Krooninen sairaus

tiivistelmä

Phellinus linteus (PL) sieni jolla on anti-kasvain omaisuutta. Olemme aiemmin raportoitu, että hoito PL aiheuttama viljellyissä ihmisen eturauhasen syöpäsolujen apoptoosin. Edelleen tutkitaan mekanismeja PL-välitteisen apoptoosin, teimme ksenografti määrityksessä yhdessä

in vitro

määrityksissä, arvioida vaikutus PL synnystä ja etenemistä kasvaimia muodostettu istuttamalla eturauhassyövän PC3 tai DU145-soluissa. Inokulaation jälkeen nude-hiiriin injektoitiin PL kahden päivän välein 12 päivän ajan. Vaikka PL hoito ei estä muodostumista ympättiin kasvainten kasvu kasvainten jälkeen PL hoidon dramaattisesti heikennetty. Sitten vaikutus testattiin PL on kasvaimia 12 päivää inokulaation jälkeen. Sen jälkeen ympättyä kasvaimet saavuttanut tietyn koon, PL oli ylläpitäjä hiirille ihon alle. Histokemialla tai immunokemian analyysi osoitti, että apoptoosin esiintynyt kaspaasi 3 kasvaimissa on muodostettu siirrostamalla eturauhassyövän DU145 tai PC3-soluja. Aineisto oli hyvä kanssa, että viljellyistä soluista. Näin ollen meidän in vivo tutkimus osoittaa, että PL ei ole vain pystyy vaimentamaan kasvaimen kasvua, mutta myös aiheuttaa kasvaimen regression indusoimalla apoptoosia.

Citation: Tsuji T, Du W, Nishioka T, Chen L, Yamamoto D Chen CY (2010) Phellinus linteuksen Ote herkistää edennyt eturauhassyöpä solut apoptoosiin Kateenkorvattomiin Nude hiiret. PLoS ONE 5 (3): e9885. doi: 10,1371 /journal.pone.0009885

Editor: Syed A. Aziz, Health Canada, Kanada

vastaanotettu: 3. joulukuuta 2009; Hyväksytty: 11 helmikuu 2010; Julkaistu: 31 maaliskuu 2010

Copyright: © 2010 Tsuji et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuetaan rahoituksella JCRT säätiön CYC. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksessa, tietojen keruun ja analysoinnin, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on tuhottu sairaus miehillä. Vaikka hoitojen (kuten leikkaus tai androgeeniablaatio) ovat parantaneet eloonjäämisaste potilaiden, ettei menestystä hormonin tulenkestävä eturauhassyöpä edelleen. Kehittynyt kasvaimet ovat usein resistenttejä kemoterapeuttisten. Vaikka mekanismit vastus ovat epäselviä, on oletettu, että kasvaimia, kuten tulenkestävä eturauhassyöpä, liittyy kertyminen geneettisiä tai epigeneettiset muutokset. Aasian, PL on yksi vakiintunut lääkkeiden sienet, jotka ovat käyttäneet hoitaa erilaisia ​​ihmisen syöpäsairauksia. Tutkimukset osoittivat, että vesiliukoinen osa PL on biologisesti aktiivinen, joka todennäköisesti on polysakkaridi [1] – [3]. On myös osoitettu, että PL pystyy tukahduttamaan kasvaimien

in vitro

joko epäsuorasti parantamalla isännän immuunijärjestelmää, tai suoraan indusoimalla apoptoosin kasvainsoluissa [4] – [6]. Viime aikoina olemme todettu, että PL on huomattavan tehokas kasvun estämiseksi eri eturauhassyövän solulinjoissa ilman toksisia vaikutuksia normaaleissa eturauhasen epiteelisolujen [7]. Koska PL hallussaan anti-kasvain, anti-angiogeeninen ja immunomodulatorisia ominaisuuksia, se on laatinut laaja etuja Aasiassa kehittää sitä anti-syöpähoitojen. Jotta voitaisiin kehittää tätä lääkettä sieni anti-eturauhassyöpä korjaamiseksi, ymmärtää paremmin taustalla molekyylitason mekanismeja PL toimintoja tarvitaan.

mahdollinen lääkeaineen apoptoosin on laajalti käytetty strategia uusien syövän hoidossa. On tunnettua, että apoptoosi voidaan laukaista erilaisia ​​sisäisiä tai ulkoisia signaaleja. Caspases, erittäin konservoitunut perheen kysteiiniproteaasien, ovat keskeisiä apoptoottisia efektoreita soluissa ja kriittisiä rooleja apoptoosin säätelyyn läpi ketjun Lohkaisureaktio [8], [9]. Kaspaasit olemassa pro-entsyymejä sytosoliin soluihin, ja niitä aktivoidaan proteolyysi. Kun solukuoleman kiihokkeet, kaspaasi 8, aloitteentekijänä, laukaisee aktivoituminen alavirtavaikuttajainhibiittorit caspases 3 ja 7, jolloin BID pilkkominen ja sytokromi c release [10] – [12]. Vapauttamaan sytokromi c: n välillä mitokondriot sytosoliin aiheuttaa muodostumista apoptosome, joka puolestaan ​​laukaisee luontainen apoptoottisen koneiston. PL on osoitettu aiheuttavan syöpäsolujen apoptoosin laukaisemalla kaspaasi cascade [6], [7]. Lisäksi pieniä annoksia doksorubisiinia (anti-cancer drug), yhdessä pieninä pitoisuuksina PL, on synergistinen vaikutus apoptoosin ihmisen eturauhasen syöpäsolujen [13].

Aiemmin olemme raportoineet että PL voi herkistää viljeltiin eturauhasen syöpäsolujen apoptoosia, jossa kaspaasit aktivoituivat [7]. Nykyinen tutkimus, koska jatkoa tutkimuksen anti-kasvain omaisuutta PL, osoitti lisäksi kyky PL apoptoosin kasvaimissa siirrostamalla eturauhassyövän DU145 tai PC3-solut nude-hiirissä. Osoitimme, että injektio PL dramaattisesti heikennetty syntyhistoria paljaissa hiirissä siirrostuksen jälkeen. Tutkimuksemme osoitti myös, että kun PL injektio, muodostunut kasvaimia siirrostamalla DU145 tai PC3-soluja nude-hiiriin tehtiin regressio, laukaisemalla apoptoottinen prosesseja.

Methods

Solut ja reagenssit

Phellinus linteuksen

jauhe ostettiin Panbio-Tech (Taejon, Etelä-Korea) ja liuotetaan veteen. Jälkeen keitettiin 5 min, PL liuos sentrifugoitiin ja supernatantti kerättiin tutkimukseen. DMEM (Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine); antibiootit (penisilliini ja streptomysiini) ja trypsiini-EDTA ostettiin Invitrogen. Ihmisen eturauhassyövän PC3-soluja (American Type Culture Collection) viljeltiin DMEM-alustassa, jota oli täydennetty 10% lämmön avulla inaktivoitua sikiövasikan seerumia, 2 mM L-glutamiinia, 100 yhdistää /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä.

Vieraslajisiirteen Pitoisuus

Mies nude-hiiriin (NCRNU-MM, CrTac: NCR-Foxn1nu) (Taconic) iässä 4-6 viikon käytettiin. Ihmisen eturauhassyövän PC3-solut (5 x 106) 100 ul: ssa PBS: ää inokuloitiin oikeaan kylkeen alueella kunkin hiiren. Kolmea hiirtä toimi positiivisena kontrollina. Inhiboimiseksi kasvaimen muodostumisen, 6-hiiriä käsiteltiin PL (30 mg /kg 100 pl PBS: ssä) heti siirrostuksen jälkeen hallinnoi sama määrä PL välein 2 päivää. Toinen 3 hiiriä käsiteltiin samalla määrällä ohjaus Hitachi sieni ratkaisun jälkeen, samalla kurssin kuin se, jota PL. Koot kasvaimet mitattiin 4 päivän välein, joiden paksuus ja lasketaan Tamayko kaavan [14]. Seurannassa kasvaimen regressio, kun istutetaan kasvaimet oli noin 1,0 cm halkaisijaltaan, hiiret käsiteltiin joko PL (30 mg /kg) tai saman määrän valvonta sieni liuos välein 2 päivää. Kymmenen päivää myöhemmin hiiret tapettiin ja tuumorit eristettiin histopathology tai histokemialla analyysi.

histopatologia tai immunohistokemia analysoi

eristetty kasvaimet kiinnitettiin 4% fosfaatilla puskuroituun neutraali paraformaldehydiä (pH 7,4). Histologinen näytteet leikeltiin ja värjättiin hematoksyliinillä /eosiinilla (H 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

PL vaimentaa DU145 tai PC3-solut muodostavat kasvaimia nude-hiirissä

Tutkimukset ovat osoittaneet, että PL hallussaan anti-kasvain ominaisuus [1], [6], [7]. Olemme osoittaneet, että PL ei vain voi aloittaa apoptoosin eri pahanlaatuisen eturauhassyövän solulinjoissa, mutta indusoi G

1 pidätys normaalissa eturauhasessa epiteelisolujen [6], [7], [13]. Edelleen testata anti-kasvain vaikutus PL, ksenografti määritys käyttää. Jälkeen ympättyä ihmisen eturauhassyövän PC3-soluja nude-hiiriin ihonalaisesti, PL on samanaikaisesti injektoitiin hiiriin. Sen jälkeen sama määrä PL injektoitiin hiiriin joka toinen päivä. Kaksitoista päivää myöhemmin, kuvia hiirillä, joilla on kasvaimia, on otettu (Fig. 1A, ylempi paneeli) ja liukuu asennettu kasvaimen kudokset värjättiin HE (Fig. 1 B, alempi paneeli). Kasvaimet PL käsitellyissä hiirissä olivat paljon pienempiä kuin kontrollihiirissä, ja ilmeni selvä HE-värjäys.

. DU145 tai PC3-soluja istutettiin ihonalaisesti nude-hiiriin. Kaksitoista päivää myöhemmin kuvia hiirille, joilla on ympätty kasvaimet otettiin (ylempi paneeli). Tuumorit eristettiin PL käsitelty tai kontrollihiiriin. Objektilasit asennettu kasvainkudoksessa valmistettiin ja värjättiin HE väriaine (alempi kuva). B ja C. Ryhmä 6-hiiriin injektoitiin PL (30 mg /kg) vedessä päivästä 0 ja sen jälkeen ylläpitäjä välein 2 päivää. Toinen ryhmä 3 oli säätimiä. Yksi viikko myöhemmin, kun ympättiin kasvain alkoi muodostua, koot kasvaimet mitattiin 4 päivän välein.

mitattiin myös halkaisijat ympättiin kasvainten, viikkoa myöhemmin inokulaation jälkeen, kun kaikki hiiret alkoivat osoittaa merkkejä muodostumista kiinteä kasvain massoja. Mittaukset otettiin joka neljäs päivä ja 12 päivää (Fig. 1 B ja C). Päivänä 12, ohjaus kasvain sotkuja alkaen rokottaminen kahden solulinjan olivat noin yli 2 taittuu suuremmat kuin hoitaa PL. Sen mahdollisuuden poissulkemiseksi, myrkyllisyyden sulatettava PL, paino (Fig. 2A) ja veden kulutus (Fig. 2B) hiiret mitattiin ja verrattiin. PL-käsitellyillä hiirillä oli samanlainen painon tai veden kulutuksen valvontaa, mikä viittaa siihen, että PL ei ole sivuvaikutus on käsitellyt tai käsittelemättömät hiiret. Edelleen onko PL hoito ollut myrkyllisiä vaikutuksia hiirillä, maksat eristettiin myös pois eläimistä. Histokemia värjäys HE väriaine osoitti, että rakenteet maksan PL-käsiteltyjen hiiret olivat samanlaisia ​​kuin eristetty verrokkihiirten (tuloksia ei ole esitetty). Molemmat maksa näytti terve ilman mitään todisteita rappeuma, fibroosia, apoptoosin tai nekroosin. In vivo tutkimus osoittaa, että PL pystyy vaimentamaan nopeuden kasvun siirrostettiin paljaissa hiirissä.

A ja B. Sen jälkeen, kun kasvaimen kyhmyt ovat muodostuneet, kehon paino (A) ja veden kulutus (B) kunkin hiiren kanssa tai ilman sitä käsiteltiin PL mitattiin. Virhepylväät edustavat standardipoikkeamaa 3-6 hiirillä.

PL hoito aiheuttaa kasvun regressio kasvaimissa inokuloitiin syöpäsolujen

Sitten vaikutus testattiin PL on olemassa olevat kasvaimet. Kun ympättiin kasvaimet olivat saavuttaneet kokoa 1,0 cm halkaisijaltaan, PL ruiskutettiin hiiriin joka toinen päivä ja yhteensä kymmeneksi päiväksi. Kasvaimet eristettiin ja valmistettiin histopatologista tai immunohistochemitry analyysiä. HE värjäys paljasti, että kasvaimia eristetyn PL- tai ohjaus hiiri olivat hyvin rajattu kanssa sidekudosta (Fig. 3A). Solukuolemaa ilmaantui PL-käsiteltyjen kasvainten siirrostuksen kahden eri eturauhassyövän solulinjoissa monia värjäämätön vacuoles, joka oli poissa kontrollien tuumoreiden. Edelleen onko apoptoosin esiintyy PL-käsiteltyjen kasvainten, immunohistokemia-analyysi käyttäen TNUEL värjäystä (havaitsemiseksi DNA säikeen katkoksia) suoritettiin (Fig. 3B). Diat PL-käsitellyt tuumorit olivat voimakkaasti värjättiin TUNEL värjäys, mutta vain harvat TUNEL värjäys positiiviset solut tunnistettiin kontrolli kasvaimia. Prosenttiosuudet värjättyjä soluja TUNEL positiivisesti mitattiin ohjaus- ja PL-käsitellyt tuumorit (tuloksia ei ole esitetty). Yli 30% soluista PL-kasvaimen oli rikkoutunut DNA-juosteen ja hyvin pieniä prosenttia soluja kontrollien tuumoreiden (noin 5%) värjäytyi positiivisesti. Immunohistokemia värjäys käyttäen anti-kaspaasi-3-vasta-aine suoritettiin myös ekspression havaitsemiseksi kaspaasi 3 (Fig. 3C). Suuri määrä soluja PL-kasvaimen muodostettu istuttamalla PC3-solut reagoivat vasta-aineen kanssa. Vertailun vuoksi vain muutamia soluja ohjaus kasvaimen ilmaistu korkean tason kaspaasi 3 Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kasvaimista muodostettu istuttamalla DU145-soluja (tietoja ei esitetty). Täten tulokset osoittavat, että solukuolemaa esiintyi PL-kasvaimen on apoptoosin kautta.

. Kasvaimet valmistettiin hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäystä. B ja C. liukuu asennettu kasvaimen kudokset värjättiin TUNEL aineen (B) tai anti-kaspaasi-3-vasta-ainetta (C).

edelleen testata kykyä PL apoptoosin, DU145 ja PC3-soluja käsiteltiin PL 1 mg /ml tai 2 mg /ml 48 tuntia. Anneksiini V-analyysi tehtiin (Fig. 4). Sen jälkeen, kun on käsitelty PL, noin 15% PL-käsitellyistä soluista tehtiin apoptoosia annoksesta riippuvalla tavalla. Lähtökohta värjäytymistä anneksiini V nähtiin kontrollien tuumoreiden. Mielenkiintoista, PC3-solut olivat herkempiä PL-kuin DU145 soluja. Kaiken

in vitro

data on yhteneväinen saatu eläinkokeista.

Soluja käsiteltiin 1 mg /ml tai 2 mg /ml 48 tuntia, ja sen jälkeen värjättiin anneksiini V Virhepylväät edustavat standardipoikkeamaa 3 erilliselle kokeelle.

keskustelu

Aiemmin olemme osoittaneet, että PL indusoi viljeltyjen syöpäsolujen apoptoosin [7], [13 ]. Tässä käytetään ksenografti määritystä, olemme osoittaneet, että PL kykenee saamaan aikaan apoptoottisen vasteen

in vivo

estää tuumorien kasvun muodostettu istuttamalla ihmisen eturauhassyövän DU145 tai PC3-soluja. Histokemia värjäys analyysi osoitti, että suurin osa soluista kasvainten eristetty PL-käsiteltyjen hiirten on apoptoottisia, joka ilmenee värjäytyivät positiivisesti TUNEL ja saatettiin reagoimaan anti-kaspaasi-3-vasta-aine. Esiintyminen apoptoosi osoitettiin myös viljellyissä DU145 tai PC3-solujen käsittelyn jälkeen PL 48 annoksesta riippuvalla tavalla. Siten Tutkimuksessamme käyttämällä

in vivo

sekä

in vitro

määrityksissä, inidcates että PL hoito aloittaa kaspaasi Cascade apoptoosin eturauhassyöpäsoluissa, jotka tarjoavat vahvaa näyttöä potentiaalin PL anti-eturauhasen syöpä korjaamiseksi.

tiedetään, että PL on myrkytön yleensä [1]. Aiemmin kerroimme, että PL, suurilla annoksilla, indusoi ohjaus keuhkojen epiteelisolujen pidättämään G

1 vaihe solusyklin estämällä ilmaus sykliini D

1 ja sen vuorovaikutus solukierron riippuvaisten kinaasien 4 ja 6 [6]. Meidän nykyisessä tutkimuksessa saadut tiedot histopatologista analyysiä osoittavat, että injektio PL nude-hiiriin inokuloitiin joko DU145 tai PC3 syöpäsolujen ei myrkyllinen vaikutus hiirillä, ilmenee, että hoito ei ole mitään merkitystä kasvun tai vedenkulutuksen hiiristä. Tärkeää on, että maksan näytteet käsiteltyjen hiirten ovat normaaleja ilman rappeuma tai fibroosia. On mahdollista, että, kuten

in vitro

kokeissa hoito PL aikaansaa solujen tarkistuspiste ohjaa normaaleissa kudoksissa tai elimissä, joka ei vahingoita hiiret. Vuonna ympättiin kasvaimia, sama kohtelu näyttää olevan hyvin paljon sytotoksinen.

Ohjelmoitu solukuolema on tärkeää koneita ilman epänormaali tai syöpäsoluja. Kaspaasi perheenjäsenten on ytimessä apoptoosin, joka edustaa leikkauspiste eri apoptoottisten reittien erilaisten syöpäsolujen, kuten eturauhasen syöpäsoluja. TNF: n tai Fas /CD95-reseptoreihin, mitokondrion proteiinit (kuten sytokromi c) ja grantsyymi kykenevät indusoimaan solukuolemaa aktivaation kautta kaspaasin kaskadin [8], [9]. Vahinkoa tai stressiä ER: ään tai Golgin on osoitettu pystyä laukaisemaan apoptoosin [15], [16]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että avatulla proteiinin vaste tai kalsiumin puutteesta vastaa ER-välitteisen apoptoosin [15]. ER stressi on osoitettu aiheuttavan translokaation tiettyjen kaspaasien ER: ään tai Golgin ja toteuttaa apoptoosin siellä. Kalsium vapautuu ER aikoina ATP puute on tärkeä osa indusoiman apoptoosin iskemia-reperfuusiovaurio. Olemme osoittaneet, että PL hoito laukaisee kaspaasi aktivaation viljellyissä eturauhasen syöpäsoluja [7], [13]. Meidän

in vivo

tutkimus osoittaa, että PL hoito kykenee myös käynnistämään apoptoosin kautta aktivoimalla kaspaasi 3, jotka ovat efektori kaspaasien ketjureaktion. Tutkimuksessa onko muita caspases ovat mukana apoptoosin

in vivo

on meneillään.

PL on yksi vakiintunut lääkkeiden sienet, jotka on otettu suun kautta yhteiseksi terveys- edistäminen ravintolisänä tai adjuvantti hoitoon syöpäsairauksia Aasiassa jo vuosikymmeniä. Uuttamalla vesiliukoinen PL jae osoittaa suhteellisen homogeeninen molekyylipainojakauma on geelipermeaation HPLC ja arvioidaan olevan noin 150-180 kD retentioajan HPLC pullulaani molekyylimarkkereina [1]. Pääkomponentit PL on ehdotettu olevan useita polysakkarideja [1] – [3]. On myös osoitettu, että vesiliukoinen osa PL pystyy tukahduttamaan kasvaimien joko epäsuorasti parantamalla isännän immuunijärjestelmää, tai suoraan indusoimalla apoptoosin kasvainsoluissa [4], [5]. On kuitenkin vielä epäselvää, mihin koostumukset polysakkaridin PL hallussaan syövän vaikutusta.

Yhteenvetona onnistunut käyttö PL eturauhassyövän edellyttää täysin mekanismien ymmärtämistä kuinka PL sovittelee anti- kasvain toimintaa kasvaimia. Edellisessä tutkimus osoitti, että PL kautta kaspaasien aktivaatio, pystyy aiheuttamaan apoptoosia viljellyissä syöpäsoluissa. Tässä tutkimuksessa käyttäen ksenografti määritystä, me osoittavat lisäksi, että injektio PL nude-hiiriin, joissa muodostuu ihonalainen kasvaimia ympätty eturauhassyövän DU145 tai PC3 soluja indusoi suurin siirrostettua kasvainsolujen menettävät elinkyvyt. Siten meidän

in vivo

tiedot tukevat käsitystä, että PL, sytyttämällä kasvaimen tukahduttaminen liittyviä koneita, voidaan kehittää tehokkaana hoitamiseksi, ihmisen maligniteettien, kuten tulenkestävä eturauhassyöpää.

Kiitokset

Kiitämme tohtori Hu (Harvard Medical School, MA) tarjoamiseksi reagenssit projektin.