Krooninen sairaus

tiivistelmä

Vaikka vaikutukset sanguinariinin, joka on Bentsofenantridiinin alkaloidi, on esto tiettyjen syöpätyyppien solujen kasvua on perustettu, taustalla olevien mekanismien ei täysin ymmärretä. Tässä tutkimuksessa tutkittiin mahdollisia mekanismeja, joilla sanguinariinin kykenee sen syövän vastaista toimintaa viljellyissä ihmisen virtsarakon syövän solulinjoissa (T24, EJ, ja 5637). Sanguinariinin hoito johti pitoisuus-vaste kasvun estämistä virtsarakon syövän solut indusoimalla apoptoosin. Sanguinariinin aiheuttama apoptoosi korreloi säätely ylöspäin Bax, alas-säätely Bid ja XIAP, aktivoituminen caspases (-3, -8, ja -9), ja sukupolvi kasvoi reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) . ROS scavenger N-asetyylikysteiini (NAC) täysin päinvastainen sanguinariinin laukaisema apoptoottisia tapahtumia. Lisäksi, sanguinariini käytännössä kasvaa aktivoinnin c-Jun N-terminaalisen kinaasin (JNK) ja ilmaisu varhaisen kasvun vaste geeni-1 (Egr-1), joka otettiin talteen esikäsittely NAC. Lisäksi knockdovvn

Egr-1

ilmentymisen Sirna heikennettyä sanguinariinin indusoiman apoptoosin, mutta ei JNK estäjä, mikä osoittaa, että kuuntelu ROS sukupolvi esti sanguinariinin aiheuttaman apoptoottisia vaikutuksia kautta vapautuminen ilmentymisen Egr-1-proteiineja. Yhdessä nämä tiedot todistamaan, että sanguinariinin on voimakas syöpälääke, joka estää niiden kasvun virtsarakon syövän solujen ja indusoi niiden apoptoosin kautta sukupolven vapaiden radikaalien.

Citation: Han MH, Park C, Jin CY Kim GY, Chang YC, Moon SK, et al. (2013) Apoptosis induktio ihmisen virtsarakon syövän solut mukaan sanguinariinin läpi reaktiivisia happiradikaaleja välittämää Up-asetus Early Growth Response Gene-1. PLoS ONE 8 (5): e63425. doi: 10,1371 /journal.pone.0063425

Editor: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, Yhdysvallat

vastaanotettu: 19 helmikuu 2013; Hyväksytty: 01 huhtikuu 2013; Julkaistu: toukokuu 22, 2013

Copyright: © 2013 Han et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Research Foundation of Korea (NRF) avustus rahoittama Korean hallituksen (2012-0000476 ja 2012046358). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

bentso [c] fenantridiini alkaloidit (BA) ovat suhteellisen pieni ryhmä isochinoline alkaloideja, jotka on havaittu monissa kasvilajien perheiden Papaveraceae, Fumariaceae, Ranunculaceae, ja Rutaceae [1]. Sanguinariini on kvaternaarinen ammoniumsuola, jotka kuuluvat tähän ryhmään ja BA. Se on uutettu joitakin kasveja, kuten lumikin juurta (

Sanguinaria canadensis

L.), Meksikon piikikäs unikko

keltapiikkiunikko

L.,

Chelidonium majus,

ja

Macleaya cordata

. [2], [3]. Sanguinariini on osoitettu olevan vahva antibakteerinen ja anti-inflammatorisia ominaisuuksia [4] – [6]. Viimeaikaiset tiedot ovat osoittaneet, että tämä yhdiste voi aiheuttaa apoptoosia erilaisissa syöpäsolulinjoissa

in vitro

; kuitenkin, se ei näytä mitään toksisia vaikutuksia normaaleihin soluihin, kun niitä annetaan samoilla annoksilla [7] – [16].

reaktiivisen hapen (ROS) ovat herkästi reagoivia molekyylejä. Ne sisältävät superoksidianionin radikaalit, vetyperoksidi, singletti happi, ja hydroksyyliradikaaleja. ROS ovat yleensä peräisin normaalin aineenvaihdunnan happea, ja mitokondriot ovat ensisijainen lähde ROS. Vaikka pohjapinta tasot ROS toimii fysiologisen säädin normaalissa solujen lisääntymisen ja erilaistumisen, korkea ROS voi aiheuttaa vakavia vaurioita DNA ja proteiinit, jotka johtavat apoptoosin [17] – [19]. Lisäksi liiallinen oksidatiivisen stressin kohdistuu erityisesti mitokondrioiden, aiheuttaen mitokondrion kalvon potentiaali (

ΔΨm

) ja mitokondrioiden-välitteisen apoptoosin [17] – [19]. Viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että sukupolven ROS mukaan sanguinariinin aloittaa kaskadeja solukuoleman signaaleja joissakin ihmisen syövän solulinjoissa

in vitro

[12], [13], [15].

Reaktiiviset happi- lajien (ROS) ovat herkästi reagoivia molekyylejä. Ne sisältävät superoksidianionin radikaalit, vetyperoksidi, singletti happi, ja hydroksyyliradikaaleja. ROS ovat yleensä peräisin normaalin aineenvaihdunnan happea, ja mitokondriot ovat ensisijainen lähde ROS. Vaikka pohjapinta tasot ROS toimii fysiologisen säädin normaalissa solujen lisääntymisen ja erilaistumisen, tutkimukset ovat osoittaneet, että korkeat ROS voi aiheuttaa vakavia vaurioita DNA ja proteiinit, jotka johtavat apoptoosin [17] – [19]. Lisäksi liiallinen oksidatiivisen stressin kohdistuu erityisesti mitokondrioiden, aiheuttaen mitokondrion kalvon potentiaali (

ΔΨm

) ja mitokondrioiden-välitteisen apoptoosin [17] – [19]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että sukupolven ROS mukaan sanguinariinin aloittaa kaskadeja solukuoleman signaaleja joissakin ihmisen syövän solulinjoissa

in vitro

[12], [13], [15].

Among monet redox-geenien, varhaisen kasvun vaste-1 (Egr-1), sinkki-sormen transkriptiotekijä, on kiinnostava, koska se on nopeasti ja ohimenevästi indusoi useiden solunulkoisen ärsykkeiden [20] – [22] ja kaikki indusoijat ROS-välitteisen signaloinnin ja tulehduksen [23] – [28]. Siksi Egr-1 voi olla ratkaiseva rooli koordinoinnissa solutapahtumiin seuraavat oxidantive stressi [29] – [31]. Kuitenkin rooli Egr-1 apoptoosin signalointipolkujen aktivoituu ROS syöpäsoluissa käsitelty sanguinariinin ei ole rajattu.

Tässä tutkimuksessa käytetyt ihmisen virtsarakon syövän solulinjoissa, T24, EJ, ja 5637, tutkia sytotoksista tehoa sanguinariinin ja tutkia molekyylitason mekanismit apoptoottinen aktiivisuus aiheuttama sanguinariinin. Tulokset osoittivat, että sanguinariinin aiheuttama apoptoottisia signalointireittien moduloitu aktiivisuutta Bcl-2 ja apoptoosi-inhibiittori-proteiinin (IAP) -perheen proteiinit ja johti mitokondrioiden, aktivointi kaspaasien, ja induktio Egr-1. Tulokset ehdotti myös, että ROS ovat kriittisiä sääntelevät sanguinariinin aiheuttama apoptoottisia tapahtumia.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja solunelinkykyisyysmääritys

Ihmisen virtsarakon syövän solulinjat ( T24, EJ, ja 5637) saatiin the American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). Soluja viljeltiin RPMI 1640-elatusaineessa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA) ja 1% penisilliini-streptomysiinillä 37 ° C: ssa kosteassa ympäristössä, joka sisältää 5% CO

2. Sanguinariinin (Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA) liuotettiin metanolin varastossa liuoksen 10 mM konsentraatio, ja varastoitiin erinä -20 ° C: ssa. Solun elinkelpoisuuden tutkimuksessa, solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille tiheyteen 1 x 10

5 solua kuoppaa kohti. 24 tunnin kuluttua stabilointi, soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla sanguinariinin vielä 24 h. Käsittelyn jälkeen elinkelpoisuutta solujen määritettiin 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT, Sigma-Aldrich) määritys, joka perustuu muuntaminen MTT MTT formatsaaniksi mitokondrion entsyymit.

Nuclear Värjäys DAPI

jälkeen käsittelemällä soluja sanguinariinin 24 tuntia, ne otettiin talteen, pestiin jääkylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), ja kiinnitettiin 3,7% paraformaldehydillä (Sigma-Aldrich) PBS: ssa 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Kiinnitetyt solut pestiin PBS: llä ja värjättiin 4,6-diamino-2-fenyyli (DAPI, Sigma-Aldrich) liuosta (2,5 ug /ml) 10 min ajan huoneenlämpötilassa. Muutokset ydinvoiman solujen morfologia analysoitiin käyttämällä fluoresenssimikroskooppia (Carl Zeiss, Saksa).

virtaussytometria analyysi sub-G1-vaiheen

Solut kerättiin ja pestiin kerran PBS, kiinteä jääkylmässä 70% etanolia, ja säilytettiin 4 ° C: ssa. Ennen analyysiä, solut pestiin kerran PBS: llä, suspendoitiin 1 ml: aan kylmää propidiumjodidi (PI, Sigma-Aldrich), joka sisälsi 100 mg /ml RNaasi A, 50 ug /ml PI, 0,1% (w /v) natriumsitraattia ja 0,1% (v /v) NP-40 ja edelleen inkuboitiin jäillä 30 minuuttia pimeässä. Virtaussytometriset analyysit tehtiin käyttämällä virtaussytometria (FACS Calibur, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA), ja Cell-Quest pro ohjelmistoa käytettiin määrittämään suhteellinen DNA-sisältö perustuu läsnä punaisen fluoresenssin [19].

havaitseminen Apoptoosi anneksiini V FITC Värjäys

solut pestiin PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen anneksiini-V: n sitoutumisen, joka sisälsi 10 mM HEPES /NaOH: lla (pH 7,4), 140 mM NaCl , ja 2,5 mM CaCl

2. Alikvootit soluja inkuboitiin anneksiini-V fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC, R 0,05 hyväksyttiin osoituksena tilastollista merkittävyyttä.

Tulokset

Vaikutukset sanguinariinin elinkykyyn ja apoptoosin

tutkia, onko sanguinariinin inhiboivat virtsarakon syövän solujen, kolme virtsarakon syöpäsolulinjoista (T24, EJ, ja 5637) stimuloitiin osoitetuilla pitoisuuksilla sanguinariinin 24 tuntia, ja MTT-määritys suoritettiin. Kuten on esitetty kuviossa. 1, käsittely sanguinariinin vähentynyt elinkelpoisuutta virtsarakon syövän solujen pitoisuudesta riippuvalla tavalla. Siten edelleen suoritettiin kokeita sen määrittämiseksi, onko tämä estävä vaikutus sanguinariinin elinkelpoisuuden solujen oli seurausta apoptoottisen solukuoleman. Ensimmäinen, DAPI-värjäyksellä määritettynä morfologisia muutoksia soluissa, kuten on esitetty kuviossa. 2A. Hoito 1,5 uM sanguinariinin johti merkittävään solujen määrä kromatiinin tiivistymistä, menetys ydinvoiman rakentamisen, ja muodostuminen apoptoottisten elinten, kun taas nämä ominaisuudet ei havaittu kontrolli-soluissa. Toinen, virtaussytometria-analyysi havaitsemiseksi hypodiploid solupopulaatioiden määritettiin astetta apoptoosin soluissa, joita käsiteltiin sanguinariinin. Kuten kuviossa. 2B, lisäämällä 1,5 uM sanguinariinin virtsarakon soluihin lisännyt keskittymistä solujen sub-G1 vaiheeseen. Kolmanneksi, virtaussytometria-analyysit anneksiini V: n ja PI-värjäyksellä määritettynä suuruus apoptoosin aikaansaama sanguinariinin. Kuten on esitetty kuviossa. 2C, numerot anneksiini V-positiivisia soluja osoitti merkitty nousua sanguinariinin käsiteltyjä soluja verrattuna käsittelemättömiin kontrollisoluihin. Näin ollen, nämä tiedot viittaavat siihen, että virtsarakon syöpä solut voivat apoptoosia altistumisen jälkeen sanguinariinin.

T24, 5637, ja EJ-soluja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla sanguinariinin 24 tuntia, mukaan mittaukset solun elinkelpoisuutta MTT-määritys. Tiedot ilmoitetaan keskiarvoina ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Poikkeaa merkittävästi valvontaa, *

p

0,05.

(A) Soluja inkuboitiin 1,5 uM sanguinariinin 24 tuntia ja sitten värjättiin DAPI. Värjätyt jälkeen tumat tarkkailtiin fluoresenssimikroskoopilla (suurennus, x 400) käyttäen n sininen suodatin. (B) määrittää, missä määrin indusoiman apoptoosin sanguinariini, solut arvioitiin sub-G1-DNA-pitoisuus käyttäen virtaussytometriä. (C) solut värjättiin FITC-konjugoidulla anneksiini-V: n ja PI virtaussytometriseen analyysiin. Apoptoottisten solujen määritettiin laskemalla prosenttiosuus anneksiini V (+), PI (-) solut ja prosenttiosuus anneksiini V (+), PI (+) soluja. Tiedot ilmoitetaan keskiarvoina ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Poikkeaa merkittävästi valvontaa, *

p

0,05.

modulaatio Bcl-2 ja IAP perhe Proteiinit, ja kaspaasi tekijänä sanguinariinin

rooli Bcl-2 ja IAP-perheen proteiineja määritettiin Western blotting tutkimaan, mitkä mekanismit olivat mukana sanguinariinin indusoiman apoptoosin virtsarakon syövän soluissa. Kuten on esitetty kuviossa. 3A, hoito virtsarakon syövän solut 1,5 uM sanguinariinin ei aiheuttanut merkittäviä muutoksia ilmaus antiapoptoottisten proteiinien Bcl-2 ja Bcl-xL. Kuitenkin tasot proapoptoottiset Bax suureni ja että antiapoptoottisten proteiinin XIAP väheni vastauksena sanguinariinin. Lisäksi väheneminen proapoptoottiset Bid proteiinien lisääntyi selvästi kanssa sanguinariinin hoitoon kaikissa virtsarakon syövän solulinjat. Sen määrittämiseksi, onko sanguinariinin: n indusoiman apoptoosin, joka liittyy kaspaasien aktivaatio, ilmaisun ja aktiivisuus kaspaasien on sanguinariinin käsiteltyjä soluja tutkittiin. Tulokset osoittivat, että sanguinariinin hoito alassäädetty tasot prokaspaasi-3 proteiinit ja nostivat aktiivisen-kaspaasi-3. Tasot prokaspaasi-8 ja -9 proteiinit myös alas-säädellä sanguinariinin käsiteltyjä soluja (Fig. 3B). Edelleen kvantifiointi proteolyyttisen aktivaation prokaspaasi-3, -8, ja -9, lysaattien tasataan proteiinin soluista käsiteltiin sanguinariinin analysoitiin niiden entsymaattisten aktiivisuuksien. Kuten on esitetty kuviossa. 3C sanguinariinin hoitoa merkittävästi lisänneet kaspaasi toimintaa. Myöhemmät Western blot-analyysit osoittivat asteittaista proteolyyttisen poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) proteiini, joka on alavirrassa oleva kohde on aktivoitu kaspaasi-3: [33], soluissa sen jälkeen, kun sanguinariinin hoidon (Fig. 3B) .

(A ja B) 24 tunnin inkuboinnin jälkeen, jossa sanguinariini, solun proteiinit erotettiin SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Kalvot tutkittiin mainituilla vasta-aineilla, ja proteiinit visualisoitiin käyttämällä ECL-detektiojärjestelmässä. Vahvista yhtä suuri lastaus, aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina. (C) Määrittämään

in vitro

kaspaasiaktiivisuus, alikvootteja inkuboitiin DEVD-pNA, IETD-pNA, ja LEHD-pNA: ta substraatteina kaspaasi-3, -8, ja -9, vastaavasti, ja sitten julkaistiin fluoresenssi tuotteet mitattiin. Kukin piste edustaa keskiarvoa ± SD: n edustajan kokeet suoritettiin vähintään kolme kertaa. Opiskelijan

t

-testi (*

p

0,05 vs. käsittelemätön kontrolli) käytettiin analysoimaan tilastollista merkitystä tuloksiin.

Sanguinarine- indusoima apoptoosi liittyy Generation ROS

sen määrittämiseksi, onko sanguinariinin: n indusoiman apoptoosin liittyvät ROS-välitteisen oksidatiivisen stressin, solunsisäinen ROS-tuotanto mitattiin kanssa DCFH-DA fluoresenssimääritys virtaussytometriä käyttämällä. Kuten kuviossa. 4A, kun solut altistettiin sanguina- taso solunsisäisten ROS kasvoi voimakkaasti 30 min (yli 8-kertainen lisäys kontrolliin verrattuna), ja se väheni ajan sen jälkeen. Ennen solujen käsittelyä, jossa on tunnettu ROS raadonsyöjä, N-asetyylikysteiini (NAC), huomattavasti vähentynyt tämän kohonneen ROS tasolla sanguinariinin käsiteltyjä soluja. Tuotannon solunsisäinen ROS on myös seurattava fluoresenssiemissiota DCFH-DA sisällä T24-soluissa käyttäen fluoresenssimikroskooppia. Lisääntynyt intensiteetti DCF-DA värjäytymistä havaittiin sanguinariinin käsiteltyjä soluja oli aikariippuvainen kumotaan kontrollien tasoihin, kun läsnä on NAC (Fig. 4B). Sen määrittämiseksi, onko sanguinariinin-indusoidun ROS johtui apoptoosin, soluja käsiteltiin NAC 1 h ja co-inkuboitiin sanguinariinin vielä 24 h. Kuten on esitetty kuviossa. 5A, estovaikutukset NAC on sanguinariinin aiheuttamaa ROS korreloi huomattavan estymisen apoptoottisen solukuoleman mitattiin virtaussytometrillä. Lisäksi estää sukupolven ROS esikäsittelemällä solut NAC esti sanguinariinin aiheuttama kaspaasien aktivaatio, pilkkominen PARP, ja modulaatio Bcl-2 ja IAP proteiinit (kuvio. 5B ja C). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että ROS-generoivan systeemin keskeinen rooli in sanguinariinin indusoiman apoptoosin virtsarakon syövän soluissa.

(A) Soluja inkuboitiin 1,5 uM sanguinariinin varten ilmoitettu ajat, tai ne esikäsiteltiin 10 mM NAC: ssa 1 tunti ja käsitellään edelleen 1,5 uM sanguinariinin varten ilmoitettu kertaa. Sitten ne värjättiin DCFH-DA. ROS: n syntyminen mitattiin virtaussytometrillä. Kukin piste edustaa keskiarvoa edustavia kokeita kahdesti. (B) DCFH fluoresenssia T24 soluja kasvatettiin samoissa olosuhteissa kuin (A) määritettiin alla fluoresenssi käyttämällä vihreää suodatinta. Vähintään viisi kenttää katsottiin kussakin kokeessa.

(A) Soluja käsiteltiin tai ei NAC (10 mM) 1 tunti ennen altistusta 1,5 uM sanguinariinin 24 tuntia. Ne otettiin talteen ja värjättiin FITC-konjugoidulla anneksiini-V: n ja PI virtaussytometriseen analyysiin. Tiedot ilmoitetaan keskiarvoina ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Opiskelijan

t

-testi (*

p

0,05 vs. käsittelemätön kontrolli;

#

p

0,05 vs. sanguinariinin käsiteltyjä soluja) oli käytetään analysoida tilastollista merkitystä tuloksia. (B) Ne koottiin sitten ja ilmoitetaan proteiinit havaittiin Western blot -analyysillä. Aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina. (C) Määrittämään

in vitro

kaspaasiaktiivisuus, alikvootteja inkuboitiin 37 ° C: ssa 1 h, ja vapautetaan fluoresenssi tuotteet mitattiin. Kukin piste edustaa keskiarvoa ± SD edustavia kokeita suoritettiin vähintään kolme kertaa. Opiskelijan

t

-testi (*

p

0,05 vs. käsittelemätön kontrolli;

#

p

0,05 vs. sanguinariinin käsiteltyjä soluja) oli käytetään analysoida tilastollista merkitystä tuloksiin.

sanguinariinin aiheuttamaa apoptoosia ei liittyy JNK: n aktivaatio

Monet aiemmissa raporteissa todettiin, että sytotoksiset ROS signalointi näytti välittyvän, osittain aktivoimalla c-Jun-N-terminaalisen kinaasin (JNK) cascade sijaan p38-mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (MAPK) tai ekstrasellulaarisen signaalin säädelty kinaasi (ERK) [34] – [36]. Siten nykyinen Tutkimuksessa selvitettiin osallistumista JNK sanguinariinin: n indusoiman apoptoosin. Kuten on esitetty kuviossa. 6A, fosforylaatio JNK oli havaittavissa sen jälkeen, kun niin vähän kuin 15-30 min sanguinariinin hoidon ja kesti vähintään 1-4 h hoito. Kuitenkin ROS raadonsyöjä NAC täysin tukossa tehostettua fosforylaatiota JNK (Fig. 6B). Nämä tulokset osoittivat, että JNK-reitin aktivoitiin ROS-riippuvaisella tavalla vastauksena läsnä sanguinariinin. Sen määrittämiseksi, onko aktivointi JNK osallistui apoptoosia, vaikutus tietyn JNK-inhibiittori, SP600125, on sanguinariinin käsiteltyjä soluja testattiin. Tulokset osoittivat, että SP600125 esikäsittely ei vaimentanut kertymistä apoptoottisten solujen suhteen käsiteltyjen solujen SP600125 yksinään (Fig. 6C). Tulokset osoittavat, että ROS-riippuvaisen JNK fosforylaatio ei esiinny ylävirtaan sanguinariinin indusoiman apoptoosin virtsarakon syövän soluissa.

(A) Soluja käsiteltiin sanguinariinin varten ilmoitettu ajat, tai (B) ne esikäsiteltiin NAC 1 h ja altistettiin sanguinariinin 24 tuntia. Ne kerättiin sitten, ja osoitetut proteiinit havaittiin Western blot -analyysillä käyttäen anti-p-JNK, anti-JNK-vasta-aineita, ja ECL-detektiojärjestelmässä. (C) Soluja käsiteltiin tai ilman SP600125 1 tunnin ajan ennen altistusta sanguinariinin 24 tuntia. Solut analysoitiin käyttäen virtaussytometriä määrittää anneksiini-V. Tiedot ilmoitetaan keskiarvoina ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Tilastollista analyysia,

t

-testi suoritettiin (*

p

0,05 vs. käsittelemättömät solut).

Association of ROS riippuvaisten Up sääntely Egr-1 sanguinariinin aiheuttama apoptoosi

, mahdollinen suhde sanguinariinin aiheuttaman apoptoosin ja Egr-1 ilmentymisen tutkittiin. Kuten on esitetty kuviossa. 7A, aika-kurssi analyysit osoittivat, että 1,5 uM sanguinariinin indusoi Egr-1-proteiineja sisällä 2 tunnin ja nämä eivät palaa lähtötasolle 4 tuntia. Kuten sanguinariinin syntyy ROS 0,5 h, tasot ROS väheni 2 h (Fig. 4), ja ilmentymistä Egr-1 sanguinariinin maksimaalisesti kasvoi 2-4 h hoitojakson aikana, potentiaali ROS aiheuttama säätely induktion Egr-1 tutkittiin. Immunoblottaus tulokset osoittivat, että estämällä sukupolven ROS esikäsittelemällä solut NAC selvästi eliminoitu sanguinariinin aiheuttama Egr-1-proteiineja kolmen solulinjoissa (Fig. 7B). Tutkia roolia Egr-1 in sanguinariinin indusoiman apoptoosin, Egr-1-geenin ilmentyminen oli onnistuneesti alassäädetty käyttäen Egr-1 siRNA (Fig. 7C). Sen vaikutus PARP pilkkominen, sekä apoptoosin, oli sitten arvioitiin. Kuten on esitetty kuviossa. 7D ja E, esto Egr-1 ilmentymisen tehokkaasti vähentänyt sanguinariinin aiheuttamaa hajoamista PARP ja kertymistä apoptoottisten sub-G1 soluihin. Tulokset vahvistavat, että apoptoosin induktio sanguinariinin esiintyy käytettäessä Egr-1-riippuvaisella tavalla, ja että kasvu ROS vaaditaan aktivoimiseksi Egr-1 ja esiintyminen sanguinariinin indusoiman apoptoosin virtsarakon syövän soluissa.

soluja käsiteltiin sanguinariinin varten ilmoitettu ajat (A) tai käsitelty tai ilman NAC 1 h ennen altistusta sanguinariinin 2 h (B). Sitten, yhtä suuret määrät proteiineja (30 ug) erotettiin SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Membraanit tutkittiin käyttämällä koettimena anti-Egr-1-vasta-aine, ja proteiinit visualisoitiin käyttämällä ECL-detektiojärjestelmässä. (C-E) Solut transfektoitiin siRNA: lla ihmisen Egr-1 käyttäen transfektioreagenssia. 24 tunnin transfektion jälkeen solut käsiteltiin sanguinariinin vielä 2 h (C) tai 24 h (D ja E). Ne kerättiin sitten, ja osoitetut proteiinit havaittiin Western blot -analyysillä (C ja D). Lisäksi solut arvioitiin virtaussytometrillä ja anneksiini-V (D). Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Tilastollinen merkitsevyys analysoitiin Studentin

t

-testi (*

p

0,05 vs. käsittelemätön kontrolli;

#

p

0,01 vs. sanguinariinin käsiteltyjä soluja).

keskustelu

tutkia mekanismeja, joilla sanguinariinin hoito indusoi apoptoosin virtsarakon syövän soluissa, tässä tutkimuksessa tarkasteltiin useita merkkiaineita, jotka liittyvät apoptoottisen solukuoleman. Mekanismi apoptoosin on jaettu kahteen reittejä: an ulkoisen syöttämällä-reseptorivälitteisen apoptoottisen reitin ja sisäiset mitokondriot-välitteisen apoptoottisen reitin. Kaspaasin aktivaatio pidetään yleisesti keskeisenä tunnusmerkki apoptoosin näistä reiteistä. Ulkoista reitti aktivoituu solun pinnalla, kun tietty syöttämällä ligandi sitoutuu sitä vastaavaan solun pinnan reseptoriin. Tässä polku, kaspaasi-8 toimii initiaattorina kaspaasi, joka aktivoi alavirtavaikuttajainhibiittorit kaspaasit, kuten kaspaasi-3, -6, ja -7. Toisaalta, sisäisen reaktiotien on apoptoottisen signaalin peräisin solujen sisällä, ja se nojautuu permeabilisaation mitokondrioiden kalvot vapauttaa apoptogenic mitokondrioiden proteiinit sytosoliin, siten aktivoimaan initiaattoria kaspaasi-9. Aktivoitu kaspaasi-9 aloittaa alavirran tapahtumia suoraan lohkaisemalla ja aktivoimalla efektori caspases, tuottaa fragmentti, joka aktivoi mitokondrio-reitin [37], [38]. Apoptoosi voidaan myös säädellä useita geenituotteita, kuten Bcl-2-perheen antiapoptoottisten ja proapoptoottiset proteiineja, ja IAP-perheen proteiineja, jotka kykenevät sitomaan ja inhiboimaan kaspaasien [39], [40]. Mitokondrion syöttämällä reitin, suhde ilmentymisen proapoptoottiset proteiinien, kuten Bax ja Bak ja antiapoptoottisten proteiinien, kuten Bcl-2 ja Bcl-x L lopulta määrittää solukuoleman tai eloonjäämistä. Lisäksi kaspaasi 8 välittää sisäisen reaktiotien kautta pilkkomalla proapoptoottiset Bid proteiini, BH3-ainoastaan ​​proteiinia, joka katkaistu Bid (tBid) kautta translokaatiota alkaen sytosolista mitokondrioissa liipaisu mitokondrioiden, jonka jälkeen aktivointi caspase- 9 [41]. Tämä tutkimus osoitti, että ilmentyminen proapoptoottiset Bax osoitti kasvua sanguinariinin: n indusoiman apoptoosin, kun taas määrä antiapoptoottisten Bcl-2 ja Bcl-x L pysyi suhteellisen muuttumattomana (Fig. 3A). Tiedot osoittivat myös, että sanguinariinin indusoi apoptoosia aktivoimalla kaksi initiaattorin kaspaasien, kaspaasi-8 ja 9, jotka olivat mukana ulkoisten ja sisäisten polkuja, vastaavasti, samoin kuin efektorisolujen kaspaasi-3 (Fig. 3B ja C), joka liittyi samanaikainen pilkkominen PARP, aktivoitu kaspaasi-3 kohdesubstraatti proteiinia (Fig. 3B) [33]. Lisäksi, sanguinariini vähensi ilmentymisen XIAP, jäsen IAP perheen proteiinien (Fig. 3A), jotka on raportoitu aiheuttavan antiapoptoottisten vaikutuksia, koska ne toimivat suoraan estäjät aktivoitua kaspaasien [37], [39]. Lisäksi altistuminen solujen sanguinariinin johtaneet huomattavaan vähenemiseen koko Bid, mikä osoittaa, että proapoptoottiset proteiini, Bid, oli katkaistu (Fig. 3A). Siten esillä oleva tulokset osoittavat, että sekä ulkoisten ja sisäisten polkuja ovat voineet vaikuttaa, ainakin osittain, että sanguinariinin: n indusoiman apoptoosin ihmisen virtsarakon syövän soluissa.

Asennus osoittavat, että vaurioituneen mitokondrioita stimuloivat ROS: n syntyminen ja että kohtuuton tuotanto ROS indusoi apoptoosin kautta sisäisen reaktiotien aiheuttamalla vaurioita mitokondrioita kautta kaspaasien aktivaatio [17] – [19]. Tiedot osoittivat, että sanguinariinin hoito johti huomattavasti ROS sukupolvi varhaisessa vaiheessa. Rinnakkaisviljelemällä NAC, joka on yleisesti käytetty ROS scavenger, esti tehokkaasti ROS sukupolvi (Fig. 4). Lisäksi estää sukupolven ROS täysin esti apoptoosin (Kuva. 5A) ja talteen sanguinariinin aiheuttama kaspaasien aktivaatio, hajoamista PARP, ja alas-säätely XIAP ja koko Bid ilmaisun (Fig. 5B ja C). Nämä tulokset osoittivat, että ROS sukupolvi by sanguinariinin vaaditaan apoptoosin virtsarakon syövän soluissa.

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että erilaiset apoptoottista ärsykkeitä voi nopeasti aktivoida MAPK, joka sisältää JNK, ERK, ja p38MAPK. Niistä JNK-reitin, kun ylävirran signalointireitille kaspaasin 3, voi olla tärkeä rooli laukaista apoptoosin vastauksena vapaita radikaaleja syntyy ultraviolettisäteilyn tai suoraan soveltamiseen H

2O

2 [42] , [43]. Siten nykyinen tutkimus selvitti tämän signaalireitin oli mukana apoptoottisen vaikutuksen sanguinariinin virtsarakon syövän soluissa. Tulokset osoittivat, että JNK fosforylaatio tapahtuu nopeasti, 30 minuutin kuluessa sanguinariinin hoitoa, ja kestää vähintään 1-6 tuntia sen jälkeen sanguinariinin altistuksen (Fig. 6A).