNA: n eristämistä, cDNA-synteesi ja kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR) B

Kokonais-RNA uutettiin käyttäen TRIzol-reagenssia (Invitrogen , Carlsbad, CA) valmistajan protokollan. Kaikki käsittelyt RNA tehtiin alle RNaasittomalla olosuhteissa. RNA-pitoisuus mitattiin käyttämällä BioPhotometer plus (Eppendorf, Hampuri, Saksa), 260 nm: ssä, ja eristettyjä RNA säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Analysointia varten HIF1α ja VMP1mRNA ilmaisun, kokonais-RNA (1 ug), tehtiin käänteistranskriptio cDNA: ksi käyttäen SuperScript-kittiä (Toyobo, Osaka, Japani), ja qRT-PCR-analyysit suoritettiin käyttämällä SYBR Green (Toyobo, Osaka, Japani) ja ABI PRISM 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Taitteen muutokset HIF1α ja VMP1 mRNA: n ilmentymisen kvantitoitiin käyttäen 2

-ΔΔCT suhteellinen kvantitointimenetelmä kanssa β-aktiini kuin taloudenhoito ohjaus. Alukkeet β-aktiinin (forward-aluke: 5′-TGGAGTCCTGTGGCATCCACGAAA-3 ’, käänteinen aluke: 5′-TGTAACGCAACTAAGTCATAGTCCG-3′), HIF-1α (forward-aluke: 5’-ATCGCGGGGACCGATT-3 ’, reverse-aluke: 5’ -CGACGTTCAGAACTTATCTTTTTCTT-3 ’) ja VMP1 (eteenpäin aluke: 5′-GAGATGCTGGAACATGCAGA-3′, käänteinen aluke: 5’-TTGCTCCACTATGTGCTTGC-3 ’) hankittiin BioSune, Shanghai, Kiina. Sillä miRNA ilmaisu, cDNA syntetisoitiin käyttämällä geenispesifisiä alukkeita (Ribobio, Guangzhou, Kiina) ja M-MLV RT (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 20 ul: n reaktiotilavuudessa. RT-reaktio reagenssien sisälsi 1 ug RNA: ta templaattina, 1 ui 10 mM dNTP-seosta, 2 ui 0,1 M DTT, 4 ui 5 x ensimmäisen juosteen puskuria, ja 1 ui 40 U /ul RNaasi-inhibiittoria. Tilavuus säädettiin RNA-vapaa H

2O. Käänteisen transkription Reaktio suoritettiin kolmena kappaleena poistaa mahdolliset poikkeavat. MiRNA ilmentyminen arvioitiin käyttämällä qRT-PCR ja ABI PRISM 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Taitteen muutokset miRNA ilmentyminen määritettiin käyttäen 2

-ΔΔCT menetelmä; ekspressio normalisoida pieni nukleaarinen U6-RNA (U6) ilmentymistaso. Lisäksi suhteellinen ilmentyminen miRNA, HIF1α ja VMP1 HT-29-solujen katkaissut kalibraattorimatriiseina kussakin aikavälillä ja asetettiin arvoon 1.

Transfektio miRNA /plasmidilla

CRC solut maljattiin tiheydellä 5 x 10

4 solua /kuoppa 24-kuoppaisille levyille tai 1,5 x 10

5 solua /kuoppa 6-kuoppalevyille ja viljeltiin noin 24 tuntia ennen transfektiota. Sen jälkeen, kun solut saavuttivat 50% konfluenssin, ohimenevä transfektio miRNA jäljittelee /inhibiittori (RiboBio, Guangzhou, Kiina) ja /tai plasmidi tehtiin käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) noudattaen valmistajan ohjeita. Kutakin koetta varten, transfektion tehokkuus arvioitiin qRT-PCR: llä 24 h transfektion jälkeen.

Migration and invasion määrityksissä in vitro

Transwell kammiot (halkaisija 6,5 ​​mm, huokoskoko on 8 um ) (Corning, NY, USA) päällystetty tai ilman matrigeelin (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) käytettiin toteuttavat siirtymisen ja invaasion määrityksissä. 24 h transfektion jälkeen, HT-29 (5 x 10

4-solut) tai SW480 (1 x 10

5-soluja) solut suspendoitiin uudelleen väliaineeseen, joka sisälsi 1% FBS: ää ja laitettiin päälle kammiossa Pakkauksiin. Alikvoottia, joka sisälsi 10% FBS: ää (500 ui) lisättiin alakammioissa. Kun oli inkuboitu 24 tuntia 37 ° C: ssa, solut kiinni alempaan kalvoon värjättiin 0,1% kristallivioletilla, kuvaamisen (200 x), ja laskettiin käyttäen IX81 käännettyä mikroskooppia (Olympus, Tokio, Japani).

Lusiferaasianalyysi

lusiferaasireporttiterilla määritys suoritettiin käyttäen pmiR-REPORTTM vektorit (RiboBio, Guangzhou, Kiina), joka sisälsi villin tyypin (WT) -VMP1 3′-UTR-sekvenssit tai mutantin (MUT) -VMP1 3 ”-UTR sekvenssit. HEK293T solut lyhytaikaisesti kotransfektoitiin miR-210 jäljittelee /miR-negatiivinen kontrolli ja WT-VMP1 3′-UTR vektori /MUT VMP1 3′-UTR vektori. Lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin käyttämällä Dual-Luciferase Assay Kit (Promega, Madison, WI) valmistajan ohjeiden 48 h transfektion jälkeen.

Western blot

Yhteensä proteiinia viljeltyjä soluja uutettiin RIPA puskuri, joka sisältää PMSF: ää. BCA-proteiinin määritys kit (Beyotime, Haimen, Kiina) käytettiin pitoisuuden määrittämiseksi. Proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-membraaneille. Blokkauksen jälkeen kalvo inkuboitiin hiiren anti-VMP1 polyklonaalista vasta-ainetta (Abcam, Southampton, UK) tai anti-β-aktiini-hiiren monoklonaalinen vasta-aine (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), jonka jälkeen inkuboitiin HRP-konjugoitua toissijainen vasta (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Signaalit määritettiin kemiluminesenssidetektiolla (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Tilastollinen

SPSS (Statistical Package for Social Sciences) ohjelmistopaketin, version 18,0 (Chicago, IL, USA), käytettiin analysoimaan kaikki tiedot. Ensin käytettiin Kolmogorov-Smirnov testi määrittää jakelun datan kunkin ryhmän. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta (SD) tai mediaani (kvartiiliväli), kun arvot normaalisti tai epänormaalisti jakautunut, vastaavasti. Tilastolliset erot ryhmien välillä testattiin käyttäen Mann-Whitney

U

-testi, Opiskelijan

t

-testi tai Kruskal-Wallisin testi tarvittaessa. Korrelaatio miR-210 ja HIF1α (tai VMP1) määritettiin Pearsonin korrelaatiota analyysi. Kaplan-Meier-menetelmää käytettiin arvioitaessa selviytymisen ja selviytymisen eroja alaryhmien tutkittiin käyttäen log-rank-testi. COX regressiomallin (Suhteellinen vaara malli) sovellettiin yhden muuttujan analyysiin ja monimuuttuja analyysiin ennustavat tekijät. Erot katsottiin tilastollisesti merkitsevä vain silloin, kun

P

0,05.

Tulokset

MiR-210 on usein säädelty vahvistavasti peräsuolen syövän kudoksissa ja mukana CRC kehittämiseen

ekspressiotasot miR-210 193 paria ihmisen CRC kudosten ja vastaavat ei-syöpäkudoksiin tutkittiin käyttäen qRT-PCR: ää. Sen varmistamiseksi, että viittaus geenin U6 ei vaihda kasvainkudoksissa ja vastaavat ei-syöpä kudoksiin, laskimme keskimääräinen Ct-arvoja, kuten 2

-ct. Taso U6 ei osoittanut merkittäviä eroja kasvaimen ja vastaavien ei-syöpä näytteistä (2

-CtTumor /2

-CtNon syövän = 0,93;

P

= 0,34) (kuva S1 ). Tulokset osoittivat, että miR-210 ilmentymisen CRC kudoksissa oli merkitsevästi säädelty verrattuna kuin viereisillä normaaleissa kudoksissa (

P

0,001, Fig. 1A). Lisäksi, 58% (111 193) näytteiden näytetään yli 2-kertainen ylössäätely miR-210 verrattuna ei-syöpä- kudosnäytteistä, mikä tarkoittaa, että yli-ilmentyminen miR-210 on yleinen tapahtuma CRC. Kontrolloidussa kokeessa, löysimme myös miR-21, toinen ilmentynyt miR CRC [29], oli merkitsevästi säädellään ylöspäin CRC kudoksissa verrattuna viereisen ei-tuumorikudoksista (

P

0,001, kuva S2 ), mikä vahvistaa toteutettavuus ja luotettavuutta menetelmän. Lisäksi HIF1α ilmentyminen CRC kudoksissa oli säädelty (

P

0,001; kuvio 1 D) ja korreloi positiivisesti miR-210 ilmentymisen CRC kudoksissa (r = 0,402,

P

1 (yli-ilmentymisen) ja -1 (ali); loput kertamuutoksia määriteltiin muuttumattomana. (C) yli-ilmentyminen miR-210 todettiin 58% (111 193) CRC kudosten verrattuna viereiseen ei-syöpäkudoksissa. (D) HIF1α mRNA: n ekspressio havaittiin CRC kudoksissa (CRC) ja viereisen ei-tuumori- kudoksiin (NT), ja sen ekspressio oli normalisoitu tasolle β-aktiinin ilmentymistä kunkin näytteen. (E) välinen korrelaatio miR-210 ilmaisun ja HIF1α mRNA tasot CRC kudoksissa analysoitiin käyttämällä Pearsonin korrelaatio analyysi. (F) Kaplan-Meier eloonjäämiseen käyrät mukaan tason miR-210 ilme. Potilaat, joilla on korkea miR-210 lauseke oli merkitsevästi huonompi 5 vuoden yleinen eloonjäämisaste kuin heikosti miR-210 lauseke (

P

0,001). Mediaani miR-210 ekspressiotaso kasvain näytteissä valittiin Ryntäysnopeus.

entisestään tiivistää yhdistys miR-210 ekspressiotasoja eri kliinis ominaisuuksia CRC kudoksissa ja totesi, että miR-210 ilmentyminen korreloi merkitsevästi suuren kasvaimen kokoa (

P

= 0,014), paikallinen invaasio (

P

= 0,047), positiivinen alueellisen imusolmuke etäpesäke (

P

= 0,001), ja TNM-luokitus (

P

= 0,005). Kuitenkin, ei ollut merkittäviä assosiaatioita miR-210 ilmaisun ja potilaan sukupuoli, ikä, kasvaimen sijainti, tai histologian arvosana (kaikki

P

0,05). Yksityiskohtaiset tulokset tilastollisten testien välillä miR-210 ilmaisun ja kliinis ominaisuudet on lueteltu taulukossa 1.

MiR-210 on itsenäinen ennustetekijöitä merkkiaine eloonjäämisaste CRC potilaiden

yhteensä 50 potilasta kuoli seuranta-aikana, ja kumulatiivinen 5 vuoden kokonaiselinaikaan oli 56,9%. Käyttäen mediaani miR-210 ekspressiotasot kuin sulku, jaoimme 116 CRC potilaat kahteen ryhmään: korkea miR-210 ilmaisun ryhmä ja matalan miR-210 ilmaisun ryhmä. Sitten käytimme Kaplan-Meierin eloonjääminen käyräanalyysi arvioida ennusteen arvioinnissa Mir-210 kolorektaalisyövässä. Tulokset osoittivat, että potilailla, joilla on korkea miR-210 lauseke oli merkitsevästi huonompi ennuste kuin heikosti miR-210 lauseke (

P

0,001, Fig. 1 F). Sen arvioimiseksi, miR-210 ilmaisu oli itsenäinen indikaattori kokonaiselinaika CRC potilaille, ensin soveltaneet univariate Coxin suhteellisen vaarat regressiomallin arvioida yksittäisten riskisuhde kaikille kliinis parametrit. Tulokset osoittivat, että kokonaiselossaoloaika oli merkittävästi liittyy miR-210 ekspressiotason (RR = 2,621; 95% CI, 1,457-4,712;

P

= 0,001) ja muut neljä parametrit (kasvaimen kokoa, paikallinen invaasio, alueellisella imusolmuke etäpesäke, ja TNM; kaikki

P

0,05). Vuonna Monimuuttuja-analyysissä Coxin suhteellisten riskien mallia, joihin liittyy viisi merkittävää ennustetekijöiden tunnistettu miR-210 ilmaisu itsenäisenä ennustetekijä potilaille, joiden CRC (

P

= 0,008). Tilastolliset arvot miR-210 ilmaisun ja muiden kliinis parametrit, jotka ovat peräisin Coxin suhteellisten riskien regressiomallia, on lueteltu taulukossa 2.

MiR-210 ilmentyy CRC solulinjoissa ja indusoi hypoksia CRC soluissa

tutki ilmentymistaso miR-210 paneelia CRC solulinjojen, kuten HCT-116, HT-29, SW620 ja SW480. Tulokset osoittivat, että taso miR-210 oli korkein HT-29-solujen verrattuna muihin kolmeen solulinjat, ja sen taso oli alhaisin SW480-soluissa (kuvio. 2A). Tämän perusteella ekspressiokuviota, siksi valitsimme HT-29 ja SW480 seuraavien tutkimuksissa. Kuten esitetty kuvassa 2D ja 2E, huomasimme, että miR-210 pinta nousi vastauksena hypoksia näissä soluissa. Lisäksi ilmaus miR-210 huomattavasti lisääntynyt pitkäaikainen altistuminen hypoksia, mikä osoittaa, että miR-210 oli todellakin indusoi hypoksia CRC solulinjoissa.

(A) MiR-210 ilmentyminen CRC solulinjoissa. (B, C) HIF1α mRNA: n ekspression HT-29 (B) ja SW480 (C) solut hypoksisissa olosuhteissa. (D, E) MiR-210 ilmentymisen HT-29 (D) ja SW480 (E) soluja hypoksinen olosuhteissa. Tiedot esitetään keskiarvona kolmesta mittauksesta, ja virhepalkit edustavat SD keskiarvon. *

P

0,05.

MiR-210 edistää CRC solumigraatioon ja invaasion ja välittää hypoksian aiheuttaman muuttoliikkeen ja invaasion CRC solujen

mittaamiseksi biologisia ominaisuuksia miR-210 CRC-soluissa, olemme ohimenevästi moduloida miR-210 ekspressiotaso transfektoimalla miR-210 jäljittelee tai inhibiittori. Kuten on esitetty kuviossa 3, transfektion tehokkuus oli hyvin korkea HT-29 ja SW480 solulinjat. TranswellTM kokeiluja tai ilman matrigeelin tehtiin testata vaikutusta miR-210 CRC solumigraatioon ja invaasiota, ja huomasimme, että säätelyä miR-210, jonka miR-210 jäljittelee parannettu migraation ja invaasion kyky CRC-soluissa (kuvio . 4A, 4C). Mukaisesti nämä tulokset, transfektio MIR-210 estäjä johti vähentynyt merkittävästi muuttoliikkeen ja hyökkäys kyky CRC solujen verrattuna soluihin transfektoitu miR negatiivinen kontrolli (Fig. 4B, 4D). Yhdessä meidän havaintojen mukaan miR-210 voisi edistää muuttoliikettä ja hyökkäys kyky CRC soluja.

(A, C) MiR-210 ilmentymisen HT-29 (A) ja SW480 (C) solujen huomattavasti transfektion jälkeen MIR-210 jäljittelee. (B, D) MiR-210 ilmentymisen HT-29 (A) ja SW480 (C) solut pieneni suuresti transfektion jälkeen MIR-210-estäjän. Tiedot esitetään keskiarvona kolmesta mittauksesta, ja virhepalkit edustavat SD keskiarvon. *

P

0,05 verrattuna vastaavaan negatiiviseen kontrolliin.

(A, B) Transwell muuttoliike määritykset HT-29 ja SW480-soluja suoritettiin transfektion jälkeen luki- 210 jäljittelee (A) tai estäjä (B). (C, D) Transwell hyökkäys määritykset HT-29 ja SW480-soluja suoritettiin transfektion jälkeen MIR-210 jäljittelee (C) tai inhibiittori (D). Kaikki paneelit, tulokset edustavat vähintään kolmen riippumattoman kokeen. NC, negatiivinen kontrolli.

Koska olemme osoittaneet miR-210 voisi lisätä maahanmuuttoa ja hyökkäyksen mahdollisuudet CRC soluja, me arveltu, että miR-210 voi myös välittää hypoksian aiheuttaman muuttoliikkeen ja invaasion CRC solujen . Vahvista Tämän hypoteesin, suoritimme siirtokuoppaan määrityksiä tutkimaan muuttoliikkeen ja hyökkäyksen mahdollisuudet CRC solujen hypoksisissa olosuhteissa ja totesi, että maahanmuutto ja hyökkäys kyky näiden CRC solut lisääntyivät merkitsevästi verrattuna soluja normoxic olosuhteissa. Lisäksi transfektio MIR-210 estäjä dramaattisesti vähentynyt muuttoliike ja hyökkäys kyky hypoksia CRC soluja, kun taas transfektio MIR-210 jäljittelee entisestään migraation ja invaasion kyky CRC solujen (Fig. 5). Edellä esitetyt tulokset osoittavat, että miR-210 on tärkeä rooli hypoksian aiheuttaman muuttoliikkeen ja invaasion CRC soluja.

(A, B) TranswellTM maahanmuutto ja invaasion määritykset HT-29 ja SW480-solut tehtiin sen jälkeen, kun transfektio miR-210 jäljittelee tai negatiivinen kontrolli (NC) alle normoxic tai hypoksinen olosuhteet. (C, D) TranswellTM maahanmuutto ja invaasion määritykset HT-29 ja SW480-solut tehtiin transfektion jälkeen MIR-210 estäjän tai negatiivisen kontrollin alla normoxic tai hypoksinen olosuhteet. Kaikissa paneelit, tulokset edustavat vähintään kolmen itsenäisen kokeen.

VMP1 on välittömänä kohteena miR-210

TargetScan tunnistaa, että 3′-UTR VMP1 sisältää ennustetun sitoutumiskohdan miR-210 (Fig. 6A). Lusiferaasiaktiivisuus määritys osoitti, että miR-210 inhiboi merkittävästi lusiferaasin aktiivisuus WT 3′-UTR, mutta ei Mut 3′-UTR VMP1 in HEK293T-soluissa (kuvio. 6B). Lisäksi yli-ilmentyminen miR-210 inhiboi merkittävästi VMP1 mRNA ja proteiini tasoilla HT-29 ja SW480-soluissa (kuvio. 6C, 6D) ja VMP1 tasoa korreloi käänteisesti miR-210 ilmentymisen ensisijaisen CRC kudoksissa (r = -0,318,

P

0,01; Fig. 6E). Nämä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että miR-210 säätelee negatiivisesti VMP1 ilmentyminen suoraan kohdentamalla sen 3′-UTR-sekvenssit.

(A): n oletettu miR-210 sitovia sekvenssejä VMP1 3′-UTR. (B) Lusiferaasiaktiivisuutta määritys suoritettiin varten HEK293T solut kotransfektoitiin pmiR-SELVITYS ™ sisältävät vektorit WT-VMP1 3′-UTR tai MUT-VMP1 3′-UTR-sekvenssit ja miR-210 jäljittelee. Tulokset on esitetty normalisoitu kertainen muutos lusiferaasiaktiivisuus. (C, D) VMP1 mRNA: ta ja proteiinia, määritettiin HT-29-solujen ja SW480-solut transfektoitiin miR-210 jäljittelee tai miR-negatiivinen kontrolli, jonka qRT-PCR: llä ja Western blot, vastaavasti. (E) käänteinen korrelaatio miR-210 ilmaisun ja VMP1 mRNA tasot CRC kudoksissa analysoitiin käyttämällä Pearsonin korrelaatio analyysi.

yli-ilmentyminen VMP1 osittain kääntää muuttoliike ja invaasion CRC solujen aiheuttama miR-210

Sen määrittämiseksi, onko VMP1 on mukana miR-210 indusoi etäpesäke CRC-solujen, teimme pelastus määrityksissä. Kuten kuviossa 7 on esitetty, miR-210 jäljittelee voisi lisätä metastaattista kykyä CRC-solujen ja laski metastaattista potentiaalia havaittiin VMP1 yli-ilmentäviä soluja verrattuna kontrollisoluihin. Lisäksi samanaikainen yli-ilmentyminen miR-210 ja VMP1 voisi osittain kumota miR-210 aiheuttama metastaattista potentiaalia CRC soluissa. Nämä tulokset osoittavat, että miR-210 voi edistää CRC solumigraation ja invaasiota kohdistamalla VMP1.

(A, B) TranswellTM maahanmuutto- ja invaasion määritykset suoritettiin VMP1 yliekspressoivia HT-29-solujen kotransfektoitu miR-210 matkii tai negatiivinen kontrolli. (C, D) TranswellTM maahanmuutto- ja invaasion määritykset suoritettiin VMP1 yliekspressoivia SW480-solujen kotransfektoitu miR-210 jäljittelee tai negatiivinen kontrolli. Kaikissa paneelit, tulokset edustavat vähintään kolmen itsenäisen kokeen.

Keskustelu

Hypoksia on vallalla ominaista useimpien kiinteiden kasvainten, ja vankka hypoksian aiheuttaman miRNA, miR-210 on tällä hetkellä pidetä ”master miRNA” on hypoksiavaste [15]. Näin ollen on tärkeää tutkia mahdollisuuksia roolit miR-210 kiinteässä syövän etenemiseen, sillä tämä miRNA on osoittautunut avainasemassa kehitettäessä syövän hypoksisissa olosuhteissa [21], [30]. Tuloksemme ovat ensimmäisiä todisteita siitä, että miR-210 yliekspressoituu CRC kudoksissa ja toimii avaintekijä etenemistä CRC.

säädeltyyn ilmentyminen miR-210 on kiistatta osoitettu eri ihmisen syöpäsairauksia. Cai et al. osoittivat, että miR-210 ilmentyminen oli merkitsevästi suurempi lapsipotilailla osteosarkooman potilaiden ja oli merkitsevästi yhteydessä aggressiivinen kliinis-ja huono ennuste [31]. Kuitenkin Tsuchiya [32] kertoi, että miR-210 ilmentyminen oli merkittävästi vaimentua, jos potilaalla on huonosti eriytetty ruokatorven okasolusyöpä. Sen sijaan, Greither et ai. [33] ilmoitti, ettei ollut tilastollisesti merkitseviä korrelaatioita miR-210 ilmaisun ja voimakkaita kliinis-in pehmytkudossarkooman. Nämä ristiriitainen havainnot voidaan selittää eri rooleja, jotka miR-210 voisi olla patogeneesin eri syöpiä. Täällä me havainneet selvästi ylössäätely miR-210 ilmentymisen CRC kudoksissa, ja miR-210 yliekspressio korreloi merkitsevästi aggressiivinen kliinis-, kuten suuri kasvaimen kokoa, positiivinen alueellisen imusolmuke etäpesäke, paikallinen tuumori-invaasio, ja kehittynyt kliininen vaiheessa. Olemme myös havainneet, että miR-210 taso korreloi positiivisesti HIF1α ilme, joka liittyi etäpesäkkeiden ja epäsuotuisa ennuste CRC [12], [13]. Nämä havainnot osoittivat, että miR-210 voi olla tärkeä rooli kehitettäessä asteittain fenotyypin CRC.

Mitä selviytymisen, yhden ja usean analyysit tehtiin tutkia mahdollisuuksia ennustetekijöiden arvo miR-210 CRC . Tulokset yhden muuttujan analyysi osoitti, että potilailla, joilla on korkeampi miR-210 tasoilla ollut huonompi ennuste kuin alemman miR-210 tasolla. Lisäksi tulokset Monimuuttuja-analyysissä ja Coxin suhteellisten riskien regressiomallia, osoitti, että miR-210 oli itsenäinen ennustetekijä yleistä potilaan selviytymisen leikkauksen jälkeen. Nämä tulokset ovat yhtäpitäviä tutkimusten raportoimat Camps et al. rintasyövässä [34] ja Gee et al. pään ja kaulan alueen syöpä [35]. Yhdessä tulokset, nämä havainnot osoittavat, että miR-210 voisi olla lupaava ennustetekijöiden merkitsin tunnistaa potilaat, joilla on huono ennuste.

toiminnallinen etsintä miR-210 osoitti, että miR-210: lla keskeinen rooli monissa solun prosessien fysiologiset ja pahanlaatuisten sairauksien. MiR-210 voi olla osallisena punasolujen ja voi myös edistää adipogeneesi [36], [37]. Kaikkein jatkuvasti ja voimakkaasti säädelty miRNA hypoksisissa olosuhteissa, miR-210 säätelee monia näkökohtia hypoksian reittejä, kuten angiogeeninen vaste endoteelisolujen hypoksia [38]. Johdonmukaiset tulokset ovat osoittaneet, että jopa säädelty ilmentyminen miR-210 on osallisena hypoksia /VEGF-signalointireitin rintasyövän [34]. Vuonna epiteelin munasarjasyöpä kuitenkin miR-210 on usein poistetaan ja voi solusyklin etenemisen [27].

Tässä tutkimuksessa havaittiin, että yli-ilmentyminen miR-210 merkittävästi edistänyt muuttoliike ja hyökkäys CRC-soluja. Tuloksemme tarkoita, että miR-210 toimii onkogeenisessä miRNA ihmisen peräsuolen syövän edistää etäpesäkkeiden, joka on sopusoinnussa havaintojen aikaisempien tutkimusten [21] – [23]. Olemme myös vahvistaneet aikaisempia havaintoja, jotka osoittivat, että miR-210 oli säädelty vahvistavasti CRC soluissa vastauksena hypoksia ja että miR-210 aiheutettiin ajasta riippuva tavalla. Nämä tulokset osoittavat, että miR-210 on myös hypoksinen markkeri CRC potilaille, koska se on muiden syöpien, kuten pään ja kaulan alueen syöpä [35]. Lisäksi olemme havainneet, että miR-210 välitti hypoksian aiheuttaman muuttoliikkeen ja invaasion CRC soluja. Näin ollen, sen lisäksi, että roolit mukauttaminen kasvainsolujen alhainen hapen stressiä ja markkerina kasvaimen hypoksia, ehdotamme, että kohonneet miR-210 voi olla biologisia toimintoja, jotka liittyvät pahanlaatuisuuden ja etäpesäkkeiden kasvainten, mahdollisesti selittää Siksi miR-210 on liitetty huonoon ennusteeseen syöpäpotilailla. Edelleen tutkimus paljasti, että VMP1 oli toiminnallinen alavirran kohde miR-210 CRC. VMP1 on transmembraani- proteiini, joka sijaitsee solunsisäisen onteloita, jotka on alun perin kuvattu proteiini, joka liittyy akuutti haimatulehdus [39].