Krooninen sairaus

tiivistelmä

Useimmat syöpäsolut ilmentävät korkeita telomeraasi ja lisääntyä loputtomiin. Sen lisäksi telomeerivasta kunnossapidon, telomeraasi on myös pro-selviytymisen toiminto johtaa lisääntyneeseen vastustusta DNA-vaurioita ja laski apoptoosin induktio. Kuitenkin molekyylitason mekanismeja tämän suojaavan tehtävän säilyvät vaikeasti ja on epäselvää, onko kytketty telomeerivasta huolto- tai pikemminkin ei-telomeerisiä funktio telomeraasiproteiinia, TERT. On osoitettu äskettäin, että proteiinin alayksikön telomeraasin voi shuttle tumasta mitokondrioiden kun oksidatiivisen stressin, jossa se suojaa mitokondrioiden toimintaa ja vähentää solunsisäisiä oksidatiivisen stressin. Tässä osoitamme, että endogeeninen telomeraasi (tert-proteiini) sukkulat tumasta tulee mitokondriot, kun oksidatiivista stressiä syöpäsoluja ja analysoitiin ydin- ulkopuolelle kuviot endogeenisen telomeraasin käsittelyn jälkeen vetyperoksidin kanssa eri solulinjoissa. Solupopulaatioiden ulkopuolelle TERT tumasta yhteydessä oksidatiivista stressiä heterogeeninen tavalla. Löysimme merkittävä korrelaatio ydinvoiman lokalisointi telomeraasi ja korkea DNA-vaurioita, kun taas solut, jotka ulkopuolelle telomeraasin tumasta näkyvissä mitään tai hyvin pieni DNA-vaurioita. Me mallinnettu ydin- ja mitokondrioiden telomeraasin käyttäen organelle erityisiä lokalisointi vektoreiden ja vahvisti, että mitokondrioiden lokalisointi telomeraasin suojaa tuma aiheutettu DNA-vaurioita ja apoptoosin mutta toisin, ydinvoiman lokalisointi telomeraasi korreloivat suurempia määriä DNA-vaurioita ja apoptoosin. On tunnettua, että ydin- DNA-vaurioita voivat aiheuttaa mitochondrially syntyy reaktiivisen hapen (ROS). Osoitamme tässä, että mitokondrioiden lokalisointi telomeraasi nimenomaan estää ydinvoiman DNA-vaurioita vähentämällä tasoilla mitokondrion ROS. Ehdotamme, että tämä lasku oksidatiivisen stressin voisi olla mahdollinen syy korkea stressinsietokyky syöpäsolujen ja voi olla erityisen tärkeää syövän kantasoluja.

Citation: Singhapol C, Pal D, Czapiewski R, Porika M, Nelson G, Saretzki GC (2013) Mitokondrioiden Telomerase Suojaa syöpäsolujen Nuclear DNA Damage ja Apoptosis. PLoS ONE 8 (1): e52989. doi: 10,1371 /journal.pone.0052989

Editor: Janine Santos, University of Medicine ja hammaslääketieteen New Jersey, Yhdysvallat

vastaanotettu: 14 elokuu 2012; Hyväksytty: 27 marraskuu 2012; Julkaistu: 9. tammikuuta 2013

Copyright: © 2013 Singhapol et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Chatchawan Singhapol rahoitti stipendiaattina Thaimaan hallitus. Glyn Nelson tukivat BBSRC avustuksen nr. BB /C008200 /1 (CISBAN). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Gabriele Saretzki on PLoS One toimittaja ja Editorial hallituksen jäsen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Telomerase on entsyymi tunnetaan parhaiten sen rooli telomeeri- ylläpitoon. Solut, joilla on alhainen tai olematon telomeraasin ilmaisu menetä telomere toistoja solunjakautumisen aikana, lopulta johtaa solun vanhenemista. Useimmat syöpäsolut, itusolujen ja alkion kantasolut ilmentävät korkeita telomeraasin, mikä edistää pluripotenssia ja kuolemattomuus. Säilyttääkseen telomeres entsyymi tarvitsee katalyyttinen alayksikkö (tert) sekä RNA-komponentin (kiksi tert tai TR), joka sisältää mallin telomere synteesiä.

Viime vuosina on kuitenkin todisteita on kertynyt että telomeraasi , ja erityisesti sen katalyyttinen alayksikkö TERT, on mukana erilaisia ​​ei-telomere liittyviä toimintoja, kuten geeniekspression säätelyä, kasvutekijöiden ja solujen lisääntymistä [1] – [6]. Lisäksi, eri ryhmät ovat osoittaneet, että TERT sukkulat tumasta ja translokoituu mitokondriot, kun eksogeeninen stressiä [7] – [12]. Me ja muut ovat osoittaneet suojaava tehtävä telomeraasi sisällä mitokondrioiden [10] – [12], kun taas kyvyttömyys telomeraasin shuttling johtaa solun stressiä, estää kuolemattomaksi ja lisää herkkyyttä vastaan ​​genotoksinen stressi, kuten äskettäin Santos ryhmä [13] – [ ,,,0],15].

Useimmat syöpäsolut ilmentävät korkeita telomeraasin, tärkeä edellytys määräämättömäksi lisääntymistä ja kuolemattomuus. Lisäksi telomeraasia myötävaikuttaa kasvaimien syntyyn kautta kuin telomere riippuvainen mekanismeja, joita ei ymmärretä hyvin vielä [16].

Telomerase on siten ehdotettu olevan tärkeä syöpälääkkeen kohde, jossa ensimmäinen kliinisten kokeiden telomeraasiestäjä imetelstat onnistuneesti käynnissä [17], [18]. Telomerase säännellään monilla tasoilla ja solunosasijaintia on yksi niistä. Syöpäsolu selviytymisen jälkeen hoidoista voi olla heterogeeninen joidenkin solujen hoitoon reagoivien kun taas toiset näyttävät olevan vastustuskykyisiä, edistää kasvainsolujen eloonjäämisen. Parempi käsitys biologisia seurauksia eri subsellulaarisen lokalisoinneissa TERT saattaisi johtaa kehitystä tehokkaampien anti-syövän hoitomuotoja.

Tässä ominaista sulkeminen telomeraasin tumasta kun stressi sovellus ja löysi heterogeeninen stressi vaste syövän solupopulaatioiden. Mikä tärkeintä, oli silmiinpistävä korrelaatio telomeraasin /TERT pidätetyksi tumassa ja korkea DNA-vaurioita. Sitä vastoin solut, jotka ulkopuolelle telomeraasin nopeasti tumasta kertynyt lainkaan tai hyvin pieniä määriä DNA-vaurioita. Mallintamalla eri subsellulaariseen lokalisoinneissa telomeraasia käyttäen organelle kohdistetun ”ampuja” vektoreita osoitamme tässä, että mitokondrioiden telomeraasin estää ydinvoiman DNA-vaurioita sekä apoptoosin hoidon jälkeen H

2O

2 ja säteilytys. Ehdotamme, että muodostumisen vähenemisen mitokondrioiden reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) voisi olla oleva mekanismi selittää kuinka mitokondrioiden TERT estää ydinvoiman DNA-vaurioita.

Näin syrjäytyminen telomeraasin tumasta jälkeen stressi, kuten syöpälääkkeen terapeuttinen hoito voisi olla suojamekanismi, joka vähentää ydinvoiman DNA-vaurioita ja apoptoosin vähentämällä oksidatiivisen stressin sisällä mitokondrioissa. Tämä saattaa osaltaan lisätä vastus näiden syöpäsolujen vastaan ​​erilaisia ​​anti-syövän hoitomuotoja.

Tulokset ja keskustelu

Subsellulaariset sukkuloinnin tert-proteiinin tumasta mitokondriot oli aiemmin osoitettu useissa erilaisissa solutyypeissä , mukaan lukien syöpäsolut [7], [10] – [12]. Olemme vahvistaneet tämän sukkuloimisen endogeenisen telomeraasin jälkeen H

2O

2 hoitoa HeLa ja MCF7-solut (Fig. 1A) tumasta mitokondrioita ja määrällisesti poissulkeminen verrattuna MRC-5 /hTERT soluja (taulukko 1). Jotta voitaisiin arvioida sukkuloitua kinetiikka TERT tarkemmin analysoitiin 3 solulinjoja, mukaan lukien 2 syöpäsolun linjat sekä hTERT yli-ilmentävät MRC-5-fibroblasteja, ja heitä seurasi yli 5 päivää.

Esimerkki sulatettu 3D-volyymin ennusteet deconvolved konfokaali kuvia HeLa ja MCF7-solut hoidettu (kontrolli, vasen paneeli) tai käsitelty 400 uM H

2O

2 3 h (oikea paneeli). Green edustaa mitotracker vihreän fluoresenssin, punainen anti-tert immunologiseen fluoresenssi ja sininen tuman DNA (DAPI). Merkityt rinnakkaispaikantumisen välillä mitotracker vihreä ja tert saadaan näkyviin punavihreä sekoitus näytetään keltaisina. B-D: TERT lokalisointi kinetiikka 3 solulinjassa populaatioiden hoidon jälkeen 400 uM H

2O

2 yli 5 päivää. B: HeLa C: MCF7 D: MRC-5 /hTERT. Mustat palkit: ydin- TERT, punaiset palkit: sytoplasminen TERT. Baarit ovat keskiarvoja ± SE vähintään 30 solua aikapistettä kohti ja solulinjaa 3 erilliselle kokeelle.

Kaikissa 3 solulinjoissa ydin- TERT syrjäytyminen alkoi noin 45 min kuluttua alkamisesta H

2O

2 hoitoa. HTERT yli-ilmentävien fibroblastien poissulkemista saavutti enintään 60% 3 tunnin kuluttua, kun se vei sekä syöpäsolun linjat jopa päivän päästä poikkeustasoa 50-60% (Fig. 1 B-D). Tämä vastaa hyvin TERT mitokondrio kolokalisaation tietoja meidän konfokaali kuvia 3 solulinjoista (taulukko 1). Kiehtovan, ydin- poikkeustasoa 50-60% säilyi kaikissa 3 solulinjoissa enintään 5 päivää, pisin ajankohtina analysoimme (Fig. 1 B-D ja S1). Täten ydinvoima TERT syrjäytyminen on melko sitkeä prosessi, joka voi kestää jopa useita päiviä kerta bolusannoksella 400 uM H

2O

2. Tietääksemme tämä on ensimmäinen kerta, kun TERT syrjäytyminen kinetiikkaa on tutkittu yksityiskohtaisesti ja verrataan kolmea eri solulinjoissa yli 5 päivää ajassa. Pitkä pysyvyys TERT proteiinin ulkopuolella ydin syövän solulinjoissa saattaa olla tärkeä tekijä lisääntynyt vastus ja laski apoptoosin syöpäsoluissa jälkeen lääkehoitoa tai säteilytys verrattuna ei-syöpäsoluja, jotka useimmissa tapauksissa esitä tai pikemminkin alhainen telomeraasia. Olemme osoittaneet aiemmin, että telomeraasin negatiiviset fibroblastit ovat paljon herkempiä apoptoosia käsittelyn jälkeen H

2O

2 ja etoposidin kuin niiden telomeraasia yli-ilmentävien kollegansa [10]. Olimme myös osoittanut aiemmin [10], että TERT syrjäytyminen ydin on palautettavissa aikajänteellä noin 10 päivää. Emme kuitenkaan tiedä, onko jatkuva TERT proteiinin sisällä mitokondriot ei aina tumasta vai syntetisoituneeseen TERT proteiini suoraan tuodaan mitokondrioita. Tämä kysymys vaatii lisätutkimuksia.

Seuraavaksi korreloivat telomeraasin syrjäytymisen kunkin yksittäisen solun sen DNA-vaurioita taso 3 tunnin kuluttua H

2O

2 hoitoa. Kvantitoimme TERT poikkeustasoa kunkin yksittäisen solun joko ydin-, jos yli 75% kaikista TERT oli tumassa tai soluliman /mitokondrion jos yli 75% TERT oli ulkopuolella ydin ja loput solut on luokiteltu keskitason fenotyyppi.

Olemme löytäneet selkeän heterogeenisuus ydin- TERT syrjäytymisen solujen välillä populaation (Fig. 2A ja S2A). Kiehtovan, huomasimme, että solut, jotka oli jätetty telomeraasin 3 tuntia hoidon jälkeen ei näkynyt tai hyvin pieni DNA-vaurioita, kun taas ne, joilla on ydin- telomeraasin oli merkitsevästi suurempi määrä tuman DNA vaurioita kaikissa 3 solulinjoissa (Fig. 2). Myös solujen välissä syrjäytymisen kuvio osoitti keskitason vaurioita tasolla vielä huomattavasti korkeampi kuin solujen täysin sulkea pois telomeraasin mutta ei merkittävästi poikkea kanssa pääasiassa ydinvoiman telomeraasia. Nämä tiedot viittaavat siihen, että korkeatasoisen ydinturvallisuuden syrjäytymisen ( 75%) ja mitokondrioiden paikallistaminen TERT on tarpeen käyttää sen suojaava toiminto [10] – [15]. Absoluuttinen DNA-vaurioita tasot olivat erilaiset välillä 3 solulinjojen kanssa kaksi syöpäsolun riviä näyttää paljon suurempi vahinko tasolla kuin TERT yli-ilmentävien fibroblastien. Olemme myös mitattava absoluuttinen TERT signaalin voimakkuudet 3 eri lokalisointi ja totesi, että mitokondrioiden TERT signaali oli aina alhaisempi kuin tumassa tai välitilassa (Fig. S2B). Se oli aiemmin osoitettu, että TERT proteiini taso on alaspäin säännellään mitokondrioita jälkeen H

2O

2 hoitoa, joka voisi selittää tämän havainnon [19].

taas mitokondrio telomerase estää sen. A-C: Kuvat ovat TERT lokalisointi (vihreä), ja γH2A.X värjäytyminen (punainen). Sininen: DAPI ydinvoiman vastavärinä V: HeLa B: MCF7 C: MRC-5 /hTERT soluja. Soluja käsiteltiin 3 h 400 uM H

2O

2. TERT lokalisointi määritettiin kuten on kuvattu kuviossa 1 B ja ryhmitelty 3 luokkaan: ydin- TERT (N) TERT (C) ja välittäjänä TERT (I) lokalisointi. Esimerkkejä 3 eri localizations on merkitty nuolilla. D välinen korrelaatio subsellulaariset TERT- lokalisointi ja tuman DNA vaurioita tasoja (lukumäärä γH2A.X pesäkkeitä). Sytoplasmisen TERT lokalisointi korreloi alhaisen tuman DNA vaurioita kaikissa 3 solulinjoissa taas ydinvoiman TERT paikannustietoa korkean ydinvahingot kuluttua 3 h hoito 400 uM H

2O

2. Välittäjä TERT paikannustietoa väli- DNA-vaurioita tasoilla. Mustat palkit: HeLa, punaiset palkit: MCF7, vihreät palkit: MRC-5 /hTERT. Baarit ovat keskiarvo ± SE vähintään 40-100 solua kohti solulinjan toistuvissa kokeissa. * P 0,05.

korrelaatio korkeampi DNA-vaurioita syöpäsoluissa ja nuclearly rajoittuu telomeraasin pysty shuttle mutaation vuoksi sen tumasta signaali kuvattiin äskettäin Kovalenko ja työtovereiden [13]. Mutatoitu TERT indusoi kasvua spontaanisti telomeerisesti sekä ei-telomeerisen tuman DNA vaurioita 2 syöpäsolulinjoissa verrattuna samaan soluja ilman mutantin TERT [13]. Lisäksi syöpäsolut mutantti TERT joka rajoittui tumaan ja voi shuttle menettäneet leviämisen kyky, eivät pystyneet muodostamaan pesäkkeitä pehmeässä agarissa ja osoitti lisääntynyt määrä mitokondriaalisen DNA-vaurioiden [13]. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että solukomponenttien sukkuloimisen TERT saattaa olla merkittäviä vaikutuksia solujen herkkyys vastaan ​​DNA-vaurioita. Tämä lisääntynyt kestävyys korkeiden telomerase ilmaisun ja ydinvoiman poissulkeminen TERT voisi suosia selviytymisen syövän kantasoluja, jotka voivat aiheuttaa taudin uusiutumisen hoidon jälkeen [17]. Myös aiemmin julkaistu tietoja suojaava tehtävä ydinvoiman TERT vastaan ​​staurosporiinille aiheuttamaa apoptoosia [9]. Kuitenkin staurosporiini on proteiinikinaasin estäjä, joka aktivoi apoptoosia nopeasti tavalla aiheuttamatta DNA-vaurioita ja riippumaton mitokondrioita. Siksi ehdotamme erilainen vaikutusmekanismi kummassakin kokeessa.

vieressä mallinnettu eri TERT localizations erikseen yli-ilmentävät ydin- ja mitokondrioiden organelle erityisiä ilmentävät katalyyttinen telomeraasin alayksikköä TERT fuusioitu myc-tag 3 syöpäsolun linjat: HeLa, MCF7 ja U87 glioblastooma (Fig. 3). Ohimenevästi transfektoituja soluja käsiteltiin joko H

2O

2 tai säteilytys ja analysoitiin γH2A.X DNA vaurioita pesäkkeet ja tert lokalisointi käyttäen sulatettua myc-tag. Lokalisointi for mitokondrioiden (Mito TERT-) ja ydinvoiman TERT on esitetty kuvassa. 3A ja B (ylempi paneeli). Ei ollut eroa DNA-vaurioita tasojen, jotka on transfektoitu joko vektorilla tai un-transfektoiduissa soluissa ennen käsittelyä. Kuitenkin olemme huomanneet, että kaikki 3 solulinjoissa ja hoitojen, solut mitokondriaalisen TERT lokalisointi oli huomattavasti vähemmän DNA-vaurioita verrattuna niihin soluihin, jotka joko ilmaistuna ydin- TERT tai olivat un-transfektoitiin (Fig. 3 A-D). Sen poissulkemiseksi, että endogeeninen telomeraasin vuorovaikutuksessa yli-ilmentynyt ampuja TERT proteiini me toisti kokeen SV40 kuolemattomaksi MRC-5 solulinjaa, joka säilyttää telomeres kautta vaihtoehtoista pidennykset mekanismin [20]. Post säteilytys, löysimme sama suojaava vaikutus mitokondrion telomeraasin (Fig. 3 E). Käytimme myös vasta-ainetta vastaan ​​53BP1, toisen proteiinin mukana DNA-vaurioita vastaus vahvistaa tuloksemme että DNA-vaurioita pesäkkeitä ovat korkeat transfektoiduissa soluissa ydin- TERT taas toisin ne transfektoidaan mitokondrioiden TERT näytä vähemmän DNA-vaurioita kuin YK-transfektoiduissa soluissa ( kuva S3).

H

2O

2 hoitoa verrattuna ydinvoiman TERT lokalisointi 4 eri solulinjoissa. V: organelle erityinen TERT vektorit transfektoitiin HeLa-soluja. Ylempi paneeli: edustavat kuvat transfektoitujen solujen mitokondrioiden ja ydinvoiman TERT ampuja vektoreita ja ilman hoitoa 200pM H

2O

2 3 tuntia. TERT värjäytymistä (käyttäen myc-tag) on ​​fuusioitu TERT proteiini (vihreä) ja γH2A.X värjäytymistä (punainen) DNA-vauriota pesäkkeitä. Nuolet osoittavat Transfektoidut solut. Alempi paneeli: kvantifiointi solujen korkea DNA-vaurioita polttopistettä transfektoitu ja YK-transfektoitujen solujen kanssa ja ilman H

2O

2 hoitoa. Palkit ovat keskiarvo ± SE 3 itsenäisestä kokeesta, * P 0,05. B: organelle erityisiä TERT vektorit transfektoitu MCF7 soluihin. Paneelit kuten on kuvattu A. C-F: kvantifiointi solujen korkea DNA-vaurioita polttopistettä transfektoitu ja YK-transfektoitujen solujen kanssa ja ilman X-säteilytys. C: MCF7 kuluttua 20 Gy X- säteilytys. D: U87 jälkeen 20 Gy X-säteilytys. E: MRC-5 /SV40 kuluttua 10 Gy X-säteilytys. Palkit ovat keskiarvo ± SE 3 erilliselle kokeelle. * P 0,05.

Koska suuria määriä tuman DNA vaurioita arvellaan vähentävän solujen eloonjääntiä analysoimme onko käytetty stressiä hoitoja myös vaarantaa solujen eloonjäämistä ja apoptoosin. Käsittelimme 3 solulinjat transfektoidaan sekä TERT ampuja vektorit H

2O

2 ja X-säteilytys ja määritettiin apoptoosin induktio käyttäen vasta-ainetta vastaan ​​aktivoitu kaspaasi 3. Kiehtovaa, ei yksittäinen solu on transfektoitu mitokondrioiden TERT osoitti mitään merkkejä apoptoosin, kun taas noin 20%: un-transfektoitujen solujen välillä 40-60% soluista, jotka ilmentävät ydin- ampuja olivat apoptoottisia (Fig. 4). Tämä tulos vahvistaa, että todellakin indusoi DNA-vaurioita löytyy solujen ydinvoiman TERT lokalisointi vaikuttaa suoraan solujen selviytymistä taas mitokondrio TERT tehokkaasti suojaa apoptoosin. Selventämiseksi mekanismia, jolla mitokondrion TERT voivat suojella syöpäsolujen tuman DNA vaurioita mittasimme määrä mitokondrion ROS jälkeen H

2O

2 hoitoa ja säteilytys käyttämällä mitosox värjäystä mittana mitokondrioiden superoksidi sukupolven lisäksi myc-tert värjäystä ydin- ja mitokondrioiden ”ampuja” vektorit samassa 3 syöpäsolun riviä (Fig. 5 A-E). Mitosox väriaine on tarttunut mitokondrioiden membraanilla potentiaali erityisellä tavalla. Sen poissulkemiseksi, että eri kalvojännite- aiheutti vaikutuksia, mittasimme mitokondrion kalvon potentiaalia HeLa ja MCF7-solut transfektoitu sekä TERT- ampujien ja vertasi niitä un-transfektoiduissa soluissa jälkeen H

2O

2 kohtelu sekä X y-säteilyä. Mukaisesti aikaisempien havaintojemme lisääntyneen mitokondrion kalvon potentiaalia MRC-5 /hTERT verrattuna emo-fibroblastien tulokset vahvistavat merkittävästi suuremman kalvon potentiaalia soluissa yli-ilmentävät mitokondrion TERT, joka on HeLa-soluissa on jo selvää, jopa ennen stressiä hoitoa (Fig. S4). Siksi mitosox tasoja löytyy meidän kokeiluja todella edustavat eri ROS tasoilla, jotka ovat riippuvaisia ​​TERT lokalisointi. Huomasimme, että yli-ilmentyminen mitokondrioiden TERT kaikissa solutyypeissä alensi merkitsevästi ROS tasoilla jälkeen H

2O

2 hoitoa ja säteilytys verrattuna un-transfektoituja soluja tai jotka yli-ilmentynyt ydin- TERT (Fig. S4 ).

kuvat ovat aktivoitua kaspaasi 3 (näkyy punaisena) A: Hela, B: MRC /SV40, C: U87 transfektoitujen solujen Mito TERT- ja ydin- TERT (myc-tag, näytetään vihreä) jälkeen 400 uM H

2O

2 hoitoa 3 h tai säteilyttämällä 20 Gy. D: kvantifiointi prosenttiosuus apoptoottisten solujen 3 solulinjoissa H

2O

2 hoitoa, E: kvantifiointi prosenttiosuus apoptoottisten solujen 3 solulinjojen jälkeen X-säteilytyksen. Bars hetkellä keskimääräinen ja keskivirhe noin 45 transfektoiduista soluista kohti kunnossa ja solulinjaa. * P 0,05.

Ylähavas: Kuvat ovat ROS värjäytymistä (punainen, mitosox) ja tert lokalisointi (myc-tag, vihreä) jälkeen organelle erityiset TERT- transfektion ja 100 uM H

2O

2 hoitoa 3 h HeLa-soluissa. Ylärivi: mito- TERT, alarivissä: ydin- TERT. Nuolet osoittavat transfektoiduissa soluissa. Alempi paneeli: kvantifiointi ROS tasoilla mitattuna prosentteina mitosox positiivinen alue koko sytoplasma käyttämällä ImageJ transfektoiduissa ja un-transfektoiduissa soluissa. B: MCF7-solut, paneelit kuten on kuvattu A. C: kvantifiointi ROS U87 soluissa 3 tunnin kuluttua 100 uM H

2O

2 hoitoa. D-F: kvantifiointi ROS tasoilla jälkeen X-säteilytys. D: MCF7 jälkeen 20 Gy X-säteilytys. E: U87 jälkeen 20 Gy X-säteilytys F: MRC-5 /SV40 kuluttua 10 Gy X-säteilytys. Pylväät edustavat keskiarvoa ± SE 3 erilliselle kokeelle. * P 0,05.

Jälleen käytetään MRC-5 /SV40 soluja ilman endogeenisiä telomeraasin vahvistaa tulokset 3 syöpäsolulinjasta ja löysi samoja suojaava vaikutus mitochondrially paikallinen TERT on ROS tasoilla ( kuva 5F). ROS tasoja soluissa, jotka ilmentävät ydin- TERT ”ampuja” olivat yleensä ei eroa un-transfektoiduista soluista, lukuun ottamatta MCF7 ja MRC-5 /SV40-solut säteilytyksen jälkeen, jossa ydin- ampuja transfektoiduista soluista osoitti, alempi ROS tasoilla kuin un-transfektoiduissa soluissa.

Nämä tiedot viittaavat siihen, että shuttling osaksi mitokondrioita telomeraasin /TERT ei ainoastaan ​​suojaa organelle, mutta vähentämällä mitokondrioiden superoksidituotantoa myös epäsuorasti suojaa tuma DNA-vaurioita. Samanlaisia ​​havaintoja telomeraasin shuttling alkaen nucleoplasm ja nucleoli oli raportoitu aiemmin alle ionisoivan säteilyn ensisijainen ja syöpäsolujen [21]. Kirjoittajat olivat arveltu, että telomeraasi voisi negatiivisesti häiritä korjaus entsyymien tumassa olosuhteissa lisääntyneen DNA-vaurioita ja stressiä. Tuloksemme näyttävät tukevan tätä ehdotusta, että telomeraasi voisi olla ”toivottuja” tumassa olosuhteissa DNA-vaurioita. Telomerase on osoitettu ”parantua” kromosomit yrittämällä muoto DNA korjaus lisäämällä telomere sekvenssit rikki telomeerivasta päihin [22]. Tämä ei ehkä johda oikea DNA korjaukseen, kuten tiedetään suorittaa todellinen DNA korjaus-.

Tuloksemme osoittavat, että mitokondrioiden telomeraasin lokalisointi nimenomaan vähentää mitokondrioiden ROS sukupolvi ja solujen oksidatiivisen stressin jälkeen induktion eksogeenisen stressiä tuottamat H

2O

2 tai säteilytys syöpäsoluissa ja saattavat siten estää vahingoittumisen tuman DNA. Se voisi myös selittää, miksi sukkuloimisen telomeraasin tumasta mitokondrioissa näyttää edistää solujen eloonjäämistä, kun taas solut, joissa telome- ei voi lähteä tumaan DNA-vaurioita kertymistä havaitaan.

Diehn ja kollegat raportoi äskettäin, että syöpä kantasolut, jotka tuottivat vähemmän ROS johtui antioksidantti ilmaisun kertynyt vähemmän DNA-vaurioita jälkeen ionisoivan säteilyn [23]. Olisi mielenkiintoista selvittää, onko näissä soluissa on myös enemmän ulkopuolelle telomeraasia kuin ei-syöpä kantasolut säteilytyksen jälkeen. On osoitettu, että syövän kantasolut ilmentävät korkeita telomeraasiaktiivisuutta tasolla; mutta ei tiedetä yhtään mitään TERT shuttling näissä soluissa [24].

Olemme osoittaneet aiemmin, että eksogeeninen ROS sukupolvi Säteilyn fibroblasteissa vahingot mitokondrioita ja nopeuttaa ydinvoiman DNA-vaurioita luotu positiivinen takaisinkytkentäsilmukka [25]. Ehdotamme, että tällainen funktionaalinen vuorovaikutus mitokondrioita ja ydin on olemassa myös syöpäsoluissa ja muissa telomeraasin positiivisten solujen, joissa telomeraasin tulee mitokondrioita, jotta vähennetään ROS joita indusoi kemoterapeuttisten ja säteilytys. Näin ollen vaikuttaa siltä, ​​että anti-syövän hoidot voivat aiheuttaa uusia, tähän asti tuntematon mekanismi telomeraasi shuttling joka estää ydinvoiman DNA-vaurioita vähentämällä mitokondrion ROS sukupolvi kautta induktion telomeraasi shuttling. Koska sen heterogeeninen malli voisi myös selittää vastus joidenkin, mutta ei kaikkien, syöpäsolut vastaan ​​terapeuttisia hoitoja.

Materiaalit ja menetelmät

Solut

HeLa, MCF7, U87 ja MRC5 /SV40 solut peräisin ATCC. MRC5 ostettiin ECACC (Lontoo). hTERT yli-ilmentyminen suoritettiin käyttäen retroviruksen transfektion hTERT kuten aiemmin on kuvattu [10]. U 87 ja MRC5 /SV40-soluja viljeltiin MEM ja DMEM vastaavasti täydennetty 1% ei-välttämättömiä aminohappoja, 10% FCS: ää (Sigma), 2 mM glutamiinia ja 1% penisilliini /streptomysiiniä. Kaikki muut solutyypit viljeltiin DMEM: ssä (PAA), joka sisälsi 10% FCS: ää (SIGMA), 1% penisilliini /streptomysiiniä (PAA) ja 2 mM glutamaattia (Gibco). Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa ympäristön happea ja 5% CO

2.

Hoidot

Solut ympättiin 1 tai 2 päivää ennen käsittelyä päälle 19 mm peitinlaseilla 12-kuoppalevyillä immuno-fluoresenssivärjäyksellä (5 x 10

4 per kuoppa).

H

2O

2 (SIGMA) käsittely suoritettiin seerumittomassa alustassa osoitetut ajat ja pitoisuuksina. Käytetty H

2O

2 pitoisuuksia oli optimoitu kullekin erilaista koetta. X-säteilytys 10 ja 20 Gy suoritettiin käyttäen Faxitron-yksikköön (Elektron Technology, UK). Kaikki säteilytys kokeissa (paitsi apoptoosin analyysi) solut kiinnitettiin ja analysoitiin 20 minuutin käsittelyn jälkeen. Solut kiinnitettiin käyttämällä 4% paraformaldehydillä PBS: ssä 10 minuutin ajan.

Immuno-fluoresenssivärjäyksellä ja Imaging

Solut kiinnitettiin coverslip käyttäen 4% paraformaldehydillä 10 minuutin ajan. Yhden tai kahden immunovärjäys suoritettiin seuraavien ensisijaisen vasta: hiiri γH2A.X (Upstate), kanin anti-TERT (Rockland), kanin anti-Ki67 (Abcam) ja anti myc-tag (Abcam). Spesifisyys ja puute taustavärjäyksen käytetyn tert-vasta on vahvistettu (Fig. S5). Toissijainen vasta-aineet olivat: vuohen anti-hiiri ja kani Alexafluor 594 ja 488 (Molecular probes /Invitrogen). Tumavärjäystä havaittiin käyttäen DAPI. Kuvat kullekin kanavalle saatiin käyttäen AxioImager Z1 (Zeiss) varustaa sopiva suodatin kuutioita spektrisesti erottaa Alexafluor

488 ja Alexafluor

594, varmistaen no bleedthrough osaksi /joko fluoroforin (perustettu aikaisemmin, tuloksia ei ole esitetty) . Kuvat analysoitiin sen jälkeen käyttäen ImageJ. Kynnysarvot määritellään kunkin kuvan erikseen.

konfokaali fluoresenssimikroskopia ja Co-lokalisointi Analysis

Solut ladattiin 400 nM mitotracker vihreä (Molecular Probes) 30 minuuttia 37 ° C: ssa ennen kiinnitystä ja värjättiin anti-tert-ainetta ja Alexa Fluor® 594. kuvat otettiin käyttäen Zeiss LSM 510 on varustettu 63 x 1,4 NA tavoitteen kanssa pinhole asetettu 1 Airy yksikkö (Zeiss, Saksa). Z pinot saatiin jokaista 100 nm jokaisen solun (näytteenotto 2 x Nyquist kriteerit). Kuvat otettiin deconvolved ja analysoitiin sitten esine kolokalisaation 3D käyttäen Huygens ohjelmistoa (SVI, Alankomaat). Sillä rinnakkaispaikantumisen analyysi ja kuvan valmistelu, deconvolved kuvat luovutettiin osaksi 3-ulotteinen määriä. Single-solut eristettiin uudelleen kuva ja yhtenäiseen esineitä (mitokondrion ja Tert) tunnistettiin käyttäen ”Object rinnakkaispaikantumisen” in Huygens joiden cut-off jättää mitään esineitä pienempi kuin yksi mitokondrioissa vuonna mitotracker vihreä kanava. Huygens sitten lasketaan Pearsonin n korrelaatio coefficent kunkin solun 3 ulotteinen rinnakkaispaikantumisen välillä mitokondrioita ja Tert värjäystä. Tämän ansiosta voimme ennustaa todellista rinnakkaispaikantumisen (rajoissa diffraction rajoitus) kahden väriaineita riippumatta eri aallonpituuksilla.

organelle Erityisiä Transfektio

TERT- sisältävä ydin- ja mitokondrioiden organelle tiettyjä vektorit ( pCMV-myc-mitoTERT ja pCMV-myc-nucTERT olivat ystävällinen lahja J. Haendeler ja Joachim Altschmied, Düsseldorf, Saksa ja kuvattu aiemmin [9], [11]). Ohimenevä transfektio suoritettiin käyttämällä Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, USA) Mito-tert ja nuc-hTERT ”ampuja” vektoreita. Keskimääräinen transfektiotehokkuudet 48 tuntia transfektion jälkeen oli välillä 25 ja 30%. Ohimenevästi transfektoituja soluja käsiteltiin 2 päivää transfektion jälkeen joko H

2O

2 tai säteilyttämällä.

määritys ROS-taso

Solut värjättiin 5 uM mitosox (Invitrogen, USA ) 15 min kuluttua H

2O

2 hoitoa tai säteilytys ennen kiinnittämistä ja vasta-värjäys. ROS tasot määritettiin prosenttiosuutena sytoplasmisen mitosox signaalin koko soluliman alueella käyttäen Image J (https://rsbweb.nih.gov/ij/).

analyysi DNA Damage

Analysis DNA-vaurion suoritettiin käyttämällä immunologiseen fluoresenssia joko yhtenä värjäys γ-H2A.X tai kaksinkertainen värjäys tERT. Solut kiinnitettiin, permeabilisoitiin PBG (PBS, BSA, fishskin gelatiinia ja 0,5% Triton) ja γ-H2A.X vasta-ainetta soluihin ja sitten värjättiin Alexa Fluor® 594. Anti myc-tag ja Alexa Fluor® 488 oli visualisoida Transfektoituja TERT proteiinia. Objektilasit tutkittiin käyttämällä Zeiss Axiovision fluoresenssimikroskooppia (Zeiss, Saksa). Analysointiin DNA vahingoittaa määrä DNA-vaurioita pesäkkeitä laskettiin kullekin TERT lokalisointi erikseen 20-40 solua per ryhmä ja solulinjaa.

mittaus TERT syrjäytymisen Hinta

kunkin yksittäisen solun, tERT lokalisointi manuaalisesti määrällisesti vertaamalla telomeraasi- signaaleja ulkopuolella ydin Image J. Subsellulaariset alueet määritettiin ydin- ja sytosolin alueiden avulla vapaalla kädellä valinta. Ilmentymissignaaleja valitulla alueella arvioitiin käyttämällä alalaskutoimituksen toiminnon jälkeen kynnystämisen kohinan poistamiseksi. Tulos kunkin yksittäisen solun osoitti prosentteina TERT signaali ilmaistaan ​​subsellulaarisessa:

% TERT ydin- ilmaisu = tert-signaalin tumaan alueella /yhteensä TERT signaali x 100,

% TERT soluliman ilmaisu = TERT signaali soluliman alueella /yhteensä TERT signaali x 100. Keskimääräinen prosenttiosuus ydin- ja sytoplasman lokalisointi TERT vähintään 30 yksittäiset solut otettiin määrittää keskimääräinen prosenttiosuus koko väestöstä.

Korrelaatio Cellular TERT- lokalisointi ja DNA Damage Level

luokiteltu lokalisointi TERT osaksi 3 luokat: ydin- TERT (N): 75% -100% TERT signaali oleskelee tumassa, sytoplasman TERT (C): 75% -100% TERT signaalin asuinpaikka tumaan ja kaikkien muiden prosentit luokan väli lokalisointi (I). Kunkin 3 luokat määritimme määrä γH2A.X pesäkkeitä noin 40-100 solua solulinjan.

Analyysi Apoptosis

Hela, U87 ja MRC /SV40-soluja transfektoitiin ydin- ja mitokondrioiden TERT ampuja. 2 päivän kuluttua he saivat joko 400 uM H

2O

2 tai 20 Gy säteilytys ja jätettiin 1 enemmän päivä (U87 ja MRC /SV40) tai 2 päivää HeLa johtuen tunnetun viiveen apoptoosin induktio nämä solut. Kiinnityksen jälkeen solut värjättiin myc-tag tert ja aktivoitu kaspaasi 3 (Abcam), jotta etiketti apoptoottisia soluja. Tulokset on määritetty 30-150 transfektoiduista soluista kohti solulinjan ja kunnossa.

Tilastot

Yksi tapa ANOVA suoritettiin käyttäen Sigma Plot (Systat Software Inc, USA).

tukeminen Information

Kuva S1.

Immuno-blot ydin- ja mitokondriofraktiosta HeLa ja MCF7-solut käsiteltiin 400 uM H

2O

2 5 päivän ajan.