Krooninen sairaus

tiivistelmä

Epidemiologiset tutkimukset ovat osoittaneet, että säännöllinen käyttö ei-steroidiset tulehduskipulääkkeet (NSAID) lääkkeet liittyy pienempi riski eri syöpiä. Lisäksi in vitro ja kokeissa hiiren malleissa on osoitettu, että NSAID: t vähennys kasvaimen aloittamista ja /tai etenemisen useita syöpiä. On kuitenkin olemassa rajoitetusti prekliinisissä tutkimuksissa vaikutusten tutkiminen tulehduskipulääkkeiden munasarjasyöpä. Täällä olemme tutkineet vaikutuksia kahdessa tulehduskipulääkkeiden, diklofenaakki ja indometasiini, munasarjasyövän solulinjoissa ja vierassiirrännänmallissa hiirimallissa. Diklofenaakki ja indometasiini hoito laski solukasvua aiheuttamalla solukierron pysähtymisen ja apoptoosin. Lisäksi diklofenaakin ja indometasiinia vähensi kasvainten tilavuus ksenograftimallia munasarjasyöpään. Jotta voitaisiin tunnistaa mahdolliset molekyyli polkuja vaikutukset välittyvät NSAID hoidon munasarjasyövän, suoritimme mikrosiruanalyysi munasarjasyövän solujen käsitelty indometasiinin tai diklofenaakki. Mielenkiintoista, useat geenit löytyi vaimentua seuraavat diklofenaakin tai indometasiinin hoito ovat transkription kohdegeenien E2F1. E2F1 säädeltiin vähentävästi mRNA ja proteiini tasolla käsittelemällä diklofenaakin ja indometasiini, ja yli-ilmentyminen E2F1 pelastettu solujen kasvua estäviä vaikutuksia diklofenaakin ja indometasiinia. Lopuksi NSAID diklofenaakin ja indometasiinia aiheuttavat antiproliferatiivinen vaikutus munasarjasyövän in vitro ja in vivo ja vaikutukset NSAID voi välittää, osittain downregulation E2F1.

Citation: Valle BL, D ’Souza T, Becker KG, Wood WH III, Zhang Y, Wersto RP, et al. (2013) steroideihin kuulumattomien tulehduskipulääkkeiden Vähennä E2F1 Expression ja estävät solujen kasvu munasarjasyöpäsoluja. PLoS ONE 8 (4): e61836. doi: 10,1371 /journal.pone.0061836

Editor: Resham Bhattacharya, Mayo Clinic, Yhdysvallat

vastaanotettu: 18 tammikuu 2013; Hyväksytty: 25 helmikuu 2013; Julkaistu: 24 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Valle et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat kokonaan Intramural tutkimusohjelma National Institutes of Health, National Institute on Aging. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjasyöpä on johtava kuolinsyy mukaan gynekologiset syöpäsairauksia. Kun havaitaan varhaisessa vaiheessa, 5 vuoden pysyvyys on peräti 90%, mutta valitettavasti suurin osa tapauksista diagnosoidaan myöhäisvaiheen sairaus, joka on usein resistentti tavanomaisille kemoterapiaa. Näin ollen kokonaisuutena 5 vuoden pysyvyys munasarjasyövän on noin 30-40%. Siksi on välttämätöntä tutkia uusia lähestymistapoja hoitoon ja hallintaan tätä tappavaa tautia.

Epidemiologiset tutkimukset ovat osoittaneet, että säännöllinen käyttö ei-steroidiset tulehduskipulääkkeet (NSAID) lääkeaineiden liittyy pienempi riski erilaisten syöpien, mukaan lukien peräsuolen syöpä, rintasyöpä, keuhkosyöpä ja munasarjasyövät [1], [2], [3]. Lisäksi in vitro ja eläinkokeet ovat osoittaneet, että NSAID voi vähentää aloittamista ja /tai eteneminen useiden syöpien [4], [5], [6]. Esimerkiksi NSAID indometasiini inhiboivat kemiallisesti indusoidun paksusuolen syöpien rotilla [7], [8]. Lisäksi indometasiini vähensi kasvua uusien ja vakiintuneiden spontaaneja nisäkasvaimia [9]. NSAID diklofenaakin vähensi kasvua haiman ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä ksenograftien [10], [11]. On kuitenkin olemassa rajoitetusti prekliinisissä tutkimuksissa vaikutusten tutkiminen ja toimintamekanismit diklofenaakin ja indometasiinia munasarjasyövän [12], [13]. Tässä suhteessa Zerbini et. al. kertoi, että diklofenaakki laski kasvaimen tilavuuden SCID-hiirissä kanssa munasarjasyöpäsolu SKOV-3 ksenografteissa by -20% [12]. Kuitenkin toinen tutkimus kertoo, että indometasiini ei ollut vaikutusta kasvuun munasarjojen retikulaarisen lusarkooma M5076 [13].

Tietääksemme ei ole raportteja vaikutuksista indometasiinia erityisesti epiteelin munasarjasyövän, joka käsittää suurin osa munasarjojen syöpien (noin 90%). Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet vaikutuksia NSAID diklofenaakin ja indometasiinia munasarjasyöpäsoluja. Me raportoimme, että NSAID vähentää merkittävästi munasarjasyövän solujen kasvua in vitro ja in vivo, ja, käyttäen microarray-analyysi, olemme tunnistaneet transkriptiotekijän E2F1 välittäjänä tämän vaikutuksen. Mikä tärkeintä huomasimme, että kohdunulkoinen E2F1 ilmaisun päinvastainen kasvua estäviä vaikutuksia tulehduskipulääkkeiden viittaa siihen, että NSAID voisi toimia osittain mekanismilla, johon E2F1 downregulation in munasarjasyöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausuma

Kaikki menettelyt suoritetaan hiirillä hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitea National Institute on Aging. Tämä tutkimus suoritettiin mukaisesti Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals of National Institutes of Health.

reagenssit

diklofenaakki ja indometasiini ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis , MO). Anti-E2F1, anti-E2F4, anti-MCM2, ja anti-MCM4-vasta-aineet hankittiin Proteintech (Chicago, IL). Vasta-aineiden Abcam (Cambridge, MA) tunnustettu GAPDH, ja vasta-aineet Cell Signaling (Danvers, MA) tunnustettu Rb. E2F1 ja eGFP ekspressioplasmidit olivat GeneCopoeia (Rockville, MD). Rb siRNA (sc-29468) oli Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA).

Soluviljely ja transfektiot

serous munasarjan adenokarsinooma solulinjoissa HEI, OVCAR5 ja UCI-101 oli ystävällisesti säädettiin seuraavaa: Hey solut Dr. Robert C. Bast [14], OVCAR5 solut Dr. Thomas C. Hamilton [15] ja UCI-101-solujen Dr. Michael J. Birrer [16]. Soluja viljeltiin McCoyn 5A-viljelyväliaineeseen, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia ja Pen /Strep (100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä), ja niitä inkuboitiin 37 ° C: ssa ilmakehässä, jossa oli 5% CO

2 . Kaikki kokeet suoritettiin seerumin sisältävässä väliaineessa.

transfektioiden HEI-soluja ympättiin tiheydellä 5 x 10

4 solut 12-kuoppalevyille ja transfektoitiin ohimenevästi E2F1 tai eGFP kontrollina; tai Rb siRNA tai ohjaus siRNA: ssa 24 tuntia, käyttäen X-treme Gene 9 DNA transfektio Reagent (Roche) tai Lipofectamine 2000 (Invitrogen), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Sitten solut maljattiin uudelleen tiheydet 5 x 10

3 solut 6-kuoppalevyille ja käsitelty 24-48 tuntia 300 uM diklofenaakin tai indometasiinin. Sitten solut hajotettiin ja analysoitiin immunoblottauksella tai pestään ja käytetään klonogeeniset määrityksissä.

MTS ja klonogeeniset määrityksissä

MTS luelinkykymäärityksillä (Promega), hei, OVCAR5 tai UCI-101-solut ympättiin tiheyteen 7 x 10

3 soluja 96-kuoppalevyille ja käsitelty 48 tunnin ajan 300 uM diklofenaakin tai indometasiinin. Sitten soluja inkuboitiin MTS reagenssien ja absorbanssi 490 nm: ssä mitattiin 1-4 tunnin inkuboinnin jälkeen 37 ° C: ssa. Annoksesta riippuvuus elinkelpoisuuden määritykset, soluja käsiteltiin 24 tuntia kasvavilla pitoisuuksilla diklofenaakin tai indometasiinin (50, 100, 250, ja 500 uM). Sillä klonogeenisten määrityksissä, hei, OVCAR5 tai UCI-101-soluja ympättiin tiheydellä 3 x 10

3-solujen 6-kuoppaisilla levyillä ja käsiteltiin 48 tunnin ajan 300 uM diklofenaakin tai indometasiinin, pestiin ja niiden annettiin kasvaa 10 päivää. Pesäkkeet sitten näkyviin värjäämällä kristallivioletilla (0,5% kristalliviolettia 50% metanolia).

Solusykli ja apoptoosin analyysi

ja käsiteltiin 24 tai 48 tuntia 300 uM diklofenaakin tai indometasiinin . Solut leimattiin propidiumjodidilla ja analysoitiin FACS Caliber -virtaussytometrillä (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Analysoimiseksi apoptoosin, soluja käsiteltiin 48 tai 96 tuntia 300 uM diklofenaakin tai indometasiinin. Apoptoosi ja DNA-pitoisuus analysoitiin BrdU ja propidiumjodidivärjäys käyttämällä Apo-BrdU Kit (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA) ja analysoitiin LSR-II Flow Cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA).

Eläinkokeet

Nainen 7-8 viikkoa kateenkorvattomia nude hiiret saatiin Harlan Laboratories (Frederick, MD) ja kaikki kokeet tarkistanut ja hyväksynyt NIA IACUC.

HEI soluja ( 1,5 × 10

6) injektoitiin subkutaanisti molemmat paljaiden hiirien kylkiin. Sillä diklofenaakki tutkimuksessa hiiret satunnaistettiin 2 ryhmään: kontrolli (PBS) tai diklofenaakkia (18 mg /kg); 6 hiirtä ryhmää kohti. Hiiriin injektoitiin vatsakalvonsisäisesti kahdesti viikossa 4 viikon ajan aloittaen 3 päivää sen jälkeen, kun solujen injektiosta. Kasvaimet mitattiin kahdesti viikossa, alkaen viikolla 1, mittaharpilla ja W

2L /2 [17], joita käytetään laskettaessa tuumorin tilavuuden. Sillä indometasiini tutkimuksessa hiiret satunnaistettiin 2 ryhmään: kontrolli (vesi) tai indometasiinin (2,5 mg /kg); 5 hiirtä ryhmää kohden. Indomethacin annettiin päivittäin juomavedessä 6 viikkoa, joka alkaa seuraavana päivänä solujen injektion. Kasvaimet mitattiin kahdesti viikossa, alkaen viikolla 3, mittaharpilla ja W

2L /2 [17], joita käytetään laskettaessa tuumorin tilavuuden. Tiedot esitetään keskiarvoina ± keskivirhe. Pitoisuudet diklofenaakkia ja indometasiinia käytetään tässä tutkimuksessa samankaltaisia ​​muille, jotka on aiemmin osoitettu olevan tehokas ja hyvin siedetty hiirillä [4], [10], [11], [18].

mikrosiruanalyysi

HEI, OVCAR5 ja UCI-101-solut ympättiin 60 mm ruokia ja käsiteltiin 24 tunnin ajan 300 uM diklofenaakin tai indometasiinin. RNA eristettiin käyttäen RNeasy-kittiä (Qiagen, Valencia, CA). Kokonais-RNA: ta käytettiin biotiinileimattua cDNA käyttäen Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit (Ambion, Grand Island, NY) ja analysoitiin Illumina mikrosiruja (Illumina n Sentrix HumanRef-8 Expression BeadChips) on Microarray Core Facility (National Institute on Aging). Jokaisella BeadChip on 24.000 hyvin selityksin RefSeq transkriptien jossa keskimäärin 30-kertainen redundanssin. Geenit, jotka olivat eri tavoin ilmaistuna 2-kertaisesti tai enemmän kaikissa kolmessa solulinjoissa tunnistettiin ja joissakin näistä geeneistä on valittu tarkempaa analysointia varten. Microarray data on toimitettu NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) tietokannasta (Liittymisnumero GSE45052).

Real-Time RT-PCR

HEI, OVCAR5, ja UCI-101-soluja hoidettiin 24 tunnin 300 uM diklofenaakin tai indometasiinin. RNA eristettiin käyttäen RNeasy Kit ja 1 ug kokonais-RNA: ta käytettiin cDNA-käyttäen Taqman Reverse Transcription Reagenssit (PE Applied Biosystems). PCR-monistamiseen ja määrän, SYBR Green I määritys ja GeneAmp 7300 Sequence Detection System (PE Applied Biosystems) käytettiin. Vertailevaa CT-menetelmää käytettiin määrittämään suhteellinen ilmentymistaso geenien kunkin NSAID käsitelty näyte n CT-arvo käsittelemätön näyte (PE Applied Biosystems) ja GAPDH-arvoja käytettiin normalisoimaan [19]. Sekvenssit alukkeiden ovat saatavilla tekijöistä.

immunoblottauksella

Solut pestiin ja solulysaatit valmistettiin lyysipuskurissa (150 mM Tris-HCl, pH 6,8, 25% glyserolia, ja 5% SDS). Solulysaatit erotettiin SDS-PAGE 4-12 tai 10-20% Tris-glysiini-geeleissä ja siirrettiin PVDF-membraaneille. Membraanit blokattiin TBS-T + 5% rasvatonta maitojauhetta, ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa vasta-aineilla, jotka ovat spesifisiä ilmoitettu proteiineja. Pesun jälkeen kalvot, ne inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita. Proteiini tunnistus suoritettiin tehostetun kemiluminesenssin (Amersham, Pittsburgh, PA).

Tilastot

Wilcoxonin testi suoritettiin sen määrittämiseksi merkitystä hiiren tutkimuksissa. Kaikki muut analyysit, Yksisuuntainen ANOVA ja Dunnettin monivertailutesti suoritettiin. Kaikki tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen Graph Pad Prism 3 -ohjelmiston.

Tulokset

tulehduskipulääkkeiden väheneminen elinkelpoisuutta munasarjasyövän solujen annosriippuvaisesti

Voit selvittää NSAID voisi vähentää kasvua munasarjasyöpäsoluja in vitro, käsittelimme solulinjat HEY, OVCAR5, ja UCI-101 kanssa NSAID diklofenaakin ja indometasiinia. 48 tunnin kuluttua hoidon, diklofenaakki ja indometasiini vähentää solujen määrä yli 50% käsitellyssä solulinjoissa suhteessa hoitamattomiin väestön kolmessa eri munasarjasyövän solulinjoissa (kuvio 1A). Näiden vaikutus NSAID olivat annoksesta riippuvaisia, kuten kasvavien pitoisuuksien diklofenaakin tai indometasiinin edelleen vähensi elinkykyisten solujen (kuvio 1 B). Lisäksi, diklofenaakki ja indometasiini vähensi pesäkkeitä muodostavien kyky munasarjasyövän soluja (kuvio 1C).

A) HEI, OVCAR5 tai UCI-101 soluja käsiteltiin 48 tunnin ajan 300 uM diklofenaakin tai indometasiinin. Sitten soluja inkuboitiin MTS reagenssien ja absorbanssi 490 nm: ssä mitattiin 1 tunnin inkuboinnin 37 ° C: ssa. Keskiarvo 3 kokeesta. Tilastollinen merkitys on edustettuina seuraavasti: * p 0,05 ja *** p 0,001. B) Soluja käsiteltiin 24 tunnin ajan osoitettujen konsentraatioiden diklofenaakin tai indometasiinin. Solujen elinkelpoisuus mitattiin käyttäen MTS-määritystä. Keskiarvo 3 kokeesta. Tilastollinen merkitys on edustettuina seuraavasti: * p 0,05 ja *** p 0,001. C) Soluja käsiteltiin 48 tunnin ajan 300 uM diklofenaakin tai indometasiinin, pestiin ja niiden annettiin kasvaa yhteensä 7-14 päivää. Sitten solut värjättiin kristallivioletilla. Kuva näkyy edustaa 3 kokeen.

diklofenaakki ja indometasiini edistää solukierron pysähtymisen ja apoptoosin munasarjasyöpäsoluja

Koska diklofenaakki ja indometasiini pienentää munasarjasyövän solujen kasvua, halusimme selvittää onko tämä lasku johtui muutoksista solusyklin. Diklofenaakki ja indometasiini indusoiman solusyklin pysähtymisen kaikki 3 munasarjasyövän solulinjoissa tutkittiin, kuten havaitaan propidiumjodidivärjäys 48 tunnin kuluttua hoidon (kuvio 2A). Kaksi NSAID oli erilaiset vaikutukset solusyklin, kuten diklofenaakin aiheuttamaa kertyminen solujen S-vaiheeseen ja G2, kun indometasiinia aiheuttama G1 pidätyksen kaikissa kolmessa munasarjasyövän solulinjoissa tutkittiin. Havaitsimme myös sub-G1 populaatio soluja UCI-101 soluja käsiteltiin diklofenaakin ja indometasiinia ja HEI käsitellyissä soluissa indometasiinin, mikä viittaa lisääntynyt apoptoosi. Sen määrittämiseksi, ovatko nämä solut läpikäyvät apoptoosin käsittelemällä tulehduskipulääkkeiden, käsittelimme solut diklofenaakin tai indometasiinin 48 tai 96 tuntia ja mitataan DNA: n fragmentoituminen Apo-BrdU värjäystä. Kuten on esitetty kuviossa 2B, UCI-101-solujen apoptoosia käsittelemällä sekä NSAID, kun taas HEI solujen apoptoosia vain indometasiinin (kuvio 2B). OVCAR5 ei apoptoosiin 4 päivän kuluttua hoidon NSAID. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että NSAID vähentää munasarjasyövän solujen kasvua indusoimalla solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin.

A) HEI, OVCAR5 ja UCI-101-soluja käsiteltiin 24 tunnin ajan 300 uM diklofenaakin tai indometasiinin. Solut leimattiin propidiumjodidilla ja analysoitiin FACS Caliber -virtaussytometrillä. Kuva näkyy edustaa 4 kokeiluja. B) Soluja käsiteltiin 48 tai 96 tuntia 300 uM diklofenaakin tai indometasiinin. Apoptoosi ja DNA-pitoisuus analysoitiin BrdU ja propidiumjodidivärjäys käyttämällä Apo-BrdU kit. Solut ylemmässä neljänneksessä laatikko (P3 portti) edustavat apoptoottisten väestöä.

NSAID vähentää kasvua HEI nude-hiirissä

Voit selvittää NSAID voisi estää kasvaimen kasvua in vivo, me käytetyt munasarjasyöpäsolu ksenografti hiirimallissa nude-hiirissä. HEI solut injektoitiin subkutaanisesti sekä paljaiden hiirien kylkiin ja satunnaistettiin 2 ryhmään: kontrolli (PBS) tai diklofenaakkia (18 mg /kg), ruiskutettiin intraperitoneaalisesti kaksi kertaa viikossa, 4 viikkoa. Kuten havaitaan, diklofenaakki vähensi merkitsevästi (p = 0,016), kasvua HEI nude-hiirissä (kuvio 3A). Keskimääräinen kasvaimen tilavuus diklofenaakki-käsitelty ryhmä väheni 33%, verrattuna kontrolliryhmään. Vaihtoehtoisesti, hiiret satunnaistettiin ohjaus (vesi) tai indometasiinin (2,5 mg /kg) ryhmille, ja huumeiden annetaan päivittäin juomavedessä 6 viikkoa. Kuten havaitaan, indometasiinia merkitsevästi (p = 0,031) pienensi kasvua HEI nude-hiirissä (kuvio 3B). Keskimääräinen kasvaimen tilavuus väheni merkittävästi 22% ryhmässä, jota käsiteltiin indometasiinin verrattuna kontrolliryhmään. Lisäksi hiiret indometasiini hoidetussa ryhmässä on kehitetty vähemmän kasvaimia kuin kontrolliryhmässä, 5 ja 9. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että NSAID: t vähentävät munasarjojen syöpäsolujen kasvua in vivo.

HEI-soluja (1,5 x 10

6) injektoitiin subkutaanisti sekä paljaiden hiirien kylkiin. A) Hiiret satunnaistettiin 2 ryhmään: kontrolli tai diklofenaakki (18 mg /kg). Hoito aloitettiin kolmen päivän kuluttua solujen injektion ja sen annettiin vatsakalvonsisäisesti kahdesti viikossa 4 viikon ajan. Kasvaimet mitattiin kahdesti viikossa, alkaen viikolla 1. Kontrolliryhmä (vain PBS) koostui 6-hiirten, jotka on kehitetty 12 kasvaimia yhteensä; diklofenaakin ryhmä (18 mg /kg) koostui 6-hiirten, jotka on kehitetty yhteensä 11 kasvaimia. Arvot edustavat keskiarvoja ± keskivirhe. Tilastollinen merkitys on edustettuna * p 0,05. B) Hiiret satunnaistettiin 2 ryhmään: kontrolli tai indometasiinin (2,5 mg /kg). Hoito aloitettiin seuraavana päivänä solujen injektion ja annettiin päivittäin juomavedessä 6 viikkoa. Kasvaimet mitattiin kahdesti viikossa, alkaen viikolla 3. kontrolliryhmä (vain vesi) koostui 5 hiiriä, jotka on kehitetty 9 kasvaimia yhteensä; indomethacin ryhmä (2,5 mg /kg) koostui 5 hiiriä, jotka on kehitetty yhteensä 5 kasvaimia. Arvot edustavat keskiarvoja ± keskivirhe. Tilastollinen merkitys on edustettuna * p 0,05.

E2F1 ja kohde- geenien vaimentua käsitellyissä soluissa NSAID

tutkimiseksi geenit ilmentyvät differentiaalisesti munasarjasyöpäsoluja hoidon jälkeen NSAID , käsittelimme HEY, UCI-101, ja OVCAR5 solujen diklofenaakki ja indometasiini 24 tuntia ja suoritetaan mikrosiruanalyysillä. MRNA: t ilmentyvät differentiaalisesti (≥2-kertainen) kolme solulinjoissa on esitetty (kuvio 4A). Pieni alijoukko ilmentyvät eri mRNA: iden jaettiin kolmeen solulinjoista, ja pieni määrä ilmentyvät eri mRNA: iden jaettiin käsittelemällä diklofenaakki ja indometasiini kaikissa kolmessa solulinjoissa.

HEI, OVCAR5 ja UCI-101 soluja käsiteltiin 24 tunnin ajan 300 uM diklofenaakin tai indometasiinin. A) RNA analysoitiin Illumina mikrosiruja. Määrä mRNA: iden, jotka ilmentyvät eri 2-kertaisesti tai enemmän kaikissa kolmessa solulinjoissa on tarkoitettu diklofenaakki ja indometasiini hoitoja (Kuvassa lihavoitu ovat yli-ilmennetty mRNA: t, esitetään säännöllisesti fontti ovat vaimentua mRNA: t). B) RNA osoitetusta solulinjoista käsitelty diklofenaakin tai indometasiinin analysoitiin Reaaliaikainen RT-PCR. E2F1 ja E2F4 mRNA-tasot on ilmaistu kertainen muutos käsiteltyjen näytteiden verrattuna käsittelemättömään, normalisoinnin jälkeen kanssa GAPDH. Keskiarvo 3 kokeesta. Tilastollinen merkitys on edustettuna *** p 0,001. C) Solulysaatit osoitetun solulinjoja, joita oli käsitelty diklofenaakin tai indometasiinin analysoitiin immunoblottaamalla vasta-aineilla, jotka ovat spesifisiä ilmoitettu proteiineja. GAPDH: ta käytettiin proteiinin lastaus ohjaus.

Suurin mRNA ekspressoituu differentiaalisesti käsittelemällä diklofenaakin havaittiin vaimentua, kun taas suurin osa geenien vaikutusta indometasiinin oli voimistunut. Koska diklofenaakki ja indometasiini aiheuttama solusyklin pysähtymiseen ja apoptoosiin, valitsimme validointi geenien mahdollisesti mukana näissä prosesseissa. Olemme vahvisti kvantitatiivisella RT-PCR: llä, että ilmentyminen

MCM2

,

MCM4

, ja muut mRNA: t, jotka koodaavat proteiineja, jotka liittyvät DNA-replikaatioon ja solusyklin säätelyssä oli vaimentua Diklofenaakki (taulukko 1), kun taas

GADD45A

ja

PPP1R15A

mRNA: iden, muiden muassa koodaavat apoptoosia kannalta relevantteja proteiineja, jotka voimistuvan indometasiinia ja diklofenaakki (taulukko 1). Lisäksi olemme validoitu mRNA: t voimistuvan indometasiinia koodauksen liuenneen aineen kantajaproteiinille SLC1A5 ja SLC7A1 (taulukko 1). Kuitenkin, mRNA: t, jotka osoittivat ero ekspressiotasot vain diklofenaakin tai indometasiinin, että mikrosiruanalyysi, havaittiin ilmentyvät differentiaalisesti molemmat lääkkeet, kun analysoitiin RT-qPCR (taulukko 1).

tunnistaa transkriptiotekijöiden, että voi säädellä ero ilmentymistä näiden mRNA: iden, transkriptiotekijä tavoite analyysi suoritettiin käyttäen WebGestalt. WebGestalt (WEB-pohjainen geeniperimä analyysi Toolkit) on online-työkalu (https://bioinfo.vanderbilt.edu/webgestalt/) analysoimaan geeni laskee ja transkriptiotekijä tavoite analyysi ohjelma WebGestalt ennustaa transkriptiotekijöiden todennäköisesti mukana säätelyssä nämä geenit. Taulukko S1 esittää eniten merkitsevä transkriptiotekijöitä ennustaa, yhdessä vastaavan differentiaalisesti ilmentyvien geenien tunnistetaan microarray. E2F1, tumatekijä Y ja E2F4 olivat alkuun transkriptiotekijät ennustetaan säädellä geenien differentiaalisesti ilmaisi käsittelemällä diklofenaakin, ja vastaavat mRNA: t olivat vaimentua. NFAT ja AP1 olivat kaksi parasta transkriptiotekijät ennustetaan säädellä geenien vaikuttaa indometasiinin, ja mRNA: t, jotka koodaavat näitä proteiineja olivat enimmäkseen ilmen- tymisen lisääntymisen.

Voit selvittää NSAID vaikuttanut ekspressioon transkriptiotekijöiden tunnistettu edellä tutkimme mRNA ja proteiini tasoilla transkriptiotekijöiden E2F1, NFY, E2F4, NFAT ja AP1. Suostumuksella suuntaus raportoitu edellä,

E2F1

mRNA vaimentua kolmessa munasarjasyövän solulinjoissa hoidon jälkeen 24 tunnin diklofenaakin tai indometasiinin, ja etenkin HEI soluissa (kuvio 4B). E2F1 proteiini myös vaimentua, sekä MCM2 ja MCM4 proteiineja (kuvio 4C).

NFAT

ja

AP1

mRNA: t olivat enimmäkseen voimistunut (taulukko S2), samoin kuin niiden transkription tavoitteita. Kuitenkin NFAT ja AP1 proteiinin runsauden oli pienempi (kuvio S1), vaikka osoittavat suurempia mRNA-tasoja. Tasot

NFY

ja

E2F4

mRNA: t eivät muuttuneet merkitsevästi (kuvio 4B ja taulukko S2).

E2F1 yli-ilmentyminen lisää selviytymisen NSAID-käsiteltyjen munasarjasyöpäsoluja

Koska ilmaisua sekä E2F1 ja sen kohdegeenien on vaimentua käsittelemällä diklofenaakin ja indometasiini, halusimme selvittää E2F1 oli mukana kasvua estäviä vaikutuksia tulehduskipulääkkeiden munasarjasyöpäsoluja. Olemme yli-ilmentynyt E2F1 in HEI soluissa (kuvio 5A) ja havaitsivat elonjäämisetua hoidon jälkeen diklofenaakin ja indometasiinin (kuvio 5B). Tämä koe viittaa siihen, että downregulation E2F1 saattaa olla mukana solujen kasvun esto, jonka NSAID.

A) HEI-soluja transfektoitiin ohimenevästi E2F1 tai eGFP kontrollina ja käsiteltiin 24 tunnin ajan 300 uM diklofenaakin tai indometasiinin. Solulysaatit analysoitiin immunoblottauksella mainituilla vasta-aineilla. B) HEI-soluja transfektoitiin ohimenevästi E2F1 tai eGFP kontrollina ja käsiteltiin 48 tunnin ajan 300 uM diklofenaakin tai indometasiinin. Sitten solut pestiin ja niiden annettiin kasvaa, ja värjättiin kristallivioletilla. Kuva näkyy edustaa 2 kokeita. C) HEI soluja käsiteltiin 24 tunnin ajan 300 uM diklofenaakin tai indometasiinin. Solulysaatit analysoitiin immunoblottauksella. D) HEI transfektoitiin Rb siRNA ja käsiteltiin 24 tuntia diklofenaakin tai indometasiinin. Solulysaatit analysoitiin immunoblottauksella. E) HEI-solut transfektoitiin Rb siRNA ja käsiteltiin 48 tunnin ajan 300 uM diklofenaakin tai indometasiinin, solut pestiin sitten ja niiden annettiin kasvaa, ja värjättiin kristallivioletilla. Kuva näkyy edustaa 3 kokeen.

retinoblastoomaproteiini (Rb) lohkot solusyklin etenemistä estämällä E2F1 ja estää muita transkription aktivaation geenien tärkeää S-vaiheeseen siirtymistä. Huomasimme, että tasot fosforyloitua Rb vähennettiin käsittelemällä NSAID (kuvio 5C), osoittaa Rb aktivointia. Siksi pyrimme downregulate ilmaus Rb tutkia tarkemmin, ovatko E2F1 oli mukana vaikutuksia tulehduskipulääkkeiden (kuvio 5D), kuten hiljentäminen Rb käyttäen pieniä häiritseviä (si) RNA olisi jäljitellä aktivointi E2F1. Hoito Rb siRNA lisäsi eloonjäämistä HEI käsiteltyjen solujen diklofenaakin ja indometasiinin (kuvio 5E), mikä viittaa siihen, että E2F1 estäminen tai alisäätely voisi osallistua kasvua estäviä vaikutuksia tulehduskipulääkkeiden näissä soluissa.

Keskustelu

tässä tutkimuksessa olemme arvioineet vaikutuksia NSAID diklofenaakin ja indometasiinia munasarjasyöpäsoluja ja hiiren ksenograftimallissa. Tietääksemme ei ole olemassa raportteja vaikutuksista indometasiinia in vivo epiteelin munasarjasyöpä. Kirjoittajat raportoivat, että indometasiini väheni merkittävästi kasvua HEI ksenograftien 22% nude-hiirissä, mikä viittaa siihen, että indometasiini voi vähentää etenemistä munasarjasyövän in vivo. Lisäksi me raportoimme että diklofenaakki vähensi merkittävästi kasvua HEY ksenograftien. Tämä vastaa koska äskettäisen tutkimuksen että diklofenaakki vähensi kasvua munasarjasyöpäsolujen SKOV-3 ksenografteissa [12]. Vaikka tulokset ovat yhtäpitäviä, tutkimuksessamme löysimme hieman parempi vaikutus diklofenaakin (33% verrattuna 20%) ja vaikutukset näkyivät aiemmin (4 viikon hoidon vs. 8 viikkoa). Tämä voi johtua osittain eroista toimitustapa (vatsaonteloon vs ruokavalion). Yhdessä meidän tiedot osoittavat, että nämä NSAID: t ovat kasvua estäviä vaikutuksia in vivo.

Indomethacin ja diklofenaakin on osoitettu indusoivan solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin useissa syöpäsolutyyppien [12], [20], [21 ], [22], [23], [24]. Tutkimuksessamme, indometasiini ja diklofenaakki vähentää munasarjasyövän solujen kasvua, ainakin osittain läpi solusyklin pysähtymisen kolmen munasarjasyövän solulinjoissa tutkittiin. Diklofenaakki ja indometasiini oli eri vaikutuksia solusyklin, kun indometasiinia indusoi G1 pidätys, diklofenaakki aiheuttama kertyminen solujen S-vaiheeseen ja G2 pidätykseen. Tulokset indometasiinia ovat yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten kanssa, joissa indometasiini on myös raportoitu aiheuttavan G1 pidätys eri soluihin [20], [21], [22], [25]. Kuitenkin vain kaksi aiemmat tutkimukset ovat ilmoitettujen vaikutusten Diklofenaakin solusyklin: sileän lihaksen soluissa, diklofenaakki aiheuttama G1 pidätys [22], kun taas hiiren glioomasoluihin diklofenaakin aiheuttamaa G2 pidätys [26]. Tutkimuksessamme diklofenaakin aiheuttamaa kertyminen solujen S-vaiheeseen ja G2 pidätykseen.

Vastatakseen ero havaitsimme solusyklin vaikutuksia välillä diklofenaakin ja indometasiini, yritimme tunnistaa erot geenien ilmentymisessä hoidon jälkeen kukin huume. Niistä mRNA: iden validoitu RT-qPCR, olemme havainneet, että suurin osa geenien muuttaa diklofenaakki hoitoon myös ekspressoituu differentiaalisesti indomethacin-käsitellyt solut. Siksi lisätutkimukset näiden geenien perusteltua määrittää, mikä aiheuttaa eroja solusyklin vaikutuksia diklofenaakin ja indometasiinia.

WebGestalt transkriptiotekijä analyysi geenien differentiaalisesti ilmaiseman diklofenaakki ja indometasiini ennusti, että useat geenit vaimentua by diklofenaakki kohdegeenien E2F1. E2F1 on transkriptiotekijä, joka ohjaa solusyklin, säätelemällä geenien ilmentymistä on tarpeen S-vaiheeseen siirtymistä. E2F1 on yli-ilmentynyt useissa syövissä, ja sen yli-ilmentyminen on yleensä liitetty huonoon ennusteeseen [27], [28], [29], [30]. Naisilla, joilla munasarjasyövän, yliekspressio E2F1 on liittynyt vähentynyt tautivapaan elinajan ja pieneni eloonjääminen [31], [32]. Aiemmissa tutkimuksissa downregulation ilmaisu- ja /tai aktiivisuutta E2F1 Tulehduskipulääkkeiden luultiin edistää kasvua estäviä vaikutuksia tulehduskipulääkkeiden [20], [33], [34], [35], [36], [37 ]. On raportoitu, että aktiivisuus E2F1 on vaimentua Tulehduskipulääkkeet selekoksibin ja sulindaakki [20]. Samassa tutkimuksessa, indometasiini ei vähennä aktiivisuutta E2F1 pään ja niskan levy- karsinoomasolulinja UM-SCC-1. Täällä me raportoimme että E2F1 säädeltiin vähentävästi mRNA ja proteiini tasoilla kolmen munasarjasyövän solulinjoissa tutkittiin käsittelemällä diklofenaakin ja indometasiinin. N yli-ilmentyminen E2F1 vuonna HEI soluissa pelastettiin soluja antiproliferatiivisia vaikutuksia tulehduskipulääkkeiden johtavat elonjäämisetua, mikä viittaa siihen, että E2F1 välittää osittain vaikutuksia tulehduskipulääkkeiden. Nämä tulokset viittaavat siihen, että tulehduskipulääkkeiden käyttöön voi olla terapeuttisesti merkityksellisiä, erityisesti osajoukko munasarjojen syöpien yli-ilmentävät E2F1, ja joiden ennustetaan olevan huono ennuste.

joukossa transkriptien ekspressoituu differentiaalisesti diclofenac- ja indometasiini -käsitellyssä solut

MCM2

,

MCM4

,

PCNA

ja

RRM2

mRNA: t, ne kaikki tavoitteet E2F1 ja tärkeitä replikointi ja solusyklin etenemistä. Äskettäin on raportoitu, että RRM2, PCNA ja MCM2 olivat vaimentua käsittelemällä NSAID NS-398 haiman syöpäsoluissa [38]. Downregulation MCM2, ja muut MCM-proteiineja oli raportoitu indusoivan G1 ja G2 pidätetty [39], [40], myötävaikuttaa solujen kasvun estäminen. Siksi on mahdollista, että downregulation näiden proteiinien voisivat edistää antiproliferatiivisia vaikutuksia tulehduskipulääkkeiden munasarjasyöpäsoluja Tutkimuksessamme.

Yhteenvetona osoitamme, että diklofenaakki ja indometasiini estävät munasarjasyövän solujen kasvua in vitro ja eläinmallissa, indusoimalla solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin. Kasvua inhiboivia vaikutuksia diklofenaakin ja indometasiinia välittyvät osittain mekanismi, johon liittyy downregulation E2F1. Yhdessä tuloksemme tukevat näkemystä, että tulehduskipulääkkeiden käyttöön voi olla terapeuttisesti hyötyä munasarjasyöpä.

tukeminen Information

Kuva S1.

Proteiinitasot transkriptiotekijöiden NFAT ja AP1. HEI, OVCAR5 ja UCI-101-soluja käsiteltiin 24 tunnin ajan diklofenaakin (300 uM) tai indometasiinin (300 uM). Solulysaatit analysoitiin immunoblottaamalla vasta-aineilla, jotka ovat spesifisiä ilmoitettu proteiineja.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0061836.s001

(TIF)

Taulukko S1.

Transkriptiotekijöihin ennustettiin WebGestalt säännellä eri tavalla ilmaistuna geenejä diklofenaakki ja indometasiini käsiteltyjä soluja. Transcription Factor Target Analyysi differentiaalisesti ilmaisi geenin sarjaa suoritettiin käyttäen WebGestalt (https://bioinfo.vanderbilt.edu/webgestalt/) tunnistaa transkriptiotekijät mahdollisesti osallisena säätelyssä differentiaalisesti ilmentyvien geenien.