Krooninen sairaus

tiivistelmä

Äskettäin histonideasetylaasi- (HDAC) estäjien noussut lupaavaksi luokan huumeiden syöpien hoidossa, erityisesti ihon alle T-solu lymfooma. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että MPT0E028, uusi

N

-hydroxyacrylamide johdettuja HDAC estäjä esti paksu- ja peräsuolisyövän HCT116 solujen kasvua

in vitro

ja

in vivo

. Tulokset NCI-60 seulonta osoitti, että MPT0E028 esti lisääntymistä sekä kiinteitä ja hematologiset kasvainsolulinjoissa mikromolaarisina pitoisuuksina, ja oli erityisen voimakas in HCT116-soluissa. MPT0E028 oli vahvempi apoptoottista aktiivisuutta ja estivät HDAC aktiivisuutta voimakkaammin kuin SAHA, ensimmäinen terapeuttinen HDAC-inhibiittori todistaa FDA.

In vivo

hiirimallissa, kasvua HCT116–tuumoriksenografti viivästyi ja esti hoidon jälkeen MPT0E028 annoksesta riippuvalla tavalla. Perustuen

in vivo

tutkimuksessa MPT0E028 osoitti vahvempi syöpälääkkeen tehoa kuin SAHA. Ei merkittävää kehon painon eron tai muita haitallisia vaikutuksia havaittiin sekä MPT0E028-ja SAHA: hoidetuissa ryhmissä. Yhdessä tuloksemme osoittavat, että MPT0E028 on useita ominaisuuksia, ja on potentiaalia lupaava syövän vastaisen terapeuttinen lääke.

Citation: Huang HL, Lee HY, Tsai AC, Peng CY, Lai MJ, Wang JC, et al. (2012) Anticancer aktiivisuus MPT0E028, Novel Voimakkaat histonideasetylaasi- Inhibitor, Human peräsuolen syövän HCT116 Cells

In vitro

ja

In Vivo

. PLoS ONE 7 (8): e43645. doi: 10,1371 /journal.pone.0043645

Editor: Manfred Jung, Albert-Ludwigs-Universität, Saksa

vastaanotettu: 20 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 24 heinäkuu 2012; Julkaistu: 22 elokuu 2012

Copyright: © Huang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat avustusta National Science neuvoston Taiwan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

histonideasetylaasi-estäjät (HDACi) ovat lupaava uusi luokka syöpälääkkeiden. HDACi estää kasvaimen etenemisen kautta niiden kyky säädellä geeniekspressiota edistämällä asetylaatio histoni ja ei-histoni-proteiinien [1], [2]. Tällä hetkellä useat HDACi, kuten SAHA, LBH589, PXD101, MS-275, ja FK228, tutkitaan kliinisissä tutkimuksissa niiden kykyä hoitaa erilaisia ​​kiinteitä ja hematologisten maligniteettien [3], [4]. Yhdysvaltain elintarvike- ja lääkevirasto (FDA) hyväksyi äskettäin SAHA ja FK228 hoitoon ihon T-solulymfooman [5]. HDAC-inhibiittorit (HDACi) moduloivat useiden geenien ekspression, jotka säätelevät apoptoosia, angiogeneesin [6], [7], solusyklin etenemistä ja solujen erilaistumista. Ne on minimaalinen toksisuus normaaleille soluille [8] – [10]. Yhdessä nämä havainnot ovat kriittisiä suunnittelussa tavoite estäjiä HDAC hoitoon syöpää ja muita sairauksia.

läheinen Näiden kliinisten tutkimusten pienimolekyylinen HDACi osoitti hydroksaamihappo- tai

N

-hydroxyacrylamide ryhmä on tärkeä rooli HDAC [11], [12]. Olemme aiemmin raportoitu tunnistaminen indoliini-1-sulfonamidia sisältäviä yhdisteitä, joissa on selviä syövänvastainen aktiivisuus [13], [14]. Pohjalta havaintojen edellä, olemme kehittäneet ja syntetisoineet sarjan uuden luokan histonideasetylaasi-inhibiittorit. Niistä, 3- (1-bentseenisulfonyyli-2,3-dihydro-1 H-indol-5-yyli) –

N

hydroksi-akryyliamidi (MPT0E028) on paras inhiboivaa aktiivisuutta HDAC-entsyymeistä. Tässä tutkimuksessa selvitimme antitumor toimintaa MPT0E028 useissa syöpäsolulinjoissa NCI-60 syöpäsolun paneeli. Tutkimme vaikutukset MPT0E028 solusyklin etenemisen ja apoptoosin ja selvittänyt mahdollisia molekyylitason mekanismeja, jotka taustalla sen syövän vastaista aktiivisuutta. Lisäksi tutkimme vaikutus MPT0E028 kasvuun paksu- ja peräsuolisyövän HCT116-solujen

in vivo

käyttäen -tuumoriksenografti malli, jossa vahvistettiin antituumorivaikutuksen of MPT0E028. Tuloksemme viittaavat siihen, että MPT0E028 on lupaava terapeuttinen ehdokas ihmisen syöpien hoidossa.

(a) NaBH

3CN, AcOH, 0 ° C-retentioaika .; (B) (i) bentseenisulfonyylikloridia, pyridiinin, refluksi; (Ii) LiAIH

4, THF, 0 ° C-hl .; (Iii) pyridiniumdikromaattia (PDC), molekyyliseuloja, CH

2CI

2, hl .; (C) (i) metyyli (triphenylphosphorylidene) asetaatti, CH

2CI

2, hl .; (Ii) 1 M LiOH: a

(aq), dioksaanissa, 40 ° C; (D) (i) NH

2OTHP, PYBOP, Et

3 N, DMF, hl .; (Iii) trifluorietikkahappo, CH

3OH, RT Lyhenteet: NaBH

3CN, natriumsyanoboorihydridiä; AcOH, asetyyli happo; LiAIH

4 (LAH), litiumalumiinihydridi; THF, tetrahydrofuraani; PDC, pyridiinidikromaatti; NH

2OTHP,

O

– (tetrahydro-2H-pyran-2-yyli) hydroksyyliamiinia; PYBOP, bentsotriatsol-1-yyli-oxytripyrrolidinophosphonium heksafluorifosfaatti; Et

3 N, trietyyliamiini; DMF, dimetyyliformamidi; TFA, trifluorietikkahappo.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

MPT0E028 ja SAHA syntetisoitiin Dr. Jing-Ping Liou Lab. (School of Pharmacy, College of Pharmacy, Taipei Medical University, Taiwan), ja puhtaus on yli 98% (Data S1). RPMI 1640, M199, naudan sikiön seerumia (FBS), penisilliiniä, streptomysiiniä, ja kaikki muut kudosviljelmässä reagenssit saatiin Life Technologies (Grand Island, NY, USA). Vasta-aineita erilaisia ​​proteiineja lueteltu seuraavasti: a-tubuliinin, PARP, aktiini, HRP-konjugoitu anti-hiiri, ja anti-kani-IgG olivat Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA); histoni 3, aktiini, asetyyli-μ-tubuliinin olivat solusignalointia olivat Cell Signaling Technologies (Boston, MA, USA); kaspaasi 3 oli peräisin IMGENEX (San Diego, CA, USA); asetyyli-histoni 3 oli Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY, USA). Propidiumjodidia (PI), sulforodamiini B (SRB), ja kaikki muut kemialliset reagenssit saatiin Sigma Chemical (St. Louis, MO, USA).

Cell Culture

ihmisen paksusuolen syövän solulinja HCT116, rintasyöpäsolulinja MDAMB231 ja ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC) hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Munasarjasyövän solulinja NCI-ADR saatiin DTP ihmisen kasvainsolulinjaa Screen (Developmental Therapeutics Program, NCI). HCT116, MDAMB231 ja NCI-ADR-soluja viljeltiin RPMI 1640: ssä, jossa oli 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (v /v) ja penisilliiniä (100 yksikköä /ml) /streptomysiiniä (100 ug /ml). HUVEC viljeltiin M199: ssä, jossa on 20% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (v /v) ja penisilliiniä (100 yksikköä /ml) /streptomysiiniä (100 ug /ml). Kaikki soluja pidettiin kosteutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa, 5% CO

2/95% ilmaa.

(A) pitoisuus riippuvainen vaikutus MPT0E028 ja SAHA solun kasvuun. HCT116-soluja inkuboitiin ilman tai ilmoitetut pitoisuudet MPT0E028 tai SAHA: ssa 48 tuntia. Solujen kasvua arvioitiin SRB-määrityksellä. Tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SEM. vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen. (B) Pitoisuus riippuvia vaikutuksia MPT0E028 ja SAHA solusyklin etenemisen. HCT116-soluja käsiteltiin ilman kanssa tai konsentraatiot MPT0E028 tai SAHA: ssa 24 tuntia ja analysoitiin virtaussytometrialla solusyklin jakeluun. (C, D) Esitetyt tiedot ovat keinoja vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen. (E) Aika riippuvia vaikutuksia MPT0E028 ja SAHA päälle subG1 väestöstä. HCT116-soluja käsiteltiin ilman tai 1 uM MPT0E028 tai SAHA varten osoitetun aikavälin ja analysoitiin virtaussytometrialla subG1 väestölle. (F) MPT0E028 indusoi kaspaasi 3 ja PARP aktivointi. HCT116-soluja käsiteltiin ilman tai osoitettu pitoisuus on MPT0E028 tai SAHA 24 tuntia kohteena western blot kaspaasi 3 ja PARP analyysi. (G) MPT0E028 indusoi casepase-riippuvaista apoptoosia. HCT116-soluja käsiteltiin ilman tai 3 uM MPTE028, SAHA tai 20 uM z-VAD-fmk 24 h ja alistettiin western blot kaspaasi 3 ja PARP analyysi.

NCI-60 Cell Lines Screening

NCI-60 syövän solulinjoissa seulonta suoritettiin NCI: n Developmental Therapeutics Program (DTP; https://www.dtp.nci.nih.gov/branches/btb/ivclsp.html).

sulforodamiini B määritys

HCT116, MDAMB231 ja NCI-ADR-soluja siirrostettiin 96-kuoppaisille levyille alustassa, jossa 5% naudan sikiön seerumia yön yli. Solut kiinnitettiin 10% trikloo- edustavat solupopulaation aikaan lääkehoidon (

T

0). Inkubaation jälkeen ajoneuvon (0,1% DMSO), MPT0E028 tai SAHA 48 h, solut kiinnitettiin 10% trikloorietikkahapolla ja värjättiin sitten sulforodamiini B 0,4% (w /v) 1% etikkahapossa. Ylimääräinen sulforodamiini B pestiin pois 1%: ista etikkahappoa ja väriainetta sisältäviä soluja lyysattiin 10 mmol /l Trizma base. Absorbanssi luettiin alle aallonpituudella 515 nm. Mittaamalla aika nolla (

T

0), ohjaus kasvu (

C

), ja solujen kasvua läsnä lääkeaineen (

t

x

), prosentuaalinen kasvu laskettiin. Prosentuaalinen kasvun esto laskettiin 100 – [(

t

x

–

T

0) /(

C

–

T

0)] x 100. Kasvun estäminen 50% (GI

50) määritetään lääkeaineen pitoisuus, joka johtaa 50%: n vähennys kokonaisproteiinia kasvusta kontrollisoluissa aikana yhdisteen inkuboinnin.

Crystal Violet Pitoisuus

HUVEC ympättiin 96-kuoppaisille viljelylevyille (5000 solua /kuoppa) neljänä kappaleena. 24 tunnin inkuboinnin jälkeen solut kiinnitettiin 0,1% kristalliviolettia /20% metanolia, mikä solupopulaatio aikaan lääkehoidon (

T

0). Muita soluja käsiteltiin MPT0E028 tai SAHA: ssa 48 tuntia. 48 h jälkeen oli inkuboitu 37 ° C: ssa, solut värjättiin 0,1% kristallivioletilla /20% metanolia 10 minuutin ajan ja pestiin 3 kertaa. Sitten väriaine eluoitiin 0,1 M natriumsitraatti /75% etanolia, ja absorbanssi mitataan 550 nm: ssä.

(A) esto HDAC: ien aktiivisuutta HeLa tumauutteet. Data ilmaistiin keskiarvona vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen. (B) esto koko HDAC-aktiivisuuden MPT0E028 ja SAHA. HCT116-soluja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla MPT0E028 ja SAHA: 24 tuntia, ja tumaproteiinit eristettiin määrittämiseksi esto koko HDAC-entsyymin aktiivisuutta. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM. vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen.

FACScan virtaussytometria

käsittelyn jälkeen ajoneuvon (0,1% DMSO), MPT0E028 tai SAHA varten osoitetun ajan kurssien, solut kerättiin trypsiinikäsittelyllä, kiinnitettiin 75% (v /v) alkoholia 4 ° C: ssa yön yli. Sentrifugoinnin jälkeen soluja inkuboitiin 0,1 mol /L fosfaattia-sitruunahappo-puskuria [0,2 mol /l NaHPO

4, 0,1 mol /l sitruunahappoa (pH 7,8)] 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten solut sentrifugoitiin ja suspendoitiin uudelleen 0,5 ml: lla PI-liuosta, joka sisälsi Triton X-100 (0,1%, v /v), RNaasi (100 ug /ml), ja PI (80 ug /ml). DNA-pitoisuus analysoitiin FACScan ja CellQuest-ohjelmaa (Becton Dickinson).

(A) HCT116-soluja käsiteltiin MPT0E028 ja SAHA: 24 h ilmoitettuina pitoisuuksina. Solulysaatit valmistettiin ja alistettiin SDS-PAGE: lla ja immunoblottaus käyttäen asetyyli-histoni H3, histoni H3, asetyyli-α-tubuliinin, ja α-tubuliinin vasta-aineita. Kvantitatiivinen analyysi western blotilla ImageQuant (Molecular Dynamics, USA); asetyyli-histoni H3 (B) ja asetyyli α-tubuliinin (C) analysoitiin HCT116-soluissa.

HDAC biokemiallisia

HDAC

in vitro

toimintaan ihmisen rekombinantti-HDAC 1, 2, 4, 6 ja 8 (BPS Biosciences) havaittiin fluorigenic vapautuminen 7-amino-4-metyylikumariini substraatista, kun deasetylaasi entsymaattista aktiivisuutta. Puolet maksimaalinen estävä pitoisuus (IC

50) määritetään lääkeaineen pitoisuus, joka johtaa 50%: n vähennys HDAC kasvusta kontrollikuopissa aikana yhdisteen inkuboinnin.

Kaikki kasvaimet kasvoi 1200 mm

3 päätepisteen tilavuus. (A) Kasvaimet mitattiin säännöllisesti ja kasvun viivästyminen laskettiin hoitoryhmissä suhteessa kontrolliin kasvaimet (TGD). (B) Kaplan-Meier eloonjääminen analyysi perustui kasvaimen kasvua päätepisteen. (C) Kasvaimen kasvun inhibitio käyrät edustaa keskiarvo ± SEM ja prosentuaalinen muutos kasvaimen keskimääräinen tilavuus (prosenttia TGI). (D) Kehon painot mitattiin päivittäin ensimmäisen viikon aikana ja sen jälkeen 2 kertaa viikossa. Kehon paino laskettiin suhteessa lähtötasoon verrattuna. (E)

In vivo

vaikutus MPT0E028 ilmenemistä kaspaasi 3, PARP, asetyyli-histoni H3 ja asetyyli-μ-tubuliinin HCT116 ksenograftikasvaimissa määritettynä western-blottauksella.

HeLa Nuclear Extract HDAC Activity Assay

HeLa- tumauutteesta HDAC-aktiivisuus mitattiin käyttämällä HDAC Fluorescent Activity Assay Kit (BioVision, CA, USA) valmistajan ohjeiden [15]. Lyhyesti, HDAC fluorometrisen substraatin ja koepuskurilla lisättiin HeLa tumauutteita 96-kuoppainen formaatti ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Reaktio pysäytettiin lisäämällä lysiiniä kehittäjä, ja seosta inkuboitiin vielä 30 minuuttia 37 ° C: ssa. Negatiiviset kontrollit sisälsivät inkubointi ilman tumaekstrakti ilman alustan, tai ilman molempia. TSA 1 uM toimi positiivisena kontrollina. Fluoresenssilevylukijaa eksitaatiolla 355 nm: ssä ja emissio 460 nm käytettiin määrittämään HDAC. Puolet maksimaalinen estävä pitoisuus (IC

50) määritetään lääkeaineen pitoisuus, joka johtaa 50%: n vähennys HeLa HDAC kasvu kontrolliryhmässä aikana yhdisteen inkuboinnin.

Yhteensä HDAC entsymaattisen aktiivisuuden määritys

Yhteensä HDAC-entsyymin aktiivisuus määritettiin käyttäen Boc-Lys (Ac) -AMC fluorometristä HDAC iinianalyysikitissä (BioVision, Mountain View, CA, USA). HCT116-soluja käsiteltiin MPT0E028 ja SAHA 24 tuntia. Sitten solut kerättiin ja koko solulysaatit analysoitiin käyttäen fluorometrisen HDAC Activity Assay Kit (k330-100; BioVision). Fluoresenssilevylukijaa eksitaatiolla 355 nm: ssä ja emissio 460 nm käytettiin määrittämään HDAC. Puolet maksimaalinen estävä pitoisuus (IC

50) määritetään lääkeaineen pitoisuus, joka johtaa 50%: n vähennys koko HDAC kasvu kontrolliryhmässä.

Western Blot analyysi

Hoidon jälkeen ajoneuvon (0,1% DMSO), MPT0E028 tai SAHA ilmoitetuilla pitoisuuksilla, solut pestiin jäähdytetyllä PBS: llä. Varten yhteensä lysaattia, solut lyysattiin 120 ui jääkylmää lyysipuskuria [10 mmol /l Tris-HCI (pH 7,4), 150 mmol /l NaCI, 1 mmol /l EGTA: a, 1 mmol /l fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 10 ug /ml aprotiniinia, 10 ug /ml leupeptiiniä, 1 mM natrium- orthovandate, 1 mM NaF ja 1% Triton X-100]. Solulysaatit sentrifugoitiin 13000 rpm 30 minuutin ajan. Western blot -analyysiä varten, proteiinin määrä (40 ug) erotettiin elektroforeesilla 10% tai 15% polyakryyliamidigeelillä ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi (PVDF) membraanille. 1 h kuluttua huoneenlämpötilassa inkuboinnin PBS /5% rasvatonta maitoa, membraani pestiin PBS /0,1% ja inkuboitiin vasta-aineiden kanssa 4 ° C: ssa yön yli. Pesun jälkeen PBS /0,1% Tween 20, vastaavat sekundääriset vasta-aineet levitettiin kalvoja 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten membraanit pestiin PBS /0,1% Tween 20 ja havaitseminen signaalin tehtiin parannettu kemiluminesenssidetektiolla (Amersham, Buckinghamshire, UK).

In vivo

Implantation ja kasvain kasvu

ihmisen HCT116 peräsuolen adenokarsinooma, joita käytetään istutettavien kerättiin aikana logaritmisessa kasvuvaiheessa ja suspendoitiin uudelleen fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen 5 x 10

7 solua /ml. Jokainen hiiri injektoitiin s.c. oikeaan kylkeen 1,0 × 10

7 solua (0,2 ml solususpensiota). Kasvaimet tarkkailtiin kahdesti viikossa ja sen jälkeen päivittäin niiden määrät lähestyi 1200 mm

3. Kasvain koko millimetreinä

3, laskettiin: missä

w =

leveys ja

l =

pituus millimetreinä kasvain. Kasvaimen tilavuus = (

w

2

×

l

) /2. Kaikki eläinkokeet seuraa eettisiä standardeja, ja protokollat ​​on tarkistettu ja hyväksytty eläinten käyttö ja hallintokomitea National Taiwan University (IACUC Hyväksyntä nro: 20100225).

Hiiret

Female nude-kateenkorvattomissa hiirissä olivat 8 viikkoa vanhoja, ja oli kehon paino (BW) välillä 17,2-22,0 g, D1 tutkimuksen. Eläimiä ruokittiin ad libitum vettä (käänteisosmoosi, 1 ppm Cl) ja PicoLab Jyrsijöiden Ravinto 20 Modified ja Irradiated Lab Diet® koostuu 20,0% raakaa proteiinia, 9,9% raakaöljyn rasvaa, ja 4,7% raakakuidun. Hiiret majoitettiin National Taiwan University Laboratory Animal Center, NTUMC, on 12-tunnin valo sykli 21-23 ° C: ssa ja 60-85%: n kosteudessa.

Tilastollinen ja graafinen Analyysit

logrank- testiä käytettiin tilastollisen merkittävyyden määrittämiseksi, että ero TTE-arvojen kaksi ryhmää, lukuun ottamatta sitä, NTR kuolemia. Tilastolliset ja graafiset analyysit tehtiin Prism 3,03 (GraphPad) for Windows. Kahden pyrstö tilastolliset analyysit tehtiin

P

= 0.05. Kaplan-Meier tontteja osoittavat eläinten osuus jäljellä tutkimukseen ajan suhteen. Kaplan-Meier koealojen käyttää samoja tietoja asetettu logrank testi.

kasvaimen kasvun käyrät osoittavat ryhmän mediaani tuumorin tilavuus, joka on log mittakaavassa ajan funktiona. Kun eläin poistuu tutkimuksen vuoksi kasvaimen koon tai TR kuolema, lopullinen kasvaimen tilavuus kirjattiin eläin on mukana tietoja käytetään laskettaessa mediaani Myöhemmissä ajankohtina. Näin ollen lopullinen mediaani tuumorin tilavuus esitetty käyrä voi poiketa MTV, joka on mediaani tuumorin tilavuus hiirille jäljellä tutkimuksessa viimeisenä päivänä (lukuun ottamatta kaikki kasvaimia, jotka ovat saavuttaneet päätepiste). Jos useampi kuin yksi TR kuolema tapahtuu ryhmässä, kasvaimen kasvukäyrät ovat katkaistu aikaan viime mittauksen, joka edeltää toista TR kuolema. Kasvain kasvukäyrät ovat myös lyhennetä kasvaimet yli 50% arvioitavissa eläinten ryhmässä on kasvanut päätepisteen äänenvoimakkuutta. (*

p

0,05; **

p

0,01; ***

p

0,001, verrattuna vastaaviin kontrolliryhmä).

In vitro

tilastollinen analyysi

tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SEM on esitetty lukumäärä erillisiä kokeita. Tilastollisessa analyysissä suoritettiin yksisuuntainen ANOVA, jonka jälkeen

t

testi, ja

p

0,05 pidettiin merkittävinä. (*

p

0,05; **

p

0,01; ***

p

0,001, verrattuna vastaaviin kontrolliryhmä).

tulokset

synteesi on MPT0E028

synteesi MPT0E028 (1) on esitetty kuviossa 1. Kaupallisesti saatavilla metyyli-indoli-5-karboksylaatti (2), saatettiin reagoimaan natriumsyaaniboorihydridin kun läsnä on etikkahappoa, saatiin metyyli-indoliini-5-karboksylaatti (3) 93%: n saannolla.

N

1-sulfonyloimalla indoliini (3) bentseenisulfonyylikloridia pyridiiniä ja sitten LiAIH

4-välitteisen C5-esteri vähennys, jonka jälkeen PDC hapettamalla tuotettu haluttua 1-benzenesulfonylindoline-5-karbaldehydiä (4) 42%: n saannolla (3 vaihetta). Wittig-reaktio, jossa oli metyyli (trifenyylifosforanylideeni) asetaattia kanssa indoliini-5-karboksialdehydiä 4T ja hoito litiumhydroksidia (LiOH) MeOH: ssa saatiin kanelihappoa (5) 73%: n saannolla. Konversio karboksyylihappo (5) hydroksaamihappo (1) toteutettiin 72%: n saannolla käsittelemällä NH

2OTHP läsnä ollessa PYBOP ja Et

3 N, jota seuraa trifluorietikkahappo-välitteisen suojauksen poisto. Yksityiskohtaiset kokeellisten tietojen valmistelua varten MPT0E028 on saatavilla täydentävien osiossa.

Vaikutus MPT0E028 leviämisen estämistä Cancer Cell Lines

Voit selvittää MPT0E028 osoittaa syövän vastaista aktiivisuutta ihmisen syövässä solut, testasimme anti-proliferatiivista aktiivisuutta MTP0E028 NCI-60 syöpäsolulinjoissa seulonta paneelin [16]. Kuten on esitetty taulukossa 1, MPT0E028 estivät merkittävästi solujen proliferaatiota kaikissa ihmisen syöpäsolulinjasta mikromolaarisina pitoisuuksina, mutta oli erityisen voimakas in HCT116-solulinjaa. Siksi valitsimme HCT116 solujen lisätutkimuksia syövän vastaisen aktiivisuuden MPT0E028

in vitro

ja

in vivo

.

MPT0E028 Merkittävästi aiheuttama HCT116 solukuoleman

Ensimmäinen, osoitimme, että MPT0E028 estää niiden kasvun HCT116-solujen pitoisuudesta riippuvalla tavalla käyttäen SRB määritystä (GI

50 = 0,09 ± 0,004 uM) (kuvio 2A). Kaksi muuta solulinjat, MDA-MB-231 ja NCI-ADR NCI-60 seulonta paneeli, myös valittu analysoida herkkyys MPT0E028 (MDAMB231, GI

50 = 0,19 ± 0,04 uM; NCI-ADR, GI

50 = 0,14 ± 0,02 uM). MPT0E028 esti myös solujen lisääntymistä merkittävästi näissä kahdessa solulinjassa (Data S2A, S2B), mutta osoitti vähemmän herkkiä kuin HCT116. Olemme myös päättäneet varmuusväli MPT0E028 ihmisen normaaleissa soluissa (esim HUVEC) ja totesi, että MPT0E028 osoittavat 20-40 taittuu vähemmän herkkiä vastaan ​​normaaleja soluja (GI

50 = 3,57 ± 0,45 uM), mikä viittaa MPT0E028 kohdistuu erityisesti pahanlaatuisten syöpäsolujen (Data S2C). Tutkia vaikutuksen MPT0E028 solusyklin etenemisen, solun DNA-pitoisuus mitattiin virtaussytometrialla. Olemme osoittaneet, että hoito MPT0E028 lisäsi solujen osa-G1 vaiheen solusyklin (kuvio 2B ja 2C). Viittaus yhdiste oli HDACi, suberoylanilide hydroksaamihappo (SAHA, vorinostat), jossa on GI

50 0,82 ± 0,07 uM, mikä osoitti antiproliferatiivinen aktiivisuus (kuvio 2A) ja indusoi apoptoosia HCT116-soluissa (kuvio 2B ja 2D) in pitoisuudesta riippuvalla tavalla, mutta osoitti vähemmän tehokas verrattuna MPT0E028. Kuten kuviossa 2E, MPT0E028 indusoi myös osa-G1 väestön ajasta riippuva tavalla, kun taas SAHA osoitti heikompi vaikutus ja viivästynyt sytotoksisuutta. MPT0E028 indusoi myös kaspaasi 3 ja PARP aktivoinnin pitoisuudesta riippuvalla tavalla (kuvio 2F). MPT0E028 indusoiman apoptoosin poistettiin, kun yhteiskäsittely kaspaasi-inhibiittoria z-VAD-fmk, viittaa siihen, että MPT0E028 indusoi apoptoosia kaspaasi-riippuvaisen reitin. Nämä tulokset viittaavat siihen, että MPT0E028 indusoi HCT116-solujen sytotoksisuuden kautta apoptoosireittiä.

MPT0E028 on Inhibitor HDAC: ien Activity

vieressä tutkittiin, mikä vaikutus MPT0E028 aktiivisuuteen HDAC-entsyymeistä, käyttäen paneelia ihmisen rekombinantti HDAC proteiineja, ja verrattiin sen toimintaa SAHA. Kuten taulukosta 2, MPT0E028 estivät merkittävästi HDAC1 ja HDAC2 luokan I sekä HDAC6 luokan IIb alhaisilla nanomolaarisina pitoisuuksina. Vaikka MPT0E028 oli tehokkaampi kuin SAHA rekombinantti HDAC1 ja 2, sillä on vain vähän aktiivisuutta rekombinantti HDAC4 ja HDAC8, joka on samanlainen kuin estävä kuvio SAHA. Olemme vahvisti, että MPT0E028 esti ydin- HDAC kohdunkaulan adenokarsinoomasolulinja HeLa (IC

50 = 11,1 ± 2,8 nM) ja HCT116-soluissa (IC

50 = 4,43 ± 0,5 uM), jotka olivat noin 9-30 kertaa tehokkaampi kuin SAHA (IC

50 = +118,8 ± 13,2 nM ja 129,4 ± 13,9 pM, vastaavasti) (kuvio 3A ja 3B). Voimakas HDAC inhiboiva vaikutus MPT0E028 voidaan myös havaita MDAMB231 ja NCI-ADR-soluja (Data S3). Nämä tulokset viittaavat siihen, että MPT0E028 on uusia ja tehokkaita HDAC-inhibiittori.

vaikutukset MPT0E028 on α-tubuliinin ja histoni-H3-asetylointi on HCT116 Solut

Koska α-tubuliinin ja histoni H3 ovat yleisiä alavirran kohteita HDAC-entsyymeistä, tutkimme vaikutuksia MPT0E028 on α-tubuliinin ja histoni H3 asetylointi in HCT116-soluissa käyttäen western blot analyysiä. Kuten kuviossa 4 on esitetty, MPT0E028 indusoi vahvempia hyperasetylaation histoni H3 kuin SAHA (kuvio 4A ja 4B), joka on yhdenmukainen sen voimakas inhiboiva vaikutus luokan I HDAC1 ja 2. Sen sijaan, SAHA esillä voimakkaampi α-tubuliinin asetylointi kuin MPT0E028 (kuvio 4A ja 4C), mikä viittaa siihen, että SAHA on tehokkaampi vasten luokan IIb HDAC6, joka on johdonmukainen löydös taulukossa 2.

MPT0E028 inhiboi ihmisen paksusuolen syövän ksenoqraftit

in vivo

Lopuksi arvioidaan tehokkuutta MPT0E028 ja SAHA käyttämällä

in vivo

kasvaimen HCT116 ksenograftien nude hiirimallissa (kuvio 5A ja 5B) (taulukko 3). Kun kasvain oli käsin kosketeltava kanssa kooltaan noin 55 mm

3, hiiret satunnaistettiin ajoneuvon hallinnan ja hoitoryhmien (8 hiirtä ryhmää kohti). Kontrollihiiret saivat vehikkeliä (0,5% karboksimetyyliselluloosa + 0,1% Tween 80). Kasvaimia kaikissa 3 ryhmissä annettiin saavuttaa päätepiste tilavuus 1200 mm

3. Mediaaniaika päätelaitteiden (TTE) valvontaa hiirillä oli 16,6 päivää. Hiirillä, jotka käsiteltiin oraalisesti SAHA (200 mg /kg, päivittäin), TTE kasvoi 27,0 päivää, joka vastaa T-C, 10,0 päivää ja prosenttia kasvaimen kasvun viivästyminen (TGD) 63%. Mukaan logrank analyysiin, SAHA tuottanut merkittävää antituumorivaikutus (

P

= 0,0251). Suun kautta MPT0E028 (200, 100, ja 50 mg /kg, päivittäin) lisäsi mediaani TTE 36,9, 19,2, ja 15,5 päivää, vastaavasti, mikä vastaa TC 20, 2,6 ja 0 päivä ja prosenttia TGD 122 %, 16%, ja 0%, tässä järjestyksessä. Perustuen logrank- analyysin MPT0E028 osoittaa merkittävää antituumorivaikutus 200 mg /kg (

P

= 0,0031). Erityisesti, 3 hiirtä ryhmässä, joita oli käsitelty 200 mg /kg MPT0E028 ja 1 hiiri toinen ryhmä, joka käsiteltiin 100 mg /kg MPT0E028 osoitti täydellistä kasvaimen regressiota hoidon jälkeen (taulukko 3). Lisäksi hiirille annosteltiin myös kerran päivässä 15 päivää kautta suun arvioida tuumorin kasvun inhibitio, kun MPT0E028 hoidon. Olemme havainneet, että kasvun HCT116-syöpäsolujen ksenografteissa tukahdutettiin 73,5%, 32,0%, ja 21,9% (prosenttia kasvaimen kasvun inhibition [TGI] arvot) käsittelyn jälkeen MPT0E028 200, 100, ja 50 mg /kg, vastaavasti, kun taas SAHA 200 mg /kg esti tuumorin kasvua 47,7% (% TGI) (kuvio 5C). Ei ole merkittävää eroa kehon painon tai muita haitallisia vaikutuksia havaittiin käsittelemällä MPT0E028 (kuvio 5D). Olemme myös määritti MPT0E028 ilmentymistä koskevat caspase3, PARP, asetyyli-histoni H3 ja asetyyli-μ-tubuliinin

in vivo

in HCT116 ksenografti- tuumorikudoksissa. Hiiriä käsiteltiin 200 mg /kg MPT0E028 tai SAHA ja 7 päivää (suun kautta päivittäin) ja sitten kasvaimet poistettiin varovasti ja alistettiin western blot -analyysi. Kuten kuviossa 5E, kaspaasi 3, PARP ja asetyyli-histoni H3 tuntuvasti indusoitui MPT0E028 saaneessa ryhmässä, kun taas asetyyli-μ-tubuliinin havaittiin laajemmin SAHA hoidetussa ryhmässä, joka on johdonmukainen havainto

in vitro

. Yhdessä MPT0E028 indusoi annoksesta riippuvan viiveen ja kasvaimen kasvun inhibition ja näytetään voimakkaampi antituumorivaikutus

in vivo

kuin SAHA.

Keskustelu

HDAC ovat tärkeitä kohteita syövän hoidossa, koska niiden kyky transkriptionaalisesti säätelevät geenien ilmentymistä, jotka ovat osallisina solujen proliferaatiota, erilaistumista, ja apoptoosin [17], [18]. HDACi ovat tällä hetkellä kliinisissä kokeissa hoitoon kiinteiden kasvainten ja leukemian. Kaksi HDACi, SAHA ja FK228, ovat saaneet Yhdysvaltain FDA hoitoon potilailla, joilla on ihon T-solu lymfooma. Tässä tutkimuksessa me raportoimme synteesiä uuden kemiallisen yhdisteen 3- (1-bentseenisulfonyyli-2,3-dihydro-1 H-indol-5-yyli) –

N

hydroksi-akryyliamidi (MPT0E028), joka on tehokas HDACi toimintaa. MPT0E028 suunniteltiin perustuvat aiempaan tutkimukseen mikrotubulusten destabilointiaineita käyttäen indoliini-1-arylsulfonamides keskeiseksi rakenne [13], [14]. Sen jälkeen kytkemällä

N

-hydroxyacrylamide funktionaalinen ryhmä on 5-asemassa indoliini renkaan, me saatiin haluttu MPT0E028.

Lisäksi olemme arvioitiin syövän vastaista aktiivisuutta ja MPT0E028 i

n vitro

ja

in vivo

. Huomasimme, että MPT0E028 aiheuttamaa sytotoksisuutta lukuisissa ihmisen syövän solulinjoja NCI-60 paneelit ja suoritetaan mekanistinen tutkimukset HCT116-soluissa, mikä osoitti korkea herkkyys MPT0E028. Verrattuna SAHA, hoito MPT0E028 indusoi vahvemman esto syöpäsolun (GI

50 = 0,82 ± 0,07 uM ja 0,09 ± 0,004 uM, tässä järjestyksessä), mutta ei normaalien solujen kasvua (GI

50 = 3,57 ± 0,45 uM) ja saatiin huomattavasti suurempi määrä sub-G1 (apoptoottisten) solujen määritettynä virtaussytometrialla. Myös MPT0E028 aiheuttama syvemmin kaspaasi 3 ja PARP aktivointi. Yhdessä MPT0E028 estää syöpäsolujen kasvua ja indusoi apoptoottista solukuolemaa.

osoittaneet, että MPT0E028 inhiboi HDAC1, HDAC2 ja HDAC8 I-luokan sekä HDAC6 luokassa II b, mutta ei HDAC4 luokassa Ila, ja johdonmukaisesti indusoi asetylointi histoni H3 ja α-tubuliinin. Luokka I HDAC on osoitettu yli-ilmentyvän ihmisen paksu- ja peräsuolen syövän soluja [19], jotka voivat vaikuttaa häirityn syöpäsolujen lisääntymistä, erilaistumista ja apoptoosia sekä epigeneettiset tai ei-epigeneettisellä muutos [20], [21]. Esto HDAC indusoi sisäiseen ja ulkoiseen apoptoottista polku, joka johtaa syöpäsolun kuoleman [22], [23]. Lisäksi, HDACi voisi indusoi p21 vakauttaa ja indusoimalla transkriptionaalista aktiivisuutta RUNX3, mikä indusoi syöpäsolujen apoptoosin [24], [25]. Esto HDAC-aktiivisuuden MPT0E028 oli 10-30 kertaa voimakkaampi kuin että SAHA HeLa ja HCT116-soluissa.

Lopuksi tutkimme tehokkuus MPT0E028 vastaan ​​ihmisen HCT116 peräsuolen adenokarsinooma solujen kasvua hiirissä. Mediaani kasvaimen kasvua ja Kaplan-Meierin käyrä analyysi osoitti vahvaa antituumorivaikutuksen MPT0E028. Päivittäinen anto MPT0E028 johtanut merkittäviin antituumorivaikutus. Lisäksi, verrattuna SAHA, MPT0E028 näytetään vahvempi kasvaimen vastainen vaikutus. Näiden tulosten perusteella, MPT0E028 on uusi synteettinen HDACi ainutlaatuisia farmakologisia ominaisuuksia, jotka pitäisi testata paksu- ja peräsuolisyövän hoidossa.

Yhteenvetona olemme tunnistaneet uuden estäjä HDAC, MPT0E028, jossa antituumoriaktiivisuus

in vitro

ja

in vivo

. Tässä esitetyt tulokset osoittavat, että MPT0E028 estää HDAC: ja joissa on tuumorin vastaista ominaisuuksia, jotka ovat tehokkaampia kuin SAHA, joka on tällä hetkellä kliinisessä käytössä ihonalaisessa T-solu lymfooma. Siten MPT0E028 sopii lisätestejä uutena syöpälääkkeen.

tukeminen Information

Data S1.

Chemistry. Ydinmagneettinen resonanssi (

1H NMR) saatiin Bruker DRX-500 spektrometrillä (toimii 500 MHz), kemiallisen siirtymän miljoonasosina (ppm,

δ

) alakenttään TMS sisäisenä standardia. Korkean resoluution massaspektrit (HRMS) mitattiin JEOL (JMS-700) elektroni (EI) massaspektrometrillä.