Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Withaferin A, joka on luonnosta peräisin steroideihin laktoni, on havaittu estävän angiogeneesiä ja etäpesäkkeiden erilaisissa kasvainmalleissa. On myös tunnustettu eri ryhmien näkyvä antikarsinogeenisiä rooleja. Huolimatta näistä tutkimuksista on withanolides, niiden yksityiskohtainen anti-metastaattisen vaikutusmekanismia jäi tuntemattomaksi. Nykyinen tutkimus on valmis käsittelemään koneen mukana hyökkäystä asetuksessa vakaa johdannainen Withaferin A, 3-atsido Withaferin A (3-azidoWA) ihmisen kohdunkaulan HeLa ja eturauhasen PC-3-solut.

menetelmät ja Principal havainnot

Sub-myrkyllinen pitoisuus 3-azidowithaferin A (3-atsido WA) esti syöpäsolujen liikkuvuutta ja hyökkäyksen haavan paranemista ja Boyden kammion invaasio tukahduttamalla MMP-2 aktiivisuus gelatiinitsymografialla ja sen ilme on osoittautunut olla merkittävä este chemo-herkkyyden. Olemme paljastunut uusi mekanismi 3-azidoWA aiheuttama solunulkoisen proapoptoottisten ehdokas tuumorisuppressoriproteiinia Par-4-proteiinin stimulaation elatusaineessa ja myös huomannut samanaikaista merkitty väheneminen Pakt ja Perk signalointi immunoblot-analyysillä. Lisäksi meidän zymografian tulokset viittaavat 3-azidoWA aiheuttama MMP-2 esto välittyvät sekretorisen Par-4. Apoptoosin 3-azidoWA voinut palauttaa MMP-2 gelatinaasiaktiivisuutta. Tämän lisäksi, meidän

in vivo

eläinkokeissa tiedot osoittivat 3-azidoWA kumottiin uudissuonimuodostusta annoksesta riippuvaisia ​​tavalla hiiren Matrigel pistoke määrityksessä.

Päätelmä /merkitys

Tästä raportti, huomasimme, että 3-azidoWA tukahdutetaan liikkuvuutta ja hyökkäys HeLa ja PC-3-solujen MMP-2 riippuvaisella tavalla. Meidän

in vitro

tulos viittaa vahvasti siihen, että osa-myrkylliset annokset 3-azidoWA parannettu eritystä ekstrasellulaarisen Par-4, joka poisti erittävien MMP-2: n ilmentymisen ja aktiivisuuden. Ehtyminen eritys- Par-4 kunnostettu MMP-2 ilmaisun ja hyökkäyksen kykyä HeLa ja PC-3-solut. Edelleen, meidän havainnot hiljaista, että 3-azidoWA heikennettyjä sisäinen fosfo-ERK ja fosfo-Akt ilmentymisen annoksesta riippuvaisella tavalla saattaa avainasemassa estymiseen hiiren angiogeneesin 3-azidoWA.

Citation: Rah B, amin H, Yousuf K, Khan S, Jamwal G, Mukherjee D, et al. (2012) romaani MMP-2 Inhibitor 3-azidowithaferin A (3-azidoWA) kumoaa syöpäsoluinvaasiota ja angiogeneesin Moduloiva Solunulkoisilla Par-4. PLoS ONE 7 (9): e44039. doi: 10,1371 /journal.pone.0044039

Editor: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 23, 2012; Hyväksytty: 01 elokuu 2012; Julkaistu: 04 syyskuu 2012

Copyright: © Rah et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Solunulkoisilla eritysreiteille katsotaan pelata keskeinen rooli ihmisen fysiologia. Kehon elintärkeitä hormoneja ja kasvutekijöitä erittyy ja ne ohjaavat kehitystä ja erilaistumista elinten normaalia fysiologista kunnossa. Samoin systeeminen (ekstrasellulaarinen) proteiinien määrite suuret

in vivo

toiminto aikana kudoksen kasvun ja apoptoosin [1]. Eturauhasen apoptoottinen vaste 4 (Par-4) ilmentyy kaikkialla, ja evoluution konservoitunutta pro-apoptoottista proteiinia, jonka ilmentyminen on pääasiassa korreloi soluja, jotka käyvät läpi apoptoosin, koska eksogeeninen solvausten [2]. Sen lisäksi solunsisäisen toiminto, uusi näkökulma solunulkoisen erityksen eri syöpäsoluissa on täydennetty terapeuttista potentiaalia Par-4 [3]. Äskettäin Burikhanov et ai. ovat osoittaneet, että nisäkässoluja yleensä aiheuttanut eritystä Par-4. Kuitenkin apoptoottinen induktio solunulkoisen Par-4 esiintyvät kautta solu- pinta GRP-78: n havaittiin edistää solujen invaasiota ja kasvaimen kehittymisen [3]. Vakauttaminen angiogeneesiä GRP-78 by Par-4 on nimetty anti-invasiivisen roolia ekstrasellulaarisen Par-4.

Etäpesäke on monivaiheinen prosessi, johon solujen vaeltamiseen ja perisellulaarinen proteolyysiä ECM, joka välittää syöpäsolut ulkonema [4]. Metalloproteinaasien (MMP: t) ovat vastuussa hajoamista ympäristössä olevien esteiden, kuten soluväliaineen ja tyvikalvon [5], [6]. Joukossa MMP perheenjäsenten, MMP-2 ja -9 katsotaan yleisesti olevan pahanlaatuisuuden erilaisten kasvainten sekä huonon ennusteen monien syöpien [6]. Näin ollen MMP pystyvät katkaisemaan tyypin IV peruskalvon kollageenin (MMP-2 ja -9) ja lisäarvoa lääkekehityksessä. Vakuuttava prekliinisissä tutkimuksissa erilaisista laboratoriot ovat säädetty ylivoimaisen kannatuksen suoraa suhdetta MMP-2 yli ilmentymisen ja kasvainten invaasio /etäpesäke [7], [8]. Aikana kehittämisvaiheessa monet MMP-estäjien epäonnistunut varhaisessa vaiheessa kliinisten tutkimusten takia laajaa homologiaa katalyyttidomeeneissa MMP: n. Lisäksi useimmat synteettisen /puolisynteettinen estäjiä MMP: n aikana otettiin kliinisten tutkimusten takia odottamattomien pitkäaikainen huumeiden intoleranssi vähennetään huumeiden noudattaminen [9]. Toisaalta viime aikoina, luonnontuotteet tai luonnontuotteiden johdannaiset on katsottu erittäin potentiaalisia kumota MMP-2 ja -9 välittämän invaasio /etäpesäke joko

in vitro

tai

in vivo

perustettu . Näitä ovat vesipitoiset kaneliuutetta [10], vihreän teen uutetta [11], kurkumiini [12], ja steroideihin saponiinia välillä sarviapilalla [4], chitooligosacharides (COS) peräisin meren luonnontuotteista [13].

Withaferin (WFA) on prototyyppi withanolide luokan luonnon tuotteita, joilla on erilaiset farmakologisia vaikutuksia, kuten antitumor, angiogeneesin vastainen, sydäntä, tulehdusta, ja immunomodulaarisia vaikutuksia [14], [15]. Bioaktiiviset ominaisuudet Withaferin sisältää cytoskeletal remodeling sitoutumalla anneksiini II [16], antiangiogeeninen [17], [18] ja antituumorivaikutus [19], [20] estämällä proteasomaalisten kymotrypsiinin [21] ja apoptoottisten induktion estämällä proteiinikinaasi C: n [22]. Äskettäin Oh et al ovat osoittaneet kaspaasin 3 aktivaation kautta Withaferin [23]. Sen lisäksi anti-syöpä toiminnan Withaferin on osoitettu myös sen tulehdusta ominaisuus tukahduttamalla alfa-2-makroglobuliinireseptori [24]. Meidän viimeaikaisen menestyksen pyritään kehittämään kirjaston Withaferin puolisynteettinen analogeja, rationaalinen seulontastrategia johtavat sukupolven 3-azidoWA, voimakas syövän vastainen ehdokas [25]. Vaikka on tärkeää α-β-tyydyttymättömiä toiminnallisuus rengas A Withaferin A ja syövän vastaisen potentiaalia 3-azidoWA kävi selväksi, silti sen toimintatapa ei ollut selvä.

Tässä tutkimuksessa arvioitiin mekanistinen rooli 3-azidoWA (3-atsido WA), atsidifunktionaalisen Withaferin johdannaisen liikkuvuuteen ja invaasion syöpäsoluja. Halusimme myös yhteistyössä koskea tässä tutkimuksessa signalointireittien

nimittäin

, ERK, Akt, jotka aktivoidaan eri syöpien ja voimistaa ja metastaasit erilaisia ​​syöpäsoluja. Tulokset näistä tutkimuksista antaa meille tärkeitä tietoja mekanistinen roolista 3-azidoWA on kumota hyökkäystä kohdunkaulan ja eturauhassyövän solut, jotka saattavat olla en-reititetty solunulkoinen Par-4.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja vasta-

Kaikki solulinjat ostettiin European Collection of Cell Culture (ECACC), naudan sikiön seerumia (FBS), RPMI-1640, Minimum Essential Medium (MEM), penisilliini G , streptomysiini, trypsiini-EDTA saatiin Invitrogen Corp. 5-difenyylitetratsoliumbromidin (MTT), paraformaldehydiä, Kristalliviolettiliuos, Staurosporiini, fenyylimetyylisulfonyylifluoridi (PMSF), ditio- treitoli (DTT), NP-40, Protease Inhibitor Cocktail, liivate, Brij- 35, Coomassie Brilliant Blue (R-250), Brefeldin A (BFA), Tunikamysiini, TRAIL, anneksiini V-FITC apoptoosin havaitsemiseen iinianalyysikitissä, dimetyylisulfoksidia (DMSO), Bradford-reagenssia saatiin Sigma Chemicals Co. (St. Louis, MO ) Propedium jodidia ja Ultracruz DAPI kiinnitysväliaine saatiin Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA), Z-VAD: Pan kaspaasiestäjä, ihmisen rekombinantti-VEGF-165 ja rekombinantti ihmisen FGF (perus 146 aa) saatiin R 0,05 arvot jaettiin merkitys.

Tulokset

3-azidoWA on antiproliferatiivinen Agent ja indusoi apoptoosia PC-3 ja HeLa Cells

Withaferin A on voimakas sytotoksinen aine, ja osoitti kasvua estäviä ominaisuuksia kasvaimen soluviljelmäkokeita [19], [26]. Niin hyvä kuin kantamolekyylin Withaferin A johdannainen Withaferin, 3-azidoWA (Fig. 1, A) merkittävästi osoitti anti-proliferatiivinen vaikutus paneelin testatuista solulinjoista (jossa on IC

50 alueella 800 nM – 1,0 uM) [25] (Fig. 1, B). Edelleen vahvistuksen apoptoosin 3-azidoWA, suoritimme anneksiini V-FITC-värjäys 3-azidoWA käsiteltyjen HeLa-soluissa. Kuten on esitetty kuviossa. 1, C 59,1% alussa apoptoottisia soluja verrattuna 72,5%: lla 25 nM staurosporiinia, esiintyi, kun HeLa-soluja käsiteltiin 1,0 uM 3-azidoWA 24 tuntia. By DAPI-värjäyksellä havaitsimme, että 1,0 uM 3-azidoWA, ei 0,5 uM indusoidun apoptoosin HeLa-ja PC-3-solujen 24 tunnin inkuboinnin verrattuna positiiviseen kontrolliin staurosporiini (kuvio 1, D). Jäännösarvo Viemisen liittyvä varhainen apoptoic soluja havaittiin FACS tiedot (alemmilla pitoisuutena 0,25 uM 3-azidoWA hoito), mutta suurempi pitoisuus (1,0 uM) 3-azidoWA, johtaa solujen kohti apoptoosin kromatiinin tiivistyminen ympäri ydin- reuna liittyy ydin- koon pieneneminen (valkoinen arrowheads, Fig. 1, D). Aktiivinen kaspaasi-3, kvantitoitiin western blot-analyysi osoitti pilkkoutumisen kaspaasi-3: 1,0 uM 3-azidoWA hoitoon, mutta ei osa-toksisilla annoksilla (0,5 uM) (Fig. 1, E). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että 3-azidoWA on mahdollinen sytotoksinen ja apoptoosin indusoiva luonnontuote johdannainen.

(A) synteesi 3-azidoWA. (B) Effects of 3-azidoWA soluproliferaatioon A549 (keuhkosyöpä), PC-3, DU-145 (eturauhassyöpä) ja HeLa (kohdunkaulan syöpä) solulinjat määritettiin MTT-määrityksellä. (C) 3-azidoWA yhdessä ajoneuvon DMSO: n ja positiivisen kontrollin staurosporiini käsiteltiin solut analysoitiin FACS: lla, (kuten on esitetty); graafinen esitys tuloksista, jotka osoittavat osuus ei-apoptoottisten solujen (Q3), varhainen apoptoottinen (Q4), nekroottinen (Q1) ja myöhäiset apoptoottiset (Q2) soluja. (D) HeLa-soluja (5 x 10

4) viljeltiin kammiossa levyt ja käsiteltiin 3-azidoWA (0,25, 0,50 ja 1,0 uM) kanssa ajoneuvon DMSO: n ja positiivisen kontrollin staurosporiini (25 nM) 24 tuntia. Kiinnityksen jälkeen solut värjättiin tumaväriä DAPI ja valokuvattiin fluoresenssimikroskoopilla (100x suurennuksilla) tunnistaa apoptoottiset ytimet (valkoinen nuolenpäät). (E) HeLa-soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla 3-azidoWA kuten, prokaspaasi-3 ja pilkottiin kaspaasi-3 ilmaisuja määritettiin Western-blottauksella yhdessä kuormituksen valvonta β-aktiini.

3- azidoWA estää Cell Motility, invaasio ja Colony Formation

withanolides olivat tiedetään estävän hyökkäystä kyky syöpäsolujen [27], halusimme tutkia vaikutusta 3-azidoWA on invasiivisia potentiaalia HeLa ja PC-3 solut

in vitro.

Haavan paranemista määrityksiä käytetään määrittämään, onko ala-myrkyllinen konsentraatio 3-azidoWA voivat estää motiliteettia Hela ja PC-3-soluja. 48 h jälkeen yksisolukerros n haavoittui, ajoneuvon DMSO käsitellyt solut olivat kokonaan täytetty tyhjennetty (Fig. 2, A), kun taas käsittely 0,50 ja 0,75 uM 3-azidoWA merkitsevästi (p 0,05) esti motiliteettia Hela ja PC-3-solut, samoin kuin hoidon staurosporiini (Fig. 2, A ja B) (Fig. S1, A ja B).

(A) HeLa-soluja (0,5 x 10

5-solut /kuoppa) kasvatettiin konfluenssiin kuuteen hyvin kudosviljelmälevylle ja naarmuuntunut steriilillä kärki; 3-azidoWA lisättiin kulttuurien ilmoitettu. Naarmuuntunut alueet valokuvattiin (suurennos 100x) nolla tunti ja sitten myöhemmin uudelleen 24 tuntia myöhemmin asteen arvioimiseksi haavan paranemista. (B) toinen naarmuuntunut alueet kvantitoitiin kolmessa satunnaisesti kentät kunkin hoidon, ja tietoja, jotka on laskettu kolmesta itsenäisestä kokeesta. (C) HeLa (1 x 10

3) solua /kolo ja käsiteltiin erilaisilla yhdisteen pitoisuus 3-azidoWA 5 päivän ajan 37 ° C: ssa ja sen jälkeen värjättiin kristallivioletilla (lisätietoja materiaaleja ja menetelmiä), määrä värjättyä pesäkkeet laskettiin, valokuvattiin (100x) ja (D) tietoja, jotka on laskettu kolmesta itsenäisestä kokeesta. Pylväät tarkoittaa; baareja SD kolmen itsenäisen kokeen. P 0,05, ** P 0,01 verrattuna käsittelemättömään kontrolliin. (E) solumigraation määritettiin kautta modifioidun Boyden kammion määritystä, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. HeLa-soluja (2 x 10

5) ympättiin yläkammiossa läsnä ollessa tai poissa ollessa 0,25, 0,50, ja 0,75 uM 3-azidoWA. Solujen annettiin kulkeutua 24 tuntia, minkä jälkeen vaeltavia solujen alaosassa insertin kalvo värjättiin 0,1% kristalliviolettia ja laskettiin 200x suurennus. (F) Invasiiviset solut laskettiin käyttämällä kuvan ohjelmisto lukumäärä siirtynyt solua suuritehoisia kenttä (HPF). Viisi kentät laskettiin kolmena kappaleena (n = 3) kustakin insertti. Cell kuvat saatiin käyttämällä mikroskooppia Nikon Eclipse E200 sisäänrakennettu kamera. Pylväät tarkoittaa; baareja SD kolmen itsenäisen kokeen. P 0,05, ** P 0,01 verrattuna käsittelemättömään kontrolliin.

Pesäkkeenmuodostusta kyky HeLa ja PC-3-solut vaimenee 3-azidoWA hoidon annoksesta riippuvaisella tavalla. Kuten on esitetty kuviossa. 2, C sub-tappava annos 3-azidoWA laski pesäkkeiden muodostumisen kyky HeLa-solujen tilastollisesti merkittävällä tavalla (P 0,05) (Fig. 2, D) (Fig. S1, C ja D).

kriittinen tapahtuma kasvaimen invaasio ja metastaasi on kyky kasvainsolujen hyökätä läpi solunulkoiseen matriisiin, jolloin kasvainsolut siirtyä rajojen primaarikasvaimen ympäristön [28]. Vaikutuksen tutkimiseksi 3-azidoWA solujen invaasiota, Boyden kammio invaasiomääritys suoritettiin kyvyn määrittämiseksi HeLa ja PC-3-solujen hyökätä biologisen matriisit

in vitro

. Kuten on esitetty kuviossa. 2, E ja F, (Fig. S1, E ja F, P 0,01) käsittely 3-azidoWA (0,50 ja 0,75 uM) esti soluinvaasiota (P 0,05) .Voit kumota muuttumisen mahdollisuus soluinvaasion takia ohjelmoidun solukuoleman, me huolellisesti valita fysiologisesti merkittävinä pitoisuuksina 3-azidoWA. Kaikki nämä tulokset yhdessä osoittavat, että osa-myrkylliset annokset 3-azidoWA muuttaa kasvun kinetiikka HeLa ja PC-3-soluja. Tämä voi olla positiivinen indikaattori testaa sen antineoplastisten toimintaa kohdunkaulan ja syöpäsolujen.

esto matriksimetalloproteinaasi 2 Gelatinaasiaktiivisuuden ja Expression 3-azidoWA

Kasvainsolulinja hyökkäyksen läpi matriisin ja kudosten tukos on yhdistettyjen vaikutusten lisääntynyt solun liikkuvuus ja kontrolloi proteolyyttistä hajoamista matriisin. Korkea MMP: n kasvainkudoksissa ovat korreloineet syöpäsolujen matriksin hajoamiseen, invaasio ja metastaasi [29]. Kuten 3-azidoWA inhiboi solun liikkuvuus, me tutkimme, 3-azidoWA kykenee anti-gelatinaasiaktiivisuutta. Kuten nähdään Fig. 3, A ja B (kuvio. S2, A), ylempi rivi, lisääntyvä keskittyminen 3-azidoWA selektiivisesti kumotaan gelatinaasiaktiivisuutta ja ilmaus 72 kDa MMP-2 band vahvistanut gelatiinitsymografialla ja Western blot-analyysi. Vaikutus MMP-2 inhibition 3-azidoWA oli jyrkempi kuin kantamolekyylin withaferin A (Fig. 3, C) (Fig. S2, B) .Further me tutkimme, onko 3-azidoWA voi estää muita (MMP-9) ja tulokset paljastivat, että 3-azidoWA estettävä MMP-2 aktiivisuus HeLa ja PC-3-solut, mutta ei MMP-9 (Fig. 3, keski rivi) (Fig. S2, keski rivi). Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että 3-azidoWA voimakkaasti ja valikoivasti kumoaa MMP-2: n ilmentymisen ja aktiivisuuden annoksesta riippuvaisella tavalla.

(A) HeLa-solut jätettiin käsittelemättä tai niitä käsiteltiin 0,50 uM ja 0,75 uM 3- azidoWA 48 tuntia, elatusaine analysoitiin MMP-2 -9 Gelatinaasiaktiivisuutta. (B) HeLa-solut jätetään hoitamatta tai hoidettiin 0,25, 0,50, 0,75 ja 1,0 uM 3-azidoWA 48 tuntia, kasvatusliuos saatu käytettiin western blot analyysillä, jota seuraa Coomassie blue-värjäys paljastaa 68 kDa BSA bändi latauskontrollina . (C) HeLa-soluja käsiteltiin eri pitoisuus vanhemman withaferin A 48 tunnin ja MMP-2 määritettiin gelatiinitsymografialla. (D) (E) HeLa-soluja käsiteltiin TRAIL: ssa 180 minuuttia ja Tumicamycin 60 minuutin (kuten on osoitettu). Esikäsitelty väliaine altistettiin gelatiinitsymografialla analyysi MMP-2: n aktiivisuuden ja Western blot-analyysi solunulkoisen Par-4, jota seuraa Coomassie blue -värjäyksellä ja kuormituksen valvonta.

3-azidoWA indusoi Extracellular Par-4 eritys by Classical Pathway

Kuten parit apoptoosin indusoivat aineet helpottaa eritystä ekstrasellulaarisen Par-4 [3], pyrimme tutkimaan paneelin lääkekasvien johdettujen puhtaita luonnollisia tuotteita, jotka voisivat edistää apoptoosia ja /tai erityksen tehostamiseksi par-4 (tuloksia ei ole esitetty). Yllättäen olemme huomanneet, että niinkin alhainen kuin 0,5 uM (paljon alle sytotoksinen annos) 3-azidoWA, mutta ei kantamolekyylin Withaferin A (tuloksia ei ole esitetty) indusoi ekstrasellulaarisen Par-4 eritystä annoksesta riippuvalla tavalla (Fig. 3, B keskimmäinen rivi), varmistettiin Western blot. Lisäksi havaitsimme 3-azidoWA hoidon täydennetty eritystä ekstrasellulaarisen Par-4 ehdollisen media, joka olennaisesti jäljitellä vaikutukset 300 ng TRAIL (TNF liittyvät apoptoosin indusoiva ligandi) ja 1,0 uM Tunikamysiini hoidon (Fig. 3, D ja E keskimmäinen rivi). Sen arvioimiseksi, onko tämä eritystä Par-4 kautta tapahtui klassisen BFA-herkkä reitti, johon liittyy ER /Golgin reitti, me lopetetaan proteiini ihmiskaupan ER Golgi kanssa Brefeldin A (BFA) ja todettu erittyvän Par-4 taso hidastui elatusaine jälkeen 3-azidoWA ja TRAIL käsittely läsnäollessa Brefeldin A (Fig. 4, A ja B ylärivi). Tässä ehdotamme, että 3-azidoWA indusoi ekstrasellulaarisen Par-4 erityksen klassisen talousarvioennustevaroituksia herkkä reitin.

PC-3-solut. (A) PC-3-solut jätettiin käsittelemättä tai esikäsitelty BFA (1,0 uM) ja 120 min, käsiteltiin sitten 3-azidoWA kuten 48 tuntia. Kuten on esitetty kuviossa. (B). (B).