Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA (Mirs) moduloida ekspressiotasot mRNA ja proteiineja ja voi siten edistää syövän aloittamista ja etenemistä. Lisäksi niiden intracelluar toiminto, Mirs vapautuvat soluista ja karistanut verenkiertoon. Me olettaisi, että kiertävä MIRS voisi tarjota käsityksen reittejä muuteta syövän etenemiseen ja voi ilmoittaa hoitovaste. Tässä keskitymme haimasyöpä pahanlaatuinen etenemisen. Me raportoimme että muutokset miR ekspressiomalleja aikana etenemisen normaaleissa kudoksissa invasiivisia haiman adenokarsinooma, että p48-Cre /LSL-Kras

G12D hiirimallissa peilaa miR havaitut muutokset ihmisen haimasyövän kudoksiin. miR-148a /b ja miR-375 ilmentyminen havaittiin vähenivät, kun taas miR-10, miR-21, miR-100 ja miR-155 lisättiin, kun verrataan normaaleissa kudoksissa, premalignien leesioiden ja invasiivisen karsinooman hiirimallissa. Ennakoi maalin mRNA: t FGFR1 (miR-10) ja MLH1 (miR-155) havaittiin vaimentua. Kvantitointi yhdeksän MikroRNA plasmanäytteissä potilaiden erottaa haimasyöpä muista syövistä sekä ei-syöpä haiman sairaus. Lopuksi gemsitabiinihoidon verrokkieläimestä ja p48-Cre /LSL-Kras

G12D eläimet haimasyöpä aiheutti erillisiä ja jopa 60-kertaiseksi muutoksia verenkierron MIRS jotka osoittavat ero lääkkeen vaikutuksia normaaleihin ja syövän kudoksissa. Nämä havainnot tukevat merkitys havaitsemiseksi Mirs verenkierrossa ja ehdottaa, että kiertävä MIRS voitaisiin käyttää osoittimina lääkkeen vaste.

Citation: LaConti JJ, Shivapurkar N, Preet A, Deslattes Mays A Peran minä, Kim SE , et ai. (2011) Tissue ja Serum MikroRNA että Kras

G12D Siirtogeenisten eläinmallissa ja potilailla, joilla Haimasyöpä. PLoS ONE 6 (6): e20687. doi: 10,1371 /journal.pone.0020687

Editor: Janine Santos, University of Medicine ja hammaslääketieteen New Jersey, Yhdysvallat

vastaanotettu: 20 tammikuu 2011; Hyväksytty: 06 toukokuu 2011; Julkaistu: 27 kesäkuu 2011

Copyright: © 2011 LaConti et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tuettiin osittain National Institutes of Health myöntää CA108440 (AW), US DOD CDMRP (JJL), Lombardi Cancer Center (NS), Gordon Foundation (AW), Lustgarten Foundation (ATR) ja Ruesch Center (JLM ja AW). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MikroRNA (miRNA tai MIRS) ovat pieniä, ei-koodaavat RNA: t, jotka on merkittävä rooli toimien valvonta solureiteillä sekä fysiologian ja patologian (katso esim [1]). Erillinen toiminto Mirs eri syöpien on tullut yhä ilmeisemmäksi viime vuosina [2], [3], ja monet tutkimukset osoittavat, että miR allekirjoituksia voidaan käyttää erottamaan eri syöpiä [4], [5], [6], [7] ennusteiden [8], [9], [10], [11], [12], [13] tai paljastaa mahdollisia kohteita [14] sekä muuttunut signalointipolkujen [15]. Useimmat yllättäen, vertailun miR ja mRNA profiilit ensisijainen ja metastaattinen vaurioita osoitti, että Mirs tarjotaan luotettavampi ja erottuva allekirjoitus kuin mRNA: iden ja totesi, että miR allekirjoitukset olivat paremmat kuin mRNA: iden tunnistamisessa elin lähde etäpesäkkeiden tuntematonta alkuperää [16] , [17]. Näiden lisäksi analyysit normaaleissa ja sairaissa kudoksissa, lisää Viimeaikaiset raportit ovat osoittaneet, että miR lajeja voidaan havaita verenkierrossa [18], ja ehdotti, että analyysi seerumin näytteiden määritelty miR lajeja voidaan käyttää tunnistamaan potilaita, joilla syöpiä [19], [ ,,,0],20], [21], [22], [23], [24], [25], samoin kuin muut sairaudet, kuten sydänsairaus, [26], [27], [28], [29], [30] tai diabetes [31].

Jaksot Mirs usein säilyneet lajien välillä ja me arveltu, että analyysi Mirs on hyvin määritelty eläinmallissa voi ilmoittaa tutkimuksissa potilaan näytteitä. Olimme erityisen kiinnostuneita arvioida, tämä voitaisiin kääntää havaitsemiseen ja määrän Mirs verenkierrossa sillä saattaa lopulta paljastaa aktivoida tai muuttaa sairauden poluista, jotka perustuvat analyysiin verinäytteen sijasta analyysi sairaan kudoksen näytteen [32] . Lisäksi hoidot todennäköisesti vaikutusta miR kuvioita verenkierrossa ja nämä kuviot voivat olla hyödyllisiä perustamisesta allekirjoituksia lääkkeen vaikutuksia.

Tässä olemme keskittyneet haimasyöpä, joka todettiin 43140 potilasta 2010 Haimasyöpä on kohtalokas sairaus, jossa on 5 vuoden pysyvyys on vain 6% [33]. Tämä huono tulos johtuu myöhään havaitseminen sekä tehokkaiden hoitojen puute [34]. Tunnistaa informatiivinen Mirs, käytimme geneettisesti hiiren mallissa p48-Cre /LSL-Kras

G12D malli, joka on ensimmäiseksi kuvannut Hingorani

et al.

[35]. Tämä malli toistaa uskollisesti pahanlaatuinen etenemisen nähdään ihmisen PDAC kehitykseen [34], [35] ja lukuisia tutkimuksia tällä mallin rajanneet solujen alkuperästä PDAC [36] ja osoittivat panos eri kuljettajan geenejä [37], [38 ], [39], jotka ohjaavat biologia ja etenemistä tämä tauti [40]. Käytimme kudosten talteen eri vaiheissa pahanlaatuisten etenemisen tästä hiirimallissa arvioida paneeli Mirs joka oli osoitettu olevan ylä- tai alassäädetty ihmisen haimasyövän kudosten ja oli tarkistettu ja koottu äskettäin Seux ja työtovereiden [41 ]. Tämä analyysi seurasi sitten kvantitoimalla Mirs verenkierrossa kärsivien potilaiden haiman ja muiden syöpien tai valvontaa ja löysimme miR ilmaisua malleja, jotka erottaa eri ryhmien välillä. miR ekspressiokuvioita seerumin koe-eläimistä samansuuntainen havainnot potilailla. Lopuksi hoito eläinten kanssa syövän huumeiden Gemsitabiinin joka on hyväksytty ensilinjan hoitoon haimasyövän [42], ilmeni selvä muutos miR tasot verenkierrossa eläinten haimasyöpä vastaan ​​kontrollit.

tulokset

microRNA ilmentymisen haiman kudoksiin Kras

G12D aiheuttama pahanlaatuinen etenemisen

paneeli Mirs johdonmukaisesti ylä- tai alassäädetty eri tutkimukset ihmisen haimasyövän kudoksiin nähden normaali haiman kudoksista valittiin kirjallisuudesta ja tietokannan haut (katso taulukko S1; Refs [7], [41], [43], [44], [45]). Tästä miR paneeli perustimme kvantitatiivinen RT-PCR havaitseminen [46], koska odotimme monenlaisia ​​miR pitoisuuksien verrattaessa kudosuutenäytteitä vs. verinäytteistä tai poikki ihmisen ja hiiren näytteitä.

Hiiri haiman kudosnäytteitä kerättiin eri-ikäisiä siitä p48-Cre /LSL-Kras

G12D hiirimallissa. Haimatiehyeeseen epithelia näillä eläimillä etenevät aikaisin ja myöhään dysplastic vaurioita, Panin (= haiman in situ karsinooma) ajan kuluessa useita kuukausia kohdunkaulan syöpä ja siten matkia pahanlaatuinen etenemistä ihmisten sairauksien [34], [35]. Kukin kudosnäyte korjattu tapahtui asteittain histologinen analyysi haimatiehyen muutoksia (kuvio 1A). Ohjaus kudokset sisälsivät 100% normaalista kanavat (kuvio 1 B). Haimoissa nuoremmilta hiiristä (kuvio 1 C) sisälsi yli 50% kanaviin alkuvaiheen dysplastic vaurioita (Panin-1 tai -2). Haimoissa vanhempien hiirten (kuvio 1 D) sisälsi -10% kaapelikanavien kanssa myöhään dysplastic vaurioita (Panin-3) lisäksi -50% kaapelikanavien kanssa Panin-1 tai -2. PDAC kudokset sisälsi enimmäkseen invasiivisia adenokarsinooma (kuvio 1 E).

(A) kvantitointi histopatologisten muutosten vuonna haimoissa valvonnan tai p48-Cre /Kras

G12D hiirillä. Näytteet erotettiin valvontaa, varhaisen vaiheen dysplastisia vaurioita (Panin-1 ja -2), myöhään dysplastisia vaurioita (Panin-3 läsnä) ja invasiivisia haiman kanava (PDAC). (B-E) edustaja histopatologia kuvia kustakin ryhmistä: (B) normaali haima, (C) PANIN-1 ja -2 (varhainen), (D) PANIN-3 (myöhäinen) ja (E) PDAC. Keskiarvo ± keskivirhe%: n haiman kudoksen vastaavaan vauriot on esitetty (n = 3 eläintä kussakin ryhmässä). 0, ei havaittu.

Analyysi ilmentymisen yksittäisten MIRS osoitti kolme suurta suuntaukset (kuvio 2A-C): Ensinnäkin, ilmentyminen miR-10, miR-16, miR-21, asennuspalveli- 100 ja miR-155 kasvoivat alussa Panin vaurioita kontrolliin verrattuna, ja ylläpidetään voimakasta ilmentymistä lopulla Panin ja adenokarsinooma kudoksiin. (Kuvio 2A) Toiseksi, miR-22, miR-148a /b, miR-212, ja miR-375 olivat erittäin ekspressoituvat kontrolli kudosten ja niiden ilmentyminen oli vähennetty PANIN (kuvio 2C) sekä adenokarsinooma kudoksissa. Kolmanneksi ilmentyminen miR-29b, miR-34a /c, miR-141, miR-199, miR-210C ja miR-301a ei muuttunut merkittävästi aikana pahanlaatuinen etenemisen (kuvio 2B).

(A- C) Expression tasot yksittäisten MIRS ohjaus- ja haiman kudoksista eri vaiheissa pahanlaatuisen muutoksen. Mirs tasot ryhmiteltiin lisääminen (A), tasainen (B), tai vähentämällä (C), joka perustuu vertailun saavuttamiseksi kussakin ryhmässä (n = 3 per ryhmä). Keskiarvo ± keskivirhe on esitetty kullekin miR ilme. (D) Hierarkkinen klusterointi hiirikudoksissa perustuvan miR ilme. Erillisiä ryhmiä on merkitty sinisellä ja keltainen laatikko. (E) Hierarkkinen klusterointi Mirs perustuu niiden ekspressiotasot. Mirs joka ilmaistiin korkeilla tasoilla ohjaus (sininen laatikko) versus PDAC kudoksiin (keltainen laatikko) on osoitettu. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001; ohjaus vs. aikaisin Panin myöhään Panin tai PDAC. #: Au 0,85 ja p = 0,06, ##: au 0,85 ja p 0,05, ###: au 0,90 ja p 0,01. (Au noin puolueeton todennäköisyys).

Erilliset klusterointi Mirs ja haiman kudosten erilaisten sairauksien vaiheissa

valvomattoman ryhmittely hiiren kudokset perustuu niiden miR ekspressiotasoja tunnistettiin kolme erillistä ryhmää (kuvio 2D). Ohjaus kudokset erillään kaikista muista kudoksista ryhmittymään omaa (sininen laatikko). Viisi kuudesta kudosten luokiteltu in situ vaurioita (Panin) on ryhmitelty yhteen toisessa ryhmässä. Invasiivinen adenokarsinooma ja yksi myöhään Panin kudokset jaotella edelleen klusterin (keltainen laatikko). Näin ollen joukko Mirs analysoitu tässä riittää erottamaan eri vaiheissa KRAS-indusoidun haiman pahanlaatuisten etenemistä.

valvomaton klusterointi yksittäisten Mirs suoritettiin sen määrittämiseksi, mitkä MIRS käyttäytyvät rinnakkain ja ovat siten yhteinen allekirjoitukset yhtenevä taudin vaiheessa (kuvio 2E). Yksi ryhmä (keltainen laatikko) sisälsi niille Mirs joka osoitti korkeimman ilmaisun adenokarsinooma kudosten ja alhaisin kontrollisilkkipaperia. Erillinen ryhmä (sininen laatikko) osoitti vastavuoroisuuden miR ilme kuvio, jossa korkeimmilla tasoilla kontrollisilkkipaperia ja alhaisimpia adenokarsinooma. Nämä ryhmittymät viittaavat siihen, että osajoukko Mirs voi määrittää kudoksen luokittelu vahvistavia aiempaa työtä muilta eri ihmisen syövän näytteitä [16], [17].

vertailu havaintojen hiirimallissa (kuvio 1 2) julkaistut tutkimukset ihmisen haimasyöpä esittää samaa laadullisia muutoksia useimmille kaksitoista Mirs analysoitiin molemmat asetukset (taulukko S1; Refs [7], [43], [44], [45]): Seitsemän Mirs yläreguloituja syöpä ja normaalissa kudosten hiirimallissa myös yläreguloituja ihmisen syövissä. Viiden Mirs löytyy vaimentua hiirimallissa, neljä olivat myös vaimentua tai osoittanut mitään muutosta tutkimukset ihmisen yksilö. Vain miR-212 oli yläreguloituja ihmisen ja vaimentua hiiren PDAC näytteissä. On houkuttelevaa spekuloida, että ristiriita on miR-212 ihmisen ja hiiren välillä PDAC näytteet voivat ilmoittaa eläinten välillä epiteelisolujen-stroomavuorovaikutuksiin aikana pahanlaatuisten etenemisen [47]. Kaiken kaikkiaan tiivis sattuma miR muuttuu pahanlaatuinen haiman kudoksista kaikilla eläinlajeilla ja eri tutkimukset viittaavat siihen, että kliininen haiman adenokarsinooma edustaa hyvin jota p48-Cre /LSL-Kras

G12D eläinmallissa.

ilmentäminen miR kohdegeenien ja MIRS hiiren haiman kudoksista

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että vallitseva aktiivisuus Mirs (84%) on niiden vaikutus kohde-mRNA vakaan tason [48]. Jotta assss tämä hiirimallissa tunnistimme ehdokas mRNA tauluja puolueeton luettelosta alle ilmaistuna mRNA ihmisen haimasyöpä ja pääsisivät samoihin kanssa miR paneelin tutkittu tässä (taulukko S3). Joukko vastaavia geenien vaimentua haimasyövän sisältää MLH1 kuin ennustettu tavoitteeksi miR-155, ja FGFR1 tavoitteeksi asetettiin miR-10. Kun verrataan normaalin ja syöpäkudoksissa korjattu hiirimalleissa mRNA: n ilmentymisen on MLH1 ja FGFR1 osoitti merkittävää, käänteinen suhde miR-155 ja miR-10 (kuvio 3).

kudokset p48-Cre /Kras

G12D hiirillä invasiivista haiman adenokarsinooma (PDAC) ja normaali haimoissa analysoitiin ilmentymisen miR-10 ja miR-155 suhteessa vastaavaan ehdokas kohde-mRNA: iden, FGFR1 ja MLH1 käyttäen kvantitatiivista RT-PCR. Keskiarvo ± SEM n = 3 kussakin ryhmässä; ***, P 0,001 normaali verrattuna syöpä.

gemsitabiinihoidon vaikutus verenkierrossa Mirs on eläinmallissa

Läsnäolo sairaiden kudosten voidaan ilmoittaa muuttaa miR concentraions vuonna setelien (katso johdanto). Kuten loogista, miR pitoisuudet verenkierrossa voisi toimia myös helposti markkereita hoidon tehoa ja jopa osoittaa reitit muuttaa tietyn hoidon. Testasimme tämän hypoteesin vuonna PDAC hiirimallissa verrattuna kontrollieläimiin ilman syövän. Gemsitabiini on ensilinjan huumeita käytetään hoidettaessa potilaita, haimasyöpä ja annettiin yhden viikon ajan eläimille PDAC ja samanikäisiin ohjaus eläimiä. Annos ja hoidon aikataulu mukautettiin muista tutkimuksista, jotka oli osoitettu tehoavan pidemmän hoitojakson aikana [49], [50]. Pieni verinäyte ( 0,1 ml) piirrettiin ennen hoidon aloittamista vertailua miR seerumin ennen ja jälkeen hoidon poikki näitä kahta ryhmää eläimiä. Läsnäolo PDAC, että p48-Cre /Kras

G12D eläinten varmistettiin histologista analyysiä varten haiman kudoksista lopussa tutkimuksen. Valitsimme kuusi MIRS löydetyistä voimistunut ja kaksi, jotka alas säännelty PDAC kudoksissa suhteessa kontrolleihin (katso kuva 2). A 10000-kertainen pitoisuusalue näistä kahdeksasta Mirs havaittiin verenkierrossa eläinten (kuva 4A). Ennen hoitoa (kuvio 4A, avoimet pylväät), seerumin miR-10 ja miR-155 olivat koholla 2-kertainen (p 0,05) PDAC (punainen) verrattuna kontrolliryhmään (musta). Sitä vastoin seerumin miR-21, miR-148B ja miR-375, jossa erottaa ryhmien välillä. Gemsitabiinihoidon (kuvio 4A, täytetyt pylväät) pienentää seerumin miR-10, miR-21 ja miR-155 eläimillä PDAC ja valvontaa 6- 60-kertainen (p 0,05 0,01; kuva 4B) . Seerumin miR-100 ja miR-375 pienensi 2-kertainen käsittelyn jälkeen tosin vain säätimet osoitti tilastollisesti merkitseviä eroja (p 0,05). miR-148B seerumissa eivät muuta hoitoa ja miR-16 nousivat 5-kertaiseksi käsittelyn jälkeen. On huomionarvoista, että gemsitabiini Eläinten käsittely PDAC pienentää seerumin miR-21, miR-10 ja miR-155 ylimääräisellä 2-, 3- ja 6-kertainen alle väheneminen nähdään kontrollieläimiin, vaikka vain luki- 155 olivat tilastollisesti merkitseviä verrattaessa PDAC ja ohjaus (kuva 4B; p 0,05). Nämä tiedot viittaavat siihen, että valvonta asianmukaista Mirs verenkierrossa voi erottaa lääkkeen vaikutuksia sairaiden kudosten lääkeaineen vaikutuksia terve kuin kohdekudoksissa.

(A) miR-tasot seeruminäytteistä korjataan ennen (avoimet pylväät) ja sen jälkeen yhden viikon gemsitabiinihoidon (5 annosta 40 mg /kg). (B) suhde pitoisuudet seerumissa ennen /jälkeen gemsitabiini hoidon. Pisteviiva osoittaa kahden kertainen ero. *, P 0,05; **, P 0,01.

Mirs verenkierrossa kärsivien potilaiden haiman ja muiden syöpien

Yhdeksän erilaista Mirs eristettiin ja kvantitoitiin plasmanäytteistä sairastavien potilaiden haiman muita syöpiä ruoansulatuskanavan syöpiä, ja ei-syöpä valvontaa. Potilaan diagnoosit on koottu taulukkoon S2. miR-100a ja miR-10 lisättiin merkittävästi haiman syöpäpotilaiden verrattuna ei-syöpä valvonta taas useat muut Mirs (miR-16, 21, 155, 199, 221, ja 223) osoitti suuntaus lisääntynyt ilmaisun että ei ollut tilastollisesti merkitsevä (kuvio 5A). Toinen alaryhmä Mirs osoittivat merkittävää ilmaisun eroja haimasyövän ja paksusuolen syöpä potilaat, mutta ei verrattuna potilaisiin muita ruoansulatuskanavan syöpiin. Ilmaisu malleja eri kiertävän Mirs viittaavat siihen, että jotkut ovat parhaiten erottamaan syövän ja ei-syöpäpotilasta taas toiset parhaiten erottaa sairaat elimet.

Näytteet olivat haiman syöpäpotilaiden, ei-syöpä valvontaa, ja potilaat muiden GI syöpiä. (A) pitoisuudet yhdeksän Mirs havaittu verenkierrossa näyttää yksilölliset erot potilaiden välillä ryhmissä. Huomaa eri valikoimia asteikkojen Y akselien. (B) valvomaton satunnainen metsä analyysillä vertaamalla haimasyöpä (mustat ympyrät) vs. ei-syöpä säätimet haiman sairaus (valkoinen kolmio), ei-syöpä kontrolleihin ilman haiman sairaus (valkeat ympyrät), ylempi GI syöpä (sininen ympyrä), paksusuolen syöpiin ( punaiset ympyrät), ja maksan syövät (keltainen ympyrä). Ympäröity punaisella ovat useimmissa haiman syövät. Nuolet osoittavat kaksi näyte potilailta, joilla pohjukaissuolisyöpä. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001. Potilaiden ominaisuudet on esitetty taulukossa S2.

valvomattoman satunnainen metsä analyysi että piti ilmaisua kaikkien yhdeksän Mirs eristetty verenkierrosta, viisi kuudesta haimasyövän potilaat ryhmitelty omaksi ryhmäkseen päässä suurin osa muista potilaista (kuvio 5B). Tämä vahvistaa, että yhteenlaskettu ekspressiokuviota näiden yhdeksän Mirs verenkierrossa oli riittävä tunnistaa potilaat haimasyöpä erillisinä potilailta muihin GI syöpiä ja valvontaa. Huomionarvoista oli kaksi näytteitä potilaista, joilla pohjukaissuolen kasvaimet (nuolet), joka on ryhmitelty lähinnä haimasyövän potilaille, johtuen mahdollisesti haiman osallistuminen huomaamatta aikaan näytteenottoa. Lisäksi näytteet potilailla, joilla on ei-syöpä haiman sairaus, ja ei-syöpä valvonnan ryhmitelty osoittaa, että paneeli miR ilmentyminen on spesifinen haimasyövän sijaan tahansa tautia peräisin haimasta.

Keskustelu

KRAS

G12D-driven haimasyöpä malli on hyvin tunnettu lukuisissa molekyyli- ja biologiset tasot [35], [36], [37], [38], [39]. Analyysimme kudosnäytteiden osoittaa, että jotkin miR muutokset liittyvät invasiivisen haimasyöpä näkyvät jo alkuvaiheessa taudin (kuva 2). Yllättävää oli se, missä määrin muutokset miR ilmaisun eläinmallissa jäljitteli miR ilmentyminen muuttuu havaitaan ihmisen haimasyövän (katso taulukko S1). Itse asiassa osajoukko MIRS, joka sisältää miR-10 ja miR-155 ilmentyivät haimasyövän potilaiden kudosten ja hiirillä sekä vastaavien verinäytteestä. Siten tämä tutkimus antaa näyttöä siitä, että lajien välistä samankaltaisuutta miR ilmaisun yhteydessä haimasyövän on suhteellisen säilyneitä, hyvin todennäköisesti johtuu KRAS merkittävänä alullepanija pahanlaatuisen [42].

vertaileva analyysi miR ilmaisun aikana pahanlaatuinen etenemisen hiirimallissa avulla voidaan tehdä joitakin päätelmiä asiaa Mirs verenkierrossa, joka voi ilmaisemaan esiasteleesioita. Habbe et ai. [51] raportoi ekspressiotasot MIRS ihmisen intraduktaalisissa papillaarinen mucinous kasvaimet (IPMN) kudoksiin, ja totesi, että miR-155 on ylössäädelty ja mahdollinen kudoksen biomarkkeri pre-invasiivisen sairauden. Olemme löytäneet miR-155 voimistuvan joukoissa, jotka sisältävät PANIN vaurioita hiirimallissa, ja totesi myös, miR-155 yläreguloituja plasmanäytteistä haimasyövän potilaille. Muut tutkimukset n arvioimista verenkierrossa miR-21, miR-210, miR-155 ja miR-196a eri sarjaa haimasyövän potilaat ovat vetäneet samanlaisia ​​johtopäätöksiä diagnostista potentiaalia Mirs [52]. IPMN, mucinous kystinen kasvain (MCN), ja Panin edustavat kolmea tunnettu esiasteleesioita of PDAC. Nämä kolme tyyppiä premalignancies on monia geneettisiä ja patologisten yhtäläisyyksiä, mutta myös joitakin ominaisuuksia, joiden avulla erottamaan niitä [53]. Meidän tulokset tukevat hypoteesia, että plasmapitoisuudet miR-155 voi todellakin edustaa biomarkkereiden että niissä on Panin vaurioita.

Samanlaisia ​​miR muutoksia kudoksissa ja verenkierrossa ehdottaa meille, että Mirs vapautuvat sairaiden kudosten jatkuvalla tavalla mahdollisesti kautta eksosomeiksi [54], [55] vaikka voi olla erityinen vapautusmekanismit jotka saattavat suosia joitakin MIRS muihin nähden [56]. Täällä keskittynyt lähinnä MIRS jotka ovat koholla sairaiden kudosten sijaan ne, joiden ilmentyminen vähenee tai katoaa. Me perusteltu, että menetys tietyn miR vain vaikuttaa vakaan tason verenkierrossa, jos sairaiden elin on merkittävä lähde miR läsnä verenkierrossa. Esim. miR-148a /b ja miR-375 ovat vaimentua erittäin vahvasti haimasyövän suhteessa normaaliin haiman kudoksiin. miR-375 on osoitettu olevan tärkeä rooli haiman saarekesolujen kehittämiseen [57], ja toiminta sekä ylläpito glukoosihomeostaasiin [58], [59] ja on huomionarvoista, että yksi varhainen oire PDAC voidaan aikuinen puhkeamista diabetes. miR-148 voidaan torjua ilmaus DNMT3b kautta alueen sen koodittavan sekvenssin [60] ja voi siten vaikuttaa DNA korjausmekanismit.

Huolimatta 100-kertainen vähentäminen miR-375 ja miR-148a /b malignin transformaation aikana haiman kudoksista, on hämmästyttävää, että niiden pitoisuus seerumissa eivät alene eläimillä kanssa PDAC (katso kuvio 2C ja 4A). Tämä viittaa siihen, että haiman panos heidän seerumin vain pieni. Tämä on todennäköisesti myös totta miR-21, jossa nousu tasot kudoksissa 100-kertainen aikana haiman pahanlaatuisen muutoksen siinä eläinmallissa ei merkitä lisääntynyt seerumin (katso kuva 2A ja 4A). Sen sijaan miR-10 ja miR-155 tasot seerumissa kasvoi haiman pahanlaatuisiksi hiirillä ja potilailla tukee käsitystä, että sairastunut elin on vaikuttanut merkittävästi seerumin näistä Mirs (katso kuvio 4A ja 5A).

Viimeaikaiset tutkimukset päässä Bartel laboratorio ovat osoittaneet, että vallitseva aktiivisuus Mirs on vähentää kohde-mRNA-tasoja ja todettiin, että yli 84% miR vaikutuksia proteiinien tuotantoa johtuvat tämän ehtyminen kohde-mRNA [48]. Siten Mirs jotka upregulated verenkierrossa sairastuneiden kohteet voivat samaan aikaan vähentäen samalla kohde-mRNA: iden on sairaan kudoksen alkuperän. Olemme lisäksi arveltu, että Mirs havaittiin lisääntynyt liikkeeseen potilaat saattavat olla läsnä paljon korkeammalla tasolla sairaiden tisses johtuen laimennus heidän irtoaminen verenkiertoon. Havaitsimme ehdokas mRNA tavoitteet ja puolueeton luettelo alle ilmaisi mRNA: haimasyöpä ja normaalissa kudosten koottu eri tutkimuksista palautetaan 154 mRNA: t, jotka voivat olla syöpä asiaan miR tavoitteita. Nämä sovitettu MIR paneelin tutkittu tässä (taulukko S3).

joukko geenejä palannut analyysin sisältää

MLH1

ennustettu tavoitteeksi miR-155. Todellakin, yli-ilmentyminen miR-155 solulinjoissa johti alas-säätely hMSH2, hMSH6, ja hMLH1. Myös käänteinen korrelaatio ekspressiotasot miR-155 ja MLH1 tai MSH2 proteiineja ilmoitettiin ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syöpiä [61]. MLH1 on mis-ottelu korjaus proteiini, joka edistää kertyminen geneettisten virheiden yhteydessä familiaalinen haimasyövän ja joissakin satunnaisia ​​tapauksia [34]. Sen mRNA löydettiin vaimentua haimasyövän näytteitä ja osa menetyksen MLH1 mRNA ilmaisun haimasyöpä syyksi on promoottori hypermetylaation [62]. Havaitsimme merkittävän käänteinen suhde ekspression miR-155 ja MLH1 mRNA: n vertailu normaaleissa ja syöpäkudoksissa (kuvio 3A). Lisäksi, FGFR1 mRNA havaittiin vaimentua ihmisen haiman adenokarsinooma (taulukko S3), ja havaitsimme merkittävää downregulation hiiren PDAC mallin suhteen normaaleissa kudoksissa (kuvio 3B). Nämä havainnot miR-10 ja miR-155 ja niiden ennakoi maalin mRNA: iden MLH1 ja FGFR1 tukevat käsitystä mahdollisen sääntelyn tehtävä näiden Mirs aikana pahanlaatuinen etenemisen.

Vielä sarjassa eläinkokeissa potentiaalisten suoraa kliinistä sovellus, testasimme MIRS voisi osoittaa lääkkeen tehoa. Pitoisuusalue kiertävien Mirs seurataan tässä kokeissa on 10000-kertaiseksi ja vaikutus huumehoitoon ei liittynyt kanssa esikäsittelyssä pitoisuus kahdeksan Mirs seurattiin (kuvio 4A). Sen jälkeen gemsitabiinihoidon miR-16 havaittiin lisääntynyt seerumin 5-kertaiseksi PDAC sekä hallita eläimiä. miR-16: n ilmentyminen liittyy apoptoosin [63], kasvun hidastuminen kautta p53: [64] ja kasvaimen suppression [65]. Kasvu Tämän miR-16 verenkierrossa syövän ja ohjaus eläimiä ottelujen sytotoksisen lääkkeen aktiivisuutta terveillä kudoksia. Toisin kuin tämä lisäys, miR-148B seerumissa ei ollut vaikutusta, kun lääkehoitoa ja seerumin miR-10 ja miR-155 oli vähentänyt eniten (30- ja 60-kertainen), kun gemsitabiini hoidon. Nämä kaksi Mirs oli todettu kohonnut seerumista PDAC eläinten suhteessa tarkastukset ennen aloittamista lääkehoidon. Lisäksi seerumin miR-10 ja miR-155 käsitellyillä eläimillä, joilla on PDAC laski alle seerumin verrokkieläimet (kuvio 4A B), mikä viittaa niiden mahdollisina indikaattoreina kasvaimen tietyn hoidon vaikutuksia. Kaiken kaikkiaan tulokset tässä kokeellisessa ympäristössä kannattaa ajatusta haimasyöpä selektiivinen teho Gemsitabiini vaikka vaikutukset homeostaasin muiden terveiden kudosten tuli ilmeiseksi.

Johtopäätös

miR muutoksia kudoksissa ja kierto näyttää merkittäviä yhtäläisyyksiä haimasyövän potilaille ja p48-Cre /Kras

G12D hiirimallissa taudin. Beyond mimcry ihmisen molekyyli patologian hiirimallissa, allekirjoitus Mirs tunnistettu tässä voivat toimia myös informatiivinen indikaattorit lääkkeen tehon kehittämisessä tarvitaan kipeästi yksin tai yhdistelmähoidot [42] tämän tuhoisan sairauden.

Materiaalit ja menetelmät

hiiri kudoksen analyysi

eläinten tutkimus pöytäkirjat hyväksynyt Georgetownin yliopiston Animal Care ja Käytä komitea (GUACUC # 08-028). P48-Cre /LSL-Kras

G12D hiirimallissa on kuvattu aiemmin [35]. Vuonna ohjaus, myöhään Panin ja adenokarsinooma ryhmien hiiret tapettiin 16 kuukauden iässä. Controls puuttui joko KRAS

G12D tai p48-CRE alleeli. Varhaiseksi Panin ryhmä, hiirillä yhden kuukauden iästä hoidettiin caerulin ja uhrattiin neljän kuukauden iässä jälkeen vakiintunut protokollaa [66]. Haimoissa oli jakaa kahtia hännän pään kanssa puolet kiinnitettiin formaliiniin ja toinen puoli jäädytettiin nestemäisessä typessä. Patologi sijoitettiin korkein Panin arvosana per lobule kaikista lobules laskettiin edustavan H käänteinen: CGGAGAGTCTCATGGCACCGC. FGFR1 eteenpäin aluke: GTAGCTCCCTACTGGACATCC; reverse-aluke: GCATAGCGAACCTTGTAGCCTC.

miR havaitsemiseksi ja kvantitoimiseksi ihmisen ja hiiren verinäytteistä

Ihmisen verinäytteitä saatiin biorepository on Lombardi Cancer Center, että kerää anonymisoidaan näyte syöpä ja ei-syöpä potilaat tutkimustarkoituksiin. Aineisto analysoitiin anonyymisti. Hiiri veri ( 0,1 ml) kerättiin submandibular verenvuotojen lansetin [67]. Seerumi- tai plasmanäytteet sekoitettiin suhteessa 1:10 Qiazol hajotusreagenssia ja vorteksoitiin. Lysaatti uutettiin CHCl3: lla ja vesipitoinen faasi käsitellään edelleen kokonais-RNA käyttäen miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) ja rikastettiin miRNA käyttäen RT2 qPCR-luokan miRNA Isolation Kit, MA-01 (SABiosciences).

Gemsitabiini eläinten kohtelu

Gemsitabiini saatiin sairaala-apteekista ja annetaan 22-23 kuukauden ikäisen p48-Cre /Kras

G12D tai ikään sovitetun kontrolli eläimistä 40 mg /kg 5 annosta aikana yksi viikko. Tämä annos on 200 mg /kg /viikko perustui Refs. [49], [50]. Verta otettiin ennen hoidon aloittamista ( 0,1 ml) ja yhden päivän kuluttua viimeisestä annoksesta. Läsnäolo PDAC vahvistettiin p48-Cre /Kras

G12D by jälkipuinti histologista analyysiä.

Tietojen analysointi

tietojenkäsittely menetelmät koodattu R (http: //www .r-project.org). Hierarkkinen ryhmittely suoritettiin perustuen keskiarvo ja skaalattiin miR ekspressiotasot.