Krooninen sairaus

tiivistelmä

lupaavia tuloksia anaplastinen lymfooma kinaasin (ALK) estäjät ovat muuttuneet merkitys ALK fuusioiden useiden syöpätyyppien. Nämä fuusiot eivät ole enää pelkkiä tutkimuskohteita tai diagnostisia markkereita, mutta ne ovat nyt liittyvät suoraan terapeuttista hyötyä potilaille. Kuitenkin useimmat käytettävissä tuumorikudokset kliinisissä asetukset ovat formaliinilla kiinnitetyt ja parafiiniin upotetut (FFPE), ja tämä rajoittaa huomattavasti yksityiskohtaisen geneettiset tutkimukset monissa kliinisissä tapauksissa. Vaikka viimeaikaiset teknisiä parannuksia ovat sallineet analyysi joitakin tunnettuja mutaatioita FFPE kudoksissa, tunnistaa tuntemattomia -fuusiogeenit käyttämällä vain FFPE kudoksia on edelleen vaikeaa. Olemme kehittäneet 5′-nopea monistus cDNA-päiden-pohjainen järjestelmä on optimoitu FFPE kudosten ja arvioidaan tässä järjestelmässä on keuhkosyöpä kudos

ALK

uudelleenjärjestelyn ja ilman 2 tunnetaan ALK-fuusiot EML4-ALK ja KIF5B-ALK . Tämän järjestelmän onnistuneesti tunnistaneet uuden ALK fuusio, KLC1-ALK. Tuloksena vahvistettiin käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktiolla ja fluoresenssin

in situ

hybridisaatio. Sitten me syntetisoida oletetun täysipituisen cDNA:

KLC1-ALK

ja osoitettiin transformoivan potentiaalin fuusio-kinaasin, joissa käytetään hiiren 3T3-soluja. Parhaan tietomme mukaan KLC1-ALK on ensimmäinen romaani kasvaimia synnyttävän fuusio tunnistaa käyttäen vain FFPE kudoksia. Tämä havainto laajentaa potentiaalista arvoa arkistointia FFPE kudosten ja antaa lisää biologista ja kliinistä oivalluksia ALK-positiivisia keuhkosyöpää.

Citation: Togashi Y, Soda M, Sakata S, Sugawara E, Hatano S, Asaka R , et ai. (2012) KLC1-ALK A Novel Fusion Lung Cancer Tunnistetut käyttäminen Formaliinifiksoidusta parafinoidut Tissue Only. PLoS ONE 7 (2): e31323. doi: 10,1371 /journal.pone.0031323

Editor: Anthony W. I. Lo, Kiinan University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu 17. lokakuuta 2011; Hyväksytty: 05 tammikuu 2012; Julkaistu: 08 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 Togashi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain Grants-in-tuki Scientific Research opetus-, kulttuuri-, urheilu-, tiede-, ja tekniikka Japanin sekä avustuksia Japanin Society for Promotion of Science; Ministry of Health, Labour, and Welfare of Japan; Ajoneuvohallintokeskus Racing Juhlaraha Foundation of Japan; Prinsessa Takamatsu Cancer Research Fund; ja Uehara Memorial Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

anaplastinen lymfooma kinaasi (ALK) on reseptori tyrosiinikinaasi, joka on löydetty anaplastic suuri-solulymfooman (ALCL) muodossa fuusioproteiinin, NPM-ALK [1], [2]. Muodostuminen fuusioproteiinina kumppanin kautta kromosomitranslokaation on yleisin mekanismi ALK yli-ilmentymisen ja ALK kinaasialue aktivointia. Viimeaikaiset lupaavia tuloksia kliinisten tutkimusten kanssa ALK estäjä, crizotinib, ovat muuttuneet merkitys ALK fuusioiden keuhkosyövän [3], [4], [5], [6], tulehduksellinen myofibroblastic kasvaimet (IMTS) [7], ja ALCL [8]. ALK fuusiot eivät ole enää pelkkiä tutkimuskohteita tai diagnostisia markkereita ja nyt suoraan sidoksissa terapeuttista hyötyä potilaille.

keuhkosyöpä, 3 fuusiokumppaneihin ALK on raportoitu-EML4, TFG ja KIF5B-vaikka läsnäolo TFG-ALK keuhkosyövän ei ole vielä todistettu histopatologisia todisteet [9], [10], [11]. Lisäksi keuhkosyöpä, ALK on lisäksi havaittu tuottaa fuusioiden ALCL (fuusioitu NPM, TPM3, TPM4, ATIC, TFG, CLTC, MSN, MYH9 tai ALO17) [1], [2], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], IMT (TPM3, TPM4, CLTC, CARS, RANBP2, ATIC tai SEC31A) [19], [ ,,,0],20], [21], [22], [23], [24], ALK-positiivisia suuria B-solulymfooman (CLTC, NPM, SEC31A tai SQSTM1) [25], [26], [27], [ ,,,0],28], ja munuaissyövän (VCL, TPM3 tai EML4) (taulukko 1) [29], [30]. Lisäksi TFG-ALK keuhkosyövän, jotkut ALK fuusiot on raportoitu ilman histopatologista näyttöä: TPM4-ALK ruokatorven okasolusyöpä [31], [32] ja EML4-ALK paksusuolen ja rintakarsinoomissa [33].

Anti-ALK immunohistokemia oli tärkeä rooli toi nämä ALK fuusiokumppaneita. Useat ALK fuusioita näytteille ominaisuus värjäyskuvion anti-ALK immunohistokemia koska solunosasijaintia ALK fuusioproteiinit riippuu fuusio-osapuoleen. Esimerkiksi, NPM-ALK, mikä on yleisin fuusio ALK-positiivisia ALCL (85%), osoittaa ydin- ja sytoplasman värjäyskuvio, koska heterodimeerin NPM ja NPM-ALK lokalisoituu tumaan ja homodimeeri NPM-ALK sytoplasmassa; CLTC-ALK osoittaa sytoplasmisen rakeinen kuvio, koska se paikantuu pienessä rakkulat. Jos kasvain on jokin tunnistamaton anti-ALK värjäyskuvion, potilas voi olla uusi fuusio kumppani. Sen lisäksi, että ero Sijainti solussa ero värjäytymisen intensiteetti on avain identifioida uusia kumppaneita. EML4-ALK tuskin värjätään tavanomaisilla anti-ALK immunohistokemia [11], [34]. Tämän rajoituksen voittamiseksi kehitimme intercalated vasta–tehostetun polymeeri (iAEP) menetelmä, joka lisää kohtalaisesti herkkyyttä immunohistokemiallinen tunnistusjärjestelmä, ja EML4-ALK johdonmukaisesti värjättiin tällä menetelmällä [11]. Tämä osoitti, että kasvain, joka on positiivisesti immunovärjättiin ALK vain herkkä immunohistokemiallisesti menetelmä, mutta ei tavanomaisilla menetelmillä hautoisi uusi ALK fuusio. Perustuen tämän hypoteesin, me onnistuneesti tunnistettu PPFIBP1-ALK 2 IMT tapauksissa, jotka olivat positiivisia anti-ALK immunohistokemia vasta, kun värjätään jonka iAEP menetelmällä [35].

Anti-ALK immunohistokemia voi siten auttaa havaitsemaan ehdokas kasvaimet romaani ALK fuusio. Kuitenkin tunnistaa fuusiokumppani, muut molekyyli- tekniikat ovat yleensä tarvita, kuten 5′-nopea monistus cDNA-päiden (5′-RACE) tai käänteinen käänteistranskriptiotuotteiden polymeraasiketjureaktio (RT-PCR). Parhaan tietomme mukaan ei novel onkogeenisiä fuusioita on löydetty käyttäen formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut (FFPE) kudoksiin ainoastaan ​​siksi nukleiinihapot uutetaan FFPE kudoksista ovat vakavasti heikkene fiksaatioprosessi. Tässä tutkimuksessa kehitimme 5′-RACE-menetelmää optimoitu

ALK

fuusiokumppani tunnistus, joka oli sovellettavissa FFPE kudoksiin ja tunnistaneet uuden fuusio, kinesiiniin kevyt ketju 1 (KLC1) alk, keuhkosyövän käyttämällä vain FFPE kudosta.

Methods

Materiaalit

FFPE kudosnäytekappaleessa keuhkojen adenokarsinooma in situ, nonmucinous (entinen bronchioloalveolar karsinooma) [36], joka oli irrotettiin 47-vuotias nainen potilas käytettiin [37]. Tämä karsinooma oli negatiivinen EML4-ALK ja KIF5B-ALK, vaikka läsnä

ALK

uudelleenjärjestelyn varmistettiin anti-ALK iAEP immunohistokemia ja split fluoresenssi in situ -hybridisaatio (FISH) määritys ALK (jäljempänä kun tuntematon ALK fuusio-positiivinen tapaus) (kuvio 1) [37]. Kaksi FFPE kudosblokeista ALK-positiivisten kasvainten tapauksissa käytettiin myös, jolle läsnäolo EML4-ALK tai KIF5B-ALK oli jo vahvistettu. Kokonais-RNA uutettiin kustakin FFPE kudoksesta käytön RECOVERALL- ™ yhteensä Nucleic Acid Isolation Kit FFPE (Applied Biosystems Japan, Tokyo, Japani). Iät 3 FFPE käytetyt lohkot (aika FFPE kudoksesta tuotannosta RNA) olivat 65, 40, ja 51 kuukautta tuntemattoman ALK fuusio-positiivinen tapaus, EML4-ALK, ja KIF5B-ALK, vastaavasti. Kirjallinen tietoinen suostumus saatiin kunkin potilaan. Tutkimuksen hyväksyi Institutional Review Board of Shizuokan Cancer Center (hyväksyminen ID 22-J132-22-1) ja japanilainen Foundation for Cancer Research (hyväksyntä ID 2010-1011).

Paneeli A esittää tulokset anti-ALK immunohistokemia kanssa iAEP menetelmällä keuhkojen adenokarsinooma in situ, nonmucinous. Värjäyssarjaan oli hajanaisesti soluliman. Pohjapinta puolella kasvainsolujen voimakkaammin värjättiin, mikä osoittaa, epätasainen solunosasijaintia KLC1-ALK proteiinia. FISH analyysit paljastivat, että tässä tapauksessa oli positiivinen split määrityksessä

ALK

(paneeli B: yksittäinen 5′- ja 3′-signaaleja havaittu) ja negatiivinen

EML4-ALK

ja

KIF5B-ALK

fuusio määritykset (paneeli C:

EML4

, punainen;

ALK

, vihreä, paneeli D:

KIF5B

, vihreä;

ALK

, punainen).

Modified 5′-RACE ALK fuusioita sovellettavissa FFPE kudoksiin

5′-RACE suoritettiin älykkäämpiä RACE cDNA Amplification Kit (Clontech ) mukaan valmistajan ohjeiden vähäisin muutoksin. Lyhyesti, sen sijaan, että alukkeiden pakkauksessa mukana, ALK-3242R (5′-CTCAGCTTGTACTCAGGGC-3 ’) käytettiin cDNA: n synteesiin. CDNA tehtiin 5′-RACE PCR: llä käyttämällä PrimeStar HS-DNA-polymeraasia (TaKaRa) ja seuraavia alukkeita: Universal Primer Sekoita sarjasta ja ALK-3206R (5’-ATGGCTTGCAGCTCCTGGTGCTT-3 ’). PCR kunto koostui 5 sykliä 94 ° C: ssa 30 s ja 72 ° C 3 min; 5 sykliä 94 ° C: ssa 30 s, 70 ° C: ssa 30 s, ja 72 ° C 3 min; ja 30 sykliä 94 ° C: ssa 30 s, 68 ° C: ssa 30 s, ja 72 ° C 3 min.

FISH

FISH-analyysi -fuusiogeenit suoritettiin DNA-koettimia KLC1 ​​ja ALK. Unstained osat (4-pm paksu) alistettiin hybridisoimalla ALK-split koetinsarjaa (Dako, Tokio, Japani) tai bakteerin keinotekoinen kromosomi (BAC) klooni johdettuja koettimia ALK (RP11-984I21 ja RP11-62B19) ja KLC1 ​​(RP11-186F6). Hybridisoitiin Objektilasit värjättiin DAPI ja tutkittava käyttäen BX51 fluoresenssimikroskooppia (Olympus, Tokio, Japani).

synteesi oletetun cDNA

KLC1-ALK

Kaksi riippumattoman PCR: t suoritettiin käyttämällä cDNA: ta, joka on syntetisoitu kasvainkudoksen ilmentävät KIF5B-ALK seuraavat alukesarjat: KLC1-Nhel-M (5′-GCGCTAGCGAATGTATGACAACATGTCCAC-3 ’) ja KLC1-BPR (5′-GTGCTTCCGGCGGTACACATCTACAGAACCAAACTC-3′), ja ALK-BPF (5’-GGGAGTTTGGTTCTGTAGATGTGTACCGCCGGAAGC-3 ’) ja ALK-EcoRI (5′-GATAGAATTCTCAGGGCCCAGGCT-3’). Sitten toinen PCR suoritettiin käyttäen 1/100 laimennosta seoksen ensimmäisen PCR-tuotteita templaattina kanssa KLC1-Nhel-M ja ALK-EcoRI-alukkeita (kuvio 2).

kaksi ensi- kierros PCR: t suoritettiin erikseen käyttäen cDNA syntetisoitiin tuumorikudoksessa ilmentävien KIF5B-ALK seuraavat alukesarjat: KLC1-Nhel-M ja KLC1-BPR, ja ALK-BPF ja ALK-EcoRI. KLC1-BPR ja ALK-BPF oli sekvenssit alavirtaan ALK taitekohta (eksoni 20) ja vastavirtaan KLC1 taitekohta (eksoni 9) kuin lapseksiottajalle sekvenssit, vastaavasti. Sitten toinen PCR suoritettiin käyttäen 1/100 laimennosta seoksen ensimmäisen PCR-tuotteita templaattina käyttäen alukkeita KLC1-Nhel-M ja ALK-EcoRI. Ensimmäisessä PCR-tuotteet liitettiin laajennettu toistensa kanssa, ja sitten monistetaan alukkeilla.

Transformation määrityksessä

KLC1-ALK

Analyysi transformoivan aktiivisuutta kinaasi fuusioiden suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [9], [38], [39]. PMXS perustuva ekspressioplasmidi kunkin fuusio käyttää rekombinantti ekotrooppisille retrovirukset [40], joka käytettiin sitten erikseen infektoimaan hiiren 3T3-fibroblasteissa. Muodostumista transformoitu pesäkkeitä arvioitiin sen jälkeen, kun soluja on viljelty 4 päivää. Samoja 3T3 ihonalaisesti nu /nu hiirille, ja tuumorin muodostus tutkittiin 14 päivän kuluttua. Eläin kokeet hyväksynyt eläimen eettisen komitean Jichi Medical University (hyväksyntä ID 1135).

Tulokset

tunnistetiedot

KLC1-ALK

uutena

ALK

-fuusiogeenin

modifioitu 5′-RACE uskollisesti eristetty cDNA-fragmentit

EML4-ALK

tai

KIF5B-ALK

tunnettujen ALK kasvaimia (täydentävät Kuva S1A ja B). Sitten yrittivät eristää cDNA- fragmentit, jotka kuuluvat fuusio kohtia tuntematon ALK fuusio-positiivinen tapaus. Nukleotidisekvensointi kuten 5′-RACE-tuotteet paljasti, että 2 10 kloonin sisälsi 3′-päässä eksonin 9

KLC1

(ENST00000348520) fuusioitu ensimmäisen nukleotidin eksonin 20

ALK

(ENST00000389048), mikä osoittaa, että läsnä on uusi fuusio välillä

KLC1

ja

ALK

. Koska tämä uudelleenjärjestelyn muodostaa in frame välisen fuusion 2-geenien, täyspitkä

KLC1-ALK

cDNA todennäköisesti tuottaa proteiinin 984 aminohappoa, joka sisältää aminopään kaksi kolmasosaa KLC1 ja solunsisäisen alueen ALK (kuvio 3A). RT-PCR-välitteisen eristäminen sulamispiste onnistuneesti vahvistanut lukukehyksessä välisen fuusion 2 viestiä (kuvio 3A ja B). Edelleen vahvistaa genominen uudelleenjärjestely vastaavan fuusiota, fuusiota FISH-määritys suoritettiin (kuvio 3C). Nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​läsnäolo t (2; 14) (p23, q32.3), mikä tuottaa

KLC1-ALK

.

Paneelissa A esitetään kaavamainen rakenne KLC1, ALK ja KLC1-ALK proteiineja ja cDNA-sekvenssin ympärillä sulamispiste. Tumman sininen, oranssi, ja punaiset osat edustavat rulla-kela, transmembraaninen ja kinaasi verkkotunnuksia, vastaavasti. Katko kohta eksonit ja määrä aminohapot osoitetaan. KLC1-ALK-spesifinen RT-PCR: llä käyttämällä RNA uutetaan FFPE kudoksesta tuntemattoman ALK fuusio-positiivisia tapauksessa monistetun fragmentin odotetun tuotteen koko (140 bp, paneeli B) kanssa yhdenmukaisia ​​fuusio-sekvenssin (paneeli A). Fuusio FISH määritys

KLC1-ALK

paljasti fuusio signaali (keltainen) useita tuumorisoluissa (paneeli C). M, merkki (100-bp tikkaat); S, näyte (tuntemattoman ALK fuusio-positiivinen tapaus); N, templaattia sisältämättömään verrokkiin.

Transforming potentiaalia

KLC1-ALK

oletetun täysipituisen cDNA:

KLC1-ALK

oli syntetisoitu jäätynyt kudos KIF5B-ALK fuusion ilmentymisen (kuvio 2, Täydennyskuvio S2), ja sitä käytettiin muodostamaan rekombinantti-retroviruksen fuusioproteiini ilmennetään jossa aminoterminaalinen FLAG-epitoopin tag. Infektio 3T3 solujen viruksen ilmentävien KLC1-ALK helposti valmistaa useita muuttaneet pesäkkeitä kulttuurin ja ihonalainen kasvaimia nude hiiren kasvainten muodostumiseen määrityksessä (kuvio 4), mikä vahvistaa voimakas transformoivan kyvyn KLC1-ALK.

Ylä paneelit : hiiren 3T3 fibroblastit tartutettiin retrovirusten koodaavat KLC1-ALK tai EML4-ALK tai vastaavaan tyhjän virus (Mock). Solut valokuvattiin jälkeen 4 päivää viljelyn. Mittakaava, 1 mm. Alemmat paneelit: Nude-hiiriin ruiskutettiin ihon alle vastaavan 3T3-solut, ja kasvaimen muodostumista tutkittiin sen jälkeen, kun 14 päivää. Kasvainten määrä muodostunut kohti injektion alareunassa näkyvän.

Keskustelu

Tässä analysoimalla FFPE kudosten ainoa, onnistuneesti keksitty uusi ALK fuusio, KLC1-ALK. Vaikka snap-jäädytetty materiaalien näytteet koepalana otetulle tai poistaa kirurgisesti näytteitä voidaan käyttää erilaisten molekyylien analyysien, niitä ei rutiininomaisesti näytteitä useimmissa hoitopaikassa. Sen sijaan FFPE yksilöt ovat yleensä tuotetaan, ja histopatologia diagnostisia arkistot ovat erittäin suuri voimavara FFPE kudosten tavallisissa diagnostisten patologian laboratorioissa. Kuitenkin DNA: n ja RNA: ta FFPE kudokset ovat vakavasti huonontunut aikana formaliinia kiinnitys ja eivät yleensä ole sopivia määrityksiä, jotka vaativat pitkän DNA /RNA laadukkaita. Viimeaikaiset tekniset edistysaskeleet ovat sallineet joitakin analyysejä tunnettujen pistemutaatioiden ja tunnetaan -fuusiogeenit, mutta se on edelleen vaikea tunnistaa tunnistamattoman geeni poikkeama käyttäen vain FFPE kudosta.

Useimmissa

ALK

fuusioita, tauon piste

ALK

sijaitsee intronin 19, ja jonka sulamispiste on mRNA: n on tyypillisesti ensimmäisen nukleotidin eksonin 20. Näin ollen, jos alukkeet 5′-RACE on sijoitettu välittömästi alavirtaan ensimmäisen nukleotidin on

ALK

eksonin 20, kuten 5′-RACE voi menestyksellisesti eristää PCR-tuotteita sisältävien kumppani geenisekvenssin jopa käyttämällä FFPE kudoksia. Perustuen tämän hypoteesin, perustimme 5′-RACE järjestelmä

ALK

fuusioiden optimoitu FFPE kudoksia. Tällä järjestelmällä olemme tunnistaneet uuden

ALK

fuusio,

KLC1-ALK

. Parhaan tietomme mukaan tämä on ensimmäinen romaani kasvaimia synnyttävän fuusio tunnistetaan käyttämällä vain FFPE kudosta.

Varoitus kuitenkin tarvitaan. Joissakin harvoissa tapauksissa, joissa

ALK

fuusio, tauon pisteen

ALK

fuusio-mRNA ei ehkä 5′-päähän eksonin 20. Esimerkiksi variantti 4

EML4-ALK

, eksonin 14

EML4

fuusioidaan tuntemattoman sekvenssin 11 emäsparin, joka puolestaan ​​on yhdistetty nukleotidiin 50

ALK

eksonissa 20 (E14; ins11; del49A20) [38]. Meidän 5′-RACE-järjestelmä ei toimi tällaisessa tapauksessa, koska käänteinen aluke ALK-3206R vastaa nukleotidejä 12-34 on

ALK

eksoni 20. Jos siis meidän modifioitu 5′-RACE ei eristää fuusio cDNA tapauksista, joissa on vahvistettu ALK uudelleenjärjestely, muut pohjamaali asetuksia voidaan yrittää.

kinesiiniin on heterotetrameeri 2 kinesiinin raskasketjujen ja 2 kinesiiniin kevyitä ketjuja, ja se siirtyy mikrotubulusten kohti plus- päättyy kuljettaa eri lastien . Raskas ketjut satama moottorin toimintaa, kun taas kevyet ketjut rooleja rahdin sitovia ja moduloivan aktiivisuuden ja solunosasijaintia raskaiden ketjujen. KLC1 ​​sitoutuu kinesiinin raskaita ketjuja, joissa on N-terminaalinen domeeni ja eri lastien kautta tetratricopeptide toista domeenit [41], [42]. Niistä 3 histopatologisesti vahvisti ALK fuusiokumppanit keuhkosyövän, EML4 colocalizes mikrotubulusten kanssa ja saattaa edistää vakauttamista mikrotubulushaarojen [43], KIF5B liikkuu mikrotubulusten kuin kinesiinin raskaan ketjun [44], ja KLC1 sitoutuu kinesiiniin raskaita ketjuja kinesiiniin kevytketju. Näin ollen, on mielenkiintoista, että kaikki 3 ALK fuusioiden keuhkosyöpä ovat todennäköisesti colocalize mikrotubulusten kanssa.

Yleisimmät ALK fuusio keuhkosyöpä on EML4-ALK (4-7%) [9], [ ,,,0],38], ja toinen on KIF5B-ALK (0,5%) [11]. Yksi kotelo TFG-ALK on raportoitu [10]. KLC1-ALK voi olla harvinaisia, mutta on olemassa keuhkoadenokarsinooma, ja potilaille, joilla on tämä fuusio on erittäin todennäköisesti hyötyä ALK estäjähoidosta kuin potilailla, joilla on muita ALK fuusioita. Ilmaantuvuus voi olla pieni, mutta tämän merkitystä fuusio on erittäin korkea näkökulmasta räätälöidyn hoitovaihtoehto potilaalle. Toinen tärkeä seikka on, että KLC1-ALK löydettiin adenokarsinooma in situ, nonmucinous (aikaisemmalta nimeltään bronchioloalveolar karsinooma, BAC). BAC on tunnustettu harvoin satama ALK fuusioita, vaikka pieni määrä BAC tapauksia on tutkittu ALK fuusio verrattuna invasiivisen adenokarsinooma. Olisi mielenkiintoista peräisin pathobiological näkökulmasta tutkia laajamittaisen kohortti BAC ja muiden syöpää edeltävät olosuhteet ALK fuusiota.

On 3 havaitsemiseksi ALK fuusioiden: RT-PCR, ALK split FISH, ja erittäin herkkä anti-ALK immunohistokemia. RT-PCR, 5 ’kumppani-geeni on tunnettu. Meidän havainnot tässä tutkimuksessa tunnistettiin yksi kumppani geeni, joka olisi kohdistettava in ALK-fuusio havaitseminen käyttäen RT-PCR keuhkosyöpä. Muut 2 menetelmillä voidaan tunnistaa kaikki ALK-fuusiot riippumatta fuusiokumppanin ja näin ollen ovat sopivia ALK-fuusion seulonta. Toisin sanoen, nämä 2 menetelmien voi tunnistaa fuusiokumppanissa ja täytyy seuraajaksi kumppanikohtaisiin RT-PCR ja /tai fuusio FISH tähän tarkoitukseen. Jos se paljasti, että kumppani geenin testattu tapauksessa on tuntematon, uusi kumppani geeni on hyvin todennäköisesti voitu havaita, kuten on esitetty esillä olevassa tutkimuksessa. Itse asiassa käytetään erittäin herkkä anti-ALK immunohistokemia (iAEP menetelmä) seulonta, olemme tunnistaneet useita uusia ALK fuusioita erilaisten syöpien mukaan lukien keuhkoadenokarsinooma [11], lymfooma [28], sarkooma [35], ja munuaissolukarsinooma kohdunkaulan [30].

Monet tehokkaat välineet on vahvistettu havaitsemiseksi ALK fuusio-positiivisia tapauksia käyttäen FFPE kudoksia, mukaan lukien anti-ALK immunohistokemia ja FISH. Meidän havainnot kasvaa entisestään mahdollinen arvo arkistointia FFPE kudosten ja antaa lisää biologista ja kliinistä oivalluksia ALK-positiivisia syöpiä tulevassa aikakauden ALK estäjähoidosta.

tukeminen Information

Kuva S1.

5′-RACE-tuotteita käyttämällä FFPE kudoksia. Meidän modifioitu 5′-RACE uskollisesti eristetty cDNA-fragmentit

EML4-ALK

(A) tai

KIF5B-ALK

(B) tunnetuista ALK positiivisia kasvaimia.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0031323.s001

(TIF) B Kuva S2.

Oletetut cDNA-sekvenssi KLC1-ALK. Otaksuttu täyspitkä cDNA

KLC1-ALK

syntetisoitiin jäätynyt kudos KIF5B-ALK fuusion ekspressiota.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0031323.s002

(PDF)

Kiitokset

Kiitämme herra Motoyoshi Iwakoshi, Ms Keiko Shiozawa, Ms Tomoyo Kakita, ja Ms Kimie Nomura niiden teknistä tukea, ja Ms Sayurin Sengoku tarjota hallinnollista apua.