Krooninen sairaus

tiivistelmä

Suun syöpä on neljänneksi yleisin kuolinsyy syöpään Taiwanin miehillä. Indirubin-3′-monoksiimi (I3M), joka on voimakas sykliiniriippuvainen kinaasi-inhibiittori, on terapeuttisia vaikutuksia muihin syöpäsoluihin. Tässä tutkimuksessa, suoritimme

in vitro

määrityksissä testata solujen elinkykyä, solusyklin etenemistä, apoptoosin, solujen vaeltamiseen ja hyökkäyksen tämän syöpätyypin. Lisäksi käytetään suullisen tuumorigeenisia eläinmallissa, tutkimme kohdegeenin ja proteiinin ilmentymisen käyttäen reaaliaikaista qPCR, immunoblottauksen ja immunohistokemiallisella värjäyksellä. Tuloksemme osoittavat, että I3M on antiproliferatiivinen vaikutus sekä Cal-27 ja HSC-3 suusyövän solulinjoissa ja että hoito Cal-27 ja HSC-3-solujen kanssa I3M johtaa apoptoosin aktivoitumisen kautta sytokromi

c

. Lisäksi, I3M keskeyttää solusyklin Cal-27-solujen annoksesta riippuvaisella tavalla pidättämällä solut G2 /M-vaiheessa. Olemme myös havainneet, että I3M tukahduttaa muuttoliike ja hyökkäyksen Cal-27-soluissa estämällä ilmaus fokaalisen adheesion kinaasi, urokinaasi plasminogeeniaktivaattorin estäjä, ja matriksimetalloproteinaasi 9. Lisäksi tunnistimme surviviinin kohdeproteiinin I3M saaneilla suun syöpäsolujen . Käyttämällä suusyöpä hiirimallissa, me osoitamme, että paikallisesti liima-aineen geeli koostuu I3M ja poly (vinyylialkoholi) (I3M /PVA) on annoksesta riippuvainen antituumorigeenisiä vaikutuksia. Käsittelyn jälkeen surviviinin ilmentymiseen proteiinia ja -mRNA: ta säädeltiin vuonna syöpäkudoksiin. Lisäksi plasman surviviini tasot vähensi myös vuonna I3M hoidetuissa hiirissä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että yhdisteen I3M, huumeiden syntetisoitu indirubin, joka löytyy Qing-Dai – on terapeuttista potentiaalia hoitoon suun syöpä.

Citation: Lo WY, Chang NW (2013) Lentotoiminnan Indirubin Johdannaissopimukset , Indirubin-3′-monoksiimi vaimentaa Suusyöpä kasvaimen kehittymisen kautta alassäätely surviviinin. PLoS ONE 8 (8): e70198. doi: 10,1371 /journal.pone.0070198

Toimittaja: A. R. M. Ruhul Amin, Winship Cancer Institute of Emory University, Yhdysvallat

vastaanotettu: May 1, 2013 Hyväksytty: 16 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 13 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Lo, Chang. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat haluaa myös kiittää National Science Council (NSC96-2320-B-039-024, NSC 97-2320-B-039-016-MY3), Taiwan Department of Health, China Medical University Hospital Cancer Research Center of Excellence ( DOH102-TD-C-111-005) ja China Medical University Hospital (DMR-96-043) tukemiseksi tätä työtä. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

suun levyepiteelisyöpä (OSCC) kattaa noin 90% suun syöpäsairauksia. Noin 274000 uutta tapausta diagnosoidaan vuosittain maailmanlaajuisesti, ja huolimatta parantuneet diagnostiset ja hoitomenetelmien, potilaat on vain 50% eloonjääneitä yli 5 vuotta [1]. Tupakointi, betel-mälli pureskelua, alkoholin käyttö, ja muut kuin poltettavat tupakkatuotteet muodostavat merkittävimmät riskitekijät suun syöpä. Nykyinen hoitovaihtoehtoja suusyöpää kuuluvat leikkaus, sädehoito ja kemoterapia, vaikka 5 vuoden pysyvyys suun syöpä on edelleen yksi alhaisin yhteinen pahanlaatuiset kasvaimet [2]. Suun syöpä on kuudenneksi yleisin syöpä Taiwanissa ja neljänneksi yleisin kuolinsyy syöpään joukosta Taiwanin miehille vuodesta 2006 [3]. Siksi tunnistaminen uusien aineiden ja uusia tavoitteita hoitoon suusyövän parantamiseksi tarvitaan kliinisen hoidon tämän sairauden.

Danggui Long Hui Wan on yhdiste perinteisen kiinalaisen lääketieteen, jota käytetään kroonisen myelosyyttileukemia [4], ja aktiivinen ainesosa näyttää olevan Qing Dai (

indigo Naturalis

), joka sisältää runsaasti indigo väriainetta. Lisäksi anti-leukeemiset aktiivisuutta tämän ainesosan syyksi on punaisen värinen indigo isomeeri indirubin. Indirubin ja sen johdannaiset inhiboivat voimakkaasti kasvua erilaisten ihmisen syöpäsoluja, pääasiassa solusyklin pysähtymisen (G2 /M tai G1 vaihe), jota seuraa apoptoosin [5], [6]. On määritetty, että indirubin johdannaiset ovat vahvoja inhibiittoreita sykliiniriippuvaisten kinaasien (CDK: t), glykogeenisyntaasikinaasi-3β [7], c-Src-kinaasia ja STAT3 merkinanto [8], [9]. Whereas indirubin itself on huono liukoisuus, alhainen korko, ja merkittäviä ruoansulatuskanavan toksisuutta, synteettinen indirubin-3′-monoksiimi (I3M) on paremmat farmakologiset ominaisuudet ja alentunut toksisuus. Sen lisäksi, verrattuna indirubin, I3M inhiboi monia muita proteiinikinaaseja sekä STAT3 signalointia, ja sen on osoitettu olevan antiproliferatiivisia vaikutuksia verisuonen sileän lihaksen soluissa [10] – [12]. Äskettäin Indirubin-3′-oksiimi on myös raportoitu indusoi mitokondrioiden ja laukaisee kasvun esto ja solusyklin pysähtymisen ihmisen neuroblastoomasoluja [13]. Näin ollen, I3M pidetään yhtenä voimakkaimmista indirubin johdannaisten syövän hoitoon.

Surviviini on ratkaisevasti solun selviytymisen, ja se toimii sekä säätelemällä solujen jakautumista ja estämällä apoptoosin [14]. Koska jäsen apoptoosi-inhibiittori (IAP) -perheen proteiinit, surviviini on alun perin tunnettu, koska fyysinen kaspaasiestäjä, joka tarjoaa cytoprotective vaihe alavirtaan kuoleman reseptori ja mitokondrioiden apoptoosin [15]. Kuitenkin nyt tiedetään, että X-linked apoptoosi-inhibiittori-proteiinin (XIAP) on ainoa todellinen fysiologinen estäjä kaspaasien 3, 7, ja 9 [16]. Puutteesta huolimatta rakenteellisia motiiveja, jotka välittävät kaspaasi sitova surviviiniperäiset voi estää aktiivisen kaspaasin 9 kautta yhteistyössä hepatiitti B -virus X-vuorovaikutuksessa proteiini [17]. Lisäksi yhdistys surviviinin kanssa XIAP johtaa synergistiseen eston kaspaasi 9 aktivointi [18]. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että surviviini yli-ilmentyy ihmisen eri syöpien ja on yhteydessä huonoon yleisen ennusteeseen [19]. Tarkemmin surviviiniperäiset ilmentyminen korreloi huonon ennusteen ja chemoresistance suun syöpä [20] – [22]. Lisäksi esto surviviinille eri pään ja kaulan alueen syövät lisää merkittävästi antituumorigeenistä toimintaa useiden sytotoksisten ja kohdennettuja hoitomuotojen [23].

Building aikaisempien tutkimusten tavoitteena oli tutkia roolia surviviini suhteen I3M hoito suun syöpä. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että I3M on useita antituumorigeenistä toimintaa ja että se voi estää solujen proliferaatiota, migraatiota ja invaasiota, vaikka samaan aikaan apoptoosin edistämiseksi, suun syöpäsoluja. Käyttämällä immunoblottauksen ja reaaliaikaista qPCR analyysi, huomasimme, että surviviinin ilmentyminen säädeltiin vähentävästi syövän solulinja Cal-27 seuraava I3M hoidon, tunnistaa surviviini mahdollisena välittäjänä antituumorigeenistä toimintaa I3M. Lopuksi varmistaneet, että I3M estää surviviinin ilmaisun ja näyttää antituumorigeenistä aktiivisuuden suullisen kasvainten synnyssä hiirimallissa. Tuloksemme viittaavat siihen, että I3M vaimentaa suusyövän kasvaimien synnyn välittämällä aktiivisuutta surviviinin.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

käytetty protokolla kokeellisten hiirten tarkistettu ja hyväksytty Institutional Animal Care ja käyttö komitean China Medical University (IACUC hyväksyntä no. CMU-99-26-N). Kaikki eläinkokeet tehtiin hoitokäytännön mukaisesti (valaehtoinen todistus hyväksyminen Animal Käytä pöytäkirjan nro 98-33-N) hyväksymä Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) Kiinan Medical University (Taichung, Taiwan).

Reagenssit ja soluviljelmä

Indirubin, I3M, dimetyylisulfoksidi (DMSO), tiatsolyyli blue tetratsolium (MTT), trypaanisinistä, triton X-100, ja penisilliiniä /streptomysiiniä ostettiin Sigma Chemical ( St. Louis, MO, USA).

ihmisen suun syöpäsolu linja Cal-27 ja solulinjaa HSC-3 ostettiin Bioresource Collection and Research Center (BCRC), Elintarviketeollisuus tutkimus- ja koulutusinstituutti (FIRDI) (Hsinchu, Taiwan). Solut maljattiin Dulbeccon muokatussa Eaglen elatusaineessa (DMEM, Gibco) ja DME /F-12 (Gibco), jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 100 yksikköä /ml penisilliiniä, 100 ng /ml streptomysiiniä, ja 1% glutamiinia, 37 ° C: ssa [24 ], [25].

MTT-määritystä

Solujen proliferaatio määritettiin käyttäen MTT-määritystä. Solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille pitoisuutena 1000 solua /kuoppa. Kuusi kuopat analysoitiin kunkin kokeellinen hoito. Sen jälkeen, kun soluja käsiteltiin 0, 5 tai 10 uM indirubin tai I3M (liuotettuna 0,1% DMSO) 0, 24 tai 48 h, 20 ui MTT-reagenssia (5 mg /ml; Sigma) lisättiin kuhunkin kuoppaan , ja soluja inkuboitiin sitten 3 tuntia. Reaktio oli pysäkki poistamalla MTT reagenssia. DMSO: ta (150 ui) lisättiin sitten kuhunkin kuoppaan liuottamiseksi formatsaanikiteet. Absorbanssi mitattiin aallonpituudella 570 nm. Vaikutuksia arvioitiin myös solujen laskenta hemosytometrillä. Kaikki mittaukset suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

valmistaminen subsellulaariset fraktiot ja immunoblottauksella sytokromi c

Solut maljattiin 10-cm: n maljoille ja käsitellään vaihteleva annos I3M 24 tuntia. Inkuboinnin jälkeen solut kerättiin, suspendoitiin uudelleen solu-uutteessa-puskurissa (20 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM KCI, 1,5 mM MgCl

2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA: ta ja 1 mM ditiotreitolia), joka sisälsi 250 mM sakkaroosia ja proteaasinestäjä seosta (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Saksa) ja homogenisoitiin. Homogenaatteja sentrifugoidaan kahdesti 1000 x

g

10 minuutin ajan 4 ° C: ssa tumien poistamiseksi ja ehjä soluja. Sitten supernatantit sentrifugoitiin 10000 x

g

15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantit 10000 x

g

spin kutsutaan nimellä ”sytosolifraktion.” Sytosoliproteiiniin näytteet (30 g) erotettiin 12% SDS-PAGE-geeleissä ja immunomerkatut anti-sytokromi

c

(1:1000) ja anti-β-aktiini (1:1000) primaaristen vasta-aineiden yön yli 4 ° C: ssa. Toinen piparjuuriperoksidaasi-leimattua vasta-ainetta inkuboitiin blotit, mitä seuraa pesu. Kemiluminesenssi signaalit havaittiin käyttäen SuperSignal West femto kemiluminesenssi-substraatteja (Pierce) mukaan valmistajan ohjeiden.

mitokondrioiden pelletit ensimmäisestä 10000 x

g

spin suspendoitiin uudelleen solu-uutetta, joka sisälsi 250 mM sakkaroosi suojella mitokondriot 20 iskua käyttämällä homogenisaattoria. Homogenaatteja sentrifugoitiin 750 x

g

3 x 10 min 4 ° C: ssa poistaa lian ja ytimeksi. Supernatantti sentrifugoitiin sitten 15000 x

g

20 min; pelletti, joka sisälsi ”mitokondrioita jae”, hajotettiin SDS-hajotuspuskuria; ja 30 ug mitokondrioiden proteiinien tehtiin immunoblot-analyysillä, kuten edellä esitetyt kuvaukset.

anneksiini V /PI-värjäyksen

Cal-27-soluja (10

5) ympättiin kuhunkin 6-kuoppaiselle levylle ja käsiteltiin joko DMSO: ssa tai 10 uM I3M 24 tuntia. Anneksiini V-FITC Apoptosis Detection Kit (Strong Biotech Corporation, Taiwan) käytettiin määrittämään prosenttiosuus apoptoottisten solujen. Lyhyesti, korjatut solut pestiin PBS: llä ja sentrifugoitiin 200 x

g

5 min. Solupelletit suspendoitiin uudelleen värjäyspuskurilla ja värjättiin anneksiini V-FITC: llä ja PI: 15 min 25 ° C: ssa mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solu Näytteet värjättiin käyttäen näitä reagensseja voidaan jakaa kolmeen populaatiot: apoptoottiset solut (merkitty vihreällä fluoresenssi), kuolleet solut (merkitty punaisella tai keltaisella fluoresenssi johtuvat yhdistelmä punainen ja vihreä fluoresenssi), ja eläviä soluja (näytetään vain vähän fluoresenssia). Solut analysoitiin käyttäen Talin ™ Kuva Cytometer (Invitrogen). Talin ™ Image Cytometer kaappaa 20 kuvaa on värjättyä näytteen analysoi automaattisesti kuvia käyttämällä digitaalista kuva-solujen laskenta ja fluoresenssi-tunnistus algoritmit, ja näyttää tarkan kvantitatiivisen analyysin elävien, kuolleiden ja apoptoottisten solupopulaatioiden. Kaikki mittaukset suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Solusyklianalyysiä

Cal-27-soluja käsiteltiin 0, 2,5, 5 tai 10 uM I3M, ja 24 tunnin kuluttua solut pestiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS). Solut kiinnitettiin yli yön kylmällä 70% etanolilla ja sitten värjättiin Cycle PI, joka koostui 2 mg /100 ml PBS: ää CAT PI, 1 x PBS: ää, 10 mg /ml RNaasi A: n ja 5% Triton X-100. Inkuboinnin jälkeen 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa pimeässä, FACScan -virtaussytometrillä havaitsemiseen käytettiin fluoresenssi-aktivoitujen solujen. Kaikki mittaukset tehtiin kolminkertaisina.

Migration määrittämiseksi

Cal-27-soluja (10

6 solua /kuoppa) maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja inkuboitiin 24 tuntia. Sitten solut ”haavoittunut” raaputtamalla yksittäisissä kuopissa käyttäen pipetin kärkeä. Soluja inkuboitiin DMEM-väliaineella (ilman FBS: ää), joko kanssa tai ilman indirubin ja I3M (10 uM). Solut valokuvattiin käyttäen faasikontrastimikroskopiaan (100-kertainen suurennus). Muuttavia kyky solujen arvioitiin mittaamalla leveys haavat. Migraatio etäisyydet solut olivat peräisin eroista leveydet haavoja 0, 24, ja 48 h.

Transwell kulttuuri järjestelmän hyökkäys määrityksissä

invasiivisia kyvyt syöpä käsitellyt solut tai ilman I3M tutkittiin käyttäen kalvoa TranswellTM kulttuuri järjestelmä. Lyhyesti, käytimme TranswellTM kalvoja (8-um huokoskoon, 6,5-mm; Corning Costar Corporation) päällystetty matrigeelin varten määrityksissä. -Soluja (1 x 10

4-solut) ympättiin ylempään kuoppiin esipinnoitettujen siirtoaltaat kanssa I3M (0, 2,5, 5 tai 10 uM). Alempi siirtoaltaat sisälsi samat väliaineen. Seuraavat 24 tai 48 h Inkubaatioiden soluja ylemmän kuoppiin ja Matrigel-päällystetyt kalvot pyyhittiin Q-Tip, kiinnitetään metanolissa, ja värjättiin 20% Giemsa-liuoksella (Sigma). Solut laskettiin valomikroskoopilla (200-kertainen suurennus). Kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin kolmena rinnakkaisena.

immunoblottauksella

In vitro -tutkimukset:

jälkeen kunkin käsittelyn jälkeen solut eristettiin määrittämiseksi liittyvien proteiinien vaeltavia ja invasiivisia toimintoja, kuten P21 (20 kDa) ja P53 (53 kDa) (Cell Signaling Technology) surviviiniperäiset (ihmisen, 16 kDa), matriisimetalloproteinaasi 9 (MMP-9, 92 kDa) (Thermo Scientific), polttoväli adheesiokinaasi (FAK, 125 kDa ), u-PA (34 kD), ja p-p38 (Santa Cruz Biotechnology). Näytteet uutetaan eristettyjä soluja (tai ilman I3M hoitoa), eroteltiin 12-15% SDS-PAGE-geeleissä ja siirrettiin PVDF-kalvoja. Kemiluminesenssi signaaleja havaittiin, kuten on kuvattu edellä sytokromi

c

. Signaalit kaapattiin ja mittaamaan ChemiGenius Bio Imaging System (Syngene-).

In vivo -tutkimukset:

plasmanäytteet (40 ug proteiinia) käytettiin määrittämään tasojen surviviinin erittämän kasvaimia käyttäen immunoblottauksella ja surviviiniperäisen (hiiren) monoklonaalinen vasta-aine, kuten edellä on kuvattu. Käytimme SwellGel® Blue Albumiini Removal Kit (Pierce) rikastuttaa plasmanäytteet.

Bioluminescent määritykset aaspase-3/7 ja -9

ajasta riippuvainen tutkimus kaspaasi-3: /7 ja -9 toimintaa suoritettiin kolmena rinnakkaisena käyttämällä määritystä sarjat kaspaasi-Glo 3/7 ja 9 (Promega Corp., Madison, WI, USA) valkoinen 96-kuoppalevyn. 10000 solua per kuoppa ympättiin ja sitä käsiteltiin 10 uM I3M 12, 24 ja 48 tuntia. Sitten kaspaasiaktiivisuus tutkittiin mukaisesti valmistajan protokollaa. Lyhyesti, 100 ui kaspaasi-Glo-reagenssia lisättiin ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 30 minuuttia. Presences aktiivisten kaspaasien apoptoottiselta solut pilkkovat synteettinen tetrapeptidiä, leimattu aminoluciferin reagenssissa. Vapautunut aminoluciferin toimii substraattina lusiferaasientsyymi, joka mitataan Synergy ™ 2 Multi-Mode Microplate Reader (Biotek, Winooski, Vermont).

valmistaminen indirubin-3′-oksiimi /poly (vinyyli alkoholi) (I3M /PVA) liima lääkkeen

PVA: ta (10 g, Sigma) suspendoitiin kuumaan tislattuun veteen (100 ml, 90 ° C) ja sekoitettiin kunnes se on täysin liuennut. Sen jälkeen, kun polymeeri näytti olevan täysin liuennut, lämpötila ja sekoittamista jatkettiin vielä 4 h sen varmistamiseksi, että koko ei enää ollut läsnä. Liuos jäähdytettiin huoneen lämpötilaan, ja I3M lisättiin, jolloin saatiin 10 ja 20 uM I3M /PVA liima lääkkeen seoksia.

kehitys 4-nitrokinoliini-1-oksidi (4-NQO) indusoi suun tuumorigeeninen hiirimallissa

Arvioimme antituumorigeenistä aktiivisuutta I3M käyttäen suullisen tuumorigeenisia malli Kuusi viikkoa vanhoja C57BL /6JNarl hiiriä (ruumiinpaino: 21,6 ± 1,2 g). Aiheuttavan optimaalisen muodostumista suun SCC, me included0.2 mg /ml 4-NQO ja 0,5 mg /ml arekoliinilla että eläinten juomaveden 8 viikon ajan kuin meidän aiemmin julkaistu [26]. Hiiret (n = 240), satunnaistettiin yhteen neljästä ryhmästä: tyhjä ryhmä (n = 60) sai ainoastaan ​​juomavettä; Carrier ryhmä (n = 60), 10 uM I3M (n = 60) ja 20 uM I3M (n = 60) ryhmät saivat molemmat 4-NQO (200 ug /ml) ja arekoliini (500 ug /ml) kehittää OSCC eläin malleja. Edellisen tutkimuksen, juomaveden vaihdettiin joka viikko, ja hiiret saivat pääsyn veteen kaikkina aikoina arekoliinilla /4-NQO hoitoa, ennen aloittamista I3M hoitoja. Sen jälkeen kasvain-induktio protokolla, joka kesti 8 viikon ajan [24], kielet ja posken kautta alueet hiiriä sotkee ​​PVA yksinään (operaattorin ryhmä) tai joko 10 tai 20 uM I3M /PVA 2 päivän välein 20 viikon ajan ( 0,1 mg /g: n hiirelle kehon painoa), joka aloitettiin sen jälkeen, kun week8 (kuvio S1, kuvio 1 ja 2). Ajankohtainen hoito aloitettiin klo 8 ja saatiin päätökseen tunnin kuluessa. Käsitellyt hiiret saa enää käyttää juomavettä ja ruokaa, kunnes keskiyö Kaikki hiiret punnittiin joka 4 viikko. Hiiret (n = 10) tapettiin kuukausittain kustakin ryhmästä viikon jälkeen 8; Seuraavat CO

2 hoitoa, keskimäärin 0,9-1,3 ml sydämen verta kerättiin kustakin hiirestä, ja heidän kielensä leikattiin irti koko (kasvaimia), kiinteä, upotettu, ja leikattiin osiin hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäystä.

(A) inhiboiva vaikutus indirubin ja I3M on Cal-27 ja HSC-3 solujen lisääntymistä. Soluja käsiteltiin 24 tai 48 tuntia erilaisilla pitoisuuksilla indirubin tai I3M. Solujen lisääntyminen analysoitiin MTT: llä (ylhäällä) ja solujen laskenta hemosytometrillä (alhaalla). Tiedot esitetään keskiarvona ± S.D.-arvot; tähdellä merkitsevät tilastollisesti merkitsevä ero (

P

0,05). (B) Cal-27-soluja (10

5), käsiteltiin 10 uM I3M 24 tuntia, ja prosenttiosuus apoptoottisten solujen määritettiin käyttämällä anneksiini V-FITC Apoptosis Detection Kit. Tiedot esitetään keskiarvona ± S.D. -arvot (n = 3); tähdellä merkitsevät tilastollisesti merkitsevä ero (

P

0,05) välillä I3M käsitellyissä ja kontrolliryhmissä. (C) Immunoblotit proteiinin uutteita (30 ug) eristettiin sytosolin ja mitokondriot jakeet Cal-27-soluja käsiteltiin 0, 2,5, 5 tai 10 uM I3M 24 tuntia. Esitetyt tulokset edustavat kuutta toisistaan ​​riippumatonta koetta.

(A) Cal-27-soluja käsiteltiin I3M (0, 2,5, 5 tai 10 uM) 24 tunnin ajan. Käsittelyn jälkeen solut kerättiin, kiinnitettiin metanolilla, värjättiin propidiumjodidilla ja analysoitiin käyttäen virtaussytometrialla. Datan kunkin näytteen edustavat solujen prosenttiosuus löytyy G0 /G1, S ja G2 /M-vaiheisiin solusyklin. (C) Immunoblotit osoittavat ilmentymisen solusyklin liittyvien proteiinien I3M-käsitelty Cal-27-soluissa. Kokosoluliuotteista valmistettiin 24 tunnin kuluttua hoidon I3M (0, 2,5, 5 tai 10 uM). Ilmentymistä p53 ja p21 määritettiin käyttäen immunoblottauksella.

β

aktiini käytettiin latauskontrollina tässä tutkimuksessa. Kokeet toistettiin kolme kertaa samanlaisin tuloksin.

Reaaliaikainen kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio (real time qPCR) B

Kokonais-RNA uutettiin soluista käyttämällä RNeasy Mini Kit (QIAGEN) . RNA käänteistranskriboitiin käyttäen SuperScript III First Strand Synthesis System (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR suoritettiin käyttäen LightCycler 480 koneen ja SYBR Green I Master Kit (Roche Diagnostics) [27]. Alukesekvenssit on lueteltu taulukossa S1.

immunohistokemiallinen analyysi

Kudosnäytteet kiinnitettiin 4% paraformaldehydiä (Merck) 4 ° C: ssa. Lyhyen pesu PBS, näytteet siirrettiin 30% sakkaroosia 0,01 M PBS: ssä kryosuojausta. Olemme esi-inkuboitiin (2 tuntia, 25 ° C) 8-um: n osat 10% hevosen seerumia ja 0,3% Triton X-100 PBS: ssä, jotta ei-spesifinen sitoutuminen. Leikkeitä inkuboitiin erityisiä primaarisilla vasta-aineilla, mukaan lukien kanin polyklonaalista anti-COX2 (1:200, Abcam), kanin polyklonaalinen anti-surviviiniperäisten (01:50, Novus Biologicals), ja TUNEL (1:100; QIA33 Calbiochem, Merck) ja 1 h 37 ° C, minkä jälkeen inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa. Leikkeet jälkeen inkuboitiin (2 tuntia, 25 ° C), jossa on biotiini-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen (1:200, Vector), jota seurasi inkubointi avidiini-piparjuuriperoksidaasi kompleksin (ABC-Elite).

tilastollinen analyysi

Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa. Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± S.D. arvot. Opiskelijan

t

-testi käytettiin analysoimaan eroja hoidettujen ja hoitamattomien ryhmissä. Aineisto analysoitiin SPSS 12.0 ohjelma.

P

-arvot 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

I3M estää suun syöpäsolujen proliferaatiota ja indusoi apoptoosia

Indigo, indirubin, ja I3M testattiin ensin kasvun inhibitiotesti aktiivisuuden annostellaan suun syöpäsolulinjoja Cal-27 ja HSC-3, ja 50% estävä pitoisuus (IC

50) arvot näiden kolmen aineen määritettiin seuraavan 24 tunnin lääkehoidon (taulukko S2). I3M oli selvästi aktiivisempi verrattuna indigo tai indirubin molemmissa solulinjoissa. Sitten tutkittiin anti-proliferatiiviset vaikutukset eri pitoisuuksia indirubin ja I3M on HSC-3 ja Cal-27-solut (Fig. 1A). MTT määritykset osoittivat, että sekä 5 ja 10 uM indirubin ei ollut selvää antiproliferatiivisia vaikutuksia joko solulinjoissa kuluttua 48 h hoidon. Sen sijaan, 10 uM I3M esiin merkittäviä antiproliferatiivisia vaikutuksia HSC-3-soluissa 48 tunnin kuluttua, ja sekä 5 ja 10 uM I3M kohdistuu antiproliferatiivisia vaikutuksia Cal-27-soluissa. Alkuvaiheessa apoptoosin kvantitoitiin käyttäen FITC-konjugoitua anneksiini V ja analysoitiin Talin ™ Image Cytometer. Cal-27-solut, 38,5% soluista oli positiivisia anneksiini V 24 tuntia sen jälkeen hoidon I3M (10 uM) verrattuna vain 5% soluista kontrolliryhmässä (Fig. 1 B). 24 tunnin kuluttua I3M hoidon annoksesta riippuvaa lisääminen immunoblottaus näkyi solulimafraktiot sytokromin

c

(Fig. 1 B).

I3M indusoi solukierron pysähtymisen suureksi osaksi G2 /M vaihe ja lisää p53 ja p21

WAF1 ekspressiota

sen määrittämiseksi, onko I3M indusoi Cal-27 solusyklin pysähtymiseen, käytimme virtaussytometria analysoida, miten kasvavien pitoisuuksien I3M vaikuttaa etenemisen solusyklin. Hoidon I3M yli 24 h kasvattanut Cal-27 jäljellä oleviin soluihin G2 /M-vaiheen annoksesta riippuvalla tavalla. Erityisesti prosenttiosuus G2 /M-vaiheen soluja kasvoi 36,6%: sta 53,9%: vastauksena 10 uM I3M. Lisäksi olemme huomanneet lisääntyminen prosentteina G0 /G1-vaiheen solut 11,4%: sta 21,4% (Fig. 2A). On tunnettua, että p53 estää kasvaimen kasvun kautta solusyklin pysähtymisen tai käynnistää apoptoosin. Siksi käytimme immunoblottauksella sen määrittämiseksi, onko I3M käsittely moduloi ekspressiotasot p53. Sen jälkeen 24-tunnin hoidon eri pitoisuuksia I3M, Cal-27-solut osoittivat annosriippuvaista nousua p53 ilmaus, jolla on samanaikainen nousu p21

WAF1 proteiinin ilmentyminen samoin, mikä viittaa siihen, että yksi niistä mekanismeista, joilla I3M kykenee sen anti -proliferative vaikutukset voivat välittyä p53 (Fig. 2B).

I3M estää syöpäsolujen muuttoliikettä ja invaasiota

tutkia I3M estää Cal-27 soluinvaasiota, teimme haavan paranemista määritys . Kuten on esitetty kuviossa. 3A, liikkumisetäisyyksiä oli merkittävästi vähentynyt käsitellyissä soluissa 10 uM I3M kontrolliin verrattuna ja indirubin ryhmiä. Seuraavaksi toteutimme Matrigel Transwell Pitoisuus onko I3M vaikuttaa myös solujen invaasiota. Olemme havainneet, että 10-uM annos I3M esti merkitsevästi solujen invaasiota sekä 24 ja 48 tuntia. Havaitsimme myös samankaltaisia ​​tuloksia alhaisemmalla I3M annos (5 uM) seuraavat 48 h hoidon (Fig. 3B). Tunnistaa molekyylejä vaikuttaa I3M, suoritimme immunoblottaus analyysi määrittää ekspressiotasot useiden proteiinien mukana hyökkäyksen ja muuttoliike. Tasot FAK, MMP-9, ja urokinaasi plasminogeeniaktivaattori (uPA) vähensi merkittävästi sen jälkeen, kun I3M hoidon 6 tuntia. Kuitenkin I3M aiheuttama jatkuva aktivointi fosfori-p38 (Fig. 3C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että muutokset ekspressiotasot FAK, MMP-9, ja uPA rooli inhibition hyökkäyksen ja muuttoliikkeen havaittu I3M-käsitelty Cal-27-soluissa.

(A) inkubointi solujen puuttuessa tai läsnä on 10 uM indirubin tai I3M suoritettiin 0, 24 tai 48 h. Solut valokuvattiin faasikontrastimikroskopiaan (100-kertainen suurennus). Tiedot esitetään inhibitioprosentti; tähdellä osoittavat tilastollisesti merkitsevä ero (

P

0,05) välillä käsitellyissä ja kontrolliryhmissä. (B) Soluja (10

4) maljattiin ylemmässä kammiossa I3M (0, 2,5, 5 tai 10 uM) ja annettiin läpikäydä muuttoliikettä 24 tai 48 tuntia. Kvantifiointi solujen alemmassa kammiossa tehtiin laskemalla soluja × 200 suurennus. Inhibitioprosentti ja sarakkeen keskiarvot saatiin 3 erilliselle kokeelle. Tähdet osoittavat tilastollisesti merkitsevä ero (

P

0,05) välillä käsitellyissä ja kontrolliryhmissä. (C) Immunoblotit osoittavat määrän muutoksia pp38, FAK, MMP-9 ja uPA proteiinit liittyvät maahanmuuttoon ja hyökkäyksen Cal-27 soluissa 10-uM I3M hoitoa (n = 3).

tunnistaminen surviviinin tavoitteeksi I3M

immunoblottaus-analyysi osoitti sekä ajasta ja annoksesta riippuvaa downregulation surviviinin mukaan I3M (Fig. 4A ja 4B). Surviviinispesifisiä ilmentyminen väheni merkittävästi seuraavan hoidon 10pM I3M 12-48 tuntia. Reaaliaikainen qPCR osoitti myös downregulation Surviviinin mRNA-tasojen I3M-käsitellyissä soluissa, mikä viittaa siihen, että I3M estää surviviinin ilmentymisen transkriptionaalisella tasolla (Fig. 4C). Tutkia downregulation surviviinin mukaan I3M ole mitään vaikutusta kaspaasi-3/7 ja -9 toimintaa. Mittasimme kaspaasi-3/7 ja -9 toiminta 10pM I3M hoito 12, 24 ja 48 tunnin aikapisteessä. Tulos osoittaa hyvin merkittävä kasvoi kaspaasi-3/7 ja -9 toimintaa havaittiin jälkeen 12 (94-kertainen ja 131-kertainen), 24 (388-kertainen ja 282-kertainen) ja 48 h (462-kertainen ja 314-kertainen) I3M altistumisen . Siten nämä tiedot viittaavat siihen, että I3M paitsi tukahduttaa surviviinille Cal-27-solut, vaikuttaa myös luontainen (mitokondrio-kaspaasi-9) kautta.

(A) osoitus ajasta riippuvaa surviviiniperäisten downregulation seuraavat 10- uM I3M hoito eri kestoja. Tiedot esitetään keskiarvona ± S.D.-arvot (n = 3); tähdellä osoittavat tilastollisesti merkitsevä ero (

P

0,05) välillä käsitellyissä ja kontrolliryhmissä. (B) annos-riippuvainen downregulation surviviinin seuraavista I3M hoitoa 12 tuntia. Tiedot esitetään keskiarvona ± S.D.-arvot (n = 3); tähdellä osoittavat tilastollisesti merkitsevä ero (

P

0,05) välillä käsitellyissä ja kontrolliryhmissä. (C) Cal-27-soluja inkuboitiin I3M (10 uM) 0, 6, 12, 24 tai 48 h. Näkyy ovat suhteellisen geeni-ilmentymisen tasoja kunkin näytteen hoitoryhmässä (n = 6). Rohkea viivat ilmaisevat keskiarvon liittyvä prosenttiosuus yksittäisten hoitoryhmissä. T /C: Käsitelty ryhmä (6, 12, 24, tai 48 h) /kontrolliryhmän (0 h). (D) osoitus ajasta riippuvaa kaspaasi-3/7 ja -9 upregulations seuraavat 10 uM I3M hoito 12, 24, ja 48 h.

I3M vaimentaa 4-NQO /arecoline- aiheuttama suusyöpä hiirillä

Vesi kulutukset raportoitu viikoittain kussakin ryhmässä yli 28 viikon ajan kurssin (4 viikkoa /ajankohtana) oli kuvassa S1. Kulutuksella havaittu joukossa kokeellisia ryhmiä. Hiiret tarjotaan vettä 4-NQO (200 ug /ml) ja arekoliinilla (500 ug /ml) kulutetaan vähemmän vesimäärä ennen viikon 8 (operaattorin, 10 uM, ja 20M ryhmät) kuin tyhjä ryhmä. Kuitenkin vähiten vettä 20, 24 ja 28 viikolla on harjoittaja ryhmä. 8. viikolla, kehon paino oli pienempi harjoittaja ryhmään hiiriä (Kuva. 5A). Kun 4-NQO ja arekoliinilla hallinnon lopetettiin ja hiirille annettiin vesijohtovettä viikolla 9, sekä otto- ja hiirten kehon painon lisääntynyt. By viikolla 12, 16, 20 ja 24, ei ollut merkittäviä eroja painon joukossa neljä ryhmää. Viikolla 28, kehon paino oli merkittävä pienempi kantaja ryhmässä kuin missään muussa ryhmässä. Hiirillä, joita hoidettiin pelkästään kantajalla osoitti ajasta riippuvaa kasvua sekä määrä ja koko heidän kielensä kasvaimia. Silmiinpistävän, paikallinen hoito koostuu 10 tai 20 uM I3M /PVA geeli sotkee ​​kielet hiirten tukahdutetaan tuumorigeneesiprosessin suurempia pitoisuuksia osoittavat suurempaa tehokkuutta (kuvio. 5B).

(A) hiirillä kokeissa kehon paino eivät osoittaneet merkittäviä eri joukossa neljä ryhmää, kunnes 8. viikko. Jälkeen I3M kokeissa, kehon paino kantaja-ryhmässä oli merkittävästi alhaisempi kuin muiden ryhmien 28 th viikolla (

p

= 0,031, n = 10). (B) Suun syöpä leesioita indusoitunut kielet hiirten 0,5 mg /ml arekoliini ja 0,2 mg /ml 4-NQO. Taulukossa on esitetty kasvain numerot ja koot neljään ryhmään (10 hiirtä /ryhmä /näytteenotto).

I3M vähenee surviviiniperäistä ja COX-2: n ilmentymisen ja lisäävät prosenttiosuuden Tunel-positiivisten solujen

in vivo

H & E-värjäystä eri ajankohtina osoitti, että 4-NOQ /arekoliini altistumisen lisääntynyt SCC muodostumista carrier-käsitellyissä hiirissä. Sen sijaan, I3M väheni SCC muodostumisen jälkeen 28 viikkoa annoksesta riippuvalla tavalla. Immunohistokemiallinen värjäys osoitti korkeita molempien COX-2 ja surviviinille SCC kantoaallon saaneilla hiirillä 28 viikon ajan. Erityisesti, I3M aiheutti annoksesta riippuvaa vähenemistä surviviiniperäistä ja COX-2: n ilmentymisen. TUNEL määritys suoritettiin arvioimaan tasot apoptoosin esiintyvien

in vivo

. Shi, et al. [35].