Krooninen sairaus

tiivistelmä

aikana syövän etenemiseen, EphA2 reseptori voi saada ligandista riippumatonta pro-onkogeenisiä toimintojen takia Akt aktivoinnin ja vähentää efriini-ligandi sitoutumista. Vaikutukset voidaan kumota ligandin stimulaation, joka laukaisee luontainen kasvain tukahduttava signalointipolkujen of EphA2 myös estämällä PI3 /Akt ja Ras /ERK reittejä. Nämä havainnot puoltavat kehittää myös pienimolekyylisiä agonisteja EphA2 mahdollisina kasvain intervention aineita. Kautta virtuaaliseulonnan ja soluihin perustuvissa määrityksissä, raportoimme täällä tunnistaminen ja luonnehdinta doksatsosiinin uutena pienimolekyylisiä agonisti EphA2 ja EphA4, mutta ei muita Ef reseptoreihin testattu. NMR tutkimukset paljastivat laajat yhteydet doksatsosiinin kanssa EphA2 /A4, pääpiirteittäin sekä hydrofobisia ja sähköstaattisia vuorovaikutuksia äskettäin löydetty EphA2 /efriini-A1 monimutkainen. Kliinisesti käytetään α1-adrenoreseptoriantagonisti (Cardura®) verenpainetaudin hoitoon ja eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun, doksatsosiini aktivoitu EphA2 riippumaton α1-adrenoreseptorin. Samanlainen efriini-A1, doksatsosiini esti Akt ja ERK kinaasi toiminnan edistämistä EphA2 riippuvaisella tavalla. Doksatsosiinihoidon laukaisi EphA2 reseptorin sisäistämisen, ja tukahdutti haptotactic ja kemotaktinen kulkeutumista eturauhassyöpä, rintasyöpä, ja gliooma soluja. Lisäksi käytettäessä potilaalle tehdä ksenograftimallia, doksatsosiini vähensi distaalinen etäpesäke ihmisen eturauhasen syöpäsolujen ja pitkäaikainen selviytymistä saajahiiret. Tietääksemme doksatsosiinista ensimmäinen pienimolekyylinen agonistina reseptorin tyrosiinikinaasin, joka pystyy estämään pahanlaatuista käyttäytymistä

in vitro

ja

in vivo

.

Citation: Petty A, Myshkin E, Qin H, Guo H, Miao H, Tochtrop GP, et al. (2012) pieni molekyyli agonistina EphA2 reseptorityrosiinikinaasin Estää Kasvainsolun Migration In vitro ja Eturauhassyöpä Metastasis In Vivo. PLoS ONE 7 (8): e42120. doi: 10,1371 /journal.pone.0042120

Editor: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australia

vastaanotettu: 22 helmikuu 2012; Hyväksytty: 02 heinäkuu 2012; Julkaistu: 15 elokuu 2012

Copyright: © Petty et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Institutes of Health BW (CA155676-01, DK077876), BW ja HM (CA152371), ja palkintoja BW päässä FAMRI ja rukouksen Maria Foundations. JS tukivat Singapore National Medical Research Council Grants NMRC /1216/2009. In silico seulonta tukivat avustusta Ohio supertietokonekeskuksessa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Dr. P. Page työskentelee Reichert, Inc. Binding analyysi suoritettiin tavallisilla biosensorisirut ja SR7000DC Dual Channel SPR System, tuote Reichert Life Sciences. Ei ole muita patentteja, tuotteiden kehittämiseen tai muita kaupan tuotteita julistaa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

jäsenenä erytropoietiinin tuottavien hepatosellulaarinen (Ef) alaryhmä reseptorin (RTK: t), EphA2 aiemmin nimellä epiteelisolujen kinaasia tai Eck, koska sen laaja ilmentyminen epiteelisoluissa

in vitro

ja

in vivo

[ ,,,0],1]. Myöhemmät tutkimukset paljastivat, että EphA2 oli yli-ilmentynyt ihmisen syöpiä, ja että yli-ilmentyminen korreloi maligni kehittyminen ja huonoon ennusteeseen [2], [3]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että EphA2 yliekspressio ja aktivaatio edistää kasvaimen kehittymisen, mikä viittaa mahdolliseen rooliin kuin onkogeenin [4], [5], [6], [7], [8]. N yli-ilmentyminen EphA2 rintamaidon epiteelisoluissa indusoi morfologista muutosta [8], kun taas eturauhassyövässä ja glioomasolulinjoja, kohonnut EphA2 lauseke aiheutti lisääntynyttä kemotaktinen solumigraatioon ja invaasiota [9].

Kontrastin pro-onkogeenistä rooleja, monet tutkimukset ovat osoittaneet, että EphA2 aktivaatio sen ligandin, efriini-A1, säätelee solujen käyttäytymistä tavalla enemmän sopusoinnussa sen ollessa tuumorisuppressori, mukaan lukien apoptoosin induktion, soluproliferaation inhibointi, ja suppressio solumigraation [7], [ ,,,0],10], [11], [12].

In vivo

tutkimukset osoittavat, että EphA2 aktivaatio systeemisesti efriini-A1 vähenee tuumorigeenisyyteen ja invaasiokyvyssä ksenografteja [13], [14]. Lisäksi EphA2 poisto hiiret osoittavat lisääntynyt alttius karsinogeeniksi aiheuttama ihon tuumorigeneesiä [15].

Viimeaikaiset tutkimukset alkavat valottaa paradoksaalinen havaintojen [3], [16]. Se on paljastanut, että EphA2 reseptori on vastakkaisilla rooleja tuumorigeneesiin [9]. Ligandin stimulaatio, EphA2 estää solujen vaeltamiseen sopusoinnussa vakiintuneiden vastenmielinen roolit Ef reseptorien säätelyssä soluliikkuvuus [17], [18]. Suorana vastakohtana ilman ligandia, EphA2 edistää solujen vaeltamiseen, joka korreloi sen ekspression tasolla. Mekanistisesti, EphA2 on havaittu olevan substraatti Akt, joka on aktivoitu eri ihmisen syövissä, [9], [19]. Akt fosforyloi EphA2 seriinin 897 sijaitsee hyvin alttiina silmukka välillä kinaasialue ja steriili-α motiivi (SAM). Mutageneesi, farmakologiset ja solujen tutkimukset osoittavat, S897 fosforylaatio on olennainen Siirrettävissä-stimuloivia vaikutuksia EphA2 puuttuessa ligandin [9]. EphA2 yliekspressio liittyy usein menetys ilmaisu- ja mislocalization of efriini-A1 rintasyövän [20], gliooma [21] ja ihotuumoreiden [15]. Pelkistetty efriini-A ilme yhdistettynä lisääntyneeseen EphA2 ilme ja usein Akt aktivointi tarjoavat salliva ympäristö edistää ligandista riippumatonta pro-invasiivisia Akt-EphA2 ylikuulumisen, joka voi olla osittain vastuussa EphA2 yli-ilmentymisen aikana kasvaimen etenemisen ja korrelaatio EphA2 ilmaisun ja epäsuotuisa ennuste. Tukevat tätä käsitystä, immunohistokemiallinen tutkimus ihmisen gliooman yksilöiden vastaisella vasta-aineella fosfo-S897 paljasti, että aktivointi Akt-EphA2 signalointi liittyy maligni kehittyminen [9].

Tärkeää on, ligandin stimulaation kasvainsolujen in vitro inaktivoi Akt ja aiheuttaa defosforylointia EphA2 on S897 [9], osoittaen monimutkainen kahtiajako EphA2 toimintoja eli ligandista riippuvan tuumorisuppressiogeeneksi ja ligandista riippumatonta kasvain edistäminen. Muut tuumorisuppressori toimintoja EphA2 myös aktivoituu ligandin indusoiman EphA2 aktivaatio, mukaan lukien inaktivaatio Ras /ERK-reitin. Ligandi-riippuvaisen signaloinnin huipentuu inhibitiota solujen vaeltamiseen ja proliferaatiota, vaikka vasteet moduloidaan solun yhteydessä, kuten Ras aktivoinnin tilan tietyn kasvainsolun tyyppi. Nämä tutkimukset motivoi meitä ehdottaa pienimolekyylisiä agonisteja EphA2 voidaan hyödyntää uusina syöpähoitojen. Kuten on esitetty kuviossa 1A, kuten agonistit eivät voi vain katkaista pro-onkogeenisen Akt-EphA2 ylikuulumisen, mutta myös uudelleen aktivoida luontainen ligandista riippuvan tuumorisuppressorigeenin toimintoja EphA2.

(A) Kaaviokuva ennustetun vaikutukset pienimolekyylisten agonistien indusoimaan ligandi-riippuvaisen signaloinnin. (B) Crystal rakenne EphA2 ligandia sitova alue (LBD) in kompleksin efriini-A1. Korostettu ovat hydrofobisia tasku ja arginiini 103 EphA2-LBD, jotka ovat vuorovaikutuksessa G-H-silmukan efriini-A1 ja glutamaatin 119 efriini-A1, vastaavasti. EphA2-LBD käännettiin -10 ° vastapäivään paremmin paljastaa sitova tasku. (C) Pienimolekyylinen seulonta tunnistaa doksatsosiinia (yhdiste 11) uutena EphA2 agonisti. MDA-231-A2-soluja käsiteltiin yhdisteet 1-11 (50 uM 0,2% DMSO) 30 minuuttia ja solulysaateista sovellettiin immunoblot fosforyloidun EphA /B-kinaasien (pEphA /B) ja yhteensä EphA2. (D) Kemiallinen rakenne doksatsosiinin (DZ). (E) Annos-vaste EphA2 aktivaation DZ. MDA-231-A2-soluja käsiteltiin osoitetulla annoksella DZ: ssa 30 minuuttia ja lysaatit immunosaostettiin EphA2-spesifistä vasta-ainetta ja niitä blotattiin kuten (C). Käsittely 1 ug /ml efriini-A1-Fc (EA1-Fc) 10 minuutin toimi positiivisena kontrollina. Huom vähentämällä määrä EphA2 seuraavista efriini-A1 ja doksatsosiinin hoitoa. (F) Immunoblotit varten pEphA /B lysaatit MDA-231-A2-soluja esikäsiteltiin 1 uM fenoksibentsamiini ja sitten sitä käsiteltiin 1 tunnin ajan ilmoitetuilla annoksilla DZ. Käsittely 1 ug /ml efriini-A1-Fc (EA1-Fc) toimi positiivisena kontrollina. Käsittely 0,2% DMSO: joko 1 tunti (vasemmalla), tai 5 tuntia (oikealla) toimi vehikkelikontrollit. (G) edustaja tontin pintaplasmoniresonanssilla (SPR) analyysi DZ sitoutumisen rekombinantti ligandia sitovaa domeenia EphA2. Käyrät alhaalta ylöspäin edustaa pitoisuuksia 1,56, 3,13, 6,25, 12,5, 25, 50 uM. Determined K

D arvo näkyy sisällä juoni. (H) Molecular mallintaminen pinta kaavion osoittaa aminohappoa EphA2 mahdollisesti mukana suorassa vuorovaikutuksessa doksatsosiinilla. Neljä aminohappoa efriini-A1 silmukka on esitetty punaisella. Kuvat luotiin käyttäen UCSF Chimera.

Tässä tutkimuksessa olemme pyrkineet tunnistamaan pienimolekyylisiä agonisteja yhdistämällä rakenne-pohjainen virtuaaliseulonnan ja soluihin perustuvissa määrityksissä. Raportoimme löytö ja luonnehdinta doksatsosiinin uutena agonisti EphA2 ja EphA4. Lisäksi äskettäin perustettu potilaalle tehdä ksenograftimallia Etäpesäkkeisen eturauhassyöpä, systeeminen anto doksatsosiinin merkittävästi tukahdutti distaalinen etäpesäke ja pitkäaikaiseen kokonaiselossaolo. Tietääksemme tämä on ensimmäinen esimerkki pieni molekyyli RTK agonistin kanssa syöpälääkkeen tehoa

in vitro

ja

in vivo

.

Tulokset

rakenne-pohjainen virtuaaliseulonnan ja soluihin perustuvissa määrityksissä tunnistaa doksatsosiinin agonistina kykenee indusoimaan katalyyttinen aktivaation EphA2 reseptorin tyrosiinikinaasin

tunnistaa pienimolekyylisiä agonisteja EphA2, otimme rakenne-pohjainen

vuonna silico

seulontaan. Meidän molekyyli mallinnus EphA2 ligandia sitovan domeenin (LBD), joka perustuu kiderakenne EphB2 LBD [22] paljasti, että sitova tasku EphA2 voi sisältää enintään 4 aminohappoa, mikä viittaa siihen, että se voisi sijoittaa pieniä molekyylejä, joilla on molekyylipaino paino (MW) noin 500 Dalton [23]. Tämä käsite on vahvistettu äskettäin määritys kiderakenne EphA2 /efriini-A1 kompleksin [24] (kuvio 1 B). Koko putoaa välillä yhteisten huumeiden [25], joten EphA2 LBD toivottava tavoite lääkekehityksen. Tämä tavoitteenaan aloitimme

in silico

seulonta etsiä pieniä molekyylejä, jotka ovat vuorovaikutuksessa suotuisasti ligandia sitova taskussa EphA2 peräisin molekyylimallitus [23] ennen kiderakenteen tuli saataville. Useita konformaatioita kunkin rakenteen kertyi OMEGA (OpenEye) ja kukin lihakkuus telakoitiin yksitellen DOCK [26]. Meidän alustava seulonta yli 750000 yhdisteiden havaittiin useita pieniä molekyylejä, jotka voivat vuorovaikutuksessa ligandin sitovaan taskuun.

Kaupallisesti saatavilla top-pisteytys yhdisteitä seulottiin niiden kyky indusoida EphA2 aktivaation MDA-MB -231 rintasyöpäsoluissa. Koska MDA-MB-231-solut ilmentävät endogeenistä EphA2 sekä muita Ef reseptoreihin, kuten EphA1, me yli-ilmentynyt EphA2 (kuva S1) minimoimiseksi osuus muista Ef reseptoreihin analyysimme. Soluja stimuloitiin yhdisteiden kanssa 50 uM. Kokosoluliuotteista koettimena aiemmin kuvattu vasta-aine, joka tunnistaa aktivoitu Ef reseptorit [27]. Kuvio 1C esittää tuloksia edustavan osajoukko yhdisteitä, joilla on rakenteet esitetään kuvassa S2. Niistä pienistä molekyyleistä testataan, yhdiste 11, tai doksatsosiini, aktivoitu EphA2 suuressa määrin. Alunperin kehitetty antagonistina α1-adrenoreseptorin, doksatsosiinia (kuvio 1 D) on FDA-hyväksytty lääke (Cardura®) yleisesti käytetty kliinisesti verenpainetaudin hoitoon ja eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun (BPH). Vahvista erityisiä EphA2 aktivoinnin doksatsosiini, analysoimme tasot aktivoitua Ef reseptorin MDA-231-A2-solujen käsittelyn jälkeen useita annoksia doksatsosiinin ja EphA2 immunosaostus. Doksatsosiini aktivoitu EphA2 reseptorin annoksesta riippuvalla tavalla. Aktivointi oli havaittavissa 25 uM ja vahvistui 50 uM tai enemmän (kuvio 1 E). Samanlaisia ​​natiivi ligandeihin, oli myös hajoamista EphA2 altistumisen jälkeen suuria annoksia doksatsosiini, joka on tyypillinen useimpien RTK: iden ligandin indusoiman aktivaation, mukaan lukien Ephs [42].

Doksatsosiinilla indusoi katalyyttinen aktivointi EphA2 riippumattomia of α1-adrenoreseptorin antagonismi

Koska doksatsosiinista hyvin tunnettu antagonisti α1-adrenoreseptorin, kysymys heräsi kysymys, onko EphA2 katalyyttinen aktivointi doksatsosiini saattaa johtua epäsuora vaikutus sen α1-adrenoreseptorin antagonismi. Käsitellä tätä kysymystä, me esikäsitellyt MDA-231-A2-solujen hyvin ominaista peruuttamatonta α1-adrenoreseptorin estäjä, fenoksibentsamiini [28], [29], [30], ja sen jälkeen testattiin induktion EphA2 fosforylaation doksatsosiinia. MDA-231-A2-solut valittiin, koska ne on aikaisemmin osoitettu ilmentävän sekä α1a ja α1b-adrenoreseptorien [31]. Eroa EphA2 aktivoitumisen doksatsosiini havaittiin seuraavat fenoksibentsamiinia esikäsittelyn versus esikäsittelyä (kuvio 1 F), jotka osoittavat, että doksatsosiini suoraan aktivoi EphA2 riippumaton sen α1-adrenoreseptorin antagonismi.

Kaksi muuta top-pisteytys yhdisteitä, dobutamiini ja labetaloli (yhdisteet 9 ja 10), funktio kuin β1-adrenoreseptoriagonisti ja α /β-adrenoreseptorin antagonisti, vastaavasti. Hoito dobutamiinia ei aktivoida EphA2 jopa 500 uM, kun taas labetalolin ei aktivoida jopa 500 uM, joka vahvistaa, että doksatsosiini on todellakin voimakkaampi ja että aktivointi ei ole suoraa seurausta yleisestä adrenoreseptorin sitoutumisen (kuvio S3A).

doksatsosiini suoraan vuorovaikutuksessa EphA2 LBD

Koska doksatsosiini löydettiin kautta virtuaaliseulonnan kohdistaminen ligandia sitovaan taskuun EphA2, sen odotettiin suoraan sitoutua toimialueen. Tämän testaamiseksi sitoutuminen doksatsosiinia aiemmin kuvattu yhdistelmä-LBD of EphA2 [24] analysoitiin pintaplasmoniresonanssilla (SPR). Olemme havainneet, että doksatsosiini suoraan sidottu EphA2 LBD dissosiaatiovakiolla (K

D) 47,6 uM (kuvio 1G). Sitovat Sekä dobutamiini ja labetalolia testattiin myös ja osoitettu tapahtuvan paljon pienemmillä affiniteetilla kuin doksatsosiinia (K

D = 1,5 mM ja 0,44 mM, tässä järjestyksessä) (Kuva S3B). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että doksatsosiini sitoutuu suoraan EphA2 LBD.

Kun viime määrittämiseksi X-ray kiderakenne EphA2-LBD kompleksissa efriini-A1 [24], vertasimme sitä kanssa homologia mallin EphA2 [23] käytetään alkuperäisessä seulonnassa. Huolimatta odotetaan eroja, EphA2 sitovan kohdan homologiamalli oli kokonaisuudessaan samanlainen kuin kiderakenne (kuvio S4), joka tukee yleisiä pätevyys molekyyli- malli virtuaaliseulonnan. Seuraavaksi toistetaan telakointi doksatsosiinin osaksi ligandin sitoutumiskohtaan päässä EphA2 kiderakenne. Kuvio 1H esittää doksatsosiinin telakoitu osaksi EphA2 kiderakenne, orientaatiossa samanlainen kuin NMR-rakenne EphA2-doksatsosiinia kompleksi (jäljempänä). Uusi kierros virtuaaliseulonnan suoritettiin myös käyttäen EphA2 LBD kiderakenne. Kuitenkin 30 uuden top-pisteytys testatut yhdisteet, emme löytäneet agonistit että paremmin esillä toiminta kuin doksatsosiinia (ei kuvassa).

Doksatsosiinilla aktivoi EphA2 reseptorin eri solutyyppejä

Määritä onko EphA2 agonistiaktiivisuuteen doksatsosiinista solu-konteksti erityisiä, arvioimme vaikutuksia doksatsosiinin ylimääräisistä solutyyppejä. Ensin käytettiin HEK 293-solut, jotka yli-ilmentävät EphA2 (HEK 293-A2), että meillä on kuvattu aikaisemmin [9]. HEK 293-solut ilmentävät alhaisia ​​endogeenisen EphA reseptorien [12]; yliekspressio EphA2 näissä soluissa mahdollistaa myös osoitus tiettyjen aktivoitumisen eksogeenisen kinaasi. Samanlaisia ​​MDA-231-A2-soluja, merkittävää aktivoitumista EphA2 nähtiin HEK 293-A2-soluja, kun doksatsosiinihoito alkaen 25 uM (kuvio 2A). Seuraavaksi testattiin PC-3-soluja, jotka ilmentävät korkeita endogeenisten EphA2 reseptorin [32]. Doksatsosiini myös aktivoida endogeeninen EphA2 PC-3-solut, vaikka se ei ollut ilmeistä vasta 50 uM. Eri kinetiikka näistä solutyyppien saattaa johtua osittain eri ekspressiotasoja EphA2 kolmessa eri solulinjoja tai erityisten solujen yhteydessä. Lisäksi EphA2 aktivaation PC-3-solujen lisäksi tukee α1-adrenoreseptorin riippumaton mekanismi, koska nämä solut puuttuu havaittavissa α1a-adrenoreseptorin ilmaisun [33].

(A) Immunoblotit for pEphA /B lysaatit PC-3 ja HEK 293-A2 (293-A2) solulinjoja käsiteltiin 30 minuuttia ilmoitetun annoksilla doksatsosiinia (DZ). (B) Immunoblotit for pEphA /B lysaatit MDA-231-A2 (231-A2) ja 293-A2 solulinjoissa käsitelty 50pM DZ 0,2% DMSO osoitetusta kertaa. (C) Doksatsosiini aktivoi selektiivisesti EphA2 ja EphA4 reseptoreihin. Immunoblotit for pEphA /B lysaatit HEK 293, jotka ilmentävät antanut Ef reseptorit hoidon jälkeen osoitetun annoksilla doksatsosiinia (DZ) 60 minuuttia. Käsittely 1 ug /ml efriini-A1-Fc-ligandi (EA1-Fc) 10 minuutin ajan (EphA2) ja 30 minuuttia (Vector, EphA1, EphA4), sekä 30 minuutin käsittely efriini-A5-Fc (EA5-Fc ) (EphA3) ja efriini-B1-Fc (EB1-Fc) (EphB3) toimi positiivisena kontrollina. Blotting täydellistä Ef kinaasien toimi lastaus valvonta.

ensi arvioitiin ajan kuluessa aktivaation sekä MDA-231-A2 ja HEK 293-A2-solut käsittelemällä yhdellä 50gM annoksen doksatsosiinia. Merkittävät EphA2 aktivaatio voitiin havaita niinkin aikaisin kuin 5 min käsittelyn jälkeen MDA-231-A2-solulinja, joka oli huipussaan noin 30 min (kuvio 2B). EphA2 aktivointi myös ilmi 10 minuutin kuluttua doksatsosiinihoito HEK 293-A2-solut, vaikka se seuraa hitaampi kinetiikka.

Doksatsosiinilla ensisijaisesti aktivoi EphA2 ja EphA4 kinaasien

On 14 nisäkkäiden Ef reseptoreita tämä osuus merkittävä sekvenssihomologia [34]. Tämä sai meidät tutkimaan, doksatsosiini saattaa myös aktivoida muita Ef reseptoreihin. Tätä tarkoitusta varten HEK 293-solulinjat, jotka yliekspressoivat EphA1, EphA2, EphA3, EphA4, ja EphB3 kinaasit käytettiin. Olemme havainneet, että doksatsosiini aktivoitu sekä EphA2 ja EphA4 kinaasien jälkeen samanlainen annos-vaste-suhde (kuvio 2C). Ei kuitenkaan aktivointi EphA1 nähtiin samoina pitoisuuksina, ja aktivointi EphA3 oli heikko verrattuna EphA2 ja EphA4. EphB3 on suurempi pohjapinta tasoja aktivaation (kuvio 2C), jota ei ole vielä aktivoitu. Itse asiassa oli merkittävä väheneminen EphB3 aktivoinnin yhteydessä doksatsosiinin altistumista. Myös kohtalainen endogeenisen EphB4 ilmentymisen HEK 293-soluissa; puute aktivoitua Ef kinaasin signaaleja seuraavat doksatsosiinia altistus vektorisäädön soluissa osoitti että endogeeninen EphB4 ei aktivoida joko (kuvio 2C). Tämä data osoittaa, että doksatsosiini ensisijaisesti aktivoi EphA2 ja EphA4 keskuudessa eri Ef reseptoreihin testattu.

NMR rakenne paljastaa laaja suora vuorovaikutusta doksatsosiinin kanssa EphA4

Dual valikoivuus doksatsosiini varten EphA2 ja EphA4 avannut mahdollisuus tutkia rakenteellinen vuorovaikutuksista NMR-spektroskopialla. Koska EphA2 LBD ilmaistu

E. coli

oli täysin liukenemattomia eikä sitä voitu laskostaa uudelleen useista yrityksistä, olemme keskittyneet vuorovaikutukset EphA4 LBD doksatsosiinilla. Ensin arvioidaan EphA4 sitoutumisen doksatsosiini mukaan isoterminen kalorimetriaa. Dissosiaatiovakio (K

D) laskettiin olevan 12,4 pM (kuvio S5a), samanlainen kuin EphA2 /doksatsosiinia vuorovaikutuksia mitattiin SPR (kuvio 1G). Far-UV ympyrädikroismilla osoitti, että doksatsosiini sitova indusoi mitään merkittävää sekundaarinen rakenne muuttuu EphA4 LBD (kuvio S5B).

Luonnehtia sitova rajapinta hankimme sarja

1 H-

15N heteronuclear yksikvanttikoherenssispektroskopian (HSQC) spektrit EphA4 LBD lisättäessä doksatsosiini eri moolisuhteissa. Asteittainen lisääminen doksatsosiinin johti progressiivisen siirtymät osajoukko HSQC huiput (kuvio 3A), sopusoinnussa suhteellisen alhainen affiniteetti vuorovaikutuksen. Useimmat näistä HSQC piikkien ei omaa enää muutoksia moolisuhteissa kuin 1:05. Siksi kemiallisen siirtymän (CSI) tämän suhteen laskettiin (kuvio 3B). Sitoutuessaan doksatsosiini, useita klustereita jäämien koki dramaattisia muutoksia. Vaikka osa siirtyy päällekkäin aiemmin kuvatun C1 antagonisteja EphA4 [35], monet muutokset olivat ainutlaatuisia doksatsosiinia (kuvio 3B). Ylimääräiset siirtymät jaettuna kuperan pinnan efriini sitovan kanava, mukaan lukien Val72-Cys73-Asn74 E-lohkon, Thr104-Leu105-Arg106 G-lohkon, Leu166 K-lohkon ja Ile192-Ala193 M-lohkon . Suurempi kosketuspinta voi selittää korkeamman affiniteetin doksatsosiinin varten EphA4 kuin C1.

(A)

1 H-

15N NMR HSQC spektrit EphA4 LBD puuttuessa (sininen) ja kun läsnä (punainen) doksatsosiinin (DZ) on moolisuhteessa 01:05 (EphA4:DZ). Useat tähteet sijaitsevat yli kuperan pinnan EphA4 efriini sitovan kanava on merkitty. (B) Jäännös-spesifinen kemiallinen siirtymä (CSI) ja EphA4 LBD läsnä doksatsosiinin on moolisuhteessa 01:05 (EphA4:DZ). Huomattavasti-siirtynyt tähteet jaetaan C1 ovat värillisiä kirkas ruskea, kun taas tähteet merkittävästi siirtynyt vain doksatsosiinia sitova ovat punaisia. (C) Telakointi malli EphA4-doksatsosiinin monimutkainen nauha. Sitovat alueet samat kuin C1-sitovien oli värjätty ruskea, kun taas ainutlaatuinen doksatsosiinin sitova punaisella. G, K, M ja E käytetään lahjoittaa β-säikeiden kuperan pinnan EphA4 /efriini sitovaa kanavaa. (D) EphA4 jäämät ottaa suoria yhteyksiä doksatsosiinilla. Jäämät D-E ja J-K silmukat ovat ruskeat, ne kuperan pinnan violetilla, ja Arg106 syaani. Green katkoviivat osoittavat välisten vetysidosten doksatsosiini ja EphA4 jäämiä. (E) – (F) Sama telakointi malli sähköstaattista potentiaalia EphA4 LBD näytetään. (G) EphA4 LBD vapaassa ja doksatsosiini sidottu valtioiden näyttää eri potenssiin yleistynyt Järjestysparametri S

2 (Kuva S6A). Sininen: S

2 erotus ≤-0,01; punainen: S

2 ero ≥0.01; ruskea: ei merkittävää muutosta tai S

2 arvoja ei määritetty. (H) Conformational vaihtoa EphA4 vapaassa (vasen paneeli) ja doksatsosiinin sidottua valtioiden (oikea paneeli). Jäännökset R

ex 5 (kuvio S6b) näkyvät pallot ja punaisina. (I) Laajennuspaikkatelakointiasema malli EphA2-doksatsosiinin monimutkainen. Ota jäämät D-E ja J-K silmukoita merkitty ruskealla, kuperalla pinnalla syaani, ja Arg103 violetilla. Violetti viiva käytetään osoittamaan välisten vetysidosten doksatsosiini ja EphA2 jäämiä.

visualisoimiseksi EphA4-doksatsosiini vuorovaikutus käyttöliittymä, rakensimme malleja EphA4-doksatsosiinilla kompleksin Haddock ohjelmiston yhdistettynä CNS, kuten aikaisemmin on kuvattu EphA4-C1 kompleksin [35]. Viisi alin energia mallia esitetään kuvioissa S5c ja S5d. Doksatsosiini on laaja vuorovaikutus EphA4 jäämiä D-E ja J-K silmukoita, sekä yhteyksiä kupera β-säikeiden koostuu Val72-Cys73-Asn74, Thr104-Leu105-Arg106 ja Ile192-Ala193 (kuvio 3C, D). Kuvio 3E korostaa vuorovaikutusta kahden doksatsosiini metoksiryhmällä ja EphA4 hydrofobiset tähteet Met60 ja Ile159. Mielenkiintoista on, EphA4 on lisäksi sitova tasku tunnettu positiivisesti varautuneen Arg106, joka ympäröi electronegative happiatomia bentsodioksin ja karbonyyliryhmät doksatsosiinia (kuvio 3D, E, F). Yhdessä rakenteelliset tutkimukset osoittavat suoraa vuorovaikutukset EphA4 ja doksatsosiini, ja KD on samanlainen pitoisuusalue tarvitaan solun reseptorin aktivaation (kuva 2).

Sidonta doksatsosiinille stabiloi selkärangan EphA4 LBD

Äskettäin on osoitettu, että proteiini dynamiikka kuin staattinen rakenne on tärkeä rooli erilaisissa biologisissa prosesseissa kuten signaalinsiirtoon [36], [37], [38], [39]. Saada rakenteellisia käsityksen siitä, miten doksatsosiini saattaa toimia kuin EphA2 agonistina, me tunnettu selkäranka dynamiikkaa EphA4 LBD vapaassa tilassa vs. että monimutkaisissa doksatsosiinilla (katso Methods S1). Lyhyesti, mittasimme selkäranka

15N rentoutumista data T1, T2 ja hetero- NOE-arvot, jotka analysoitiin sitten ”Model-free” formulism [40], [41], [42]. Analyysi syntyy ”potenssiin yleistynyt järjestys parametrit”, S

2, jotka heijastavat selkäranka jäykkyys on ps-ns aika-asteikolla. Kuva S6A, lisäsi S

2 arvot useampien tähteiden kun EphA4 sitoutumisen doksatsosiinille verrattuna ilmaiseksi EphA4. Monet jäämät huomattavasti suurempi S

2 arvot kartoitetaan selkäranka EphA4 (kuvio 3G). Tämä havainto osoittaa, että doksatsosiini vakiintunut selkäranka EphA4 LBD on ps-ns aika-asteikolla.

Muita todisteita tukemaan vakauttamiseen EphA4 LBD mukaan doksatsosiinin tuli kemian kurssi, R

ex, joka heijastaa konformaatiomuutoksia on mikrosekunnissa ms aikaskaala yksittäisiä tähteitä. Kuten kuviossa S6b, monet jäännökset poikki EphA4 LBD vapaassa tilassa esillä merkittävä R

ex arvoja, mikä osoittaa, että ne käyvät läpi perusteellisen konformaatiomuutoksia. Sitä vastoin sitoutumalla doksatsosiini vähensi R

ex arvot useimmille jäämiä, lukuun ottamatta Asn74-Val75 ja Thr121. Muutokset R

ex arvot kartoitetaan takaisin EphA4 rakenteeseen (kuvio 3H), mikä osoittaa dramaattinen alenemista konformaatiomuutoksia doksatsosiinilla sitoutuneen vs. vapaa tila. Yhteenlaskettuna meidän rakenteellinen analyysi ja proteiini dynamiikka mallinnus osoittaa, että doksatsosiini aiheuttaa merkittäviä vakauttaminen EphA4 LBD, jotka voivat myötävaikuttaa agonistinen toimintojen doksatsosiinin.

Uusi malli EphA2-doksatsosiini kompleksi ennustaa ylimääräisiä agonistit

Seuraavaksi mallinnetaan EphA2-doksatsosiinilla vuorovaikutusta sisällyttämällä rajoitteet päässä EphA4-doksatsosiinin rakenne. Sequence ja rakenteellisia linjauksia havaittiin jäämiä konservoituneet EphA2 ja EphA4 LBD, joka osoitti merkittävää huippu muutoksia EphA4 sitoutumisen jälkeen doksatsosiinia. Nämä vastaavat Ile58, Met59, Val69, Cys70, Asn71, Thr101, Val102, Arg103, Arg159, Leu163, Val189 ja Ala190 on EphA2. Kuvio 3I havainnollistaa rakennetta EphA2-doksatsosiini kompleksin rakennettu Haddock ohjelmiston. Samanlainen EphA4-doksatsosiini monimutkainen, metoksi- ryhmien doksatsosiinin vuorovaikutuksessa hydrofobinen pinta muodostetaan Ile58, Met59 ja Ala158, kun taas Arg103 ja EphA2 vuorovaikutuksessa karbonyyliryhmän ja happiatomit bentsodioksin osa doksatsosiinia (kuvio 3I). Lisäksi, bentsyyli- rengas bentsodioksin istuu hydrofobisen ontelon EphA2 pääasiassa koostuu Cys70, Thr101 ja Ala190 sivuketjut (kuvio 3I). Yllättävää kyllä, äskettäin määritetty röntgen- co-kiderakenne EphA2-efriini-A1 kompleksi [24], efriini-A1 on vuorovaikutuksessa myös hydrofobisen taskun ja Arg103 of EphA2 (kuvio 1 B), mikä viittaa siihen, että doksatsosiini voivat saada toistaa kaksi erillistä muodot reseptorivuorovaikutuksissa natiivi ligandin.

Doksatsosiinilla laukaisee EphA2 riippuvaisen eston ERK ja Akt kinaasiaktiivisuudet

aktivointi EphA2 reseptorin efriini-A1 ligandi estää sekä ERK1 /2 ja Akt-kinaasin toiminnan useimmissa normaaleissa soluissa ja osajoukko syöpäsoluja [9], [12], [43]. On osoittanut, että doksatsosiini voivat jäljitellä efriini-A1 sitomisessa ja aktivoimalla EphA2 reseptori, kysyimme doksatsosiini hoito voi estää ERK1 /2 ja Akt aktivoinnissa samoin. Ensin testannut tätä hyödyntämällä A172 glioomasoluihin käsitelty yliekspressoimaan EphA2 reseptorin (A172-A2). Toisin kuin MDA-MB-231-soluja, jotka on aktivoitu Ras ja ne kestävät efriini-A1-Fc indusoi inhibition ERK1 /2, A172-solut satama villityypin Ras ja niillä on suuri pohjapinta aktivaation tasot ERK1 /2 ja Akt, joka oli herkkä efriini-A1 inhiboivan (kuvio 4A, pitkälle taistella kaista). Vastaavia muita solutyyppejä testattu (kuviot 1 ja 2), doksatsosiini aktivoituu myös EphA2 on A172 glioomasoluilla annoksesta riippuvalla tavalla alkaa noin 25 uM (kuvio 4A). Lisäksi, käsittely 50 uM ja 100 uM doksatsosiini oli riittävä aiheuttamaan merkittävää inhibitiota Akt ja ERK1 /2 aktivointi. Vaikutukset Akt inhibitio samaan aikaan, EphA2 aktivaatio näissä soluissa, ja korkeampi konsentraatio tarvitaan ERK1 /2 inhibitio (kuvio 4A). Samanlainen MDA-231-A2 solut (kuvio 1 E), havaitsimme hajoaminen EphA2 seuraavista doksatsosiinin hoidon A172-soluissa.

(A) Immunoblotti lysaatit A172-A2-solut käsiteltiin osoitetulla annoksilla doksatsosiinia (DZ ) 0,2% DMSO: ssa 90 minuuttia. Käsittely 1 ug /ml efriini-A1-Fc-ligandin 10 minuutin toimi positiivisena kontrollina. Lysaatit immunosaostettiin efriini-A1-Fc (IP: EA1-Fc) kuten esitetään menetelmät, ja koestettiin pEphA /B ja koko EphA2. Kokosoluliuotteista seulottiin fosforyloidun muotojen ERK1 /2 ja Akt, sekä yhteensä ERK1 /2 ja Akt. (B) Immunoblot kokosolulysaateille päässä LK133A-Vec ja LK133A-A2-soluja käsiteltiin osoitetulla annoksella doksatsosiinia (DZ) 0,2% DMSO: ssa 90 minuuttia. Käsittely 1 ug /ml efriini-A1-Fc: ssa 10 minuuttia toimi positiivisena kontrollina. Lysaatit tutkittiin fosforyloidun muotojen EphA /B, Akt, ja ERK1 /2, sekä kokonaisia ​​EphA2, Akt, ja ERK1 /2.

Vaikka tulokset edellä osoittivat, että doksatsosiini hoito voisi tukahduttaa Akt ja ERK aktivointi, keskeinen kysymys jäi onko tämä vaikutus tuloksiin nimenomaan EphA2 aktivointi. Käsitellä tätä kysymystä, käytimme kuolemattomaksi maksan epiteelisolujen linja, LK133A, eristetty hepatoomasta aiheuttama DEN vuonna EphA2 hiirien. Retrovirusvektorin käytettiin palauttamaan EphA2 ilmentymisen näissä soluissa (LK133A-A2), ja solut, jotka on transdusoitu tyhjällä vektorilla, käytettiin kontrollina (LK133A-Vec). Kuvio 4B osoittaa, että ilman EphA2, ei doksatsosiini eikä efriini-A1-Fc kykeni inhiboimaan ERK ja Akt toimintaa LK133A-Vec soluissa (kuvio 4B). Itse asiassa oli merkittävä nousu ERK ja Akt aktivoinnin doksatsosiinia. Uudelleen EphA2 ilmaisun palautettu ERK ja Akt esto paitsi efriini-A1-Fc lisäksi myös doksatsosiini, joka oli mukana EphA2 aktivointia.