Krooninen sairaus

tiivistelmä

On hyvin osoitettu, että suoliston mikrobiston avainasemassa patogeneesissä Crohnin tauti (CD) ja haavainen paksusuolen tulehdus ( UC) yhteisesti kutsutaan tulehduksellinen suolistosairaus (IBD). Epidemiologiset tutkimukset ovat antaneet vahvaa näyttöä siitä, että IBD potilaat bear suurentunut kehittämiseen peräsuolen syöpä (CRC). Kuitenkin vaikutus mikrobiston kehittämisestä koliitti liittyvän syövän (CAC) on edelleen suurelta osin tuntemattomia. Tässä tutkimuksessa olemme perustettiin uusi malli CAC käyttäen azoxymethane (AOM) -exposed, conventionalized-

IL10

– /-

hiiret ja ovat tutkineet osuus isännän suoliston mikrobiston ja MyD88 signaloinnin kehittäminen CAC. Osoitamme, että 8/13 (62%) AOM-

IL10

– /-

hiirille kehittyi paksusuolen kasvaimissa verrattuna vain 3/15 (20%) ja AOM- villityypin (WT) hiiret . Conventionalized AOM-

IL10

– /-

hiirille kehittyi spontaani koliitti ja peräsuolen karsinoomat vaikka AOM-WT hiiret olivat koliitti-vapaa ja kehittää vain harvoissa adenoomia. Tärkeää on, kasvainten lukumäärää suoraan korreloi läsnä koliitti.

IL10

– /-

hiirillä mono-liittyvän lievästi colitogenic bakteerin

Bacteroides vulgatus

näytetä vähensi koliitti ja peräsuolen kasvainten lukumäärää verrattuna

IL10

– /-

hiirillä. Mikrobivapaaksi AOM-käsitelty

IL10

– /-

hiiret osoittivat normaalia paksusuolen histologia ja olivat vailla kasvaimia.

IL10

– /-

;

Myd88

– /-

hiiriä hoidettiin AOM näytetä alennettu ilmentyminen

Il12p40

ja

TNFa

mRNA ja osoittanut mitään merkkejä kasvaimen kehitystä. Esitämme ensimmäinen suora osoitus siitä, että manipulointi suolistomikrobistoa muuttaa kehitystä CAC. TLR /MyD88 reitti on välttämätöntä mikrobiston aiheuttaman kehitystä CAC. Toisin havainnoista käyttämällä AOM /DSS malli, osoitamme, että vakavuus kroonisen koliitin korreloi suoraan peräsuolen kasvainten kehittymiseen ja että bakteerien aiheuttama tulehdus asemien etenemistä adenooma ja invasiivisen karsinooman.

Citation: Uronis JM, Mühlbauer M, Herfarth HH, Rubinas TC, Jones GS, Jobin C (2009) modulaatio suolistomikrobistoa Alters Colitis-Associated peräsuolen syövän Herkkyys. PLoS ONE 4 (6): e6026. doi: 10,1371 /journal.pone.0006026

Editor: Stefan Bereswill, Charité-Universitätsmedizin Berliini, Saksa

vastaanotettu: toukokuu 19, 2009; Hyväksytty: 30 toukokuu 2009; Julkaistu: 24 kesäkuu 2009

Copyright: © 2009 Uronis et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Institutes of Health (NIH): ROI DK 47700 ja RO1 DK 73338 (C. Jobin) ja Gastroenterologia tutkijankoulutusverkot myöntää NIH 5 T32 DK007737 (J. Uronis) ja NIH P30 DK034987 (Center for Ruoansulatuskanavan Biology and Disease). Gnotobioottisissa olosuhteissa kasvatetusta ja mikrobittomalla työtä tukivat NIH Grant: P40RR018603. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

kyky asentaa tulehdusreaktion seuraavat vamman tai alttiita vieraille organismeihin on elintärkeä isäntä homeostaasiin ja selviytymistä. Kuitenkin jatkuvasti kohonnut immuunivasteen kaltainen havaittu kroonisten tulehdussairauksiin vakavasti heikentää isäntä elintoiminnot, mikä johtaa lopulta tautiin [1]. Merkittävän riskin, joka liittyy krooniseen tulehdukseen on lisääntynyt todennäköisyys syövän kehittymisen [2] – [4]. Crohnin tauti (CD) ja haavainen paksusuolen tulehdus (UC) kollektiivisesti kutsutaan tulehduksellinen suolistosairaus (IBD) on pohjimmainen esimerkki, jossa kroonisen tulehduksen kääntää lisääntynyt syöpäriskiä [2]. Kumulatiivinen ilmaantuvuus kolorektaalisyövän IBD potilailla vaihtelee 7,6%: sta 18,4%, 30 vuotias post-diagnoosi [5] – [8]. Lisäksi epidemiologiset tiedot viittaavat siihen, että kesto ja vakavuus kroonisen koliitin edustaa merkittävää riskitekijöitä koliitti liittyvän paksusuolensyöpä (CAC) [9] – [11]. Vaikka etiologia IBD on vielä selvittämättä, eläinmallissa perustuvat tutkimukset osoittavat, että isäntä suolistomikrobistoon laukaisee immuunivasteen, joka on edellytys sille, että puhkeamista tauti [12] – [15]. Tämä hallitsematon immuunivaste saattaa edustaa vika yhdessä tai useammassa immunosuppressiivisen mekanismeja tarkoitettu toleranssi isäntä suoliston mikrobiston, jolloin ylituotanto tulehdusta välittäjien [12], [16]

Käsite tasapainoisen immunosuppressiivista vaste pyritään sääntelemään mikrobiston voidaan parhaiten kuvattu interleukiini-10 knock-out (

IL10

– /-

) hiirillä. Nämä hiiret, jotka eivät siedä niiden suolistomikrobistoon kehittää spontaanin paksusuolentulehduksen, seurauksena mikrobien aiheuttaman aktivaation efektori-T-solujen [17] – [19].

Ihmisen paksusuolen sataman niin paljon kuin 36000 bakteerilajien määrä yli 100000 miljardia aerobiset ja anaerobiset bakteerit [20], [21]. Koska tuote meidän co-evolution bakteerit, viestintäjärjestelmä on kehitetty, jotta voimme säädellä toisiaan ja näin ylläpitää suoliston homeostaasiin [21]. Olennainen merkitys cross-talk joka tapahtuu ihmisen suolistossa ja sen asukas mikrobiston suoritetaan synnynnäinen bakteerien anturit tunnetaan hahmontunnistus reseptorit (PRRS) [21]. Kahteen pääluokkaan PRRS on osoitettu säätelevän välistä viestintää suoliston epiteelin ja mikrobiston. Toll-like-reseptorien (TLR) ja Nodin kaltaiset reseptorit (NLRs) palvelevat varoittaa isäntänä bakteerien esiintyminen solunulkoisen ja solunsisäisen tilat vastaavasti [22], [23]. Käyttämällä azoxymethane (AOM) /DSS malli CAC, Fukata ja työtoverit osoittivat, että TLR4 osallistuu kehittämiseen peräsuolen syöpä [24]. Vaikka mielenkiintoinen, tässä tutkimuksessa ei ole osoitettu suoraan vaikutusta mikrobiston CAC kehittämiseen. Lisäksi AOM /DSS mallin CAC näyttää osoittavan erottaminen toisistaan ​​vakavuuden suolistotulehdus ja syövän kehittymisessä. On selvää, lisätutkimuksen vaikutuksista bakteerien kehitykseen CAC tarvitaan.

Tässä tutkimuksessa käytimme alkio-vapaa ja gnotobioottisissa olosuhteissa kasvatetusta tekniikkaa muuntamaan sisällön suoliston mikrobiston määrittää suoraa vaikutusta bakteerien kehittäminen CAC. Osoitamme, että AOM-käsitelty

IL10

– /-

hiiret kehittävät CAC läsnäollessa colitogenic bakteerit taas mikrobivapaaksi hiiret säilyvät tautivapaan. Läsnäolo koliitin suoraan korreloi kasvainten lukumäärää ja toimii edistäjänä paksusuolisyövän. Lisäksi AOM-käsitelty

IL10

– /-

;

Myd88

– /-

hiirille ei kehittynyt peräsuolen kasvaimia, mikä osoittaa, että bakteerien signalointi kautta TLR /MyD88 varten tarvitaan oma kehittämiseksi CAC.

Tulokset

bakteeri-välitteinen paksusuolentulehdus parantaa peräsuolen kasvaimien syntyyn

roolin tutkimiseksi bakteeri-välitteisen koliitin puhkeamista peräsuolen syövän synnyn, conventionalized WT ja

IL10

– /-

hiirille annettiin kuurina AOM ja seurataan

in vivo

merkkejä koliitti ja kasvainten kehittymiseen kolonoskopialla määrätyin väliajoin (Fig. 1). 16 viikon jälkeen WT hiirillä ei esiintynyt makroskooppisia tulehduksen ja esittää osittain läpikuultava limakalvon hyvin määritellyt vascularization liittyvät terveen kaksoispiste (Fig. 2A, vasen paneeli). Sen sijaan

IL10

– /-

hiirten limakalvon paksuuntumista ja menetys ilmeinen verisuoniston liittyy makroskooppisten suolistotulehdus (Fig. 2A, keskimmäinen paneeli). Makroskooppisia leesioita yhteensopiva kasvaimia havaittiin conventionalized

IL10

– /-

hiirillä 16 viikon (Fig. 2A, oikeanpuoleinen paneeli). Lisätutkimuksia näiden leesioiden histologinen analyysi paksusuolen kudoksiin suoritettiin WT ja

IL10

– /-

hiirillä. Olemme vahvistaneet, että makroskooppisten havaitut vauriot

IL10

– /-

hiiret olivat kasvaimia, jotka kehitettiin tulehtunut paksusuolessa. Kuten on esitetty kuviossa. 2B, AOM-käsitelty

IL10

– /-

hiiret osoittivat dramaattisen kasvaimen penetrance ja moninaisuus verrattuna WT hiirillä. Tutkimuksessamme 8/13 (62%)

IL10

– /-

hiirille kehittyi paksusuolen kasvaimissa verrattuna vain 3/15 (20%) ja WT-hiirissä. Lisäksi kasvainten lukumäärää oli 5 kertaa suurempi

IL10

– /-

hiirten keskimääräinen 1- verrattuna vain 0,2 kasvaimia WT hiirillä (Kuva. 2B) (p = 0,034). Huomattavaa on, että kehittyvä kasvain

IL10

– /-

hiiriä liittyi tiiviimmän suolistotulehdus määritetty histologista analyysiä (Fig. 2C) (p 0,0001). Paksusuolen ilmaus

IL12p40

ja

TNFa

mRNA olivat merkittävästi koholla

IL10

– /-

– verrattuna WT hiiriin (Fig. 2C).

Germ hiiriin siirrettiin SPF olosuhteissa ja niiden annettiin sopeutua 5 viikkoa. Hiirille annettiin AOM injektiot kerran viikossa 6 viikon ajan (mustat nuolenpäät). Kehittäminen koliitti ja kasvainten muodostumista seurattiin kolonoskopialla viikoista 4-18 siirtymisen jälkeen alkio vapaasti SPF olosuhteissa (valkoinen nuolenpäät). Hiiret tapettiin välillä 18 ja 20 viikon kuluttua ja kudokset käsitellään histologista ja mRNA: n ilmentymisen analyysi.

. Edustavia esimerkkejä WT (vasen paneeli) ja

IL10

– /-

kaksoispisteet (keskimmäinen ja oikea paneelit) alkaen AOM-käsitellyistä hiiristä 16 viikkoa siirron jälkeen SPF olosuhteet. B. Kasvain penetrance ja kirjoa WT ja

IL10

– /-

hiiret (vasen ja oikea paneeli) (p = 0,034). C. WT ja

IL10

– /-

paksusuolen tulehdus tulokset, distaalinen paksusuoli

Il12p40

ja

TNFa

mRNA jälkeen 18-20 viikkoa alle SPF olosuhteissa (p = 0,026).

Jotta voitaisiin edelleen tutkia yhteyden bakteerin aiheuttama koliitti ja kehittämistä kasvaimia, suoritimme lineaarinen regressioanalyysi, jossa verrataan histologiset tulehdus pisteet vastaan ​​kasvain numero. Pearsonin korrelaatio analyysi paljasti voimakas positiivinen korrelaatio tulehdus ja paksusuolen kasvainten kehittymistä (p = 0,0028). Nämä tiedot viittaavat siihen, että krooninen koliitti parantaa etenemistä varhaisen muunnostapahtumille aloittaman AOM, kenties perustamalla mikroympäristön tukee solujen lisääntymisen.

Krooninen paksusuolitulehdus parantaa AOM aiheuttama peräsuolen syövän etenemiseen

Kun otetaan huomioon dramaattinen kasvu alttius paksusuolen kasvainten kehittymiseen, me arveltu, että hiiret, joilla on krooninen koliitti voi myös osoittaa lisääntyneestä alttius edistyneen syövän etenemiseen. Histologinen arviointi suoritettiin ja kasvaimet luokiteltiin joko matala- tai dysplasiaan tai invasiivisia karsinooma. Seitsemän kahdeksasta (88%) kasvain AOM /

IL10

– /-

hiirille kehittyi korkealaatuisesta tai invasiivinen karsinooma kun yksikään 3 kasvainten havaittu WT hiirillä ilmeni merkkejä kehittyneiden histologisia vaiheessa ( kuva 3A). Edustavia esimerkkejä paksusuolen kasvainhistologiaa havaittu AOM-käsiteltyjen WT ja

IL10

– /-

hiiriä kuvassa 3B. Nämä tiedot viittaavat siihen, että kroonisen koliitin paitsi altistaa lisääntynyt alttius AOM-indusoidun peräsuolen kasvaimen kehitystä, mutta myös parantaa kasvaimia onkogeeninen, mikä edistää etenemistä edenneessä vaiheessa.

. Prosenttia kasvain WT ja

IL10

– /-

hiirten korkealaatuisesta tai invasiivinen karsinooma (ylempi paneeli). Edustavia heikompilaatuisen adenoomia havaittiin WT hiirillä (keskimmäinen paneeli). Edustavia invasiivisen kohdunkaulan havaittu

IL10

– /-

hiirten (alempi paneeli).

NFKB aktiivisuutta ja soluproliferaatiota in kasvaimia

IL10

– /-

hiiret

NFKB signalointi on keskeinen rooli edistettäessä bakteerin aiheuttaman koliitin

IL10

– /-

hiirillä [25], [26]. Voit tarkistaa läsnäolon aktivoitua Rel A (NFKB) -signaling että AOM /

IL10

– /-

malli CAC, arvioimme ilmaus /lokalisoinnin fosforyloidun RelA (S276) in

IL10

– /-

paksusuolen kudoksiin immunohistokemiallinen (IHC). Kaksoispisteet alkaen

IL10

– /-

hiiret osoittivat runsas fosforyloidun RelA positiiviset infiltroivien immuunisolujen (Fig. 4A). Lisäksi läsnä on lukuisia fosforyloidun RelA positiivinen immuuni- ja suolen epiteelisolujen havaittiin adenoomien päässä

IL10

– /-

hiirissä (Fig. 4B).

. Fosforyloitua-Rel immunovärjäyksen normaali

IL10

– /-

paksusuolen kudosta. B. laajentuminen Rel Positiivinen immuuni soluttautua A. C. Fosfory- Rel immunovärjääminen

IL10

– /-

adenooma. D. laajentuminen adenooma CE: Kanin IgG negatiivinen kontrolli.

Koska sen edistämisessä soluproliferaatioon ja selviytymistä, arvioimme jakelu Ki67 positiivisten solujen aktiivisesti tulehtunut ja neoplastisia alueiden kaksoispisteitä eristettyjen AOM /

IL10

– /-

hiirillä. Nuclear Ki67 värjäys oli enimmäkseen rajoitettu krypta emäkset WT hiirillä (Kuva. 5A). Sen sijaan, paksusuolen limakalvon tulehtunut

IL10

– /-

hiiret osoittivat alat, joilla on proliferaatiota ulottuvat joissakin tapauksissa koko krypta pituus (Fig. 5A). Lisäksi peräsuolen adenoomia korjattu

IL10

– /-

hiiret osoittivat johdonmukaisesti lisääntynyt Ki67 värjäytyminen verrattuna normaaliin limakalvo (Fig. 5B). Tämä parannettu leviämisen vastaa lisääntynyt kertyminen ydinvoiman CTNNB1 sisään adenomatoottisen kudoksissa

Il-10

– /-

hiirissä (Fig. 5C). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että kohonnut tulehdus- ja proliferatiivinen tila havaittu yhteydessä

IL10

– /-

hiiri paksusuolen yhdistettynä AOM aiheuttama aktivointi WNT /CTNNB1 reitti johtaa lisääntyneeseen taipumus peräsuolen kasvainten muodostumista ja etenemistä.

. Ki67 positiiviset solut rajoittuvat krypta emäksiä normaalissa WT paksusuolessa. Normaali kaksoispisteet alkaen

IL10

– /-

hiirillä pitkänomainen crypts laajennettu Ki67 positiivista värjäytymistä. B. Edustavia adenooman iältään

IL10

– /-

hiiri osoittaa lisääntynyt Ki67 positiivista värjäytymistä (vasen paneeli). Rabbit IgG negatiivinen kontrolli (oikea paneeli). C.

IL10

– /-

adenoma näyttää positiivista CTNNB1 värjäystä.

mikrobittomat

IL10

– /-

hiirillä mono-liittyvä

Bacteroides vulgatus

näyttö pienentää paksusuolen tulehdus ja paksusuolen kasvainten kehittymistä verrattuna

IL10

– /-

SPF hiirillä

määritellä tarkemmin roolia bakteerien edistämällä CAC, me mono-liittyvä alkio-vapaa WT ja

IL10

– /-

hiirten

Bacteroides vulgatus

(

B. vulgatus

), enteerinen bakteeri, joka on raportoitu aikaisemmin aiheuttavan vain lieviä koliitti

IL10

– /-

malli IBD [18]. Histologinen arviointi osoitti, että

IL10

– /-

hiirillä kolonisoituu

B. vulgatus

kehitetty kohtalainen koliitti (Keskimääräinen pisteet = 1,6) verrattuna WT hiiriin (Keskimääräinen pisteet = 0,36) (Fig. 6A). Nämä arvot eivät kuitenkaan olleet merkitsevästi vähemmän kuin tulehduksellinen tulokset havaittiin conventionalized

IL10

– /-

hiiriä (Keskimääräinen pisteet = 2,6, p = 0,03) (Fig. 6A). Yhtäpitävä tulehdus tila, mono-liittyvä

IL10

– /-

hiirillä näkyy huomattavasti pienempi kasvainten lukumäärää verrattuna niiden conventionalized kollegansa (0,4 ja 2,3 vastaavasti, p = 0,002) (kuvio 6B). Pearson lineaarinen regressioanalyysi paljasti voimakas positiivinen korrelaatio histologisia koliitti pisteet ja peräsuolen kasvainten määrä keskuudessa

B. vulgatus

mono-liittyvä hiirillä (p = 0,009). Lisäksi AOM-käsitelty mikrobittomat

IL10

– /-

hiirille ei kehittynyt koliitti ja näin Kolorektaalituumorien mikä vahvistettiin histologinen arviointi (Fig. 6A B). Nämä havainnot viittaavat siihen, että läsnä colitogenic bakteerien on olennaista kehitystä CAC.

. Vertailu tulehdus pistemäärät

IL10

– /-

hiirten SPF,

B. vulgatus

mono-liittyvä ja mikrobittomat olosuhteissa. B. kasvainten lukumäärää

IL10

– /-

hiirten SPF,

B. vulgatus

mono-liittyvä ja mikrobittomat olosuhteissa.

MyD88 signalointi tarvitaan bakteerin aiheuttama CAC

Jotta voidaan tutkia roolia TLR /MyD88 reitin signaloinnin CAC kehittämiseen,

IL10

– /-

;

Myd88

– /-

hiirille annettiin AOM ja peräsuolen kasvainten muodostumiseen arvioitiin. Kolonoskopia osoitti, että läsnä uudisvaurioiden

IL10

– /-

hiiret taas

IL10

– /-

;

Myd88

– /-

hiirissä ei näkynyt taudin oireita (tuloksia ei ole esitetty). Edustavia esimerkkejä paksusuolikudos histologisesti

IL10

– /-

ja

IL10

– /-

;

Myd88

– /-

hiiriä kuvassa 7A.

IL10

– /-

hiirille kehittyi keskimäärin 0,8 Kolorektaalituumorien /hiiri, kun taas

IL10

– /-

;

Myd88

– /-

hiiret olivat vailla uudisvaurioiden (kuvio 7B).

. Edustavia histologia havaittavissa

IL10

– /-

ja

IL10

– /-

;

Myd88

– /-

hiiriä hoidettiin AOM. B. kasvainten lukumäärää

IL10

– /-

ja

IL10

– /-

;

Myd88

– /-

hiiriä hoidettiin AOM. C. Suhteellinen ilmentyminen

Il12p40

ja

TNFa

mRNA distaalisessa kaksoispisteet on

IL10

– /-

ja

IL10

– /-

;

Myd88

– /-

hiirillä.

tutkimaan mahdollisuutta, että kumotaan kasvainten muodostumista

IL10

– /-

;

Myd88

– /-

hiirissä on muuttumisen johdosta tulehduksellinen sytokiiniekspressiota, käytimme semi-kvantitatiivisen PCR: n määrittämiseksi suhteessa mRNA: n ilmentymisen tasoja proinflammatoristen sytokiinien

TNF

a ja

Il12p40

distaalisessa paksusuolessa, hallitseva sivuston kasvaimen muodostumisen. Havaitsimme merkittävästi pienempi

Il12p40

mRNA: n ilmentymisen (p = 0,032) sekä huomattava suuntaus kohti laski

TNFa

lauseke (p = 0,089) in

IL10

– /- ; Myd88

– /-

verrattuna

IL10

– /-

hiirissä (kuvio 7C). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että bakteerin aiheuttama tulehdus kehitystä edistävä koliitti liittyviä peräsuolen syövän ja on riippuvainen TLR /MyD88-reitin signalointi.

Keskustelu

Vaikka UC edustaa prototypical esimerkki liittää aikaisemmat välillä krooninen tulehdus ja riski sairastua peräsuolen syöpä, mekanismeista tämä prosessi on vielä selvittämättä. Tämä johtuu todennäköisesti rajoitusten aiheuttamat nykyisten koemalleilla, jotka vaikeuttavat kerrata vaikutuksia kroonisen tulehduksen on peräsuolen kasvaimien syntyyn. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että colitogenic bakteerit ovat välttämättömiä kroonisten suolistotulehdus johtaa kasvaimien syntyyn. Käyttäen AOM kuten kasvain aloitteentekijänä ja mikrobiston laukaista kroonisen koliitin geneettisesti alttiissa

IL10

– /-

hiirillä, osoitamme, että tulehdus suoraan korreloi peräsuolen kasvainten lukumäärää ja parantaa syövän etenemiseen. Näitä tapahtumia ei havaittu

IL10

– /-

hiirillä sijaitsee alle alkio vapaissa olosuhteissa ja oli voimakkaasti vaimentunut hiirillä liittyy

B. vulgatus

, heikko indusoija suoliston tulehdus. Lisäksi häiriöitä MyD88 signalointi, keskeinen integraattori useita TLR estäneet Kolorektaalituumorien in

IL10

– /-

hiirillä. Nämä havainnot vahvasti vahvistaa mikrobiston keskeisinä puhkeamisessa suolistotulehdus ja neoplastisia muutoksia taudille alttiin isännän. Rooli TLR signaloinnin kehittämiseen peräsuolen syöpä on tehty viime aikoina voimakasta tutkimus. Rakoff-Nahoum ja työtoverit osoittivat, että MyD88 signalointi edistää syövän etenemisen

APC

Min

malli ihmisen familiaalinen adenomatoottisen polypoosin, mikä viittaa rooli suoliston mikro-organismien prosessissa tumorigensis [27]. Kuitenkin, koska sytokiinit, kuten IL1 ja IL18 myös käyttää MyD88 aktivoida alavirtaan kohdegeenien [28] osallistumista suoliston mikrobiston tässä mallissa on epäselvä. Lisäksi osallistuminen MyD88 signaloinnin kehittämisessä CAC ei käsitelty tässä tutkimuksessa. Parempi kuva roolin TLR signaloinnin CAC on alkanut tutkimusten avulla AOM /DSS malli. Esimerkiksi Fukata ja työtoverit osoittivat, että peräsuolen kasvainten synnyssä on voimakkaasti vähentynyt

TLR4

– /-

hiirissä, mikä viittaa siihen, että tämä luontainen reseptori on tärkeä kehittämisen CAC [24]. Kuitenkin tämä voimakas väheneminen neoplasia ei liittynyt kaventumiseen tulehdusta. Näin ollen on ilmeinen katkaista välillä suolistotulehdus ja tuumorigeneesiä AOM /DSS malli. Tämä ilmiö ei ole spesifinen TLR signaloinnin koska tuore raportti osoitti, että kasvaimen kehittymisen dramaattisesti pienenee

IL6

– /-

ja

Stat3

– /-

hiiret huolimatta merkittävästi suurempi tulehduksellinen tulokset näissä hiirissä [29]. Sen sijaan käyttämällä AOM /

IL10

– /-

malli, havaitsimme vahva korrelaatio tulehduksen pisteet ja kasvainten lukumäärää. Tämä viittaa siihen, että vaikea tulehdus osuvasti tukee selviytyminen varhaisen muunnostapahtumia. Lisäksi meidän tiedot osoittavat, että tulehduksen riippumatta vakavuus vaikuttaa syövän etenemiseen. On mahdollista, että kasvain microenvironment läsnä AOM /DSS malli eroaa AOM /

IL10

– /-

malli, joka voisi selittää laski kasvaimien synnyn huolimatta korkea tulehduksellinen tila entisessä malli.

Viimeaikaiset raportit ovat antaneet käsityksen rooliin koliitti edistäjänä peräsuolen tuumorigeneesiä AOM /DSS malli [24], [29]. Kuitenkin yksi tärkeä kysymys, joka jää avoimeksi, onko näillä kasvain edistäviä vaikutuksia aikaan saamat haavan paranemista vastaus luonnostaan ​​aiheuttamaa DSS hoitoon tai tulehdus sen ohessa. Esimerkiksi Grivennikov ja työtoverit osoittavat, että

IL6

– /-

hiirillä laskivat kasvainten lukumäärää ja kuorman verrattuna WT hiirillä AOM /DSS hoitoa vielä näillä hiirillä näkyy ankarampaa suolistotulehdus kuin WT hiiret . Näin ollen pienentää tuumorigeneesiä tässä mallissa on seurausta heikentyneestä IL6 /STAT3 signalointi suolen epiteelisolujen (IEC) ja ei välttämättä suoliston tulehdus. Osoitamme tässä, että AOM /

IL10

– /-

malli CAC voidaan tutkia erityisesti, vaikutus paksusuolen tulehdus on peräsuolen kasvaimien syntyyn. Olipa IL6 /STST3 signalointi on tärkeää kehitettäessä CAC AOM /

IL10

– /-

hiiriä vielä tutkittava. Lisäksi osoitamme, että CAC tapahtuu yhteydessä aktivoitua NFKB-reitin signalointi osoittamalla läsnäolo NFKB positiivisia immuunisolujen viittaa siihen, että tämä tulehduksellinen signalointireitille on tärkeää kehitettäessä ja /tai edistäminen neoplasia. Lisätutkimuksia vaaditaan tarkemmin määritellä rooli NFKB-välitteisen tulehduksellinen signalointi CAC.

Yhteenvetona osoitamme, että suoliston mikrobiston on olennaista kehitystä CAC ja että krooninen koliitti edistää onkogeeninen Kolorektaalituumorien johtaa etenemiseen vaiheissa. Nämä tapahtumat ovat riippuvaisia ​​mikrobien tunnustaa TLR /MyD88 järjestelmässä. Modulaatio tämän tärkeän synnynnäinen tunnistusjärjestelmä voisivat edustaa uutta keinoja, joilla estetään /vaimentaa kehitystä CAC.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Kaikki eläin protokollat ​​hyväksyttiin Institutional Animal Care ja käyttö komitea University of North Carolina at Chapel Hill.

Hiiret ja induktio CAC

WT ja

IL10

– /-

hiirillä on 129 SvEv tausta kasvatettiin ja sijoitettu gnotobioottisissa olosuhteissa kasvatetusta Animal Facility, University of North Carolina at Chapel Hill. Kymmenestä kahteentoista viikon ikäisiä alkio-hiiriin siirrettiin erityisiä patogeenittomia (SPF) olosuhteissa (conventionalized), ja sen jälkeen 5 viikkoa, injektoitiin i.p. 10 mg /kg kehon paino AOM (Sigma Aldrich) kerran viikossa 6 viikon ajan.

IL10

– /-

;

Myd88

– /-

hiiret ja ohjaus

IL10

– /-

hiiret (C57BL /6J /129) alla on esitetty SPF olosuhteissa ja 12 viikon iässä injektoitiin kanssa AOM edellä kuvatulla tavalla. Kaikki hiiret testattu vapaaksi helikobakteerin hepaticus ja Helicobacter pylori, kaksi tunnettua indusoijia tuumorigeneesiä

IL10

– /-

hiirissä [30].

bakteerikolonisaatiota

IL10

– /-

– ja WT hiiret olivat mono-liittyvä klo 10-12 viikon iässä letkulla ruokinta ja peräsuolen swabbing kanssa elävien bakteereiden viljellyt marsun eristetyn

Bacteroides vulgatus

. Mono-liittyvä hiiriä ylläpidetään gnotobioottisissa olosuhteissa kasvatetusta Animal Facility, University of North Carolina at Chapel Hill. Bakteerien yhdistys ja puuttuminen saastumisen muiden bakteerilajien vahvistettiin määräajoin aerobista kulttuuri ulostenäytteitä ja gramma värjäystä.

Ruumiinavaus ja kasvainhistologiaa

Kun uhri, kaksoispisteet poistettiin Umpisuoli että peräsuoli, huuhdeltiin PBS, hajavarpaiset pitkittäin ja kasvaimet laskettiin. Distal paksusuolikudos kerättiin ja jäädytettiin. Kaksoispisteet olivat Swiss-valssatut distaalisesta proksimaaliseen päähän, vahvistetaan yön yli 10% formaliiniin ja paraffiiniin upotetut. Kuusi um leikkeet valmistettiin ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla histologista analyysiä varten. Kasvaimet pisteytettiin tulehduksen ja kasvaimen.

histologinen arviointi limakalvon tulehdus suoritettiin käyttäen pisteytysjärjestelmän 0-4 luokitella aste lamina propria mononukleaaristen solujen infiltraatiota, krypta liikakasvu, pikari soluvajeeseen ja arkkitehtoninen vääristymä , kuten aiemmin on kuvattu [18]. Kasvaimet luokiteltiin heikompilaatuisen dysplasia kun ne näkyvät sekavaa epiteelin reunustavat hyperchromatic soluja ydin- pseudostratification. Kasvaimet luokiteltiin korkealaatuisesta kun ne sisälsivät back-to-back rauhaset, ydinvoiman sytoplasmiseksi suhteet, lisääntynyt ydinvoiman pleomorfisimia ja menetys solun polariteetti. Kasvaimet luokiteltiin invasiivisia karsinoomia, kun oli selvää tunkeutumista dysplastic alueen läpi muscularis limakalvon johtaen desmoplastic vastausta lähialueiden strooman. Tulehdus ja neoplastisia pisteytettiin koulutettu patologi.

immunohistokemia

Kudosleikkeitä poistettiin parafiini ksyleenillä ja rehydratoitiin luokiteltujen sarjojen läpi alkoholin pesee. Immunohistokemia fosforyloidun-Rel A (RelA 276) suoritettiin kanin polyklonaalisella vasta-ainetta laimennettuna 1:50 (Cell Signaling Technology) käyttäen Vectastain Elite Rabbit IgG Kit (Vector Laboratories). Ki67 immunohistochemisry suoritettiin seuraavasti: Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin inkuboimalla 0,3% H

2O

2 30 minuuttia. Antigeeni haku suoritettiin keittämällä osiot 7 minuuttia 0,01 M sitraattipuskurissa, pH 6,0, ja jäähdytettiin huoneen lämpötilaan 30 minuuttia. Estäminen suoritettiin 3% BSA: ta fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Ki67 monoclonoal vasta-ainetta (Dako) laimennettiin 1:200. Biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineen (Vector Laboratories) laimennettiin 1:200 1% BSA /PBS: ssä. Seuraavat vaiheet suoritettiin käyttämällä Vectastain ABC-kitti valmistajan ohjeiden mukaisesti. CTNNB1 immunohistohistochemistry suoritettiin käyttäen hiiren anti-CTNNB1 vasta-ainetta laimennettuna 1:100 (Transduction Laboratories) kanssa M.O.M. peroksidaasi kit (Vector Laboratories). Primaarisen vasta-aineen inkubointivaiheet suoritettiin yön yli 4 ° C: ssa. Visualisointi tehtiin käyttämällä 3,3′-diaminobentsidiiniä (Dako).

Reaaliaikainen PCR

RNA eristettiin distaalisen paksusuolen kudoksiin käyttämällä TRIzol menetelmää (Invitrogen, Carlsbad, CA). cDNA valmistettiin käänteiskopioinnissa 1 ug RNA käyttämällä 126 yksikköä M-MLV käänteistranskriptaasia, 1 mM dNTP ja 875 pmol satunnaisia ​​alukkeita (Invitrogen). Semi-kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR suoritettiin käyttäen Eppendorf Realplex Master Cycler. PCR-reaktio: 150 nM loppukonsentraatio eteen ja taakse alukkeita, 6 ui QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen, Valencia, CA) ja 50 ng cDNA mallin yhteensä 12 ui. Seuraavat PCR-olosuhteita käytettiin: 95 ° C, 15 minuuttia; (95 ° C, 15 sekuntia; 56 ° C, 30 sekuntia; 72 ° C, 30 sekuntia) x 40 sykliä. Spesifisyys ja lineaarisuus vahvistus jokaiselle alukesarjan määritettiin sulamiskäyräanalyysillä ja laskeminen rinne sarja laimennettuja näytteitä. Suhteellinen fold-muutokset määritettiin käyttämällä ΔΔCT laskentamenetelmää. Arvot normalisoitiin sisäisen valvonnan β-aktiini. Alukkeita:

TNFa

(5 ’ATGAGCACAGAAAGCATGATC 3’and 5’ TACAGGCTTGTCACTCGAATT 3 ’) ja

Il12p40

(5′ CACGGCAGCAGAATAAATATG 3 ’ja 5’ TTGCATTGGACTTCGGTAGA 3 ’).

tilastollinen analyysi

tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen GraphPad Prism versio 5.0a. Vertailut välillä WT ja

IL10

– /-

tai

IL10

– /-

ja

IL10

– /-

;

Myd88

– /-

hiiret analysoitiin käyttäen kaksisuuntaista paritonta t-testiä. Vertailut välillä SPF,

B. vulgatus

mono-associated ja alkio-hiiriä analysoitiin käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysiä (ANOVA). Yksittäiset vertailuja sittemmin tehty käyttäen kaksisuuntaista paritonta t-testiä. Pearsonin korrelaatio analyysi tehtiin arvioida korrelaatiota kasvainten lukumäärän ja tulehduksen vaikeusaste in AOM saaneilla WT ja

IL10

– /-

hiiriä (n = 22) käyttäen SAS (SAS Institute, Cary NC).

Kolonoskopia

Kolonoskopia suoritettiin 4, 8, 12, 16 ja 18 viikon kuluttua siirrosta hiiret sukusoluista-vapaasti SPF olosuhteissa (Fig. 1) seurata etenemistä koliitin ja kasvainten muodostumisen .

In vivo

tuumorien visualisoinnin suoritettiin käyttämällä ”Coloview System” (Karl Storz Veterinary endoskopian). Hiiret nukutettiin käyttämällä 1,5%: sta 2% isofluraania ja ~ 4 cm paksusuolen alkaen peräaukon välillä pernan flecture tehtiin näkyväksi. Menettelyt olivat digitaalisesti kirjattujen AIDAn Compaq PC.

Kiitokset

Kiitämme Maureen Bower ja Cindy Spivey The National gnotobioottisissa olosuhteissa kasvatetusta Jyrsijöiden Resource Center for heidän asiantuntija-apua mikrobittoman jyrsijä tekniikkaa. Tekijät haluavat kiittää Amber McCoy Center for Ruoansulatuskanavan Biology and Disease (CGIBD) Histologia Core Facility apua histologisia käsittelyyn.