Krooninen sairaus

tiivistelmä

STAT6 transkriptiotekijä on tullut potentiaalinen molekyyli terapeuttista intervention koska se säätelee monenlaisia ​​solun prosessien monenlaisia ​​solutyyppejä. Vaikka jotkut kohdegeenien ja vuorovaikutuksessa kumppanit STAT6 on tunnistettu, sen tarkkaa toimintamekanismia on selvitetty. Tässä tutkimuksessa olemme pyrkineet edelleen luonnehtia molekyylivuorovaikutusten, verkkojen ja toiminnot STAT6 profiloidaan mRNA ilmaus STAT6 vaiennettu ihmisen keuhkojen solut (NCI-H460) käyttäen mikrosiruja. Meidän analyysi paljasti 273 differentiaalisesti ilmentyvien geenien jälkeen STAT6 hiljentäminen. Analyysi geeniekspression data Ingenuity Pathway Analysis (IPA) ohjelmistot paljasti

geeniekspressio, Cell kuoleman, rasva-aineenvaihdunta

kuin liittyvät toiminnot korkein mitoitettu verkkoon.

Kolesteroli biosynteesin oli

kaikkein rikastetun reittejä IPA sekä PANTHER analyysissä. Nämä tulokset on validoitu reaaliaikaisella PCR ja kolesterolin määritys käyttäen salatun siRNA negatiivisena kontrollina. Samanlaisia ​​vaikutuksia havaittiin myös ihmisen tyypin II keuhkorakkuloiden epiteelisolujen A549. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme ensimmäistä kertaa, on esitetty käänteinen suhde STAT6 kanssa kolesterolin biosynteesiä keuhkosyövän soluja. Esillä olevat havainnot ovat mahdollisesti merkittäviä edistämään ymmärrystä ja suunnittelu hoitomuotoja patologisista tiloista, joissa sekä STAT6 ja kolesterolin biosynteesin ovat osallisina eli. astma, ateroskleroosi jne

Citation: Dubey R, Chhabra R, Saini N (2011) Sirna vastaan ​​transkriptiotekijä STAT6 lisäävästi kolesterolin synteesiä Keuhkosyöpä Cell Lines. PLoS ONE 6 (12): e28509. doi: 10,1371 /journal.pone.0028509

Toimittaja: Sunil K. Ahuja, South Texas Veterans Health Care System, Yhdysvallat

vastaanotettu: 9. kesäkuuta, 2011; Hyväksytty: 09 marraskuu 2011; Julkaistu: 05 joulukuu 2011

Copyright: © 2011 Dubey et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat tunnustaa Department of Biotechnology (DBT) lta hankkeelle nimeltään ”Study of STAT6 transkriptiotekijän apoptoosin asetuksessa käyttäen RNAi Technologyn (GAP0047). RD sai taloudellista tukea DBT projekti GAP0047. RC tuettiin CSIR-Senior Research Fellowship (neuvoston tieteellisen ja teollisen tutkimuksen). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

STAT6 on yksi seitsemästä perheenjäsenten transkriptiotekijöiden, jotka osallistuvat geenin ilmentymisen säätelyyn, kun solut kohtaavat erilaisia ​​solunulkoisia polypeptidejä, kuten sytokiinien, hormonien ja kasvutekijöiden ja säädellä laajan soluprosessien kuten solujen lisääntymisen , erilaistuminen ja apoptoosin [1], [2], [3], [4]. Yleensä fosforyloitumaton STAT proteiinit esiintyä piilevänä muotoja sytoplasmassa. Sytokiini altistuminen aiheuttaa STAT fosforylaatioon Janus-kinaasien ja kerran fosforyloitiin dimeroinnin yksittäisten STAT proteiinien tapahtua niiden SH2-domeenia seuraa migraatio toiminnallinen STAT dimeerin tumaan, jossa se voi sitoutua DNA ja sitä aktivoi sytokiini reagoivien geenien [5] , [6]. Aivan kuten muut jäsenet STAT perheen STAT6 on kaksijakoinen rooli signaalin anturin ja aktivaattori transkription joko suoraan geenin ilmentymisen säätelemiseksi tai olemalla vuorovaikutuksessa monenlaisia ​​muita transkriptiotekijöiden [7].

IL -4 ja IL-13 indusoi STAT6 signalointi on osoitettu olevan tärkeä rooli erilaistumista Th2-solujen, B-solujen indusoima IgG ja IgE, ja solun pinta-näyttö MHC-luokan II ja CD23 [8], [9] , [10], [11]. Vaikka STAT6 tunnetaan pääasiassa liittyvän allergisen tulehduksen ja astman, STAT6 vapauttaminen on myös ollut mukana useita muita sairauksia. STAT6 on keskeinen rooli T-solun hepatiitti kautta tehostaen eotaxins maksasoluissa ja endoteelisolujen, ja indusoi IL-5 ilmaisu, soluttautumista eosinofiilien ja neutrofiilien maksaan ja johtaa hepatiitti [12]. On myös todisteita siitä, että IL-4-indusoidun aktivaation STAT6 liittyy alentunut maksan ilmentymisen TNFa sekä vaimennus maksan neutrofiilien ja voivat suojata maksan iskemia /reperfuusio-vamma [13]. STAT6 on myös osoitettu olevan osallisena siliaarisessa mechanosensation munuaisen epiteelisolujen [14]. Äskettäin IL-4 ja STAT6-geenin polymorfismien on myös havaittu liittyvän systeeminen lupus erythematosus kehitystä Kiinan potilaille [15]. Shum

et al

vuonna 2006 tarjosi yhteyden allergisen tulehduksen ja rasvahappojen aineenvaihduntaan, jossa he ovat osoittaneet, että IL-4 /STAT6 säännelty geenin aP2, jolla on tärkeä rooli rasva-aineenvaihdunnan, tarvitaan Th2-välitteisen allergiset hengitysteiden tulehdus [16] ja viime aikoina STAT6 on todettu olevan rooli säätelyssä lipidien homeostaasin maksan lisääntynyt lipidien kertymistä havaittiin STAT6 hiirien [17]. Lisäksi edellä mainittuja päätelmiä, Zhang

et al

vuonna 2006 raportoitiin, että STAT6 hiljentämisen estää proliferaatiota ja indusoi apoptoosia paksusuolensyöpä HT-29-solujen [4]. Toisessa tutkimuksessa Das

et al

vuonna 2007 todettiin, että STAT6 on konstitutiivisesti selviytymisen tekijä ihmisen eturauhassyövän [18]. Tämä vaikutus STAT6 vahvistui edelleen tutkimuksessa Cui

et al

vuonna 2007, jossa he ovat osoittaneet, että fosforyloitumaton STAT6 kopiointia jopa säätelee COX-2 ilmaisun ja suojaa apoptoosin NSCLC (ei-pienisoluinen keuhkosyöpä ) soluihin [19].

Vaikka muutama kohdegeenien ja jotkut vuorovaikutuksessa kumppanit STAT6 ovat olleet tiedossa asti mennessä, tarkka mekanismit STAT6 välittämä signalointi ei juuri tunneta. Ottaen huomioon tämän, pyrimme vaikutuksen tutkimiseksi STAT6 hiljentäminen genomipohjaisia ​​laaja geeniekspressiomalleja NCI-H460-solujen (keuhkosyöpä epiteelin). Saadut tulokset jälkeen siRNA välittämää vaiennettu STAT6 NCI-H460-soluja myös validoitu A549-solut.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja siRNA transfektio

keuhkosyöpä ( NCI-H460 ja A549) hankittiin National Center for Cell Science, Pune, Intia ja RPMI-1640 /DMEM, joka sisälsi 10% vasikan sikiön seerumia ja antibiootteja (100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2 ilmassa.

transfektiota 12 kuoppalevyillä, 1,2 x 10

5-solut ympättiin per kuoppa ja annettiin kiinnittyä yön yli. Seuraavana päivänä solut transfektoitiin 60 nM validoitu siRNA (Ambion, USA) käyttämällä 4 pl lipofektamiinia 2000 (Invitrogen, USA) valmistajan protokollan. Aina, kun on osoitettu, soluja stimuloitiin 50 ng /ml ihmisen rekombinantti-IL-4 (BD Pharmingen, USA) 4 tuntia. Solut kerättiin sen jälkeen, kun 24 h /48 h /72 h transfektion jälkeen, ja käytettiin kokeissa. Transfektoidut ja muokkaamalla siRNA transfektoidut solut otettiin talteen 48 tunnin kuluttua kaikissa kokeissa, ellei toisin ole ilmoitettu.

RNA uuttaminen ja Real Time PCR

Kokonais-RNA uutettiin käyttäen Trizol-reagenssia (Invitrogen, CA, USA) ja 2 ug RNA: ta käänteiskopioitiin käyttäen RevertAid ™ H Minus käänteistransskriptaasi kit (Fermentas, USA) valmistajan protokollan. Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA). Tulokset normalisoitiin kanssa 18s rRNA. Data analysoitiin käyttäen Pfaffl menetelmällä [20]. Aluke sekvenssejä, joita käytetään RT-PCR on esitetty taulukossa S1.

Western-blottaus

Solut trypsinoitiin ja solupelletit hajotettiin muutettu RIPA-puskurilla {50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40, 0,25% Na-deoksikolaatti, 1 ug /ml aprotiniinia, 1 ug /ml leupeptiiniä, 1 ug /ml pepstatiinia, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF), 1 mM natrium- orthovandate, ja 1 mM natriumfluoridia} ja pidettiin jäissä 30 min. Lysaattia sentrifugoitiin 12000 rpm: ssä 30 min, supernatantti kerättiin ja proteiinin arviointi tehtiin käyttäen BCA-menetelmällä. Yhtä suuret määrät proteiinia (50 ug) erotettiin 12% natriumdodekyylisulfaatti – polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE) ja siirrettiin PVDF-kalvolle. Membraani blokattiin 3% rasvatonta maitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (20 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4), jossa oli 0,1% Tween-20: ssa 1 h ja sitten inkuboitiin primaarisen vasta-aineen 1% rasvatonta maitoa 2 h, mitä seurasi inkubointi sopivan sekundäärisen vasta-aineen (anti-hiiri-ALP liittyy ja /tai anti-kani-ALP sidottu) 1 h. Blotit kehitettiin käyttämällä NBT- BCIP substraattina. Equal lastaus proteiinia varmistettiin käyttämällä GAPDH vasta-ainetta. Mittaus signaalin voimakkuuden PVDF kalvoja jälkeen western blottaus suoritettiin käyttäen AlphaImager 3400 (Alpha Innotech Corporation, San Leandro, Kalifornia). IDV arvot lasketaan tiheyden arvot tietyn proteiinin bändi /GAPDH tiheys arvoja. Taitteen eroavat transfektoimattomilla soluja laskettiin sitten perustuen IDV arvoihin. Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa; edustavia tuloksia on esitetty.

Illumina Microarray

Genome laaja vaikutus STAT6 hiljentäminen tutkittiin Illumina mikrosirulla. Kaksi biologista rinnakkaisnäytettä transfektoimattomista NCI-H460-solujen ja NCI-H460-soluissa, jotka on transfektoitu 60nm STAT6 siRNA (48 h) käytettiin array kokeessa. Kokonais-RNA uutettiin käyttäen Trizol-reagenssia (Invitrogen, CA, USA), puhdistettiin ja konsentroitiin käyttämällä RNeasy MinElute uudelleenjärjestäminen Kit (Qiagen, CA, USA) kohti valmistajan protokollaa. Kaikki RNA-näytteet testattiin eheyden geelielektroforeesilla. Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit (Ambion, TX, USA) käytettiin tuottamaan biotinyloidun, monistettiin RNA. Lyhyesti, 500 ng kokonais-RNA: ta käänteistranskriptio oligo (dT) alukkeen avulla ArrayScript entsyymiä ja monistettiin yön yli T7-RNA-polymeraasia ja biotiinilla leimattu mukaan valmistajan protokollaa. Tämä leimatun monistettu RNA (arna) hybridisoitiin Illumina Genome-Wide Expression BeadChips (Human Ref-6 v.3.0, Illumina, CA, USA), joka edustaa ~43,000 ihmisen transkriptejä 58 ° C: ssa yön yli. Taulukot inkuboitiin Cy3 streptavidiinin ja pestiin mukaan valmistajan protokollaa. Siru skannattiin käyttäen Illumina skannerin (Iscan) ja analysointi microarray tietojen tehtiin käyttäen Illumina Beadstudio 2,0-ohjelmisto. Aineisto oli keskimääräiseksi ja geenien kynnyksen havaitseminen p-arvo ≤ 0,05 joukossa kaikki näytteet ja ero pisteet p-arvo ≤ 0,05 joukossa testinäytteitä katsottiin ilmentyvät eri geenit. Työ-vuokaaviota Tämän kokeen on kuvassa S1. Saatuja tietoja on talletettu NCBI: n Gene Expression Omnibus [21] ja on saatavilla kautta Gene Expression Omnibus (GEO) Sarjan hakunumerolla GSE25942 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi ? acc = GSE25942).

Ingenuity koulutusjakson analyysi (IPA) B

Aineistot edustavat geenejä, joilla on muuttunut mentymisprofiili peräisin mikrosirujen analyysit tuotu Ingenuity Pathway Analysis Tool (IPA Työkalu; Ingenuity®Systems , Redwood City, CA, USA, https://www.ingenuity.com). IPA, ilmentyvät eri geenit kartoitetaan geneettinen verkkoja saatavilla kekseliäisyyttä tietokantaan ja sitten paremmuusjärjestykseen pisteet.

perusteella IPA-ohjelmasta koostuu Ingenuity Pathway Knowledge Base (IPKB), joka on peräisin tunnetuista toiminnoista ja vuorovaikutukset geenien julkaistu kirjallisuudessa. Siten IPA Työkalu mahdollistaa tunnistamaan biologisia verkkojen maailmanlaajuinen toimintoja ja toiminnallisia polkuja tietyn aineisto. Ohjelma antaa myös merkitystä arvo geenien, muiden geenien, joiden kanssa se on vuorovaikutuksessa, ja tuotteiden geenien suoraan tai epäsuorasti vaikuttavat toisiinsa, mukaan lukien ne, jotka eivät osallistuneet mikrosiruanalyysillä. Luodut verkostot on luokiteltu sen mukaan, kuinka monta merkittävästi ilmaisivat geenien ne sisältävät myös listan sairauksista, jotka olivat merkittävimmät. Verkko on graafinen esitys molekyylien välisiä suhteita molekyylejä. Molekyylit ovat edustettuina solmuja, ja biologisen suhde kahden solmun on edustettuna reunan (viiva). Kaikki reunat tukevat vähintään 1 viite kirjallisuudesta, oppikirjasta, tai kanoninen tallennetut tiedot Ingenuity Pathways Knowledge Base. Intensiteetti solmun väri kertoo asteen ylä- (punainen) tai alaspäin (vihreä) sääntelyä. Solmut näytetään käyttäen erilaisia ​​muotoja, jotka edustavat toiminnallinen luokka geenituotteen.

PANTHER analyysi

PANTHER (Protein analyysiin Evolutionary Relationships) Classification System on ainutlaatuinen resurssi, joka luokittelee geenit niiden toimintoja, käyttäen julkaistuja tieteellisiä kokeellista näyttöä ja evoluution suhteita ennustaa toiminto jopa ilman suoria kokeellista näyttöä [22]. Differentiaalisesti ilmentyvien geenien saatu STAT6 hiljentäminen NCI-H460-soluissa tuotiin PANTHER (https://www.pantherdb.org/), jossa joukko geenejä kussakin reitin verrattiin vastaan ​​joukko geenejä NCBI: n

Homo sapiens

genomin että polku. Binomisen testiä käytettiin tilastollisesti määrittää yliedustus PANTHER luokitusluokkien. Bonferroni korjattu p-arvot 0,05 pidettiin merkittävinä.

Kolesteroli määrityksessä

Kolesteroli pitoisuus määritettiin solujen käyttäen kolesteroli määritysrajan kit (BioVision, CA, USA) valmistajan ohjeita. Lyhyesti, 10

6 solut hajotettiin ja lipidit uutettiin homogenisoimalla 200 ui kloroformi: isopropanoli: Triton X-100 (7: 11: 0,1). Nämä rasva-uutteet kuivattiin vakuumissa 30 min ajan ja jäännökset liuotettiin 200 ul: kolesteroli Reaction Buffer varustettu sarjasta. Kolesteroli arvioitiin spektrofotometrisesti λ = 570 nm: ssä 96-kuoppaisen levyn mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kolesterolitasoa normalisoituivat määriä totaalisoluproteiinia.

promoottorianalyysi

tunnistamiseksi alaisiksi valvonta keskuudessa muuttunut geenejä, geenit kolesterolin biosynteesireitillä (HMGCR- 3-hydroksi 3-metyyliglutaryylikoentsyymi A: n reduktaasin HMGCS1- 3-hydroksi-3-metyyliglutaryylikoentsyymi A: n syntaasi 1 ja IDI1- iso–difosfaatti delta-isomeraasi 1) otettiin promoottorin analyysiä. Ensembl [23], käytettiin hakemaan 5,0 kb ylävirtaan alueita transkription aloituspaikat näiden geenien ja transkriptiotekijä (t) sitova tämän alueen sisällä määritettiin käyttäen yliedustettuna Transcription Factor Binding Site Prediction (OTFBS) työkalun [24], että havaitsee yliedustettuna motiiveja tunnettujen transkriptiotekijöiden varten joukon geenejä.

elektroforeettinen liikkuvuus Shift Assay (EMSA) B

elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määritys suoritettiin kuten kuvataan Shiraga

et al

. [37]. Tumauutteita valmistettiin transfektoimattomista, siRNA-transfektoiduissa (60 nM, 48 h /72 h) ja salattu siRNA transfektoitiin NCI-H460-soluissa käyttäen NE-PER ydin- ja sytoplasmisia Extraction Reagent Kit (Pierce) mukaan valmistajan protokollaa.

oligonukleotidisekvenssit käytetty EMSA otettiin aiemmin julkaistusta tutkimuksesta [25]. Kaksijuosteista DNA: ta on tuotettu sekoittamalla ekvimolaariset määrät komplementaaristen oligonukleotidien in hybridisointipuskuriliuosta (Ambion, CA, USA). Mutatoidun sekvenssin transkriptiotekijän käytettiin myös tarkistaa spesifisyys sitoutumisen transkriptiotekijä. Nämä hehkutettu kaksijuosteista DNA: ta leimattiin [c32-P] -ATP: tä (Brit, Hyderabad, Intia), kun läsnä on T4-polynucleotidekinase (New England Biolabs, MA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tumauutteita (18 ug) peräisin transfektoidut ja siRNA-transfektoituja soluja inkuboitiin 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, kun läsnä on reaktiossa, joka sisälsi 8 ​​mM Tris-KCl (pH 8,0), 2 mM EDTA, 1 mM DTT, 12% glyserolia , 1 mg BSA: ta ja 1 mg poly (dl-dC). Joko villityypin tai mutatoidun leimattua kaksijuosteista oligonukleotidiä (40000 cpm) lisättiin sitten reaktioseokseen ja inkuboitiin 45 min ajan huoneenlämpötilassa. Päättyessä inkuboinnin näytteet ladattiin ei-pelkistävään 6% polyakryyliamidigeelillä ja elektroforeesi 0,5 X TBE. Sitten geelit kuivattiin ja altistettiin phosphorlmager analyysejä (FLA-2000, Fujifilm, Japani). Densitometriset analyysit tehtiin käyttäen AlphaImager 3400 (Alpha Innotech Corporation, San Leandro, Kalifornia). Samankokoinen suorakaide laatikko vedettiin ympäröivä kunkin kaistan ja intensiteetti kunkin analysoitiin ohjelman vähentämisen jälkeen taustan intensiteettiä.

anneksiini V määritys

Apoptoosi arvioi Guava neksiini kit ja Guava PCA-järjestelmän (Guava Technologies, Hayward, CA, USA). Altistuminen fosfatidyyliseriinin (PS) solun pinnalla (joka liittyy apoptoosin alkaminen) muodostaa perusteella Guavan neksiini määrityksessä. Guava neksiini määrityksessä käytetään kahta tahrat (anneksiini V ja 7-amino aktinomysiini D: [7-AAD]). Anneksiini V-PE sitoutuu PS solun pinnalla apoptoottisten solujen ja 7-AAD, solu läpäisemätön väriaine on osoitus kalvon rakenteellisen eheyden. 7-AAD jätetään eläviä, terve ja varhainen apoptoottisia soluja, mutta leimaa myöhään apoptoottiset ja kuolleita soluja. Määritys suoritettiin valmistajan protokollan ja anneksiini-PE-fluoresenssi analysoitiin avulla cytosoft ohjelmisto (guava Technologies, Hayward, CA, USA). Vähintään 2000 tapahtumien laskettiin.

Cell cycle määritys

analyysi solusyklin jakautuminen, solut kiinnitettiin jääkylmällä 70% etanolilla ja käsiteltiin 1 mg /ml RNaasi 30 minuuttia 37 ° C: ssa. Solut käsiteltiin sitten fluoresenssiväri propidiumjodidilla (50 ug /ml, Sigma, USA), jotka sitoutuvat DNA: han interkalatoivat välillä emästen 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan ja analysoitiin käyttäen virtaussytometriä (guava Technologies, Hayward, California, USA ). Vähintään 5000 tapahtumien laskettiin.

Tulokset

STAT6 downregulation käyttämällä STAT6 erityisiä siRNA

tehoa STAT6 erityisiä siRNA saadaan säädeltyä STAT6 ilmentymistä NCI-H460-soluissa oli arvioitiin reaaliaikainen PCR RNA ilmaisun ja western blotting proteiinin tasoja. Kuten on esitetty kuviossa. 1b, RNA tasot laskivat 1,20 kertaista 24, 2,12-kertainen (p-arvo = 0,046) 48 h ja 1,66-kertaisesti (p-arvo = 0,05) 72 tuntia siRNA transfektoiduissa NCI-H460-soluissa verrattuna transfektoimattomiin NCI-H460 solut. Ei ollut merkittävää muutosta transfektoimattomissa soluissa ja salattu siRNA transfektoidut solut eri ajankohtina. Kuitenkin proteiinin tasot STAT6 pienennettiin aika-riippuvaisella tavalla. Kuten on esitetty kuviossa. 1a ja 1b, oli 1,12-kertainen pieneneminen 24 tunnin, 1,79 kertainen (p-arvo = 0,02) pienenee 48 h ja 2,40-kertainen (p-arvo = 0,028) laskua 72 h transfektion jälkeen STAT6 erityisiä siRNA NCI-H460-solujen verrattuna transfektoimattomiin NCI-H460-soluissa vastaavissa ajankohtina. Me seuraavaksi tarkastetaan ilmentymistä fosforyloidun STAT6 (pSTAT6) proteiini, joka on aktivoitu signaloinnin muodossa STAT6. Vuonna yhteensopivuutta STAT6 proteiinin tasoja, ekspressiota pSTAT6 proteiinin tasot havaittiin vähemmän ajasta riippuva tavalla. Oli 1,13-kertainen pieneneminen 24 tunnin, 1,85 kertainen (p-arvo = 0,0008) pienenee 48 h ja 2,67-kertainen (p-arvo = 0,001) laskua 72 h transfektion jälkeen STAT6 erityisiä siRNA NCI-H460-soluissa verrattuna transfektoimattomilla NCI -H460 solut vastaavilla ajankohtina (Fig. 1 a ja b). Non merkittäviä muutoksia havaittiin transfektoiduissa soluissa salattu siRNA (negatiivinen kontrolli) eri ajankohtina.

a) western blot STAT6 ja fosforyloitua muotoa STAT6 (pSTAT6) proteiini solun otteita transfektoimattomista, STAT6 erityisiä siRNA ja salattu siRNA transfektoitiin NCI-H460-solujen eri ajankohtina tarpeen mukaan. b) Kaavio edustaa kertainen muutos STAT6 mRNA-tasolla, STAT6 proteiini ja pSTAT6 proteiinin taso verrattuna transfektoimattomiin NCI-H460-soluissa vastaavissa ajankohtina. Salattu siRNA eri ajankohtina käytettiin negatiivisena kontrollina. GAPDH käytettiin latauskontrollina varten Densitometrinen analyysi western blot analyysiä. MRNA-tasot normalisoituivat 18s rRNA ilmaisun Reaaliaikainen PCR-analyysi. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± S.D. 3 riippumattoman kokeen. * Tarkoittaa p-arvo 0,05 verrattuna transfektoimattomiin soluihin. ** Osoittaa p-arvo 0,01 verrattuna transfektoimattomiin soluihin. c).

Genome laaja vaikutusten STAT6 hiljentäminen NCI-H460 solulinjaan käyttämällä Illumina mikrosirujen

geeniekspressioprofiilien transfektoimattomissa NCI-H460-solujen ja NCI-H460-soluissa, jotka oli transfektoitu STAT6 siRNA määritettiin Illumina mikrosirujen avulla kahden biologisen rinnakkaista. Illumina array kokeilu tunnistettu 273 ilmentyvät eri geenit (

187 vaimentua ja 86 ilmen- tymisen lisääntymisen)

. Raaka Aineisto analysoitiin Beadstudio 2.0 -ohjelman. Array data oli keskimääräiseksi ja suodatetaan havaitseminen p-arvo ≤ 0,05 ja ero p-arvo ≤ 0,05. Luettelo eri tavalla ilmaistuna geenien sekä niiden kertamuutoksia annetaan taulukossa S2.

selventäminen reittejä ja vuorovaikutuksen differentiaalisesti ilmentyvien geenien

tutkia mahdollisia biologisen vuorovaikutuksen eri tavoin säänneltyjen geenejä, aineistot edustavat geenejä, joilla on muuttunut mentymisprofiili peräisin microarray analyyseja tuotu Ingenuity Pathway Analysis Tool.

luettelo ilmentyvät eri geenien analysoitiin IPA paljasti 20 merkittävää verkkoja (taulukko S3). Kuva. 2a edustaa listan top 5 verkkojen tunnistaa IPA. Näistä verkot,

geeniekspressio, Cell kuoleman, rasva-aineenvaihdunta

oli korkein mitoitettu verkon 28 keskittyy molekyylien ja merkitys pisteet 54 (Fig. 2b). Tilanne on todennäköisyys, että kokoelma geenien yhtä suuri tai suurempi kuin määrä verkossa voitaisiin saavuttaa mahdollisuuden yksin. Pistemäärä 3 osoittaa 1/1000 mahdollisuus, että painopiste geenit ovat verkossa ei johdu sattumasta. Luettelo geenien tähän verkostoon omien kertaiseksi muutoksia array data annetaan taulukossa S4.

tutkia mahdollisia yhteisvaikutuksia eri geenien, aineistot, jotka edustavat 273 geenejä, joilla on muuttunut ilme profiili saatu Illumina mikrosirujen tuotiin Ingenuity Pathway Analysis Tool ja seuraavat tiedot on esitetty: a) luettelo viisi verkkojen kanssa niiden tulokset saadaan IPA b) Eniten hyvin mitoitettu verkon IPA analyysi verkosto esitys hyvin mitoitettu verkon ( Gene Expression, Cell Death, lipidiaineenvaihdunnan). Geenit, jotka ovat harmaana määritettiin olevan merkittäviä tilastoanalyysin. Geenit Varjostetut punaiset ovat voimistunut ja ne, jotka ovat vihreitä ovat vaimentua. Intensiteetti varjostus osoittaa, kuinka kukin geeni oli ylös tai vaimentua. Kiinteä viiva on suora vuorovaikutus kahden geenituotteiden ja katkoviiva tarkoittaa, on epäsuora vuorovaikutus. Geenit merkitty sinisellä tähdellä on validoitu reaaliaikainen PCR. Liittyviä geenejä geeniekspressio, Cell Death ja lipidiaineenvaihdunnan ovat ympyröity oranssi, sininen ja violetti väri, vastaavasti. c) Toksikologia reitin alalta IPA analyysiin. X-akseli edustaa alkuun toksikologian toimii laskettu IPA perusteella differentiaalisesti ilmentyvien geenien on korostettu, ja y-akseli edustaa lukumäärän suhteena geenit aineisto, että kartta polkuun ja määrä kaikkien tunnettujen geenien katsoa johtuvan polku. Keltainen viiva kynnys p-arvo 0.05 laskettuna Fischerin testi.

IPA analyysi myös ryhmiä differentiaalisesti ilmentyvien geenien biologisten mekanismien jotka liittyvät myrkyllisyys ryhmille. Vuonna toksikologian luettelossa,

Kolesteroli biosynteesiä ja p53 Signaling

tuli olla kaksi parasta merkittävimmät reitit, joiden p-arvo 0,011 ja 0,013, tässä järjestyksessä (Kuva. 2c). Geenit liittyvä alkuun tox listan myös annettu taulukossa S5.

Samalla ilmentyvät eri geeni lista saatu STAT6 hiljentäminen NCI-H460-soluissa syötettiin PANTHER web resurssi paljastaa rikastettua polkuja. Mielenkiintoista on, että tämä analyysi liian löysimme kolesterolin biosynteesin ja apoptoosin signalointi joukossa merkittävästi rikastettu reittejä. Reitit joka läpäisi kynnys p-arvo 0.05 in PANTHER analyysi on lueteltu taulukossa 1.

STAT6 hiljentäminen lisää geenien ilmentymistä, jotka liittyvät kolesterolin biosynteesin /homeostaasiin ja parantaa kolesterolitasoa

Koska alkuun kaikkein verkon saatu IPA analyysi oli

geeniekspressio, Cell kuoleman, rasva-aineenvaihdunta

ja kolesterolin biosynteesin ilmestyi rikastunut sekä IPA ja PANTHER analyysi pyysimme muutokset kolesteroliarvot jälkeen STAT6 hiljentäminen siRNA NCI-H460-soluissa. Salattu siRNA käytettiin negatiivisena kontrollina. Kuva. 3a osoittaa, että STAT6 Äänenvaimennusjärjestelmä kohonnut kolesterolipitoisuus on aikariippuvainen tavalla, jossa 1,23 kertainen lisäys 24 tunnin, 1,8-kertainen (p-arvo = 0,005) kasvaa 48 tunnin ja 2,3-kertainen (p-arvo = 0,004) kasvaa 72 tuntia transfektion jälkeen siRNA NCI-H460-soluissa. Ei kuitenkaan ole tällaista muutosta ei havaittu kolesterolitasoa NCI-H460-soluissa, jotka on transfektoitu salattu siRNA. Olemme myös saaneet samankaltaisia ​​tuloksia A549-solut (Fig. 3a). Oli 1,28-kertainen kasvu 24 h, 1,6-kertainen lisäys (p-arvo = 0,03), 48 tuntia ja 2,2-kertainen nousu (p-arvo = 0,04), 72 h transfektion jälkeen siRNA A549-soluissa, mikä osoittaa, että kasvu kolesterolitasoa voisi olla yleinen vaikutus STAT6 hiljentäminen on keuhkojen soluihin.

yhteensä kolesteroliarvot jälkeen STAT6 knockdown tarkastettiin eri ajankohtina NCI-H460 ja A549-solut. Salatut siRNA käytettiin negatiivisena kontrollina. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± S.D. 3 itsenäisen kokeen suoritettiin kolmena rinnakkaisena. * Tarkoittaa p-arvo 0,05 verrattuna transfektoimattomiin soluihin. a) Western blot analyysi tehtiin analysoimaan muutosta ilmaus pSTAT6 proteiinin kun IL-4 käsittely NCI-H460-soluissa. GAPDH käytettiin latauskontrollina varten densitometrisen analyysiä. Kaavio edustaa kertaluokkamuutos proteiiniekspressiossa verrattuna transfektoimattomiin NCI-H460-soluissa. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± S.D. 3 riippumattoman kokeen. * Tarkoittaa p-arvo 0,05 verrattuna transfektoimattomiin soluihin. b) Real Time PCR suoritettiin sen määrittämiseksi, muutokset ekspressiotaso liittyvien geenien kolesterolin biosynteesiä ja homeostaasin NCI-H460-solut ja A549-solut 48 h transfektion jälkeen STAT6 erityisiä siRNA. Näytteet normalisoitiin 18s rRNA ilme. Reaaliaikainen data ilmoitetaan keskiarvona ± S.D. 3 itsenäisen kokeen suoritettiin kolmena rinnakkaisena. * Tarkoittaa p-arvo 0,05 verrattuna transfektoimattomiin soluihin. c) Kolesteroli määritys suorittaa vaikutuksen määrittämiseksi IL-4 käsittely yhteensä kolesterolitasoa transfektoimattomissa ja siRNA transfektoidut NCI-H460-soluissa ja A549-soluja. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± S.D. 3 itsenäisen kokeen suoritettiin kolmena rinnakkaisena. * Tarkoittaa p-arvo 0,05 verrattuna transfektoimattomiin soluihin. d) western blot HMGCS1, HMGCR ja IDI1 tehtiin solu-uutteiden transfektoimattomista ja siRNA transfektoitiin NCI-H460-solujen eri ajankohtina. GAPDH käytettiin latauskontrollina varten densitometrisen analyysiä. Kaavio edustaa kertaluokkamuutos proteiiniekspressiossa verrattuna transfektoimattomiin NCI-H460-soluissa. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± S.D. 3 riippumattoman kokeen. * Tarkoittaa p-arvo 0,05 verrattuna transfektoimattomiin soluihin.

Koska IL-4 tiedetään fosforyloimaan STAT6, halusimme etsiä roolia IL-4 kolesterolin synteesiä. NCI-H460-soluissa, oli 1,48-kertainen (p-arvo = 0,01) muutos tason pSTAT6 (fosforyloitu muoto STAT6) proteiini jälkeen IL-4 hoitoa, 0,48 kertainen (p-arvo = 0,01) muutos transfektion jälkeen STAT6 siRNA ja 0,69-kertainen (p-arvo = 0,05) muutos, kun solut on transfektoitu STAT6 siRNA käsiteltiin IL-4 (Fig. 3b). Joka vastaa tätä, oli 0,8-kertainen (p-arvo = 0,05) muutos kolesteroliarvot jälkeen IL-4 hoitoa, 1,5-kertainen (p-arvo = 0,01) muutos transfektion jälkeen STAT6 siRNA ja 1,32-kertainen (p-arvo = 0,03) muutos, kun solut, jotka on transfektoitu STAT6 siRNA käsiteltiin IL-4 (Fig. 3d). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin myös A549-solulinjassa (kuvio. 3d).

vieressä etsineet differentiaalisesti ilmaisi liittyvien geenien kolesterolin biosynteesin /homeostaasiin saatu microarray data. Yhdenmukaiset kanssa Illumina array data, transkriptio tasot näiden geenien vahvistettiin voimistuvan reaaliaikainen PCR. Havaitsimme 1,27 kertainen (p-arvo = 0,03) lisäystä HMGCR tasoa, joka on keskeinen säätelyentsyymi kolesterolin biosynteesipolun. Havaitsimme myös 1,94-kertainen (p-arvo = 0,03) kasvu HMGCS1, 2,7 kertainen nousu IDI1, 4,2-kertainen (p-arvo = 0,04) kasvaa CYP27B1

(Sytokromi P450, perhe 27, B-alaryhmän, polypeptidi 1)

, ja 3,0-kertainen nousu INSIG1

(Insulin indusoitu geeni 1) B-tasot 48 h transfektion jälkeen NCI-H460-solujen STAT6 erityisiä siRNA verrattuna transfektoimattomat NCI-H460-solut (Fig. 3c).

Samanlaisia ​​nousu transkriptipitoisuuksissa näiden geenien havaittiin myös toisessa keuhkosyövän solulinjassa A549 (Fig. 3c), jossa me havaitsimme 1,6 kertaisesti (p-arvo = 0,03) lisäystä HMGCR tasoilla, 1,4 kertainen nousu HMGCS1, 1,56-kertainen kasvu IDI1, 2,4-kertaiseen CYP27B1, ja 1,25-kertainen nousu INSIG1 tasolle 48 h transfektion jälkeen A549-solujen STAT6 erityisiä siRNA verrattuna transfektoimattomiin A549-soluja. Tämä merkitsee sitä, että vaikutukset STAT6 hiljentämisen ovat yleisiä ja ei rajoitu mihinkään tiettyyn keuhkosyövän solulinjassa.

proteiinin tasot HMGCR, HMGCS1 ja IDI1 tutkittiin myös ei-transfektoituja ja siRNA transfektoitiin NCI-H460-solujen 48h ja 72 tuntia transfektion. Oli 2,9, 3,5 (p-arvo = 0,048) ja 4,3-kertainen nousu HMGCS1 tasoilla, 0,94, 1,8 ja 2,4 (p-arvo = 0,03) kertainen HMGCR tasoilla, 1.6, 2.4 ja 2.5 (p-arvo = 0,024) kertainen Kuten on esitetty kuviossa. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina.