Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA, ei-koodaavan 20- 22 nukleotidin yksijuosteisen RNA: t, aiheuttaa translaation tukahduttamisen tai hajoamista ja geenien niiden kohdegeenien, ja merkittävästi lisää geenin ilmentymisen säätelyyn. Nykyisessä tutkimuksessa raportoimme, että miR-182 ilmentyminen oli merkittävästi voimistunut eturauhassyövässä kudoksissa ja neljä solulinjoissa, verrattuna eturauhasen hyvänlaatuinen liikakasvu kudosten ja normaalin eturauhasen epiteelin (RWPE-1) soluissa. Kohdunulkoinen yli-ilmentymisen miR-182 merkittävästi edistää leviäminen, lisää invaasio, edistää G1 /S solusyklin siirtymistä ja vähentää varhaisen apoptoosia PC-3-solut, kun taas tukahduttaminen miR-182 vähensi leviämisen ja invaasion, estää G1 /S solusyklin siirtyminen ja kasvu varhainen apoptoosia PC-3-solut. Lisäksi osoitimme, että miR-182 voisi downregulate ilmaus NDRG1 suoraan kohdistamalla NDRG1 3′-alue. Lopuksi tulokset viittaavat siihen, että miR-182 on tärkeä rooli lisääntymisessä ihmisen eturauhasen syöpäsolujen suoraan estämällä kasvaimen Supressor geenin NDRG1. Olemme paljastui uusi epigeneettisellä sääntelyä NDRG1.

Citation: Liu R, Li J, Teng Z, Zhang Z, Xu Y (2013) yli-ilmentyy MicroRNA-182 Edistää leviämisen ja invaasion in Eturauhassyöpä PC-3-solujen Down-sääntely N-myc Loppupään Säännellyt Gene 1 (NDRG1). PLoS ONE 8 (7): e68982. doi: 10,1371 /journal.pone.0068982

Editor: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu 7 huhtikuuta, 2013 Hyväksytty: 8. kesäkuuta 2013. Julkaistu: 16 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (nro: 30800226), Tianjin Kunnan Science and Technology komissio (nro: 12ZCDZSY17200) ja toinen sairaalan Tianjin Medical University (nro: Y1003). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on edelleen yksi suurimmista terveysongelmista ikääntyvän miehen, arviolta 238590 uutta tapausta ja 29720 syöpään liittyvien kuolemien odotetaan vuonna 2013 pelkästään Yhdysvalloissa [1]. Vaikka kiinalaiset miehet kuuluvat alhaisen riskin ryhmään, jolla PCA esiintyvyys ja kuolleisuus ovat lisääntyneet merkittävästi johtuen väestön ikääntymisestä, muutokset elintavoissa ja muut syyt. Eturauhassyövän on tullut yksi yleisimmistä pahanlaatuisten kasvainten miehillä maailmanlaajuisesti, jossa voimakkaasti vaihteluista taudin etenemiseen ja hoitovaste. Jos kasvain rajoittuu eturauhasen, potilaita voidaan hoitaa kirurginen poisto kasvain tai säteilyn, joilla on korkea teho. Sitä vastoin hoito löyhän kasvaimia on yhä suuri ongelma. Standard hoitoa näille potilaille on antiandrogens saavuttaa yhteensä androgeenien saarto [2]. Valitettavasti että kasvainten edistymistä ja siten kiertää hoito on hyvin yleinen tapahtuma ja ei ole tehokkaita hoitoja kastraatio resistenttejä PCa (CRPC) potilasta, vaikka urologi yrittävät käyttää kemoterapeuttisia. Vaikka sekä geneettiset ja ympäristötekijät pidetään tärkeimmistä tekijöistä, molekyylimekanismeja Eturauhassyövän kehittymisen ja etenemisen edelleen suurelta osin unknown.Therefore, parempi ymmärtäminen synnyssä Eturauhassyövän ja tutkimalla uusia intervention tavoitteita PCA kiireesti vaativiin tehtäviin.

MikroRNA (miRNA) ovat ryhmä pieniä (noin 20-22 nukleotidia) endogeenisten ei-koodaavaa RNA: iden. Aikuinen miRNA säätelemään negatiivisesti niiden kohdegeenien kautta epätäydellinen komplementaarinen sekvenssi pariliitoksen 3’alue (UTR) kohdegeenien johtaa joko mRNA: n hajoamisen tai translaation tukahduttaminen. Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että poikkeava ilmentyminen miRNA liittyy läheisesti leviämisen, invaasio, etäpesäke ja ennusteen erilaisten syöpien, kuten PCA rintasyövän, gliooman ja keuhkosyövän [3] – [6]. Eturauhassyövän eteneminen liittyy muuttunut ilmentyminen useiden onkogeenien ja tuumorisuppressoreilla, ja miRNA saattavat säädellä näitä geenejä; kuitenkin, suhdetta miRNA ja PCa on vasta alkanut valaistaan ​​viime vuosina [7]. Yli 50 miRNA raportoidaan osallistuvan PCa; kuitenkin, useimmat nykyiset tiedot osoittavat, että vain pieni osa niistä liittyy patogeneesiin PCa [8]. Enemmän miRNA tulisi valita ja tutkia, jotta voidaan paremmin ymmärtää etenemistä PCa.

Toistaiseksi useita artikkeleita tutkittu miRNA ilmaisun PCA näytteissä, mutta tulokset olivat erittäin epäjohdonmukaisia ​​[9] – [15]. Ei miRNA mikrosirujen havaitsemiseen tulokset raportoitiin kiinalaisesta PCa näytteistä toistaiseksi. Nykyisessä tutkimuksessa, ensin seulotaan miRNA liittyvät PCa mukaan miRNA mikrosiruja, ja mukaan alustavien tulosten, huomasimme, että microRNA-182 (miR-182) yliekspressoitui PCA kudoksissa. Osoittivat, että miR-182 voisi edistää -melanoomaetäpesäkemallilla mukaan tukahduttaa FOXO3 ja mikroftalmia liittyvä transkriptiotekijä [16], puolestaan, miR-183-96-182 klusteri on yli-ilmentynyt eturauhaskudoksessa ja voi säädellä sinkin homeostaasin eturauhasen soluissa [17]. MiR-182 ajateltiin olevan tärkeä oncomiR. Kuitenkin miR-182 voisi suppresse keuhko kasvaimen kehittymisen kautta alas säätely RGS17 ilmentymisen in vitro [18]. Lisäksi uusi tutkimus osoitti, että miR-182 ja microRNA-200a voisi valvoa G-proteiinin alayksikön alfa-13 (GNA13) ilmaisun ja solujen invaasiota synergistisesti PCA soluissa [19]. Nämä epäjohdonmukainen tulokset osoittavat, että toiminta miR-182 on monimutkainen ja lisätutkimusta tarvitaan. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että miR-182 edistänyt PCa PC-3-solujen lisääntymistä ja hyökkäyksen välittömänä päämääränä on 3′-UTR N-myc alavirtaan säännelty geenistä 1 (NDRG1, NM_006096.3) mRNA. Tuloksemme viittaavat siihen, että miR-182 voi olla tärkeä rooli kehityksen ja etenemisen PCa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tutkimus hyväksynyt eettinen aluksella toisen sairaalan Tianjin Medical University. Kaikki näytteet saatiin potilailta, jotka allekirjoittivat tietoisen suostumuksen hyväksymisestä käyttöä kudoksiin tutkimustarkoituksiin leikkauksen jälkeen.

eturauhasessa Näytteet

Viisi PCa kudokset kerättiin sen jälkeen eturauhasen laitoksella of Urology sairaalan välillä tammikuussa 2010 ja joulukuu 2012. kukaan potilaista oli saanut neoadjuvant hormonihoidon ennen leikkausta. Kolme eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun (BPH) kudokset kerättiin jälkeen suprapubic enucleation eturauhasen. Tuore eturauhaskudoksiin otettiin näytteet heti kirurgisen poiston gland.These näytteet jäädytettiin välittömästi nestemäisessä typessä ja käytettiin miRNA microarray kokeiluja. Diagnostinen H 2 tai -2 ja P-arvot 0,05 (t-testi) katsottiin ilmentyvät eri miRNA. Reaaliaikainen RT-PCR käytettiin vahvistusta joidenkin ilmentyvät eri miRNA.

Cell Culture

Ihmisen PCa solulinjat LNCap, PC-3, DU145, 22Rv1 ja normaalissa eturauhasessa epiteelisolulinja RWPE-1 saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) ja pidettiin laboratoriossamme. Soluja viljeltiin RPMI-1640 (Gibco), jota oli täydennetty 10% naudan vasikan seerumia ja penisilliiniä (100 U /ml). Viljelmiä ylläpidettiin atmosfäärissä, joka sisälsi 5% CO

2.

Yhteensä RNA ja Reaaliaikainen RT-PCR

Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä Trizol reagenssia (Invitrogen, CA, USA ). cDNA syntetisoitiin käyttämällä M-MLV MicroRNA Reverse Transcription Kit (Promega, USA). Reaaliaikainen RT-PCR suoritettiin SYBR® Esisekoite Ex Taq ™ (TaKaRa, Biotech Co., Ltd, Dalian, Kiina). RT primeri miR-182 oli 5’GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACAGTGTGA -3 ’, PCR Mir-182 oli 5′-TGCGGTTTGGCAATGGTAGAAC-3′ (eteenpäin), 5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3 ’(reverse). Ilmaisu taso normalisoituivat U6. RT primeri U6 oli 5’- GTCGTATCCA GTGCAGGGTCCGAGG TGCACTGGATACGACAAAAT ATGG -3 ’PCR primeri U6 oli 5’TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC -3’ (eteenpäin), 5’CCAGTGCAGGGTCCGAGGT -3 ’(taaksepäin). PCR suoritettiin seuraavissa olosuhteissa: 94 ° C: ssa 4 minuutin ajan, minkä jälkeen 40 sykliä 94 ° C: ssa 30 s, 50 ° C: ssa 30 s ja 72 ° C: ssa 40 s. Kukin näyte ajettiin kolmena kappaleena.

Western-blottaus

Western blottaus suoritettiin sen määrittämiseksi NDRG-1-proteiinin ilmentymisen. Kaikki proteiinit erotettiin 8% SDS-denaturoitua polyakryyliamidigeelissä ja siirrettiin sitten nitroselluloosakalvolle. Membraaneja inkuboitiin estopuskurilla 90 minuuttia huoneen lämpötilassa ja sitten inkuboitiin vasta-aineen kanssa vastaan ​​NDRG-1 tai Beta-tubuliinin kanssa Blotto yön yli 4 ° C: ssa. Membraanit pestiin ja niitä inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta. Proteiinin ilmentyminen arvioitiin parannettu kemiluminesenssin ja altistuminen kemiluminesenssi elokuva. Labworks kuva hankinta ja analyysi ohjelmisto (UVP, LLC) käytettiin määrittämään kaistaintensiteettejä. Kaikki vasta-aineet hankittiin Saier Biotechnology (Tianjin, Kiina).

Cell transfektio

Transfektiot suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA, USA) valmistajan protokollan. Lyhyesti, PC-3-solut maljattiin kuudessa-kuoppalevyille ja kasvatettiin ilman antibiootteja 60-80% konfluenssiin. Jokainen hyvin vastaan ​​10 ui lipofektamiinireagenssia ja 50 pmol synteettistä miR-182 matkii (GenePharma Co., Ltd, Shanghai, Kiina), synteettiset negatiivinen kontrolli miRNA (miR-182 jäljittelee-NC), synteettinen miR-182-estäjän sekvenssin tai synteettinen miR-182-estäjän negatiivinen kontrolli (miR-182 estäjä-NC). Sekvenssit miR-182 jäljittelee, miR-182 jäljittelee-NC, miR-182-estäjän ja miR-182 estäjä-NC on esitetty taulukossa 1. Kaikki matkii ja inhibiittorit leimattiin FAM (karboksifluoreseiini). Kuusi tuntia transfektion jälkeen, PC-3-solujen havaittiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia ja seerumivapaassa väliaine vaihdettiin täydelliseen alustaan.

MTT-määritys

PC-3-solut transfektoitiin joko asennuspalveli- 182 jäljittelee tai miR-182 jäljittelee-NC, tai miR-182-inhibiittorin ja miR-182-inhibiittori-NC maljattiin 96-kuoppalevyille 1 x 10

4 solua /kuoppa. Elävät solut mitattiin 1, 2, 3, 4, ja 5 päivää sen jälkeen, kun pinnoitus. Inkubaation jälkeen 3- (4, 5- dimethylthiazolyl-2) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT), solut hajotettiin 150 ml: ssa 100%: iin dimetyylisulfoksidia (DMSO) ja UV-näkyvä absorbanssi luettiin 490 nm: ssä käyttäen 96-kuoppaisen levyn lukijaa. Kukin näyte ajettiin kolmena kappaleena.

Cell Cycle Analysis

PC-3-solut transfektoitiin joko miR-182 jäljittelee tai miR-182 jäljittelee-NC tai miR-182-estäjän ja asennuspalveli- 182-inhibiittori-NC kerättiin 72 h transfektion jälkeen, pestiin kylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja kiinnitettiin 1 ml 70% etanolia. Sen jälkeen kun oli inkuboitu yön yli 4 ° C: ssa etanolissa, solut pestiin PBS: ssä ja suspendoitiin 500 ml: aan propidine jodidi (PI) 30 minuuttia ennen virtaussytometrialla. Populaatiot G0-G1, S ja G2-M vaihe mitattiin virtaussytometrialla (BD Biosciences, USA) ja tiedot analysoitiin käyttämällä Multicycle-DNA Cell Cycle Analysoitiin software.The mittaus suoritettiin kolmena kappaleena.

Detection of Cell Early apoptoosin

PC-3-solut transfektoitiin joko miR-182 jäljittelee tai miR-182 jäljittelee-NC tai miR-182-estäjän ja miR-182 estäjä-NC kerättiin ja kiinnitettiin 70% etanolia varhaisten apoptoosin. Värjäys soluissa suoritettiin ohjeiden mukaisesti anneksiini V-R-PE-solujen apoptoosia detektioreagenssipakkaus (SouthernBiotech, USA). Virtaussytometria (BD Biosciences, USA) käytettiin havaitsemaan prosenttiosuus alussa apoptoosin. Mittaus suoritettiin kolmena kappaleena.

Transwell Cell Invasion määritys

PC-3-solut transfektoitiin joko miR-182 jäljittelee tai miR-182 jäljittelee-NC, tai miR-182-inhibiittorin ja miR -182 estäjä-NC kerättiin. 5 x 10

4 PC-3-solut sijoitetaan ylempään kammioon kunkin insertin päällystetty 50 ui 2 mg /ml matrigeelin (kasvutekijä pienentää BD MatrigelTM matriisi), ja 600 ui RPMI 1640 20% FBS lisättiin alaosan kammion. Inkuboimisen jälkeen 24 tuntia, kammiot purettiin, ja kalvot värjättiin 2% kristalliviolettiliuoksella 15 minuutin ajan ja asetettiin lasilevylle. Sitten solut, jotka olivat vaeltaneet kalvon läpi laskettiin viidessä satunnaisesti näkökentän valomikroskoopilla. Kaikki määritykset suoritettiin kolme itsenäistä kertaa kolmena kappaleena.

miRNA tavoitteet Prediction

Oletettu miRNA tavoitteet ennustettiin käyttämällä TargetScan (https://www.targetscan.org/vert_50/), miRBase (https://www.mirbase.org/index.shtml), ja PicTar (http: //pictar.mdc – berlin.de/) algoritmit.

Plasmidin Hakemisto Rakentaminen

PmirGLO- Dual-lusiferaasireportteri- vektori (7350 bp, Promega, Madison, WI, USA) käytettiin vahvistamaan toiminto oletetun miR-182 sitoutumiskohta NDRG1 3′-UTR. Mukaan mahdolliset miR-182 sitovan sekvenssin NDRG1 3′-UTR, kaksinkertainen – kerrattu sekvenssi saatiin pariuttamalla käyttämällä kahta yksittäisten juosteiden NDRG1-Top, (NheI) 5′-CTAGCTAGCGGCCGCTAGT CCTC AGAGAC ACCAAACTGCCAAAAG- 3 ’; NDRG1-Bot (Sall) 5’-TCGACTTTTGGCA GTTTGGTGTC TCTGAGG ACTAGCGGCCGCTAG- 3 ’, ja sitten kloonattiin Nhel /SalI-kohtiin pmirGLO-Dual-lusiferaasireportterilla vektori. Hehkutus suoritettiin: 95 ° C 5 min ja huoneenlämpötilassa 2 tuntia. Rekonstruoitu plasmidi varmistettiin restriktioendonukleaasipilkkomisella ja sekvensointi, ja se nimettiin pmirGLO /NDRG1-UTR.

Dual Luciferase Reporter Gene Assay

PC-3-solut jaettiin viiteen ryhmään sen mukaan, eri transfektio sisältö: a: (tyhjä) pmirGLO /NDRG1-UTR; b: pmirGLO /NDRG1-UTR + miR-182 estäjä-NC; c: pmirGLO /NDRG1-UTR + miR-182-estäjä; d: pmirGLO /NDRG1-UTR + miR-182 jäljittelee-NC; e: pmirGLO /NDRG1-UTR + miR-182 jäljittelee. PC-3-soluja ympättiin kolmena rinnakkaisena 96-kuoppalevyillä, annetaan laskeutua 24 tuntia ja sitten ko-transfektoitiin eri sisällön käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA, USA). Lusiferaasi ja Renilla aktiivisuus mitattiin 48 h transfektion jälkeen käyttäen Dual LuciferaseReporter Assay Kit (Promega) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kolme itsenäistä koetta suoritettiin, ja tulokset on esitetty keskiarvona ± SD. Lusiferaasiaktiivisuus arvot normalisoitu Renillaa aktiivisuuden suhteellisen kevyt yksikkö (RLU).

Tilastollinen analyysi

kaksisuuntaisella Studentin t-testiä käytettiin arvioimaan merkitystä erot kahden ryhmien

P

arvojen 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

MiR-182 oli yläreguloituja PCa Kudokset

Kun ensisijainen miRNA mikrosiruanalyysi, PCA kudoksissa viisi miRNA (miR-345, miR-145, miR-221, miR-27b ja miR-378) oli alassäädetty ja kaksikymmentäkaksi miRNA oli säädelty (kuvio 1). MiR-182 oli säädelty kanssa kertainen muutos 6.14 ja vahvistaa vielä reaaliaikaisen RT-PCR kertainen muutos 5,70. Koska merkittävin ilmentyvät eri miRNA välillä PCa ja BPH kudoksissa, miR-182 valittiin jatkotutkimuksiin. Kaikki ilmentyvät eri miRNA nähtiin taulukossa S1.

PCA kudoksissa, viisi miRNA olivat alassäädetty ja kaksikymmentäkaksi miRNA oli sääteli. miRNA-182 oli säädelty kanssa kertainen muutos 3,07 ja vahvistaa vielä reaaliaikaisen RT-PCR kertainen muutos 2,85.

MiR-182 oli yläreguloituja PCa Cell Lines

Reaaliaikainen RT-PCR-analyysi paljasti, että miR-182-ekspressio lisääntyy selvästi neljä yhteistä PCa testatuissa solulinjoissa (PC-3, DU145, 22Rv1 ja LNCaP), verrattuna normaaliin eturauhasen epiteelin RWPE-1-solu, joka osoittaa, että miR -182 esiintyminen lisääntyy PCa solulinjoissa ja PC-3 on korkein ekspression taso (kuvio 2). Sitten PC-3-solut valittiin lisätutkimuksia varten.

Reaaliaikainen RT-PCR osoittavat, että suhteellinen ilmentymistaso PC-3-solujen on korkein neljään eturauhassyövän solulinjoissa ja RWPE-1 on alhaisin ilmaisun tasolla. Arvot edustavat keinot kolmesta erillisestä kokeesta ja virhepalkit edustavat SD.

MiR-182 Expression taso on muuttunut merkittävästi sen jälkeen, kun Transfektio Mimics tai estäjät

MiR-182 ekspressiotason havaittiin reaaliaikaisella RT-PCR transfektion jälkeen jäljittelee tai estäjien PC-3-solut. Tulokset osoittivat, että jäljittelee tai inhibiittorit tehokkaasti transfektoida (kuva 3) ja lauseke taso on korkein miR-182 jäljittelee ryhmä ja pienin miR-182 estäjä ryhmä (kuva 4). Nämä tulokset osoittivat, että nämä jäljittelee tai inhibiittorit voivat jäljitellä tai estää miR-182 tehokkaasti.

Tulokset osoittavat, että transfektio määrä on yli 80%. Kuvat ovat ja satunnaisesti valitut kentät näytetään.

Blank esittelee nollakoe. Tulokset osoittavat, että ilmentymistaso on korkein miR-182 jäljittelee ryhmä ja pienin miR-182 estäjä ryhmä. Arvot edustavat keinot kolmesta erillisestä kokeesta ja virhepalkit edustavat SD.

yli-ilmentyminen miR-182 Edistää leviämisen PC-3 solujen

Tutkiakseen toiminta asennuspalveli- 182 PCA, transfektoimme miR-182 jäljittelee tai inhibitros osaksi PC-3 PCa solujen ja mitatun solujen lisääntymistä. Käyttämällä MTT määrityksiä, havaitsimme, että kasvuvauhti miR-182 yliekspressoivia solujen lisääntynyt dramaattisesti verrattuna miR-182 jäljittelee -NC-transfektoiduissa soluissa (

P

0,05). Päinvastoin, kun downregulation miR-182 toimesta inhiobitor, kasvuvauhti PC-3-soluissa dramaattisesti laski verrattuna miR-182 estäjä -NC-transfektoiduissa soluissa (

P

0,05) (kuvio 5). Nämä tulokset osoittivat, että ylössäätely miR-182 edistää leviämisen PC-3-solut.

Blank esittelee nollakoe. UV-näkyvä-absorbanssi mitattiin 490 nm: ssä. Suhteellinen absorbanssi oli merkitsevästi erilainen 3 vuorokauden kuluttua transfektiosta (

P

0,05). Arvot edustavat keinot kolmesta erillisestä kokeesta.

yli-ilmentyminen miR-182 Edistää G1 /S Cell Cycle Transition in PC-3 solujen

tutki tarkemmin vaikutusta miR-182 proliferaatioon käyttämällä virtaussytometria. MiR-182-yliekspressoivassa PC-3-soluja oli huomattavasti alhaisempi prosenttiosuus solujen G0 /G1 vaiheeseen ja lisääntynyt prosenttiosuus solujen S-vaiheeseen verrattuna miR-182 jäljittelee-NC- transfektoiduissa soluissa. Päinvastoin, kun downregulation miR-182 toimesta inhiobitor, PC-3-soluja oli huomattavasti suurempi prosenttimäärä solujen G0 /G1 vaiheeseen ja laski prosenttiosuus solujen S-vaiheeseen verrattuna miR-182-estäjän NC- transfektoiduissa soluissa (kuvio 6). Tämä tiedot osoittivat, että yli-ilmentyminen miR-182 voisi edistää G1 /S solusyklin siirtyminen, ja voi näin ollen lisätä leviämisen PC-3-solut.

Blank esittelee nollakoe. Arvot edustavat välineet kolmesta erillisestä kokeesta ja virhepalkit edustavat SD. (*

P

0,05).

yli-ilmentyminen miR-182 Vähentää Early apoptoosia PC-3 solujen

tutkia mahdollisuutta säätelevä osallistumista miR -182, varhainen apoptoosi PC-3-soluja havaittiin transfektion jälkeen. Tulokset osoittivat, että varhainen apoptoosin määrä miR-182 yliekspressoivia solujen dramaattisesti vähentynyt verrattuna miR-182 jäljittelee-NC-transfektoiduissa soluissa. Päinvastoin, kun downregulation miR-182 toimesta inhiobitor, varhainen apoptoosin määrä PC-3-solujen lisääntynyt dramaattisesti verrattuna miR-182-inhibiittori-NC-transfektoiduissa soluissa (kuvio 7). Nämä tulokset osoittivat, että ylössäätely miR-182 vähentää alussa apoptoosin PC-3-soluja.

Blank esittelee nollakoe. Tulokset osoittavat, että varhainen apoptoosin määrä on pienin miR-182 jäljittelee ryhmä ja korkein miR-182 estäjä ryhmä (*

P

0,05, **

P

0,01) . Kuvat ovat näytettiin ja varhaisen apoptoosin solut viitenumerolla Q4 (LR) alue.

yli-ilmentyminen miR-182 Lisäykset Invasion PC-3 solujen

yli-ilmentyminen miR-182 merkitsevästi lisäsi invasiivisia potentiaalia PC-3-soluja, kun transfektoitu miR-182 jäljittelee verrattuna kontrolli solujen Transwell määrityksessä Matrigel, ja transfektoidut solut miR-182-estäjän johti merkittävästi, pienenee invasiivisia mahdollisia (kuvio 8). Nämä tiedot viittaavat siihen, että miR-182 lisää hyökkäyksen PC-3-solujen

in vitro

.

Invasion määritykset suoritettiin PC-3-solut transfektoitiin miR-182 jäljittelee tai inhibiittorit. Blank esittelee nollakoe. Kuvat ovat ja satunnaisesti valitut kentät näytetään (*

P

0,05, **

P

0,01).

tunnistaminen miR-182 Sidonta sivustoja NDRG1 3′-UTR alue

Kun ennustus online miRNA tavoitteet työkaluja, monet otaksuttu geenejä ennustettiin. Genes liittyvät soluproliferaation apoptoosin, invaasio ja metastaasi valittiin, mukaan lukien NDRG1. Lisäksi olemme havainneet, että NDRG1 oli etäpesäke Supressor geenin [21] – [25], tai kasvainsuppressorigeenin [26], ja NDRG1 oli tarpeen, p53-riippuvaista apoptoosia [27]. Tutkimuksemme osoittivat myös, että NDRG1 säädeltiin vähentävästi PCA kudosten ja PC-3-soluja verrattuna BPH kudosten ja RWPE-1-soluissa (tietoja ei esitetty). Lopuksi, NDRG1 valittiin jatkotutkimuksiin. Seuraavaksi havaittiin, että NDRG1 3′-UTR alue on vain yksi erittäin konservoitunut miR-182 sitoutumiskohtia (kuvio 9).

NDRG1 3′-UTR alue on vain yksi erittäin konservoitunut miR-182 sitoutumiskohtia jälkeen bioinformatiikan analyysi.

MiR-182 Suoraan tavoitteet etäpesäke Supressor Gene NDRG1 PC-3 solujen

Western-blottaus tulokset osoittivat, että yli-ilmentyminen miR-182 PC-3-solujen vähensi -proteiinin ekspressiotasot NDRG1 transfektion jälkeen miR-182 jäljittelee verrattuna miR-182 jäljittelee -NC-transfektoiduissa soluissa. Päinvastoin, kun downregulation miR-182 toimesta inhiobitor, proteiinin ekspressiotasot NDRG1was kasvanut dramaattisesti verrattuna miR-182-inhibiittori-NC-transfektoiduissa soluissa (kuvio 10), mikä osoittaa, että NDRG1 on mahdollinen miR-182 kohdegeenin.

Blank esittelee nollakoe. Yli-ilmentymisen miR-182 vähensi merkittävästi proteiinin ekspressiotasot NDRG1 ja downregulation miR-182 kasvanut dramaattisesti proteiinin ekspressiotasot NDRG1 (*

P

0,05, **

P

0,05, **

P

0,01).

keskustelu

viime vuosina satoja miRNA on osoitettu tärkeitä rooleja geenin ilmentymisen säätelemiseksi kautta mRNA: n hajoaminen tai tukahduttaminen kääntämisen eri mallin järjestelmien [28] – [29]. Todisteet viittaavat siihen, että miRNA voi toimia uuden luokan sekä tuumorigeenisiä ja kasvaimen estäviä geenejä [30]. Tässä tutkimuksessa ensin valmisteltu kymmenen PCa näytettä ja kymmenen BPH näytteet, kuitenkin vain viisi PCa näytettä ja kolme BPH näytteet täyttivät seulonta standardin mikrolevytesti. Jälkeen miRNA mikrosiruanalyysi ja reaaliaikaisen RT-PCR-vahvistus, olemme osoittaneet, että miR-182 on yliaktiivista Kiinan PCa kudoksissa verrattuna BPH kudoksiin. Säätely tulos miR-182 oli yhdenmukainen tutkimuksessa Schaefer A. et al [14]. Sitten kävi ilmi, että miR-182 ilmentyminen oli merkittävästi lisääntynyt neljä yhteistä PCa tutkituissa solulinjoissa (PC-3, DU145, 22Rv1 ja LNCaP), verrattuna normaaliin eturauhasen epiteelin RWPE-1 solun, mikä osoittaa, että miR-182 on yliaktiivista PCa solussa linjat ja PC-3 on korkein ekspressiotaso. Sitten PC-3-solut valittiin lisätutkimuksia varten. Seuraavaksi todistaa, että miR-182 kohdistuu erityisesti NDRG1 3′-UTR PC-3-solut.

Aiemmat tutkimukset osoittivat, että NDRG1 oli etäpesäke Supressor geeni tai tuumorisuppressorigeeniä Eturauhassyövän [21], [24] , [25]. Tutkimuksemme osoittivat myös, että NDRG1 säädeltiin vähentävästi PCA kudosten ja PC-3-soluja verrattuna BPH kudosten ja RWPE-1-soluissa (tietoja ei esitetty). Lisäksi toiminnallinen koe osoitti, että downregulation NDRG1 voisi lisätä leviämisen ja invaasion PC-3-soluja, ja säätelyä NDRG1 voisi vähentää leviämisen ja invaasion PC-3-soluja (tietoja ei esitetty). Tutkimukset osoittivat, että molekyylin säätely NDRG1 invovles PTEN [21], [26], P21 [22], Wnt-β-kateniinin [23], aktivoiva transkriptiotekijä 3 [24], ATF3-NF kappaB kompleksin [25] ja p53 [27]. Kuitenkin, ei ollut raportin NDRG1 säädellään microRNA PCA edistää leviämisen selvästi ja suoraan vielä. Se on ensimmäinen meille paljastaa uuden suhteen sääntelyn NDRG1 ja mikroRNA PCA. Havaitsimme, että miR-182 oli merkittävästi yli-ilmentynyt PCa solulinjoissa, verrattuna RWPE-1. Lisäksi kohdunulkoinen yliekspressio miR-182 merkittävästi edistää leviäminen, lisää invaasio, edistää G1 /S solusyklin siirtymistä ja vähentää varhaisen apoptoosia PC-3-solut, kun taas tukahduttaminen miR-182 vähensi leviämisen ja invaasion, estää G1 /S solusyklin siirtyminen ja kasvu varhainen apoptoosia PC-3-solut. Jotta tutkia mekanismi miR-182, tunnistimme NDRG1 otaksutuksi miR-182 kohdegeenin avulla bioinformatiikka analyysin, ja vahvisti, että NDRG1 on välittömänä kohteena miR-182 by dual lusiferaasireportterigeenillä määrityksessä. Nämä tulokset osoittivat, että miR-182 lisää leviämisen ja invaasion PCa PC-3-soluista suoraan kohdistamalla NDRG1 3′-UTR säädellä vähentä- västi NDRG1.

Viime vuosina NDRG1 on kuvattu mahdollinen tuumorisuppressori geenin eri ihmisen syövissä, ja ne voivat liittyä kasvaimen aggressiivisuus ja etäpesäkkeiden [31] – [34]. Kuitenkin hiljentäminen mekanismilla on NDRG1 ole vielä selvää. Yksi tapa, jolla syöpäsolut hiljentää tuumorisuppressorigeeniä ilmentymisen ovat epigeneettiset muutokset, jotka sisältävät DNA hypermetylaatiota promoottorin CpG-saarekkeiden ja /tai muutokset liittyvät translaation jälkeiset histoni muutoksia, jotka johtavat transkription tukahduttaminen [35]. Promoottori of NDRG1 sisältää suuren CpG-saarekkeen, nostamalla mahdollisuus, että se voisi vaiennetaan DNA hypermetylaation syövässä. Siksi tutkijat alkavat tutkia epigeneettiset sääntelyn NDRG1 äskettäin. Angst et al [36] Tutkimus osoitti, että NDRG1 ilmaisua voidaan säädellä farmakologisen estämällä DNA metylaatio ja histonien deasetylaatiolla haiman syöpäsoluja. Ei kuitenkaan metylaation CpG saari NDRG1 promoottorin todettiin haiman syöpäsoluja, mikä viittaa epäsuora mekanismi NDRG1 de-tukahduttamisen näitä hoitoja. Li ja Chen [37] Tutkimus osoitti, että vaiennettaisi NDRG1 vuonna koolonsyöpäsolulinjaa SW620 ja SW480 johtui histonimodifikaation, muut kuin promoottori hypermetylaation. Kuitenkin, Chang et ai [38] Tutkimus osoitti, että vähentynyt ilmentyminen NDRG1 mRNA: ta ja proteiinia, mahasyövän solulinjoissa ja kudoksissa johtui metylaatio NDRG1-geenin promoottorin. Nämä tutkimukset viittaavat siihen, että epigeneettiset sääntelyn NDRG1 on erilainen erityyppisissä syöpäsoluja. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että NDRG1 voitaisiin suoraan kohdistaa miR-182 ja paljastui uusi epigeneettisellä sääntelyä NDRG1, mikä viittaa siihen, että säätelyä miR-182 voi tarjota vaihtoehtoisen mekanismin alennettu ilmentyminen NDRG1 tuumorisuppressoriproteiinia PCA soluissa .

Lisätutkimuksia tarvitaan vielä tutkittava, onko muuta miRNA tai signaalinvälitysreittien voi säädellä NDRG1 PCA, koska emme voineet sulkea pois, että saattaa olla muita MikroRNA, ei vielä löytynyt, tärkeä rooli säätelyssä NDRG1 PCA, ja onko miR-182 voidaan kohdistaa muiden jäsenten NDRG1 perheen. Esimerkiksi olisi mielenkiintoista tietää, onko muita reittejä ovat mukana antiproliferatiivinen vaikutus NDRG1 ja tutkia, mitä muita komponentteja pahanlaatuisen fenotyypin määräytyvät NDRG1 ja miRNA PCA soluissa, ja nämä asiat ovat parhaillaan lisätutkimuksia meidän laboratorio.

Johtopäätökset

Yhteenvetona keskeinen havainto nykyisessä tutkimuksessa on, että miR-182 voi lisätä leviämisen PCa solulinjojen kohdistamalla NDRG1. Nämä tiedot osoittavat, että miR-182 on keskeinen rooli sääntelyn Eturauhassyövän solujen lisääntymistä ja voi toimia kuin onkopsykologista miRNA. MiR-182 voi katkaista uutena terapeuttisena kohteena hoitoon PCa.

tukeminen Information

Taulukko S1.

Differentially ilmaisi miRNA välillä PCa ja BPH kudoksiin. Bold Mirs oli vaimentua MIRS PCA kudoksissa.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0068982.s001

(DOC) B