Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

epiteelikasvaimet munasarjasyöpä on johtava syy Gynekologiasairauksien syöpäkuolemista. Useimmat potilaat reagoivat aluksi platinapohjaiseen kemoterapiaan jälkeen kirurgisten debulking kuitenkin taudin uusiutumiseen on hyvin yleinen ja lopulta platinaa vastus syntyy. Ymmärtäminen kasvainten kasvua, etäpesäkkeitä ja lääkkeille vastustuskykyiset uusiutumisen syvällisesti vaikuttaa hoitona munasarjasyöpää.

Methods /Principal Havainnot

Käyttämällä potilaskudos mikrosiru (TMA),

vuonna vitro

ja

in vivo

tutkimuksissa me raportoimme roolin on cystathionine-beeta-syntaasi (CBS), rikki- aineenvaihdunnan entsyymi munasarjasyöpäpotilailla. Me raportoimme tässä, että ilmaus cystathionine-beeta-syntaasi (CBS), rikkiä aineenvaihdunta entsyymi, on yleinen ensisijainen vakavasta munasarjasyöpäpotilailla.

in vitro

vaikutuksia CBS hiljentäminen voidaan peruuttaa eksogeeninen lisäravinteen GSH ja H

2S kemiallisen Na

2S. Hiljentäminen CBS on sisplatiinin kestävä potilaalle tehdä malli

in vivo

mukaan nanoliposomal toimituksen CBS siRNA estää kasvaimen kasvua, vähentää kyhmy muodostumista ja herkistää munasarjasyöpäsoluja sisplatiinia. Vaikutuksia tukee myös immunohistokemiallisesti, joka osoittaa vähennystä H Harvard Medical School, Yhdysvallat

vastaanotettu: 30 elokuu 2013; Hyväksytty: 18 syyskuu 2013; Julkaistu 13 marraskuuta 2013

Copyright: © 2013 Bhattacharyya et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Institutes of Health (NIH) CA135011 ja CA136494 (PM), CA 157481 (RB), CA148747 (WC) ja Mayo Clinic Naisten Cancer Program. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

viime vuosina gasotransmitter H

2S on saavuttanut valtavan merkityksen vaihtelevat prokaryoottiin selkärankaisen biologian ja laajentamalla [1] – [6]. Vuonna uraauurtava artikkelissa Roth et ai. osoittivat, että esikäsittely H

2S esti hypoksinen vahinkoa hiirissä vähentää radikaalisti eläimen ruumiinlämpöä ja aineenvaihduntaa, liittyy siihen, mitä havaitaan lepotilassa nisäkkäillä [7]. Vielä toisessa artikkelissa osoitetaan, että menetys H

2S syntetisointi entsyymejä herkistyneet lukuisia sairauden aiheuttavien bakteerien antibiooteille pääasiassa lisääntynyt oksidatiivinen stressi [8]. Kuitenkin rooli aineenvaihdunnan entsyymejä, jotka syntetisoivat H

2S ei ole kuvattu syövän biologian jää alle tutkittu.

Ihmisillä kaksi metaboliaentsyymeistä koota H

2S, cystathionine beeta-syntaasi (CBS ) pääasiassa lokalisoitu aivoissa ja maksassa kudoksissa ja cystathionine gamma lyase (CSE /CTH) esiintyy lähinnä lihaskudoksen [9]. CBS on ensimmäinen nopeutta rajoittava entsyymi transsulfuration reitin ja hyödyntämällä homokysteiinin (Hcy) tuottaa H

2S ja kysteiini esiaste cystathionine [10]. Paitsi soluunottoa kysteiinin synteesi on nopeutta rajoittava vaihe glutationin (GSH) tuotanto, arjen antioksidantti. Tutkimukset käyttäen CBS Knockdown hiiret ovat korostaneet, miten tärkeää on tämän entsyymin sydän- ja neurovaskulaarinen häiriöt, lähinnä aiheuttaa endoteelin toimintahäiriö, ajatellaan johtuvan tehostetun plasman Hcy tasoilla [11] – [13]. Kuitenkin lisäravinteen B-vitamiini

12 ja foolihappoa (jotka helpottavat remetylaatiossa Hcy ja metioniini) vähensi verenkierrossa Hcy tasoilla vielä onnistunut vähentää oireita sydän. Toisaalta, B-vitamiini

6, kofaktorina CBS, ei vähentää verenkierrossa Hcy kasvuun viime kliinisissä tutkimuksissa [14], [15]. Nämä tulokset osoittavat, osallistuminen muiden komponenttien lisäksi Hcy, olevan keskeisiä toimijoita edellä mainituille sairauksille.

Kun otetaan huomioon merkittävä soluja suojaava toiminta fysiologista H

2S ja glutationi me posited että syöpäsolut voisi hyödyntää tätä ainutlaatuista piirre CBS tuottaa H

2S alaisena oksidatiivisen stressin tai kun sytotoksinen loukkaus. Tässä yhteydessä olemme keskittyneet epiteelin munasarjasyövän, joka on johtava syy Gynekologiasairauksien syövän naisten yleisin kuolinsyy. Useimmat potilaat reagoivat aluksi platinapohjaiseen kemoterapiaan jälkeen kirurgisten debulking kuitenkin taudin uusiutumiseen on hyvin yleinen ja lopulta platinaa vastus syntyy. Mekanismia toistuminen ja kehittymistä huumeiden resistenssifenotyyppi kuitenkin edelleen huonosti [16], [17]. Parhaan tietomme mukaan tämä on ensimmäinen raportti, jossa kuvataan rooli CBS ylläpitämisessä solujen terveyden munasarjasyöpäsoluja virittämällä solujen redox käyttäytymistä ja mitokondrioiden energiantuotannon. Hiljentäminen CBS merkittävästi estyy munasarjasyövän solujen lisääntymistä, metastaattisen kyhmy muodostumista ja herkistää heidät sisplatiini sekä

in vitro

ja prekliinisissä potilaalle tehdä hiirimalleihin

in vivo

. Mekanistisesti hiljentäminen CBS vakavasti vähentää solun GSH tasoilla, heikentää H

2S tuotanto, aktivoi tuumorisuppressorit kuten p53 ja estää NF-KB: n aktivoitumisen. CBS lokalisoituu mitokondrioiden markkereita syöpäsoluissa, ja hiljentäminen CBS vähentää mitokondrioiden hapenkulutusta kanssa samanaikainen kasvu reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) tuotanto. Nämä tulokset yhdessä viittaavat siihen, että CBS on tärkeä rooli säätelyssä redox tasapainoa ja aineenvaihduntaa munasarjasyöpäsoluja edistää kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

Patient näytteitä.

kaikki 210 osallistujaa ilmoittautunut kautta 2009 jolta kudosta TMA saatiin, edellyttäen kirjallinen lupa varten IRB-hyväksytty protokolla (09-008365) ja kliiniset tiedot oli otetun kaikissa tapauksissa. Kaikki tutkimukset hyväksyttiin Mayo Clinic Institutional Review Board (Protocol # 09-008365).

Eläinkokeet.

Nainen atyymisissä nude-hiirten (NCR-nu) hankittiin National Cancer Institute -Frederick Cancer Research ja Development Center (Frederick, MD). Kaikki hiiret majoitettu ja ylläpidettiin spesifisissä patogeenivapaissa olosuhteissa hyväksytyissä tiloissa American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care (Acuf # 01-12-01531) ja voimassa olevien määräysten ja standardien Yhdysvaltain Department of Agriculture, USA Department of Health and Human Services, ja NIH. Kaikki tutkimukset hyväksyi Teksasin yliopiston MD Anderson Cancer Center Institutional Animal Care ja käyttö komitea.

reagenssit

Tiedot kaikkien reagenssien annetaan

Tiedoston S1.

OV167 ja OV202 (saatu V. Sridhar, Mayo Clinic) solulinjoja kasvatettiin MEM ja DMEM vastaavasti täydennetty 10% FBS: ää ja 1% antibioottia (penisilliini /streptomysiiniä). OVCAR-5 oli peräisin ATCC ja kasvatettiin DMEM: ssä, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia ja 1% antibioottia (penisilliini /streptomysiiniä). A2780-soluja (Sigma-Aldrich) kasvatettiin RPMI 10% FBS ja 1% antibioottia (penisilliiniä /streptomysiiniä) mukaan palveluntarjoajan suositusta. OVCAR-5-soluja kasvatettiin DMEM korkea glukoosi, jossa oli 10% FBS: ää, L-glutamiinia ja NEAA. OSE (TST) soluja kasvatettiin MCDB105 median 15% FBS: ää ja 1% hygromysiini. A2780 /CP-70-solulinjoja kasvatettiin mukaan meidän aiemmin julkaistujen menetelmien [18]. SKOV3 solulinja ATCC ja SKOV3-ip V. Sridhar laboratoriossa (Mayo Clinic) kasvatettiin McCoyn 5A-alusta täydennettynä 10% FBS ja 1% antibiootti.

TET ja rakentaminen kudossiruina (TMA)

TMA luotiin formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut kasvaimet 210 Mayo Clinic tapauksissa ilmoittautunut joulukuuhun 2009 kaikki osallistujat kirjallinen lupa varten IRB-hyväksytty protokolla (09-008365) ja kliiniset tiedot oli otetun kaikissa tapauksissa. Kaikki tutkimukset hyväksyttiin Mayo Clinic Institutional Review Board (Protocol # 09-008365).

Käytimme automaattista Beecher Instruments ATA-27 ryhmittäjällä seuraavat patologi tarkastelun osoittaa kasvaimen sijainnista. Kolme 0,6 mm ytimet poistettiin kussakin tapauksessa parafiiniblokkiin ja sijoitetaan vastaanottajan parafiiniblokkiin mukaan satunnaistettu sähköisen TMA kartalla. Vastaanottajalohkot viipaloitiin 5-um: n leikkeitä ja asennettu ladattu dioja.

Antibody, immunohistokemia, ja Scoring

TMA värjäys suoritettiin Leica BOND auto stainer käyttäen bond polymeeri tarkempaa havaitseminen pakki (luettelo # DS9800, Leica Microsystems). Dioja altistettiin ensisijainen tunnistavaa vasta-ainetta CBS (1:1000, polyklonaalinen A01, Abnova), optimoinnin jälkeen värjäyksen edellytykset positiivisen kontrollin kudoksissa (follikkeliepiteelisolujen kasvaimia). Negatiiviset kontrollit sisälsivät epäspesifinen isotyypin haun ja negatiivisen hiiren seerumia (1:500); Objektilasit pisteytettiin itsenäisesti 2 kirjoittajaa (RB ja EB), ja poikkeamat ratkaistiin gynekologista patologi (

Tiedoston S1

).

Transfektio ja knockdown

Solut transfektoitiin kanssa sekoitetun ohjaus siRNA tai CBS siRNA (Hs_CBS_5 FlexiTube siRNA (SI02777159, QIAGEN) /SASI_Hs01_00214623 (Sigma)) mukaan HiPerFect® transfektion agentti suspensiossa pienin muutoksin valmistajan protokollan (

Tiedoston S1

).

solujen lyysi ja Western-blottaus

Solulyysi ja western blottaus suoritettiin kohti jo julkaistu menettely [19]. Ensisijainen vasta-aineita käytettiin pitoisuutena seuraavasti: CBS (1:1000 laimennus), CSE-vasta-aine (1:1000), α-tubuliinin (1:2000), β-Actin (1:1000 laimennus), NF-KB: n p65 (1:1000 laimennos) ja p53-vasta-ainetta (1:200 laimennus).

Realtime PCR

Kokonais-RNA eristettiin transfektoiduista soluista käyttäen RNeasy Plus Mini kit (QIAGEN). RNA ensimmäisen retro- transskriboidun käyttäen iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad), ja sitten reaaliaikaisiin PCR suoritettiin käyttäen TaqMan® SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems). Alukkeet ihmisen CBS (PPH13484B-200) ja beeta aktiini (PPH00073G-200 ACTB) olivat QIAGEN. Sillä CSE, räätälöityä alukkeita (eteenpäin: CAGCAATTACACCAGAAACCAAG ja Reverse: CAGCCTTCAATGTCAATCACC) käytettiin. Vertaileva C

t menetelmää käytettiin lasketaan suhteellinen runsaus mRNA ja verrattiin beeta aktiinin ilmaisun [20]. Kokeet suoritettiin kolmesti kolmena kappaleena.

proliferaatiomääritystä

Transfektoidut munasarjasyövän solut kerättiin trypsinoimalla, lasketaan ympättiin 24-wellplates (4 x 10

4 kuoppaa kohden) ja viljeltiin 24 tunnin ajan ja (3H) tymidiinin määritystä suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [21] (

File S1

).

homokysteiini (Hcy) mittaus

Hcy tasot solulysaateista Sc-siRNA ja CBS siRNA käsiteltiin A2780-soluja määritettiin 48 h transfektion jälkeen nestekromatografia tandem-massaspektrometrialla (LC /MS /MS) (

File S1

).

homokysteiini Yliannostus kokeilu

Noin 10

4 A2780, OSE tai SKOV3–ip solua kuoppaa kohti maljattiin 96-kuoppaiselle levylle vastaavien kasvun elatusaineet. 24 tunnin kuluttua, eri pitoisuuksia Hcy liuotetaan kasvua viljelyalustassa lisättiin soluihin ja inkuboitiin 24 tunnin ajan CO

2-inkubaattorissa. 24 h hoidon jälkeen, solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTS-määritys, kuten edellä mainittiin.

H

2S Measurement

H

2S pitoisuudet käsittelemättömän tai AOAA käsitelty munasarjasyöpäsoluja mitattiin jälkeen kirjallisuudessa raportoitu protokollaa vähäisin muutoksin [22]. H

2S pitoisuus kutakin näytettä laskettiin vapaaksi kalibrointikäyrä Na

2S.

H

2S Rescue Experiment

A2780-soluja transfektoitiin sekoitetun ohjaus siRNA tai CBS ohjaus siRNA kuten edellä on mainittu. 48 h transfektion jälkeen, solut otettiin talteen trypsinoimalla ja 10

4 solua /kuoppa maljattiin 96-kuoppaiselle levylle. 12 tunnin kuluttua eri pitoisuuksia Na

2S liuotettiin RPMI-10% FBS: ää, lisättiin soluihin ja inkuboitiin 24 tunnin ajan CO

2-inkubaattorissa. 24 tunnin jälkeen solujen elinkykyisyys arvioitiin MTS-määritys, kuten edellä mainittiin.

GSH Pitoisuus

Määritys suoritettiin valmistajan protokollan (Cayman Chemicals). Lyhyesti, munasarjasyövän solulinjoissa transfektoitiin salattu ohjaus- tai CBS siRNA 60 mm viljelymaljoille, kuten edellä mainittiin. 48 tunnin kuluttua solut kaavittiin irti ja kerättiin 50 mM MES, pH 6,0 ja lyysattiin sonikoimalla 4 ° C: ssa. Sitten lysaattia sentrifugoitiin 14000 rpm: llä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja kirkas supernatantti (toisin sanoen solulysaatti) kerättiin. Lysaatti de-proteinated käyttäen TEAM reagenssia ja solun kokonais-GSH Standardia vastaan ​​määritetty käyrä tuotetaan samanaikaisesti mittaamalla absorbanssi 405 nm: ssä 25 min lisäämisen jälkeen määrityksen cocktail. Koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja merkitys määritettiin käyttämällä kaksipuolista Studentin t-testiä, P≤0.05 katsottiin merkitseväksi.

GSH Rescue Experiment

A2780-soluja transfektoitiin sekoitetun ohjaus siRNA tai CBS ohjaus siRNA kuten edellä on mainittu. Post 48 h transfektion jälkeen solut kerättiin trypsinisaatiolla ja 10

4 solua /kuoppa maljattiin 96-kuoppaiselle levylle. 12 tunnin kuluttua eri pitoisuuksia pelkistettyä glutationia liuotetaan RPMI-10% FBS: ää, lisättiin soluihin ja inkuboitiin 24 tunnin ajan CO

2-inkubaattorissa. Post 24 h käsittelyn jälkeen solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTS määrityksessä Cell Titer 96® (Promega) kohti valmistajan protokollaa. Solujen elävyys on ilmaistu prosentteina suhteessa absorbanssi käsiteltyjen solujen käsittelemättömiin kontrolleihin.

ROS Pitoisuus

ROS-määritys suoritettiin A2780-soluissa 48 h transfektion jälkeen, jossa sekoitetun ohjaus- tai CBS siRNA jälkeen modifikaatio aiemmin julkaistun menetelmän mukaisesti käyttäen virtaussytometriaa [23] (

File S1

).

Luciferase Reporter Assay

Noin 2 x 10

4 lukumäärä A2780 solua maljattiin kuoppaa kohti 96-kuoppalevyllä, päivää ennen transfektiota. Seuraavana päivänä solut transfektoitiin seoksella NF-KB: n ajettu tulikärpäsen lusiferaasi-plasmidia (100 ng), renilla lusiferaasi-plasmidia (50 ng) ja siRNA (200 nM) kuoppaa kohden käyttäen Lipofectamine ja Plus-reagenssia (Invitrogen) valmistajan protokollan . Post 48 h transfektion elatusaineet heitettiin pois ja analysoitiin tulikärpäsen lusiferaasiaktiivisuus ja Renilla lusiferaasiaktiivisuus käyttäen Dual Glo lusiferaasimäärityssysteamiä (Promega) kohti valmistajan menetelmällä. Suhde tulikärpäsen lusiferaasin aktiivisuuden Renilla lusiferaasiaktiivisuutta mitattiin luminesenssi laskettiin sitten ja tiedot normalisoituivat. Koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja merkitys määritettiin käyttämällä kaksipuolista Studentin t-testiä, P≤0.05 katsottiin merkitseväksi.

konfokaalimikroskopialla

lokalisaatio CBS määritettiin immunovärjäyksellä seuraa konfokaalimikroskopialla. Noin 1,5 x 10

3 solua maljattiin kohti kammion 4-chambered dioja. 12 tunnin kuluttua solut käsiteltiin 200 nM Mitotracker Green (Invitrogen) 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa täydellistä väliainetta kiinnitettiin 4% PFA, läpäiseviksi 0,1% Triton X-100 PBS: ssa, blokattiin 4% BSA: lla PBS, värjättiin ensisijainen CBS-vasta-ainetta (laimennus 1:100) 1% BSA-PBS: llä, blokattiin 5% vuohen seerumissa 1% BSA-PBS: llä ja värjättiin Cy3-leimattua vuohen anti-kani sekundääristä vasta-ainetta. Solut pestiin 3 x 3 min PBS jokaisen vaiheen jälkeen aikana Immunovärjäyksen. Kuvat hankittiin käyttäen Zeiss LSM510 mikroskoopilla ja käsitellään käyttämällä ImageJ (NIH).

hapenkulutus Kokeet

korkean resoluution respirometria (Oxygraph, Oroboros Instruments, Innsbruk, AT) käytettiin mittaamaan hapen kulutus hinnat ehjien solujen [24]. DatLab ohjelmisto (Oroboros Instruments, Innsbruk AT) käytettiin määrittämään O

2 flux akuuttien AOAA hoito ja siRNA käsitellään A2780 soluissa. Happi virtausnopeudet ilmaistiin miljoonasosina solujen

(File S1).

Mitokondrioiden ROS Production

Mitokondrioiden ROS tasot määritettiin muokatussa ohjaus siRNA ja CBS siRNA käsiteltyjen solujen 48 h transfektion by MitoSOX (Invitrogen) värjäys toteutettiin kohti kirjallisuuden protokollaa [25]

(Yksityiskohtaiset in File S1)

.

sitraattisyntaasin (CS) Activity

CS-aktiivisuus mitattiin spektrofotometrisesti kokosolulysaateista A2780-solujen käsittelyn jälkeen eri annoksilla AOAA 3 tuntia sen jälkeen, kun kirjallisuudessa on raportoitu menetelmä, [26].

NAD /NADH: n suhteen mittaus

NAD /NADH-suhde mitattiin käyttäen Abcam NAD /NADH Assay Kit (ab65348) in kokosolulysaateista mukaan valmistajien protokollan (tarkempia tietoja

Tiedoston S1

).

Yhteensä ATP ja ADP /ATP-suhde

Yhteensä ATP tasot CBS vaiennetaan A2780 soluissa ja AOAA käsiteltyjen A2780 soluissa mitattiin käyttämällä Sigma adenosiini-5′-trifosfaatti (ATP) Bioluminescent Assay Kit (Flaa) ja ADP /ATP-suhde mitattiin Abcam n ADP /ATP-suhde iinianalyysikitissä kohti valmistajien protokollia. Yksityiskohtainen protokolla

Tiedoston S1.

Liposomalia siRNA valmistelu

in vivo

toimitus, siRNA sisällytettiin DOPC kuten aikaisemmin on kuvattu [18]. Tarkempia tietoja

Tiedoston S1.

Orthotopic malli munasarjasyövän

Ennen injektiota kasvainsoluja hiiriin (8-12 viikkoa vanhoja), solut pestiin kahdesti PBS, erillinen 0,1% kylmä EDTA, sentrifugoidaan 7 minuuttia, ja liuotetaan uudelleen HBSS (Invitrogen). Solujen elinkelpoisuus varmistettiin trypaanisinieksluusiolla. Kasvaimet perustettu i.p. injektio 1,0 × 10

6A2780 /CP20 soluja. Perustamisensa jälkeen tämä kasvain malli heijastaa kasvumalli kehittyneen munasarjasyövän [27]. Vaikutusten arvioimiseksi siRNA hoidon kasvaimen kasvua, hoito aloitettiin 1 vk kuluttua i.p. kasvainsolujen injektion. Yksilöt jotka tekivät ruumiinavauksen, kasvain kokoelmat ja kudosten käsittely sokaisi hoitoon ryhmätyöt (File S1).

immunohistokemia Kasvaimen Näytteitä

lokakuu pakastetut kasvainnäytteestä leikeltiin ja värjättiin H 0,001) ja korkeamman asteen syöpiä (64,7% vs. 31,6%, asteen 3 tai 4 vs. luokka 1 tai 2, p = 0,005) (Fig. 1A). Vaikka tilastollisesti merkitsevästi eri puolilla vaiheisiin, ilme oli edelleen läsnä 35% alkuvaiheen kasvaimia. Kun otetaan huomioon vain 149 serous tapausten suurempi kohortin ilmentyminen oli kohtalaisesta vahvaa 8/11 alkuvaiheen (FIGO vaiheet I ja II) syövät, mikä viittaa siihen, että CBS ilmaisu on suhteellisen varhaisessa ominaisuus vakavasta munasarjojen syöpien. On osoittanut ekspressiota CBS ihmisen tuumorikudoksissa, vertasimme ilmentymistä CBS normaalissa munasarjan vs. syöpäsolulinjoilla. Käytimme kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: n (qRT-PCR) ja immunoblottaus arvioida ilmentymisen CBS mRNA ja proteiini tasoja vastaavasti (Fig. 1 B-D). Sekä mRNA ja proteiini tasolla, vähän tai ei lainkaan ekspressiota CBS havaittiin ei-pahanlaatuisia munasarjojen pinnan epiteelisolujen linja (OSE). Kuitenkin 4 ulos 6 syövän solulinjat ilmensivät merkitsevästi korkea CBS sekä proteiinin ja mRNA tasolla. Mielenkiintoista, ilmentyminen CSE havaittiin solulinjoja, jotka ilmaisivat vähän mitään CBS kuten OSE, mikä viittaa käänteinen korrelaatio ilmauksia kahden entsyymin (Fig. 1 B). On vahvistettu, että CBS on ilmaistu sekä solulinjoissa ja primääri munasarjojen syövät seuraavan kerran pyrittiin tutkimaan toiminnallinen merkitys CBS.

(A) immunohistokemiallinen värjäys kudoksen microarray epiteelin munasarjasyöpä näytteitä. Edustavia kuvia näytetään of none (i), heikko (ii), kohtalainen (iii), (iv) vahva värjäytyminen. (B) ilmentäminen CBS ja CSE erilaisissa munasarjojen solulinjoissa määritettynä immunoblottauksella. α-tubuliinin käytetään lastaus ohjaus. (C) RT-PCR-data osoittaa ilmentymisen CBS-mRNA: n eri munasarjojen solulinjoissa. (D) RT-PCR-data osoittaa ilmentymisen CSE mRNA: n eri munasarjojen solulinjoissa. (E) vaikutus CBS Knockdown proliferaatioon OV202, SKOV3, A2780 ja A2780 /CP-70-solut ja (F) Immunoblottaus datan laajuuden määrittämiseksi siRNA-välitteisen knockdown. (G) vaikutus CBS estoa leviämisen OV202, SKOV3- ja A2780 soluissa AOAA (24 h hoito) määritetään MTS-määritys.

alassäätely CBS haittaa Cell Proliferation

in vitro

määrittämiseksi minkäänlaista roolia CBS munasarjasyövän solujen lisääntymisen, CBS hiljennettiin A2780, A2780 /CP-70, OV202 ja SKOV3- soluja käyttäen CBS-erityisiä siRNA. Sulkea pois epäspesifisen kohdentamista siRNA, knockdown ja lisääntymistä arvioitiin siRNA kahdesta eri lähteestä. Merkittävä laskun proliferaatiossa havaittiin kaikissa munasarjasyövän solulinjoissa tutkittiin kun CBS taintumisen mukaan (

3H) -tymidiinin (Fig. 1 E). Tehokas knockdovvn CBS (-80%) varmistettiin myös immunoblottauksella 48 tuntia transfektion jälkeen, verrattuna salattu siRNA transfektoituja soluja (Kuva. 1 F). Edelleen vahvistavat vaikutukset CBS hiljentäminen on munasarjasyövän solujen elinkykyä, käytimme tietyn kemiallisen inhibiittorin CBS, Aminoxyacetic Acid (AOAA) [8]. Elinkelpoisuus A2780, OV202 ja SKOV3-soluja, käsiteltiin eri pitoisuuksilla AOAA 24 h arvioitiin MTS-määrityksellä. Solujen elävyys laski jyrkästi 50% -7 mM AOAA konsentraatio edelleen annosriippuvaista laskua kunnes -10 mM pitoisuuden A2780 ja SKOV3- solut taas OV202 vaikutus oli vähäisempi (kuvio. 1G). Nämä tiedot viittaavat siihen, että raja-arvoa CBS toimintaa olemassa, joka tarvitaan ylläpitämään leviämisen munasarjasyöpäsoluja.

alassäätely CBS Alters Antioksidantit tasot, käynnistimet Apoptotic Cascades ja Parantaa Drug Herkkyys

Tuotos CBS esti reaktioita solun voisi olla, a) kertyminen Hcy b) väheni H

2S ja c) väheni cystathionine, edeltäjä GSH. Siksi testattiin ensin jos Hcy oli syynä alentunut lisääntymistä (Fig. 2A, B). Olemme täydennetty elatusaineet kasvavien pitoisuuksien kanssa Hcy ja sitten määrätietoinen elinkelpoisuus OSE ja munasarjasyöpä soluja (SKOV3-ip ja A2780) käyttäen MTS-määritystä. Lisääntyvä Hcy tasoa ei ole vaikutusta kannattavuuteen tahansa solujen testattujen mikä osoittaa, että alentuneesta H

2S tai cystathionine olivat luultavasti vastuussa heikentynyt lisääntymistä (Fig. 2B). Myös merkittävää eroa solujen Hcy tasot havaittiin mitattuna massaspektrometrialla kun CBS Knockdown A2780 soluissa, lisäksi sulje pois rooli Hcy aiheuttamisessa pienentää leviämisen (Fig. 2A). Kuitenkin puute merkittäviä eroja Hcy tasossa saattaa johtua Hcy voivat läpikäydä nopeaa muuntaminen metioniinin metioniini syntaasia tai voidaan hyödyntää CSE tuottaa H

2S mutta ei cystathionine [31].

(A ) muutos Hcy tasojen solulysaateista Sc-siRNA ja CBS siRNA käsitellään A2780 soluissa mitataan massaspektrometrillä. (B) Hcy yliannos koe osoittaa vaikutuksen Hcy (24 h hoito) proliferaatioon OSE, A2780 ja SKOV3–ip soluissa MTS-määritys. (C) H

2S tasoilla OV202, SKOV3- ja A2780 soluissa, sen jälkeen krooninen esto eri annoksilla AOAA 3 h. (D) Na

2S pelastus kokeilun jälkeen knockdovvn CBS A2780 soluissa. Soluja käsiteltiin eri annoksilla Na

2S 24 tuntia ja solujen elinkelpoisuus määritettiin MTS-määrityksellä. (E) Muutos yhteensä glutationin tasolle 48 h transfektion kanssa sekoitetun ohjaus ja CBS siRNA OV202, SKOV3- ja A2780-soluissa. (F) GSH pelastus kokeen jälkeen knockdovvn CBS A2780 soluissa. Soluja käsiteltiin eri annoksilla GSH 24 tuntia, ja solujen elinkyky arvioitiin MTS-määrityksellä.

Seuraavaksi testasimme osuus H

2S tukemaan leviämisen munasarjasyövän solulinjoissa . Annosriippuvainen väheneminen solunsisäisiä tasoja H

2S havaittiin 3h jälkeen inhibitio CBS eri pitoisuuksilla AOAA (Fig. 2C). Kokonaismäärän lasku H

2S tasoilla OV202 solujen oli vähäisempää kuin A2780 ja SKOV3- soluja, jotka voivat johtua olemassa vaihtoehtoisia H

2S synteesireitti sisään OV202 soluissa. Nämä tulokset osoittavat, että CBS on ratkaiseva rooli H

2S synteesiä näissä munasarjasyöpäsoluja. Kuitenkin rooli CSE ei voida sulkea pois tässä vaiheessa, vaikka se on epätodennäköistä, koska suurin osa munasarjasyövän solulinjoissa testataan tässä osoittaneet alhainen heikko ilmentyminen CSE sekä sanansaattaja ja proteiinitasolla. Edelleen vahvistaa roolia H

2S täydensimme elatusaineet kasvavilla pitoisuuksilla H

2S luovuttaja, natriumsulfidin (Na

2S) [(32, 33] muokatussa siRNA ja CBS siRNA käsiteltiin A2780 soluissa. Klo 5 mM Na

2S konsentraatio a -20% pelastus solujen elinkelpoisuutta havaittiin (Fig. 2D). Osittainen pelastamista soluproliferaation H

2S in CBS-vaiennetaan soluihin viittaa siihen, että reitit muu kuin H

2S biosynteesin kuten GSH voisi myös olla tärkeä rooli. Siksi seuraavaksi keskittyneet kului roolin GSH munasarjasyövän solujen lisääntymisen. hiljentäminen CBS laski merkitsevästi totaalisoluproteiinia glutationin (GSH + GSSG) tasot munasarjasyöpäsoluja dramaattisesti kontrolliin verrattuna soluihin (kuvio. 2E). Tärkeää on, joka on GSH pitoisuudesta riippuva pelastamiseen solujen elinkelpoisuuden havaittiin CBS vaiennetaan A2780-soluja, täydellinen rescue 2 mM konsentraatio 24 h (Fig. 2F). Samanaikaisesti kasvaa solujen ROS tasot havaittiin määritettynä H

2-karboksi DCF fluoresenssimääritys CBS-vaiennetaan A2780-soluissa (kuvio. 3A), jotka vahvistavat kanssa lasku koko solunsisäisen glutationin CBS-vaiennetaan soluissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että merkittävin vaikutus hiljentäminen CBS syöpäsoluissa estämällä solujen antioksidantti koneita. Tässä suhteessa kaksi muita molekyylejä, p53 ja NF-KB: n on osoitettu olevan erittäin redox-herkkien [34] – [38]. Todellakin, hiljentäminen CBS A2780 soluissa indusoi p53 ja vähentynyt ilmentyminen

RelA Twitter /p65-alayksikköä NF-KB (Fig. 3B). Mukaisesti, NF-KB: n on myös inhiboi lähes 50% CBS vaiennetaan A2780 soluissa määritettynä promoottori lusiferaasianalyysissä, jossa on useita NF-KB (p65 /p50) sitoutumiskohtiin (Fig. 3C). Kuitenkin suorempi rooli CBS paitsi parantaa ROS aiheuttamisessa laski NF-KB on myös mahdollista. Koska solunsisäinen glutationin ja ROS olivat huomattavan vaikutti CBS vaiennetaan soluissa, me seuraavaksi määritetään, onko yhdistelmänä sisplatiinin lisäisi terapeuttinen teho [39]. Itse hoito A2780 soluja sisplatiinin vähensi IC

50-arvo 13,1 uM ohjaus siRNA transfektoidut solut 7,9 uM CBS siRNA transfektoiduissa soluissa määritettynä MTS-määritys, 24 tunnin kuluttua sisplatiinihoitoon (Fig. 3d). Nämä tiedot osoittavat, että CBS toimimalla glutationin ja H

2S voi olla paljon selviytymisen etu syöpäsoluja vastaan ​​sytotoksista loukkaus.

(A) vaikutus CBS taintumisen (48 h transfektion jälkeen) koko- ROS taso määräytyy DCF ja kvantitoitiin virtaussytometrillä. (B) Immunoblottaus data esimerkkinä vaikutuksen CBS hiljentäminen on p53 ja NF-KB p65 in A2780 soluissa. β-aktiini toimii latauskontrollina. (C) lusiferaasireporttiterilla määritys, joka osoittaa CBS pudotus aktiivisuudesta NF-KB: n A2780 soluissa, jotka on transfektoitu tulikärpäsen lusiferaasi, jossa on useita NF-KB: n sitoutumiskohdan ja salattu ohjaus siRNA tai CBS siRNA.

paino-

-renilla lusiferaasia transfektoitiin normalisoi tulikärpäsen lusiferaasiaktiivisuus. (D) CBS hiljentäminen lisää aktiivisuutta sisplatiinin A2780 soluissa. The (•) ja (О) osoittaa sisplatiinin vaikutusta sekoitetun ohjaus siRNA ja CBS siRNA käsiteltyjen solujen. Solujen elinkelpoisuus määritettiin käsittelyn jälkeen kasvavia annoksia sisplatiinia 24 h kautta MTS-määritys ja solujen elinkykyisyys oli ilmaistu prosentteina suhteessa käsiteltyjen solujen käsittelemättömiin kontrolleihin. IC

50-arvot saatiin epälineaarisella regressioanalyysillä.

hiljentäminen CBS Vähentää Mitokondrioiden hengitys ja estää ATP synteesi

Kun pyritään tutkimaan rooli CBS lisäksi aminohappometabolian, ensin määritetään solun lokalisoinnin CBS entsyymin avulla immunofluoresenssilla.